CN103289974A

CN103289974A - 绵羊fgf5基因定点敲除系统及其应用

Info

Publication number: CN103289974A
Application number: CN2013101555012A
Authority: CN
Inventors: 皮文辉; 周平; 杨华; 杨永林; 甘尚权; 梁龙; 王新华; 刘守仁
Original assignee: Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences
Current assignee: Xinjiang Academy of Agricultural and Reclamation Sciences
Priority date: 2013-04-28
Filing date: 2013-04-28
Publication date: 2013-09-11

Abstract

本发明公开了一种绵羊FGF5基因定点敲除系统，即剪切绵羊FGF5基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN；所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由剪切所述识别模块TALFGF5F的核酸酶TALEN-L和剪切所述识别模块TALFGF5R的核酸酶TALEN-R组成；所述核酸酶TALEN-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示核苷酸编码的蛋白质，所述核酸酶TALEN-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核苷酸编码的蛋白质。本发明为进一步验证绵羊FGF5基因对羊毛长度和羊毛品质影响提供了可行的材料和方法，同时也为增加羊毛长度和改善毛品质提供新的技术途径。

Description

绵羊FGF5基因定点敲除系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术中的基因敲除技术领域，具体地说是涉及一种绵羊FGF5基因定点敲除系统及其在绵羊FGF5基因ATG位点敲除中的应用。

背景技术

转录激活样效应子(transcription activator-like effector,TALE)来源于黄单胞杆菌(Xanthomonas sp.)，TALE-DNA结合结构域由串联重复单元组成，大部分单元含34（33～35）个氨基酸，单元的第12和13位氨基酸高度可变，称为重复可变区（repeat variable diresidues,RVDs）。TALE的RVDs识别DNA序列的4个碱基具有高度的专一性，TALE重复单元的第13位氨基酸直接与DNA的碱基特异结合。研究者几乎能够针对任何DNA靶序列，构建特异性TALE-DNA结合域，在靶向改变基因序列和调控基因表达方面具有广泛的用途。

设定DNA靶序列，组装TALE-DNA结合域，融合Fok I内切酶的非特异性DNA切割域，组装成TALE核酸酶(tanscription activator-likeeffector nucleases,TALENs)。TALENs靶向结合DNA，产生DNA双链断裂（DNA double-srand breaks,DSBs）。在真核细胞内，DSBs激活两条保守的DNA修复通路。非同源末端连接修复(non-homologous endjoining，NHEJ)能够将断裂的染色体重新连接，在断裂位点引进小片段插入或删除，影响基因功能或产生基因敲除效应。同源指导修复（homology-directed repair，HDR）能够用相似序列的DNA供体模板，代替断裂点周围的DNA序列，交换DNA序列，实现特定突变或导入外源DNA序列。

发明内容

本发明的目的在于提供一种绵羊FGF5基因定点敲除系统及其在绵羊FGF5基因ATG位点敲除中的应用。

本发明中术语绵羊FGF5基因是指绵羊成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor5）基因。

为了解决上述技术问题，本发明采用了如下技术方案：

绵羊FGF5基因定点敲除系统，所述定点敲除系统为剪切绵羊FGF5基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN；

所述绵羊FGF5基因靶序列如SEQ ID NO.1所示核苷酸序列，12-30位核苷酸为识别模块TALFGF5F、与51-69位核苷酸互补的序列为识别模块TALFGF5R，31-50位核苷酸为间隔序列；

所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由剪切所述识别模块TALFGF5F的核酸酶TALEN-L和剪切所述识别模块TALFGF5R的核酸酶TALEN-R组成；所述核酸酶TALEN-L为SEQ ID NO.2或SEQ IDNO.3所示核苷酸编码的蛋白质，所述核酸酶TALEN-R为SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示核苷酸编码的蛋白质。

本发明还提供上述绵羊FGF5基因定点敲除系统的制备方法，包括步骤：

（1）根据绵羊FGF5基因选择SEQ ID NO.1所示核苷酸序列为靶序列，SEQ ID NO.1所示核苷酸序列中12-30位核苷酸为识别模块TALFGF5F、与51-69位核苷酸互补的序列为识别模块TALFGF5R，31-50位核苷酸为间隔序列；

（2）根据步骤（1）所得识别模块TALFGF5F和识别模块TALFGF5R合成剪切所述靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN；所述转录激活子样效应因子核酸酶TALEN由剪切所述识别模块TALFGF5F的核酸酶TALEN-L和剪切所述识别模块TALFGF5R的核酸酶TALEN-R组成；

所述核酸酶TALEN-L为SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示核苷酸编码的蛋白质，所述核酸酶TALEN-R为SEQ ID NO.4或SEQ IDNO.5所示核苷酸编码的蛋白质。

含有上述绵羊FGF5基因定点敲除系统编码基因的重组表达载体、重组菌或重组细胞系。

一种定点敲除绵羊FGF5基因的方法，包括在绵羊成纤维细胞中表达上述定点敲除系统的步骤。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

1、已经发现绵羊FGF5基因第一外显子存在碱基多态性，但受限于胚胎干细胞要求，除小鼠外，其他哺乳动物很难有效应用同源打靶技术。因此，本发明通过TALENs技术对绵羊胚胎FGF5基因ATG起始密码子进行TALENs编辑，获得FGF5基因ATG起始密码子发生突变的细胞系，为进一步验证FGF5基因对羊毛长度和羊毛品质影响提供了可行的材料和方法。

2、本发明获得FGF5基因ATG起始密码子发生突变的细胞系，能够为核移植克隆制作FGF5基因突变的绵羊提供核供体细胞，为增加羊毛长度和改善毛品质提供新的技术途径。

3、TALENs技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out、Knock-in或点突变。它克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZEN相等或更好的活性，使FGF5基因ATG起始密码子操作变得更加简单、方便。

附图说明

图1为TALENs介导的FGF5基因位点突变Surveyor检测电泳图；

图2为FGF5基因位点突变细胞PCR片段SDS-PAGE检测结果；注：12，40和64号DNA带型不同于肌肉组织样品（“+”泳道）和2号样品；

图3为绵羊FGF5基因测序比对分析图；注：图中12-2单碱基缺失；40-7和64-4多碱基缺失，并含ATG（68-70bp处）缺失；

图4为40-7序列缺失测序结果图；注：40-7正向测序，黑色竖线标记处缺失35个碱基；

图5为64-4序列缺失测序结果图；注：64-4反向测序缺失38个碱基。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细描述，但不作为对本发明的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可以从商业途径购买得到。

实施例绵羊FGF5基因敲除

FGF5基因同毛发生长有关。本发明应用TALENs技术，针对绵羊FGF5基因的ATG起始密码子进行敲除操作。

1.1实施例所需材料与试剂

TALE Toolbox试剂盒由Addgene（http://www.addgene.org）提供。该试剂盒由13个质粒组成，5个RVD单体模板质粒：pNI_v2、pNG_v2、pHD_v2、pNN_v2、pNH_V2，RVD单体模版基因编码34个氨基酸；4个TALE-TF骨架质粒：pTALE-TF_v2（NI）、pTALE-TF_v2（NG）、pTALE-TF_v2（HD）、pTALE-TF_v2（NN）；4个TALEN骨架质粒：pTALEN_v2（NI）、pTALEN_v2（NG）、pTALEN_v2（HD）、pTALEN_v2（NN）。

Herculase II fusion polymerase购自Agilent Technologies，Esp3I（BsmBI）、AfeI购自Fermentas，BsaI-HF购自NEW England Biolabs，T7DNA ligase购自Enzymatics，PlasmidSafe ATP-dependent DNase购自Epicentre，琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小提试剂盒等试剂购自生工生物工程（上海）股份有限公司，DL10 000DNA Marker、DL2 000DNAMarker购自宝生物工程(大连)有限公司，Marker VII、DH5a大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司，核酸染料GELVIEW购自北京百泰克生物技术有限公司，引物合成由Invitrogen公司完成。

1.2 TALENs靶点选择

针对绵羊FGF5基因ATG起始密码子位点，采用TAL effectorNucleotide Targer 2.0(https://tale-nt.cac.cornell.edu/node/add/talen)设计识别模块，5’端保留T碱基。识别模块TALFGF5F和TALFGF5R为绵羊FGF5基因ATG起始密码子的TALEN识别模块。

TALFGF5F AGGACCCCCGCGGCTGGAA

AAGATGCACTTAGGACCCCCGCGGCTGGAAGCATGAGCTTGTCCTTCCTCCTCCTCCTCTTCCTTAGCCACC（SEQ ID NO.1）

TTCTACGTGAATCCTGGGGGCGCCGACCTTCGTACTCGAACAGGAAGGAGGAGGAGGAGAAGGAATCGGTGG

TALFGF5R GAGGAGGAGAAGGAATCGG

识别模块TALFGF5F对应RVD序列：

NI-NN-NN-NI-HD-HD-HD-HD-HD-NN-HD-NN-NN-HD-NG-NN-NN-NI-NI或

NI-NH-NH-NI-HD-HD-HD-HD-HD-NH-HD-NH-NH-HD-NG-NN-NN-NI-NI

识别模块TALFGF5R对应RVD序列：

NN-NN-HD-NG-NI-NI-NN-NN-NI-NI-NN-NI-NN-NN-NI-NN-NN-NI-NN或

NH-NH-HD-NG-NI-NI-NH-NH-NI-NI-NH-NI-NH-NH-NI-NH-NH-NI-NN

2.3 TALENs表达载体的构建

应用Golden Gate克隆法和PCR构建TALENs表达载体，即TALFGF5F质粒1、TALFGF5F质粒2、TALFGF5R质粒1和TALFGF5R质粒2。

构建流程：首先PCR扩增得到RVD单体模块DNA，接着用“GoldenGate”克隆法将N₁N₂N₃N₄N₅N₆，N₇N₈N₉N₁₀N₁₁N₁₂和N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆N₁₇N₁₈分别组装形成3个环形6聚体。然后以环形6聚体为模板进行PCR扩增得到线性6聚体，用BsaI酶切适合的TALEN骨架质粒和3条线性6聚体，产生粘性末端依次互补的DNA片段，再用“Golden Gate”克隆法顺次连接DNA片段的粘性末端，获得人工TALENs表达载体。

2.4 RVD单体扩增

TALE Toolbox构建程序需要PCR扩增RVD单体72个。分析TALEToolbox构建程序，扩增的72个单体中有48个重复出现3次。因此能够减少32个单体扩增，只扩增40个单体，减轻了后续胶回收的工作量，降低了定量RVD单体片段的误差。扩增RVD片段所用的引物见表1，引物配对见表2。

表1 TALE构建引物序列

表2 引物配对方案

N代表A(NI)、T(NG)、C(HD)、G(NN或NH)；单体8、9、10、11及14、15、16、17引物与单体2、3、4、5引物完全一样。

以TALE Toolbox试剂盒中pNI_v2、pNG_v2、pHD_v2、pNN_v2RVD单体模板质粒为模板，利用相应引物对PCR扩增获得RVD单体。采用100μL反应体系（表3）：

表3 RVD片段扩增体系

PCR反应程序：95℃预变性2min；95℃变性20s，60℃退火20s，72℃延伸10s，共32个循环；最后72℃延伸3min，4℃保存。为保证琼脂糖凝胶纯化回收后单体的浓度能够达到下一步实验所需，每个单体100μL反应体系扩增两管。琼脂糖凝胶纯化回收PCR扩增产物。

PCR扩增所得单体跑胶，并用Quantity One定量分析确定各单体浓度。定量时每一单体样品上样1μL，DNA标准定量Marker适量（2-5μL），120v跑电泳直至标准定量Marker全部拉开。根据定量所得浓度值调整各单体浓度。

本实施例中单体1，6，7，12，13，18终浓度调至18ng/μL，其余调至15ng/μL。

2.5 环形6聚体的组装

根据识别模块TALFGF5F对应RVD序列：NI-NN-NN-NI-HD-HD-HD-HD-HD-NN-HD-NN-NN-HD-NG-NN-NN-NI-NI，分别用“GoldenGate”克隆法将N₁N₂N₃N₄N₅N₆，N₇N₈N₉N₁₀N₁₁N₁₂和N₁₃N₁₄N₁₅N₁₆N₁₇N₁₈组装形成3个环形6聚体，RVD序列中单体按前后顺序由1开始编号，最终RVD单体N₁₉由TALEN骨架质粒提供。重复上述过程构建其他RVD序列对应的环形6聚体。采用10μL反应体系（表4）：

表4 环形6聚体组装体系

反应条件：37℃5min，20℃5min，共15个循环，4℃保存。由于DTT在空气中容易氧化，故此实施例中所用DTT均为现配现用。

2.6 非环形片段消化降解

第一轮“Golden Gate”反应结束后，只有正确组装的6聚体才能够环化。非环化DNA片段用PlasmidSafe ATP-dependent DNase消化降解，采用10μL反应体系（表5）：

表5 PlasmidSafe ATP-dependent DNase消化降解体系

反应条件：37℃ 30min，70℃ 30min。

经过PlasmidSafe DNase消化反应后，反应体系只剩环形6聚体，再以此作模板，扩增线性6聚体。

2.7 线性6聚体的扩增

采用Hex-F和Hex-R引物，以环形6聚体为模板，PCR扩增获得线性6聚体片段。采用50μL反应体系（表6）：

表6 线性6聚体扩增体系

PCR反应程序：95℃ 2min；95℃ 20s，60℃ 20s，72℃ 30s，共36个循环；最后72℃延伸3min，4℃保存。为保证琼脂糖凝胶回收纯化后单体的浓度能够达到下一步实验所需，每个六聚体50μL反应体系扩增两管。

琼脂糖凝胶纯化回收PCR扩增产物，用Quantity One定量分析确定各6聚体浓度（方法同上）。根据定量所得浓度值调整各线性6聚体浓度至20ng/μL。

2.8 质粒组装

第二轮“Golden Gate”克隆反应，将RVD序列：NI-NN-NN-NI-HD-HD-HD-HD-HD-NN-HD-NN-NN-HD-NG-NN-NN-NI-NI，对应的3个环形6聚体与TALEN骨架质粒pTALEN_v2（NI）连接组装，构建TALFGF5F质粒1。用相同过程，分别采用相应环形6聚体和TALEN骨架质粒构建TALFGF5F质粒2、TALFGF5R质粒1和TALFGF5R质粒2。反应前，将骨架浓度调至100ng/μL。采用10μL反应体系（表7）：

表7 真核表达质粒组装反应体系

反应条件：37℃ 5min，20℃ 5min，共21个循环；最后80℃灭活20min，4℃保存。

最终获得4个质粒，分别为TALFGF5F质粒1、TALFGF5F质粒2、TALFGF5R质粒1和TALFGF5R质粒2。

TALFGF5F1质粒包含核苷酸序列：SEQ ID NO2，对应RVD序列：NI-NN-NN-NI-HD-HD-HD-HD-HD-NN-HD-NN-NN-HD-NG-NN-NN-NI-NI；TALFGF5F1质粒可以表达剪切识别模块TALFGF5F的核酸酶TALEN-L。

TALFGF5F2质粒包含核苷酸序列：SEQ ID NO3，对应RVD序列：NI-NH-NH-NI-HD-HD-HD-HD-HD-NH-HD-NH-NH-HD-NG-NN-NN-NI-NI；TALFGF5F2质粒可以表达剪切识别模块TALFGF5F的核酸酶TALEN-L。

TALFGF5R1质粒包含核苷酸序列：SEQ ID NO4，对应RVD序列：NN-NN-HD-NG-NI-NI-NN-NN-NI-NI-NN-NI-NN-NN-NI-NN-NN-NI-NN；TALFGF5R1质粒可以表达剪切识别模块TALFGF5R的核酸酶TALEN-R。

TALFGF5R2质粒包含核苷酸序列：SEQ ID NO5，对应RVD序列：NH-NH-HD-NG-NI-NI-NH-NH-NI-NI-NH-NI-NH-NH-NI-NH-NH-NI-NN；TALFGF5R1质粒可以表达剪切识别模块TALFGF5R的核酸酶TALEN-R。

上述剪切识别模块TALFGF5F的核酸酶TALEN-L和剪切识别模块TALFGF5R的核酸酶TALEN-R组成转录激活子样效应因子核酸酶TALEN。

2.9 质粒转化

（1）将2.8中获得的含相应质粒的连接产物5μL加入50μL冰浴的DH5a大肠杆菌(Escherichia coli)感受态细胞中（感受态细胞从-80℃取出，置于冰上待其溶解）。

（2）轻指弹离心管使连接产物与感受态混合均匀，冰中静置5min。

（3）42℃热激45s，快速转移至冰中静置5min。

（4）加入500μL无抗性SOC培养基。

（5）37℃震荡培养1h，使菌复苏，表达抗性蛋白。

（6）培养1h后，吸取100μL培养液涂于氨苄抗性LB平板

（7）将已涂平板放入37℃恒温培养箱培养过夜。

平板经过夜培养后，次日实验组平板可看到大量单克隆菌落，而阴性对照组平板只能看到少许单克隆菌落。

2、绵羊胚胎成纤维细胞培养及预处理

绵羊胚胎成纤维细胞培养采用添加15%胎牛血清的DMEM培养液，在37℃，5.0%CO₂和饱和湿度条件下培养。当绵羊胚胎成纤维细胞生长至汇合度90%时，用0.25%胰蛋白酶消化液处理，洗涤收集后获得的绵羊胚胎成纤维细胞备用。

3、电转染

按照Amax NucleofectorⅡ电转仪操作说明，1：50倍预混S1溶液（10ml溶液:2g ATP-二钠盐，1.2g MgCl₂*6H₂O）和S2溶液（500ml溶液：6g KH₂PO₄,0.6g NaHCO₃,0.2g葡萄糖）制备电转液，收集2×10⁶个绵羊胚胎成纤维细胞，用100ul电转液悬浮细胞，加入除内毒素的TALFGF5F质粒1和TALFGF5R质粒1各2.5ug，混匀转入电击杯中。选择小鼠成纤维细胞电转程序，对绵羊胚胎成纤维细胞实施电转。静置10min，加入DMEM培养液悬浮细胞，将电转染后的绵羊胚胎成纤维细胞转入6孔培养板，31℃、5.0%CO₂和饱和湿度条件培养96h。

类似的实验采用加入除内毒素的TALFGF5F质粒2和TALFGF5R质粒2各2.5ug，采用加入除内毒素的TALFGF5F质粒1和TALFGF5R质粒2各2.5ug，其他步骤和上述相同。

4、Surveyor检测TALENs活性

将3中培养96h的绵羊胚胎成纤维细胞取1/3收集于200ulEppendorf管中，用20ul QuickExtract DNA抽提液悬浮上述细胞，然后68℃ 15min、95℃ 8min裂解。以裂解后的细胞裂解液做模版，用DNA聚合酶pfu，热启动扩增靶点DNA序列，上游引物FGF5svF：GTGCACGGAGCAGTGAGAT，下游引物FGF5svR：AGAAGAGGAAGACACGGTGC。PCR反应条件：95℃ 2min；95℃20sec，60℃ 20sec，68℃ 1min，共35个循环；68℃ 3min。绵羊野生型基因组DNA扩增作为阳性对照。凝胶电泳胶回收纯化DNA目的片段。为了实现野生型DNA链与TALENs编辑DNA杂交，产生DNA异源双链和同源双链。取300ng目的DNA，用1×pfu buffer稀释至20ul体积，采用PCR仪控温进行缓慢变性复性过程。混合Surveyor突变检测试剂成份(Transgenomic,cat.no.706025)，42℃水浴1h，加2ul终止液停止Surveyor核酸内切酶反应。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)检测确定TALENs活性。

图1为TALENs介导的FGF5基因位点突变Surveyor检测结果。3号泳道是TALFGF5F1/TALFGF5R1组合，Surveyor检测表明产生突变。1、2、4、5是发明人创新过程中尝试所得的无效的TALENs组合。6号泳道是绵羊肌肉组织基因组PCR扩增片段的Surveyor检测结果，说明扩增的这段绵羊FGF5基因片段自身也含有多态。7号泳道是绵羊FGF5基因组的PCR扩增片段。

5、绵羊胚胎成纤维细胞克隆传代培养：

无限稀释法将TALENs处理有效的细胞无限稀释接种于96孔板，增殖传代至24孔培养板。细胞生长至汇合度90%时，胰酶消化细胞，收集2/3的细胞冻存，1/3的细胞进行PCR检测，采用Surveyor检测中的引物和扩增条件，PCR扩增DNA目的片段，PAGE电泳检测并送出测序。如图2所示，从71孔细胞中得到3个明显不同于其它样品的带型，64、40、12。尽管所得3个细胞样品不纯，可能来自2个或3个细胞增殖，但位点发生突变的细胞比例明显增高（图2）。说明绵羊胚胎成纤维细胞具备从单个或几个细胞增殖至10⁵个细胞的能力。

绵羊FGF5基因测序比对结果

将细胞基因组扩增DNA片段连接T载体，送Invitrogen公司测序。序列比对结果如下图3；40-7序列缺失测序结果图如图4；64-4序列缺失测序结果图如图5。检测结果说明使用本发明的TALENs处理绵羊成纤维细胞，能够定点敲除其绵羊成纤维细胞生长因子（fibroblast growthfactor 5，FGF5）基因的ATG起始密码子。

以上实施例仅为本发明的示例性实施例，不用于限制本发明，本发明的保护范围由权利要求书限定。本领域技术人员可以在本发明的实质和保护范围内，对本发明做出各种修改或等同替换，这种修改或等同替换也应视为落在本发明的保护范围内。

序列表

Claims

1.绵羊FGF5基因定点敲除系统，其特征在于，所述定点敲除系统为剪切绵羊FGF5基因靶序列的转录激活子样效应因子核酸酶TALEN；

2.权利要求1所述绵羊FGF5基因定点敲除系统的制备方法，其特征在于，包括步骤：

3.含有权利要求1所述绵羊FGF5基因定点敲除系统编码基因的重组表达载体、重组菌或重组细胞系。

4.一种定点敲除绵羊FGF5基因的方法，包括在绵羊成纤维细胞中表达权利要求1所述定点敲除系统的步骤。