CN103278367A - 一种柑橘黄龙病快速诊断方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种柑橘黄龙病快速诊断方法。本发明通过有效的去除叶片中的残留淀粉，去除残留淀粉的影响，再通过有效的去除叶绿素，去除叶绿素的影响，直接在叶片上显色，无需与水混合研磨，从而避开由于淀粉是不溶于水的，与水混合进行显色反应，准确性易受影响，从而大大的提高了柑橘黄龙病的诊断准确性，实现了对柑桔黄龙病的快速诊断，为黄龙病的防治提供了有效检测手段，有利于黄龙病的防治。
Description
技术领域：
本发明属于柑橘病害防治领域，具体涉及一种柑橘黄龙病快速诊断方法。
背景技术：
我国是世界上的柑橘生产大国；柑橘产业是我国农业支柱产业，在农业经济中占有极其重要的地位，在促进农民增收、增加社会就业和社会主义新农村建设中发挥极其重要的作用。柑橘病虫害是柑橘产业发展的重大障碍，其中最严重的是被称为柑橘“癌症”的柑橘黄龙病。随着柑橘生产的快速发展，柑橘黄龙病的发生和为害越来越严重。该病是一种为害极大的传染性病害，其流行持续时间长、发病范围广、发病率高，造成我国大部分地区柑橘寿命短、产量低、生产成本高，每年经济损失高达数十亿美元，严重困扰和制约我国乃至世界范围内柑橘产业的发展。
研究结果已证明，田间的黄龙病病菌主要是由柑橘木虱传播的。因此，防治柑橘木虱，减少田间柑橘木虱的种群数量，成为控制黄龙病的核心问题。广东省昆虫研究所在柑橘木虱和柑橘黄龙病方面进行了比较深入的研究，并申请发明专利“一种柑橘园控制柑橘木虱和黄龙病的方法”，申请号：201310049098.6。
然而，目前黄龙病防治面临的主要问题是难度大，技术要求高，实施较困难。其问题的关键是由于检测诊断技术跟不上，种植户不认为自己的柑橘树染上黄龙病，所以也就不积极去采取措施。因此，快速准备易操作的检测诊断技术，成为黄龙病防治的急需的技术难点。
目前，检测诊断技术主要田间症状诊断及指示植物鉴别、电镜检测诊断、免疫学检测诊断、核酸分子检测诊断、基于淀粉碘反应的诊断方法（张利平，2009），其中PCR技术是目前的主流技术（邓晓玲等，1999；王中康等，2004；孟祥春等，2007）。基于淀粉碘反应的诊断方法来源于Schneider(1968)发现黄龙病感染的叶片中淀粉含量很高，2002年MasatoshiOnuki用组织学方法证实了感染黄龙病的柑橘叶片积累大量的淀粉粒。Le Thi Thu Hong和Nguyen Thi Ngoc Truc（2003）随后建立了碘反应诊断黄龙病技术，技术要点为：（1）采集黄龙病特征的叶片，采集时不要采集内膛叶、卷叶、嫩叶，采集时间为早晨，不要采集枝、果和根。（2）取1g的叶片，与2ml蒸馏水混合，研碎。（3）滴加2μL叶和水的混合液在反应膜上(NCM，NitroCellulose Membrane)，5分钟后，滴加2μL碘液在反应膜的样品上。（4）观察叶片颜色变化，等待结果，阴性反应颜色不变，阳性则变蓝。日本TAKUSHI(2007)测定感染黄龙病的柑橘叶片中淀粉含量是400-500mg/kg，正常叶片为85.6mg/kg，并建立快速诊断技术，他们用砂纸擦刮叶片表面20下，然后将砂纸放在塑料袋中，向袋内加25μL的碘液显色。马来西亚的Lily Eng（2007）用不同的砂纸重复了上述方法。我国张利平等（2009）重复该技术，磨碎采集的柑橘感病材料，加等量的纯水，然后吸取4μL叶片和水混合液于反应膜上，等5分钟，滴加等量的碘溶液，观察颜色变化，试验结果与PCR结果一致性可以达到93.3%。
本发明人通过研究发现：目前淀粉显色技术之所以没有广泛应用是因为以下原因，（1）由于早晨采样，没有真正消除正常叶淀粉的影响。正常叶进行光合作用积累淀粉，有时由于环境因素，晚上可能不能完全转移，导致早晨正常叶中有淀粉残留；（2）由于上述技术没有去掉叶绿素，显色时存在干扰，也可能影响检测诊断准确率；（3）上述诊断技术中需要与水混合进行研磨，而淀粉是不溶于水的，与水混合进行显色反应，准确性易受影响。
发明内容：
本发明的目的是提供一种简便快速，准确性高的柑橘黄龙病快速诊断方法。
本发明的柑橘黄龙病快速诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、暗处理：用黑色袋子套住待检测的柑橘的叶片，封口，暗处理12-24小时，得到暗处理后的叶片；或者采集待检测的柑橘的枝条，带回室内，插在水中，再用黑色袋子套住叶片或放在暗室中，暗处理12-24小时，收集叶片得到暗处理后的叶片；或者在日出之前，去采集过夜的待检测的柑橘的叶片作为暗处理后的叶片；
b、叶片的冷冻处理：对暗处理后的叶片进行剪切，至少剪切叶片主脉的一侧叶片，从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干细条的细条状，再置于-4～-15℃冷冻12～24小时，得到冷冻后的叶片；或者将暗处理后的叶片置于-4～-15℃冷冻12～24小时，然后再对叶片进行剪切，至少剪切叶片主脉的一侧叶片，从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干细条的细条状，得到冷冻后的叶片；
c、叶片的脱色：将冷冻后的叶片放入叶绿素脱色液中，直至叶片的细条变为白色，再取出，得到脱色后的叶片；
d、显色检测：在脱色后的叶片的细条上滴加淀粉显色液，然后观察叶片的颜色变化，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘的叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。
所述的叶绿素脱色液是指能脱除叶绿素的溶液，优选为丙酮、乙醇、苯、甲苯或二甲苯等有机溶剂中的一种或几种的混合物。
所述的淀粉显色液是指能显色淀粉的溶液，优选为碘酒、碘化钾溶液或聚乙烯吡咯烷酮碘。
所述的细条优选为1mm宽的细条。
本发明通过暗处理，正常叶片中的淀粉被转移，叶片中无淀粉积累。而黄龙病叶因为筛管堵塞，淀粉无法转移，沉积在叶片中，因此通过暗处理可以真正的消除正常叶淀粉的影响，提高准确率。
叶片的冷冻处理，其主要目的是去除叶绿素，因为现有技术中没有完全去除叶绿素，显色时会存在干扰，也影响检测诊断准确率。本发明通过冷冻处理，温度上的聚变加速细胞膜的破裂，从而缩短叶绿素的溶解浸提时间，再加上对叶片剪切成细条状，可以加速叶绿素的溶解，但不完全剪断，保持叶片形状，有利于后续步骤的进行，通过上述步骤加速叶绿素的溶解，并有助于叶绿素溶解完全从而去除叶绿素。
叶片的脱色是利用叶绿素脱色液溶解和萃取叶片中的叶绿素，直至叶片变白色，从而完全去除叶绿素，避免由于叶绿素的存在形成干扰，影响检测诊断准确率。
显色检测是利用黄龙病叶富含淀粉，淀粉遇碘变蓝，而正常叶内不含淀粉，颜色不变的原理，利用淀粉显色液对上述脱色后的叶片进行检测诊断，从而确定待检测叶片是否是黄龙病叶的。
本发明的柑橘黄龙病快速诊断方法与现有技术的不同之处如表1所示：
表1
本发明通过有效的去除叶片中的残留淀粉，去除残留淀粉的影响，再通过有效的去除叶绿素，去除叶绿素的影响，直接在叶片上显色，无需与水混合研磨，从而避开由于淀粉是不溶于水的，与水混合进行显色反应，准确性易受影响，从而大大的提高了柑橘黄龙病的诊断准确性，实现了对柑桔黄龙病的快速诊断，为黄龙病的防治提供了有效检测手段，有利于黄龙病的防治。
附图说明：
图1是剪切叶片成细条的三种情况示意图，A表示只剪切主脉的一侧叶片，B表示主脉的两侧叶片都剪切，C表示去除主脉的一侧叶片后，剪切剩余的一侧叶片；
图2是实施例1的诊断结果图；
图3是实施例2的诊断结果图；
图4是实施例3的诊断结果图；
图5是实施例4的诊断结果图；
图6是实施例5的诊断结果图；
图7是实施例6的诊断结果图；
图8是实施例7的诊断结果图；
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：沙糖桔黄龙病的检测诊断。
在广州萝岗柑橘园中进行，时间2013年4月12日10：00暗处理（用黑色胶袋将待检测沙糖桔树叶片（待检测叶片，经核酸分子检测诊断，其为黄龙病感染叶）罩住，用夹子夹紧封口）。13日上午9：30采集叶片，得到暗处理后的叶片，放在黑色胶袋中带回室内，下午4点在室内将叶片剪成约1mm宽的细条（叶片一侧从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干宽度为1mm细条的细条状，具体如图1A所示），放入冰箱冷冻层冷冻，冷冻温度为-10℃。14日上午8：00取出冷冻后的叶片，放试管中，加入叶绿素脱色液（丙酮）25mL，中间摇动2-3次。下午3点细条叶片变为白色，将试管脱色液倒掉，得到脱色后的叶片，在脱色后的叶片的细条上直接滴加淀粉显色液（碘酒），观察叶片颜色的变化进行诊断。结果如图2所示，图2中的A为本实施例的待检测叶片，而B是已经通过现有技术证明其不是黄龙病叶的正常叶。由图2可以看出，本实施例的待检测叶片（A）经显色后，细条状叶片呈蓝色，由此鉴定该待检测叶片为黄龙病叶，而正常叶（B）则不变色，由此鉴定为不患黄龙病的正常叶。该检测结果与利用常规的核酸分子检测诊断检测结果一致。
实施例2：马水桔黄龙病的检测诊断
在阳春果园中进行，下午3点暗处理（用黑色袋子套住待检测的马水桔的叶片（经核酸分子检测诊断，其为黄龙病叶）罩住，用夹子夹紧封口），第二天早上拿出，得到暗处理后的叶片，然后再放入冰箱冷冻层，-15℃温度，冷冻12小时后取出，然后将叶片剪成约1mm宽的细条（叶片一侧从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干宽度为1mm细条的细条状，具体如图1A所示），得到冷冻后的叶片，将冷冻后的叶片放入叶绿素脱色液（乙醇）中，脱色6小时后，叶片细条变为白色，倒掉脱色液，取出叶片，得到脱色后的叶片，再脱色后的叶片的细条上滴加淀粉显色液（碘化钾溶液）诊断。
结果如图3所示，图3中的A为本实施例的待检测叶片，而B是已经通过现有技术证明其不是黄龙病叶的正常叶。由图3可以看出，本实施例的待检测叶片（A）经显色后，细条状叶片呈蓝色，由此鉴定该待检测叶片为黄龙病叶，而正常叶（B）则不变色，由此鉴定为不患黄龙病的正常叶。该检测结果与利用常规的核酸分子检测诊断检测结果一致。
实施例3：萝岗橙黄龙病的检测诊断。
在广州萝岗萝岗橙园中进行，时间2013年4月12日10：00暗处理（用黑色胶袋将待检测萝岗橙树叶片（待检测叶片，经核酸分子检测诊断，其为黄龙病叶）罩住，用夹子夹紧封口）。13日上午9：30采集叶片，得到暗处理后的叶片，放在黑色胶袋中带回室内，下午4点在室内将暗处理后的叶片剪成约1mm宽的细条（叶片一侧从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干宽度为1mm细条的细条状，具体如图1A所示），放入冰箱冷冻层冷冻，冷冻温度为-4℃。14日上午8：00取出冷冻后的叶片，放试管中，加入叶绿素脱色液（丙酮）25mL，中间摇动2-3次。下午3点细条叶片变为白色，将试管脱色液倒掉，得到脱色后的叶片，在脱色后的叶片的细条上直接滴加淀粉显色液（碘酒），观察叶片颜色的变化进行诊断。
结果如图4所示，图4中的B为本实施例的待检测叶片，而A是已经通过现有技术证明其不是黄龙病叶的正常叶。由图4可以看出，本实施例的待检测叶片（B）经显色后，细条状叶片呈蓝色，由此鉴定该待检测叶片为黄龙病叶，而正常叶（A）则不变色，由此鉴定为不患黄龙病的正常叶。该检测结果与利用常规的核酸分子检测诊断检测结果一致。
实施例4：脐橙黄龙病的检测诊断
在韶关乐昌浩天果园中进行，时间2013年5月15-17日。15日下午5点暗处理（用黑色胶袋将待检测脐橙叶片罩住，用夹子夹紧封口）。16日上午6：00采集经过暗处理后的叶片（待检测叶片，经核酸分子检测诊断，其为黄龙病叶），得到暗处理后的叶片，带回室内（采样点距室内距离约100M），放入冰箱冷冻层冷冻，温度为-4℃，24小时后取出，将叶片剪成约1mm宽的细条（叶片一侧从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干宽度为1mm细条的细条状，具体如图1A所示），得到冷冻后的叶片，放试管中，加入叶绿素脱色液（甲苯）25mL，中间摇动2-3次，10小时后，细条叶片变为白色叶片，将试管脱色液倒掉，得到脱色后的叶片，在脱色后的叶片的细条上直接滴加淀粉显色液（碘酒），观察叶片颜色的变化进行诊断。
结果如图5所示，图5中的B和C为本实施例的待检测叶片，而A是已经通过现有技术证明其不是黄龙病叶的正常叶。由图5可以看出，本实施例的待检测叶片（B和C）经显色后，细条状叶片呈蓝色，由此鉴定该待检测叶片为黄龙病叶，而正常叶（A）则不变色，由此鉴定为不患黄龙病的正常叶。该检测结果与利用常规的核酸分子检测诊断检测结果一致。
实施例5：红江橙黄龙病的检测诊断
在廉江青平果园进行，时间2013年5月23日下午1点采集待检测的红江橙的枝条，带回室内，将枝条插在水中，再放在暗室中，24日上午8点，采集经过暗处理的叶片，得到暗处理后的叶片，再将其放入冰箱冷冻层冷冻，温度为-4℃，24小时后取出，将叶片剪成约1mm宽的细条（叶片一侧从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干宽度为1mm细条的细条状，具体如图1A所示），得到冷冻后的叶片，放试管中，加入叶绿素脱色液（甲苯）25mL，中间摇动2-3次，6小时后，细条叶片变为白色，倒掉叶绿素脱色液，滴加淀粉显色液（碘酒），观察叶片颜色的变化进行诊断。
结果如图6所示，图6中的A为本实施例的待检测叶片，而B是已经通过现有技术证明其不是黄龙病叶的正常叶。由图6可以看出，本实施例的待检测叶片（A）经显色后，细条状叶片呈蓝色，由此鉴定该待检测叶片为黄龙病叶，而正常叶（B）则不变色，由此鉴定为不患黄龙病的正常叶。该检测结果与利用常规的核酸分子检测诊断检测结果一致。
实施例6：夏橙黄龙病的检测诊断
在北海夏橙园中采样，时间2013年5月25日下午暗处理（用黑色胶袋将待检测夏橙叶片罩住，用夹子夹紧封口），5月26日上午7点采集经过暗处理后的叶片（待检测叶片，经核酸分子检测诊断，其为黄龙病叶），放入冰箱冷冻层冷冻，温度为-12℃，5月27日上午6点取出，将叶片剪成约1mm宽的细条（叶片一侧从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干宽度为1mm细条的细条状，具体如图1A所示），得到冷冻后的叶片，放试管中，加入叶绿素脱色液（甲苯）25mL，中间摇动2-3次，中午12：00细条叶片变为白色叶片，在脱色后的叶片的细条上直接滴加淀粉显色液（碘酒），观察叶片颜色的变化进行诊断。
结果如图7所示，图7中的A为本实施例的待检测叶片，而B是已经通过现有技术证明其不是黄龙病叶的正常叶。由图7可以看出，本实施例的待检测叶片（A）经显色后，细条状叶片呈蓝色，由此鉴定该待检测叶片为黄龙病叶，而正常叶（B）则不变色，由此鉴定为不患黄龙病的正常叶。该检测结果与利用常规的核酸分子检测诊断检测结果一致。
实施例7：皇帝柑黄龙病的检测诊断。
时间2013年5月29日，在德庆柑橘园中采集待检测的皇帝柑的枝条，带回室内，将枝条插在水中，再用黑色袋子套住叶片进行暗处理，暗处理24小时，得到暗处理后的叶片（待检测叶片，经核酸分子检测诊断，其为黄龙病叶），5月30日下午6点将暗处理后的叶片放入冰箱冷冻层冷冻14小时，冷冻温度为-10℃，5月31日上午8点将叶片剪成约1mm宽的细条（叶片一侧从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干宽度为1mm细条的细条状，具体如图1A所示），得到冷冻后的叶片，放试管中，加入叶绿素脱色液（甲苯）25mL，中间摇动2-3次。下午3时细条叶片变为白色叶片，得到脱色后的叶片，在脱色后的叶片的细条上直接滴加淀粉显色液（碘酒），观察叶片颜色的变化进行诊断。
结果如图8所示，图8中的B为本实施例的待检测叶片，而A是已经通过现有技术证明其不是黄龙病叶的正常叶。由图8可以看出，本实施例的待检测叶片（B）经显色后，细条状叶片呈蓝色，由此鉴定该待检测叶片为黄龙病叶，而正常叶（A）则不变色，由此鉴定为不患黄龙病的正常叶。该检测结果与利用常规的核酸分子检测诊断检测结果一致。
Claims (4)
1.一种柑橘黄龙病快速诊断方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、暗处理：用黑色袋子套住待检测的柑橘的叶片，封口，暗处理12-24小时，得到暗处理后的叶片；或者采集待检测的柑橘的枝条，带回室内，插在水中，再用黑色袋子套住叶片或放在暗室中，暗处理12-24小时，收集叶片得到暗处理后的叶片；或者在日出之前，去采集过夜的待检测的柑橘的叶片作为暗处理后的叶片；
b、叶片的冷冻处理：对暗处理后的叶片进行剪切，至少剪切叶片主脉的一侧叶片，从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干细条的细条状，再置于-4～-15℃冷冻12～24小时，得到冷冻后的叶片；或者将暗处理后的叶片置于-4～-15℃冷冻12～24小时，然后再对叶片进行剪切，至少剪切叶片主脉的一侧叶片，从叶片侧边沿叶片侧脉方向向叶片主脉剪，直至主脉，但不要剪断主脉，从而将叶片剪成具有若干细条的细条状，得到冷冻后的叶片；
c、叶片的脱色：将冷冻后的叶片放入叶绿素脱色液中，直至叶片的细条变为白色，再取出，得到脱色后的叶片；
d、显色检测：在脱色后的叶片的细条上滴加淀粉显色液，然后观察叶片的颜色变化，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘的叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。
2.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病快速诊断方法，其特征在于，所述的叶绿素脱色液为丙酮、乙醇、苯、甲苯或二甲苯中的一种或几种的混合物。
3.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病快速诊断方法，其特征在于，所述的淀粉显色液为碘酒、碘化钾溶液或聚乙烯吡咯烷酮碘。
4.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病快速诊断方法，其特征在于，所述的细条为1mm宽的细条。
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