CN104132938A - 一种柑橘黄龙病快速检测方法 - Google Patents

一种柑橘黄龙病快速检测方法 Download PDF

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张宇宏
郭洋洋
郑基焕
毛润乾
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Abstract

本发明公开了一种柑橘黄龙病快速检测方法。它包括：a、脱色处理：将经过暗处理的待检测柑橘叶片进行打磨处理，磨掉叶片表面的蜡质层，将此叶片放入叶绿素脱色液中浸泡直至叶片变为白色；b、显色检测：在脱色后的叶片上滴加淀粉显色液，然后观察叶片的颜色变化，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。其具有操作更加方便、耗时更短、准确性更高的、适合农户自行操作的优点。

Description

一种柑橘黄龙病快速检测方法
技术领域：
本发明属于柑橘病害防治领域，具体涉及一种柑橘黄龙病快速检测方法。
背景技术：
柑橘黄龙病(citrus huanglongbing disease,HLB)是一种柑橘毁灭性病害，全年都能发生，该病春、夏、秋梢均可出现症状。通常叶片有三种类型的黄化：均匀黄化、斑驳黄化和缺素状黄化。病株中，有的新叶可能从叶片基部、叶脉附近或边缘开始褪绿黄化，并逐渐扩大成黄绿相间的斑驳状黄化，这种斑驳黄化也可能转变为均匀黄化；有的黄化枝上发出新梢，有的黄化枝剪截后抽出新梢，其枝短叶小变硬，又表现缺锌、缺锰状的症状，因此，只有一些有经验的技术员可以根据田间症状进行初步的大致的判断。因此，快速准确易操作的检测诊断，成为黄龙病防治的急待解决的问题。
当前，主要检测诊断技术有田间症状诊断及指示植物鉴别、电镜检测诊断、免疫学检测诊断、核酸分子检测诊断、基于淀粉碘反应的诊断。其中，基于淀粉碘反应的诊断源于Schneider(1968)发现黄龙病感染的叶片中淀粉含量很高，2002年日本科学家Masatoshi Onuki用组织学方法证实了感染黄龙病的柑橘叶片积累大量的淀粉粒，黄龙病叶片淀粉通常是正常叶片的16-20倍。Le Thi Thu Hong和Nguyen Thi Ngoc Truc(2003)随后建立了碘反应诊断黄龙病技术，技术要点为：(1)采集疑似黄龙病的叶片，取样研碎；(2)反应膜上使碘与样品反应；(3)根据颜色变化判断柑橘是否患有黄龙病。此外，日本的TAKUSHI(2007)、马来西亚的Lily Eng(2007)和我国的张利平(2009)等都在此基础之上创立了自己的检测诊断方法。
为实现农户自助式快速检测诊断柑橘黄龙病，人们利用淀粉碘显色原理开发出了柑橘黄龙病快速检测技术(专利申请号201310244391.7)。此技术利用暗处理法消除正常叶片中淀粉的干扰，利用冷冻法破坏叶肉细胞后脱色，最后染色判断。该技术与PCR技术检测结果一致性超过90％。表1为几种碘反应法技术成果及与PCR技术一致率比较。
表1几种碘反应法技术成果及与PCR技术一致率
但存在以下不足：
(1)需要冰箱冷冻，虽然现在各家各户都有冰箱，一些农户不愿意将家用冰箱用于冷冻柑橘叶片；
(2)冷冻脱色时间久，导致检测周期过长；
(3)样品处理时需将叶片剪成1mm左右的细条，用户在操作时难以把握。细条太宽时，脱色、染色时间延长，且常造成只有剪的切口处显色，影响判断；
(4)不能及时出检测结果，一些农户希望在田间就能看到结果，而不需要带回家做实验；
(5)冷冻脱色时间太久，需要6-10小时，气温低时，时间更久。
因此，目前急需一种操作更加方便，耗时更短，准确性更高的，适合农户自行操作的柑橘黄龙病快速检测方法。
发明内容：
本发明的目的是提供一种操作更加方便、耗时更短、准确性更高的、适合农户自行操作的柑橘黄龙病快速检测方法。
本发明的柑橘黄龙病快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、脱色处理：将经过暗处理的待检测柑橘叶片进行打磨处理，磨掉叶片表面的蜡质层，将此叶片放入叶绿素脱色液中浸泡直至叶片变为白色；
b、显色检测：在脱色后的叶片上滴加淀粉显色液，然后观察叶片的颜色变化，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。
所述的将经过暗处理的待检测柑橘叶片进行打磨处理优选是用砂纸轻轻打磨叶片，磨掉叶片表面的蜡质层。砂纸可以为金刚砂纸、人造金刚砂纸或玻璃砂纸，常用刚砂纸(CiliconCarbide Abrasive Paper)。其作用是用于打磨叶片表面，将柑橘叶片表面的腊质层打磨掉，便于脱色。
所述的暗处理的待检测柑橘叶片优选是用黑色袋子套住待检测柑橘叶片，封口，暗处理12-24小时，得到暗处理的待检测柑橘叶片。
所述的叶绿素脱色液为丙酮、乙醇、苯、甲苯或二甲苯中的一种或几种的混合物。
所述的淀粉显色液为碘酒、碘化钾溶液或聚乙烯吡咯烷酮碘。
本发明相比于现有技术，具有以下优点：
(1)无需冰箱冷冻，可直接脱色。农户可直接在田间脱色处理和显色判断。
(2)叶片用砂纸轻轻打磨即可，无需剪成1mm左右的细条，省时省力，同时保证叶片的完整性。
(3)由于叶片完整，没有受到破坏，显色更清晰、直观、准确。
(4)脱色时间短，只需2-3小时，气温高时只需1小时即可。
(5)通过比色卡比色可以了解淀粉积累量高低。
(6)本发明方法仍保持了与PCR技术高度的一致性，准确性高。
附图说明：
图1是实施例1的检测结果图，其中A、B、C分别表示黄龙病感染叶(有症状叶)、黄龙病感染叶(无症状叶)和正常健康叶，Ⅰ表示检测结果图，Ⅱ表示与Ⅰ相对应的叶，在Ⅰ中，剪成细条的为对照组的检测结果，而未剪成细条，成完整状的则是按照本发明的方法进行检测的结果，两者是同一片叶用不同的方法检测。
图2是实施例2的检测结果图，其中A、B、C分别为待检测柑橘叶片、检测后的叶片的正面图和检测后的叶片的背面图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
用黑色袋子套住待检测柑橘叶片，封口，暗处理12小时，得到暗处理的待检测柑橘叶片。从中分别选择黄龙病感染叶(有症状叶)、黄龙病感染叶(无症状叶)和正常健康叶三种叶片，每种叶片分成两半，分别用下述方法处理：
1、将待检测柑橘叶片剪成约1mm宽的细条，放入冰箱冰冻，冷冻温度为-10℃，24小时后取出放入叶绿素脱色液(丙酮)中脱色，10小时后，细条叶片变为白色叶片，倒掉脱色液，滴加淀粉显色液(碘酒)显色，观察叶片颜色的变化进行诊断，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。此组作为对照。
2、将待检测柑橘叶片用金刚砂纸进行轻轻打磨处理，磨掉叶片表面的蜡质层，将此叶片放入叶绿素脱色液(丙酮)中浸泡脱色1小时，叶片变为白色，倒掉叶绿素脱色液，在脱色后的叶片上滴加淀粉显色液(碘酒)，然后观察叶片的颜色变化，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。
结果如图1所示，图1A为黄龙病有症状叶，1B为黄龙病但无症状叶，1C为正常健康叶。
表2是两种检测方法所用的时间对比。
表2本发明的方法和冷冻脱色技术所用时间对比
实施例2：
在郁南县一砂糖橘园，于2014年5月28日，用黑色袋子套住待检测柑橘叶片，封口，暗处理24小时，得到暗处理的待检测柑橘叶片。将待检测柑橘叶片用玻璃砂纸轻轻进行打磨处理，磨掉叶片表面的蜡质层，将此叶片放入叶绿素脱色液(丙酮)中浸泡脱色2小时，叶片变为白色，倒掉叶绿素脱色液，在脱色后的叶片上滴加淀粉显色液(碘酒)，观察叶片的颜色变化，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。1分钟后发现颜色变化，如图2所示，由此可知，该待测柑橘叶片为柑橘黄龙病感染叶。其与PCR检测方法的检测结果相同。
实施例3：
在郁南县一砂糖橘园，于2014年5月28日午3点，用黑色袋子套住待检测柑橘叶片，封口，暗处理结束采样于29日上午11点30分，采样数共50棵树。待检测柑橘叶片(同一片分切)分成两种处理方式。
1、将待检测柑橘叶片用玻璃砂纸轻轻进行打磨处理，磨掉叶片表面的蜡质层，将此叶片放入叶绿素脱色液(丙酮)中浸泡脱色2小时，叶片变为白色，倒掉叶绿素脱色液，在脱色后的叶片上滴加淀粉显色液(碘酒)，观察叶片的颜色变化，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。1分钟后发现颜色变化。
2、用常规的PCR检测方法检测。
结果如表3所示，PCR检测方法利用柑桔黄龙病亚洲种核糖体蛋白基因rplj/rplL(NCBI登录号：M94319)的特异靶序列(目的片段382bp)设计引物为：
Larpof:5’-CAAGGAAAGAGCGTAGAA-3’；
Larpor:5’-CCTCAAGATCGGGTAAAG-3’。
表3.本发明的方法与常规PCR检测方法结果的相关性
由此可见，本发明的柑橘黄龙病快速检测方法的检测结果仍与PCR检测方法具有高度的一致性。

Claims (5)

1.一种柑橘黄龙病快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
a、脱色处理：将经过暗处理的待检测柑橘叶片进行打磨处理，磨掉叶片表面的蜡质层，将此叶片放入叶绿素脱色液中浸泡直至叶片变为白色；
b、显色检测：在脱色后的叶片上滴加淀粉显色液，然后观察叶片的颜色变化，如果叶片变蓝，说明待检测的柑橘叶片为黄龙病感染叶，如果叶片不变色，则为正常叶。
2.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病快速检测方法，其特征在于，所述的将经过暗处理的待检测柑橘叶片进行打磨处理是用砂纸轻轻打磨叶片，磨掉叶片表面的蜡质层。
3.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病快速检测方法，其特征在于，所述的暗处理的待检测柑橘叶片是用黑色袋子套住待检测柑橘叶片，封口，暗处理12-24小时，得到暗处理的待检测柑橘叶片。
4.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病快速检测方法，其特征在于，所述的叶绿素脱色液为丙酮、乙醇、苯、甲苯或二甲苯中的一种或几种的混合物。
5.根据权利要求1所述的柑橘黄龙病快速检测方法，其特征在于，所述的淀粉显色液为碘酒、碘化钾溶液或聚乙烯吡咯烷酮碘。
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