CN103276094B - 多重pcr检测方法及试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了多重PCR检测方法及试剂盒。本发明所提供的多重PCR检测方法，包括以下步骤：（1）根据靶标基因序列，分别设计上游引物、下游引物、共同引物和探针序列；（2）配置多重PCR反应体系；（3）进行PCR扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析。本发明在PCR扩增过程中针对每一扩增子引入特异性外源核酸序列标签，在扩增过程中与之后采用完全互补与有限错配的单标记荧光寡聚合核苷酸探针荧光杂交与熔解分析实现多重检测。本发明所提供的多重PCR检测方法，有效地提高了实时荧光定量PCR的检测重数、检测通量，并缩短检测时间。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测领域，尤其涉及多重PCR检测方法及试剂盒。
背景技术
聚合酶链式反应（PCR）已被广泛应用于医学、遗传学、微生物学乃至整个生命科学中。多重PCR是在常规PCR基础上发展的一种新型扩增技术，即可在一个反应体系中加入两对或以上引物，同时扩增多个核酸片断。多重PCR在微生物、遗传病、肿瘤、药物基因组学等学科中有着重要的应用。
当前多重PCR检测技术主要利用下列技术方法：1）多重扩增产生长度不同的扩增片段，PCR后利用琼脂糖凝胶电泳或毛细管聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨出长度不同片段；2）多重扩增产生核酸序列不同的片段，利用不同波长荧光素标记的探针在实时荧光PCR仪的相应通道检测；3）多重扩增产物与携带不同PCR产物互补链的颜色标记微珠杂交检测。以上所诉方法各有优缺点。
利用凝胶电泳需要在PCR后打开PCR反应管，凝胶电泳，染色照相或读取电泳图等步骤。其最大缺点是扩增后的开管操作，易造成实验室PCR产物污染。且操作繁杂，劳动强度大，实验周期长，通量小。Luminex微珠法成本明显高于其它两种方法，且所需设备昂贵，普及程度较低。荧光探针法，如Taqman、Fret杂交探针等主要局限性于实时荧光PCR仪的通道数量有限，通常不超过6通道，因此限制了最高PCR扩增目标数量。
多重连接探针扩增技术（MLPA）法是一种多重核酸检测的方法。它采用变化标签序列长度的方法，其检测依赖于分辨PCR扩增子的长度。MLPA需在PCR反应后打开反应管，之后利用毛细管电泳分辨扩增产物。具有设备昂贵，操作复杂，易污染等缺点。不适于在临床分子检测实验室广泛推广。
临床实验室、疾病控制中心、进出口检疫等部门迫切需要一种多重PCR检测方法同时高效率检测多种被检物，如肿瘤突变基因、血源性微生物病原体、传染性呼吸道微生物病原体、个性化药物基因组学等。它需具有设备要求低、操作简单、检测周期短、不造成实验室污染等特点。
发明内容
为了弥补以上领域的不足，本发明提供了一种多重PCR检测方法及试剂盒。
本发明所提供的多重PCR检测方法，包括以下步骤：
（1）根据靶标基因序列，分别设计上游引物、下游引物、共同引物和探针序列：
所述上游引物与靶标基因序列的上游序列相同；
所述下游引物由3'端特异结合区、外源标签序列区和下游共同引物区三部分组成；所述3'端特异结合区与靶标基因序列特异杂交；所述外源标签序列区与所述探针序列完全互补或含有限数目核苷酸错配；所述下游共同引物区与所述共同引物序列相同；
所述共同引物的3'端标记荧光素；
所述探针序列与目的基因序列无显著同源性，且3'端标记荧光素；
（2）配置多重PCR反应体系：所述多重PCR反应体系包括：Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、探针、上游引物、下游引物和共同引物，其中，上游引物与下游引物浓度相同，共同引物浓度为上游引物或下游引物浓度的10-20倍；
（3）进行PCR扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析；当探针与外源标签序列完全匹配时，Tm值最高；Tm值随着探针与外源标签序列的错配数目增多而降低。
所述外源标签序列对应于特异的目的基因序列。
所述外源标签序列区与所述探针序列含有限数目核苷酸错配为所述外源标签序列区与所述探针序列有1-3个碱基错配。
所述共同引物的3'端标记荧光素为荧光素供者，所述探针的3'端标记荧光素为荧光素受者，所述荧光素供者与所述荧光素受者在相距小于3个碱基距离时发生能量共振转移。
所述探针序列的长度为15-35个核苷酸碱基，Tm值为55℃-75℃。
所述上游引物的长度为15-30个核苷酸碱基；所述下游引物长度为45-80个核苷酸碱基。
本发明还提供了一种用于检测人肌动蛋白的多重PCR试剂盒。
本发明所提供的多重PCR试剂盒，包含以下序列：
上游引物序列BA1FP：序列表中序列1；
下游引物序列BA1RP：序列表中序列2；
上游引物序列BA2FP：序列表中序列3；
下游引物序列BA2RP：序列表中序列4；
上游引物序列BA3FP：序列表中序列5；
下游引物序列BA3RP：序列表中序列6；
通用引物序列：序列表中序列7；
探针序列：序列表中序列8。
本发明所提供的多重PCR检测方法采用荧光标记寡聚核苷酸探针(Probe)，长度为15-35核苷酸碱基。不同于常用探针取自靶标基因序列，本探针序列为用生物信息学方法产生的人工序列，其目的在于探针序列与genbank已知生物核酸序列无显著同源性，从而避免交叉反应，其Tm值设计在55-75℃间。探针标记单个荧光素，位于3'端。
PCR扩增由上下游引物延伸产生。其一侧引物(称上游引物FP)，长为15-30碱基，与被扩增靶标区间上游序列相同，上游引物延伸产生正链。PCR扩增子另一端的引物为复合结构(称下游引物RP)，其长为45-80碱基，下游引物延伸产生负链。RP由三部分组成：3'端特异结合区、外源标签序列区和下游共同引物区；3'端为特异结合区，可与靶标序列特异结合杂交，它与上游引物共同决定扩增产物的特异性；下游引物的中间部分为与探针序列完全互补或含有限数目核苷酸错配的外源标签序列；每一个被检靶标携带一个独特标签序列。当探针与标签序列完全互补时，标签与探针杂交的Tm值为最高。而当探针与标签序列有一个或以上的核苷酸错配时，标签序列互补链与探针杂交的Tm值均低于完全匹配时的Tm值。下游引物的5'端为下游共同引物区。
PCR扩增还包含共同引物（RCP），其序列与下游引物5'端的下游共同引物区序列相同。RCP3'端标记荧光素供者，在探针的3'端标记荧光素受者，探针与RCP荧光素光谱重叠，但二者在相近足够近的距离时能量共振转移传。因此，荧光素标记的位置与类别要求在下述情况下两个荧光素距离小于3个核苷酸。
在PCR扩增体系中，加入Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液，Mg2+，dNTP，荧光标记探针，等量的FP与RP，过量的RCP。采用一般的PCR扩增程序，扩增时观测扩增曲线并在扩增后进行熔解曲线分析。RCP的浓度为FP或RP浓度的10-20倍。由于RCP总量为FP/RP的10-20倍，扩增将产生过量负链单链DNA。由于该负链含标签序列，探针可与其在适当温度下杂交，如在扩增周期的复性阶段。杂交后探针荧光素与RCP荧光素相邻，激发供体荧光染料，通过能量共振转移传递给探针的荧光素，可检测探针的荧光素的荧光发射波长的荧光强度。这样特异性的基因扩增可被实时检测。RP同样含有标签序列，但其核苷酸没有被标记，这样即使探针与FP杂交，也不会有能量共振转移传发生。
为区分携带不同标签序列的靶标扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析。同一探针可与含有限数目错配的标签序列杂交，但其Tm值不同。针对同一个荧光探针核苷酸序列，其错配率为小于1-3个核苷酸碱基。通过熔解曲线法分析，可观察到Tm不同的熔解峰。探针与标签完全匹配的熔点最高为Tm；单碱基错配Tm降低，而双碱基错配Tm更低。每一个峰对应一个独特标签序列。从而达到检测特异靶标的目的。
每一探针占用一个PCR仪荧光通道，可同时定性检测1-3个被检物，或用标准曲线法检测1个被检物。每一通道可容纳一个荧光标记探针。这样利用5个荧光通道，可在同一反应管中同时检测最多15被检物，即15重反应。
本发明在PCR扩增过程中针对每一扩增子引入特异性外源核酸序列标签，在扩增过程中或之后采用完全互补与有限错配的单标记荧光寡聚合核苷酸探针荧光杂交与熔解分析实现多重检测。外源序列作为探针具有设计容易,不受靶标序列的任何限制，容易控制Tm与交叉反应等优点。另外，它可作通用探针使用。本发明所提供的多重PCR检测方法，有效地提高了实时荧光定量PCR的检测重数、检测通量、并缩短检测时间。
附图说明
图1为本发明原理示意图；上部显示各引物与扩增子间的关系；下部显示扩增后的负链与探针复性杂交。
图2为实施实例1中所采用的寡聚核苷酸序列。探针序列为正链，标签序列1-3为互补序列。标签1与探针序列完全互补，标签2含一T-〉A变异，标签3含T-〉A与G-〉A的两个变异。
图3为荧光标记探针与标签靶标寡聚核苷酸熔解曲线分析结果图；三条曲线分别为探针与标签1（｜)、探针与标签2(×)、探针与标签3(*)；Tm值为曲线最高峰对应的温度。三个杂交体Tm值分别为：71.4℃、68.3℃、65.1℃。
图4为实施例2中PCR产物dF/dT峰值图；在71.4℃、68.3℃、65.1℃处观测到熔解峰；每一个有特异Tm值得熔解峰代表一个特定的被检物。
图5为荧光强度相对扩增周期图；相邻稀释反应间的Ct值约相差3.3。
图6拟合曲线；对图5中的每一条扩增曲线确定Ct值，将Ct值与Log模板浓度用直线函数拟合；直线函数的Y轴截距为45.9，斜率为-3.9。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细描述。
实施例1、荧光标记寡聚合核苷酸探针与标签核酸杂交，通过异链荧光共振能量转移显示Tm差异
合成寡聚核苷酸探针及三个互补靶标序列，序列名称分别为探针序列（序列表中序列9）、标签序列1（序列表中序列10）、标签序列2（序列表中序列11）和标签序列3（序列表中序列12）。图2显示了探针与靶标的逆向互补序列比对。探针的3'端标记Cy3荧光作为荧光受体，靶标序列的3'端标记FAM荧光素作为荧光供体。在三个PCR反应管内分别加入探针与标签1寡聚核苷酸、探针与标签2寡聚核苷酸、探针与标签3寡聚核苷酸，之后加入10×PCR缓冲液。按20uL反应中含10×PCR缓冲液2uL，探针与靶标寡聚合核苷酸分别为200nM和400nM，加水至20uL。反应条件：95℃变性2min，50℃退火1min，以0.05℃/S速率升温的同时激发465nM波长，在570nM通道连续检测荧光强度，对所得荧光强度/温度曲线取负导数。图3显示实验结果。标签序列1与探针序列完全匹配，通过熔解峰测得的Tm值为71.4℃，含一个核苷酸错配的标签序列2的Tm值为68.3℃，而含两个核苷酸错配的标签序列3的Tm值为65.1℃。利用邻近算法（Nearest Neighbor)方法计算探针与标签序列1、2、3的Tm值分别为71.0℃、67.8℃、64.5℃。此试验证实通过有目的的在与探针结合的靶标序列中设计有限数量的核苷酸错配，其杂交体的Tm值可获得与计算吻合的实验值。
荧光能量的供体与受体分别位于互补的正负链上，该系统中FAM与Cy3位于互补的核苷酸碱基上。实验证明位于互补链上的荧光供体与受体本通过FRET原理发生能量共振转移。
实施例2、多重实时荧光PCR检测
在人肌动蛋白（β-actin）核酸序列上设计三个相互不重叠PCR扩增子。人工合成 β-actin扩增子1（序列表中序列13）、β-actin扩增子2（序列表中序列14）、β-actin扩增子3（序列表中序列15），克隆至pMD18载体（购自中美泰和生物技术(北京)有限公司），测序，称为pMD18BA1、pMD18BA2、pMD18BA3。制备质粒，使用NdeI酶切线性化，琼脂糖凝胶电泳检测酶切完成状况。利用紫外分光光度计测定DNA浓度，根据质粒分子量计算拷贝浓度。用PCR级高纯水梯度稀释为5×106至5×10-1拷贝/uL做为基因扩增底物用。三个扩增子上下游引物序列分别为：
β-actin扩增子1：上游引物序列BA1FP，其核苷酸序列如序列表中序列1所示；
β-actin扩增子1：下游引物序列BA1RP，其核苷酸序列如序列表中序列2所示；
β-actin扩增子2：上游引物序列BA2FP，其核苷酸序列如序列表中序列3所示；
β-actin扩增子2：下游引物序列BA2RP，其核苷酸序列如序列表中序列4所示；
β-actin扩增子3：上游引物序列BA3FP，其核苷酸序列如序列表中序列5所示；
β-actin扩增子3：下游引物序列BA3RP，其核苷酸序列如序列表中序列6所示；
下游通用因引物：5'-CGCAACCTACGAACCAGCT-FAM-A-3'（FAM荧光素标记于3’端T核苷酸碱基）（序列表中序列7）；
探针序列：5'-TACAGGCCGACGTTGGCAGGTGCT-Cy3-3'（序列表中序列8）。
PCR反应体系中含10×PCR缓冲液2uL，每一组上下游引物各为50nM，下游通用引物1.2mM,探针400nM，线性化质粒2uL。所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15秒，60℃退火20秒，72℃延伸15秒，共45循环，之后72℃延伸2min；95℃变性30秒,以0.05℃/S速率升温的同时激发465nM波长，在570nM波长检测荧光强度，对所得荧光强度相对温度曲线取负导数。图4为PCR产物dF/dT峰值图。图4的结果显示：在71.4℃、68.3℃、65.1℃处观测到熔解峰；每一个有特异Tm值得熔解峰代表一个特定的被检物。在三种模板同时存在于反应中，三种模板同时扩增，扩增后三种PCR产物被与探针杂交由于Tm值不同而产生可分辨的熔解曲线峰，每一个峰对应一个标签序列，即一个被检靶标序列。此实验结果说明一个探针可同时进行3重检测。
实施例3、探针用于被检物精确定量呈良好线性关系
β-actin扩增子1核酸序列质粒DNA10倍连续稀释，加入到PCR扩增反应中。DNA最终量为每反应107、106、105、104、103、102、101、100拷贝。β-actin扩增子1引物进行PCR扩增，PCR后测定每一反应的Ct值。相邻稀释反应间的Ct值约相差3.3。反应体系中含10×PCR缓冲液2uL，上游引物序列BA1FP（序列表中序列1）和下游引物序列BA1RP（序列表中序列2）各为50nM，通用引物（序列表中序列7）1.2mM，探针（序列表中序列8）200nM，NdeI限制性内切酶线性化质粒pMD18BA1后，作为底物按107、106、105、104、103、102、101每反应管加入PCR反应体系。所述实时荧光定量PCR检测的扩增程序为：95℃预变性2min；95℃变性15秒，60℃退火20秒，72℃延伸15秒，共45循环，之后72℃延伸2min。在扩增的同时激发465nM波长，在570nM波长检测荧光强度。图5为荧光强度相对扩增周期图。取得每一PCR反应的Ct值（Crossing Point）。PCR反应的Ct值对质粒浓度对数进行拟合，图6为拟合曲线，Y轴截距为45.9，斜率为-3.9，在1到107范围显示出优良的线性动态范围。
Claims (5)
1.一种多重PCR检测方法，包括以下步骤：
(1)根据靶标基因序列，分别设计每种所述靶标基因的上游引物、下游引物、共同引物和探针序列：
所述上游引物与靶标基因序列的上游序列相同；
所述下游引物由3'端特异结合区、外源标签序列区和下游共同引物区三部分组成；所述3'端特异结合区与靶标基因序列特异杂交；所述外源标签序列区与所述探针序列完全互补或含有限数目核苷酸错配；每种所述靶标基因的下游引物中的下游共同引物区序列相同，并与所述共同引物序列相同；
所述共同引物的3'端标记荧光素；
所述探针序列与目的基因序列无显著同源性，且3'端标记荧光素；
(2)配置多重PCR反应体系，所述多重PCR反应体系包括：Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液、Mg2+、dNTP、每种所述靶标基因的探针、每种所述靶标基因的上游引物和下游引物和所述共同引物，其中，每种所述靶标基因的上游引物与下游引物浓度相同，所述共同引物浓度为每种所述靶标基因的上游引物或下游引物浓度的10-20倍；
(3)进行PCR扩增，在PCR扩增周期结束后，进行熔解曲线分析；当探针与外源标签序列完全匹配时，Tm值最高；Tm值随着探针与外源标签序列的错配数目增多而降低；
所述外源标签序列对应于特异的靶标基因序列；
所述共同引物的3'端标记荧光素为荧光素供者，所述探针的3'端标记荧光素为荧光素受者，所述荧光素供者与所述荧光素受者在相距小于3个碱基距离时发生能量共振转移。
2.根据权利要求1所述的多重PCR检测方法，其特征在于：所述外源标签序列区与所述探针序列含有限数目核苷酸错配为所述外源标签序列区与所述探针序列有1-3个碱基错配。
3.根据权利要求1或2所述的多重PCR检测方法，其特征在于：所述探针序列的长度为15-35个核苷酸碱基，Tm值为55℃-75℃。
4.根据权利要求3所述的多重PCR检测方法，其特征在于：所述上游引物的长度为15-30个核苷酸碱基；所述下游引物长度为45-80个核苷酸碱基。
5.一种用于检测人肌动蛋白的多重PCR试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含以下序列：
上游引物序列BA1FP：序列表中序列1；
下游引物序列BA1RP：序列表中序列2；
上游引物序列BA2FP：序列表中序列3；
下游引物序列BA2RP：序列表中序列4；
上游引物序列BA3FP：序列表中序列5；
下游引物序列BA3RP：序列表中序列6；
通用引物序列：序列表中序列7；
探针序列：序列表中序列8。
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