CN103275206A - 孕马血清促性腺激素的提纯方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种孕马血清促性腺激素的提纯方法，它包括偏磷酸沉淀、乙醇清洗、辛酸沉淀、盐析沉淀、透析除盐、低浓度乙醇沉淀、高浓度乙醇沉淀和透析清洗八个工艺步骤。它增加了辛酸沉淀步骤将偏磷酸难沉淀的白蛋白和其它大分子杂蛋白沉淀出去，盐析沉淀步骤中增加了硫酸铵加入浓度，避免了白蛋白被析出的问题，同时由于增加了硫酸铵加入浓度，提高了孕马血清促性腺激素活性物质析出比例，尤其能够提高促卵泡素(FSH)活性物质的析出比例，在提高了孕马血清促性腺激素纯度的同时，还提高了回收率。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体的说是涉及一种孕马血清促性腺激素的提纯方法。
背景技术
孕马血清促性腺激素，即PMSG(Pregnant Mare Serum Gonadotropin)。也称为马绒毛膜促性腺激素。它是在怀孕母马血清中发现的一种激素。它具有促卵泡素(FSH)及黄体生成素(LH)的双重作用，用它可以防治家畜不孕症，诱发超数排卵，控制同期发情和促进多胎多产等。
孕马血清中大量存在的无促性腺活性的大分子蛋白质具有抗原性，注射到非马属家畜体内容易引起过敏性休克，严重时死亡，尤其是反复应用更容易发生。正是由于过敏反应，流行病学等方面的原因，使孕马血清的应用受到了限制，所以必须加以纯化。
目前，孕马血清促性腺激素的提纯的方法主要有偏磷酸分离-盐析-乙醇沉淀-透析法、偏磷酸分离-离子交换法和硫酸铵盐析-透析法。其中，偏磷酸分离-盐析-乙醇沉淀-透析法是应用的最多的一种方法，它工艺技术简单、设备要求不高、成产成本低廉、适合批量生产，但是这种方法主要不足为收率低，常常不到30％。
分析原因，一方面是偏磷酸使蛋白溶液发生凝聚，纤维蛋白质及大分子蛋白质凝聚沉淀的过程中也带走了一些促性腺活性物质；另一方面硫酸铵盐析步骤中，在1000毫升溶液中硫酸铵的加入量不能高于450克，高于这个浓度就会使一些白蛋白沉淀出来，但是这个浓度又不能足以使促性腺活性物质全部沉 淀出来，尤其是促卵泡素(FSH)不能全部沉淀出来。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种工艺技术简单、设备要求不高、成产成本低廉、适合批量生产和回收率高的孕马血清促性腺激素的提纯方法。
本发明的目的是这样实现的：一种孕马血清促性腺激素的提纯方法，包括以下步骤：
(1)偏磷酸沉淀：在孕马血清中加入偏磷酸，过滤收集沉淀物和上清液；
(2)乙醇清洗：在步骤(1)收集的沉淀物中加入与沉淀物等重量的无水乙醇，搅拌、过滤收集乙醇清洗液，弃沉淀；
(3)辛酸沉淀：在步骤(1)收集的上清液中加入辛酸，搅拌、离心、过滤收集上清液，弃沉淀；
(4)盐析沉淀：将步骤(2)收集的乙醇清洗液和将步骤(3)收集的上清液合并，在20～22℃的温度下，按照1000毫升液体加600～700克硫酸铵的比例加入硫酸铵，充分搅拌溶解，过滤收集沉淀，弃上清液；
(5)透析除盐：将步骤(4)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析除去硫酸铵，收集透析袋内的保留液；
(6)低浓度乙醇沉淀：在步骤(5)收集的保留液中加入乙醇浓度至42～46％，搅拌、过滤收集上清液，弃沉淀；
(7)高浓度乙醇沉淀：在步骤(6)收集的上清液中补充加入乙醇浓度至74～76％，搅拌、离心、过滤收集沉淀，弃上清液；
(8)透析清洗：将步骤(7)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析清洗， 收集透析袋内的保留液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素(PMSG)液体制品。
作为本发明更具体的方案如下：
一种孕马血清促性腺激素的提纯方法，包括以下步骤：
(1)偏磷酸沉淀：在孕马血清中边搅拌边缓慢加入0.4～0.5mol/L偏磷酸HPO3，至溶液pH值为3.1～3.3时，停止加酸和搅拌，滤收集沉淀物和上清液；
(2)乙醇清洗：在步骤(1)收集的沉淀物中加入与沉淀物等重量的无水乙醇，搅拌过滤，收集乙醇清洗液，弃沉淀；
(3)辛酸沉淀：在步骤(1)收集的上清液中滴加2mol/L的氢氧化钠调节pH值至4.4～4.6；然后按照1000毫升上清液加20～30毫升辛酸的比例，边搅拌边缓慢加入辛酸，产生沉淀之后，离心、过滤收集上清液，弃沉淀；
(4)盐析沉淀：将步骤(2)收集的乙醇清洗液和将步骤(3)收集的上清液合并，在20～22℃的温度下，按照1000毫升液体加600～700克硫酸铵的比例加入硫酸铵，充分搅拌溶解，过滤收集沉淀，弃上清液；
(5)透析除盐：将步骤(4)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析除去硫酸铵，使得透析袋内保留液中的铵根离子小于0.1％，收集透析袋内的保留液；
(6)低浓度乙醇沉淀：在步骤(5)收集的保留液中加入-20～-80℃的预冷乙醇浓度至42～46％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为5.0～5.4，过滤收集上清液，弃沉淀；
(7)高浓度乙醇沉淀：在步骤(6)收集的上清液中补充加入-20～-80℃的预冷乙醇浓度至72～80％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为4.0～4.4， 离心收集沉淀，弃上清液；
(8)透析清洗：将步骤(7)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析清洗22-48小时，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为6.8～7.2，收集透析袋内的保留液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素(PMSG)液体制品。
本发明与现有技术相比具有以下积极效果：
它增加了辛酸沉淀步骤将偏磷酸难沉淀的白蛋白和其它大分子杂蛋白沉淀出去。盐析沉淀步骤中增加了硫酸铵加入浓度，避免了白蛋白被析出的问题，高浓度的硫酸铵提高了孕马血清促性腺激素活性物质析出比例，尤其能够提高促卵泡素(FSH)活性物质的析出比例。在偏磷酸使蛋白溶液发生凝聚，纤维蛋白质及大分子蛋白质凝聚沉淀的过程中也带走了一些促性腺活性物质，增加了乙醇清洗步骤，可以将偏磷酸沉淀的蛋白质凝聚物中的促性腺活性物质洗脱下来，进入盐析沉淀步骤，提高了孕马血清促性腺激素回收率。通过上述三个工艺环节的改进，孕马血清促性腺激素纯度达到纯度为200～3001U/mg，孕马血清促性腺激素回收率达40～50％。
附图说明
图1是本发明孕马血清促性腺激素的提纯方法工艺流程图
具体实施方式
下面结合图1所示的工艺流程图，通过三个实施例对本发明做进一步的详细说明。
实施例1：一种孕马血清促性腺激素的提纯方法，包括以下步骤：
(1)偏磷酸沉淀：在孕马血清中边搅拌边缓慢加入0.40mol/L偏磷酸HPO3，至溶液pH值为3.1时，停止加酸和搅拌，滤收集沉淀物和上清液；
(2)乙醇清洗：在步骤(1)收集的沉淀物中加入与沉淀物等重量的无水乙醇，搅拌过滤，收集乙醇清洗液，弃沉淀；
(3)辛酸沉淀：在步骤(1)收集的上清液中滴加2mol/L的氢氧化钠调节pH值至4.4；然后按照1000毫升上清液加20毫升辛酸的比例，边搅拌边缓慢加入辛酸，产生沉淀之后，离心、过滤收集上清液，弃沉淀；
(4)盐析沉淀：将步骤(2)收集的乙醇清洗液和将步骤(3)收集的上清液合并，在20℃的温度下，按照1000毫升液体加600克硫酸铵的比例加入硫酸铵，充分搅拌溶解，过滤收集沉淀，弃上清液；
(5)透析除盐：将步骤(4)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析除去硫酸铵，使得透析袋内保留液中的铵根离子小于0.1％，收集透析袋内的保留液；
(6)低浓度乙醇沉淀：在步骤(5)收集的保留液中加入-50℃的预冷乙醇浓度至43％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为5.0，过滤收集上清液，弃沉淀；
(7)高浓度乙醇沉淀：在步骤(6)收集的上清液中补充加入-50℃的预冷乙醇浓度至72％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为4.0，离心收集沉淀，弃上清液；
(8)透析清洗：将步骤(7)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析清洗28小时，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为6.8，收集透析袋内的保留液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素(PMSG)液体制品。
实施例2：一种孕马血清促性腺激素的提纯方法，包括以下步骤：
(1)偏磷酸沉淀：在孕马血清中边搅拌边缓慢加入0.5mol/L偏磷酸HPO3， 至溶液pH值为3.2时，停止加酸和搅拌，滤收集沉淀物和上清液；
(2)乙醇清洗：在步骤(1)收集的沉淀物中加入与沉淀物等重量的无水乙醇，搅拌过滤，收集乙醇清洗液，弃沉淀；
(3)辛酸沉淀：在步骤(1)收集的上清液中滴加2mol/L的氢氧化钠调节pH值至4.5；然后按照1000毫升上清液加25毫升辛酸的比例，边搅拌边缓慢加入辛酸，产生沉淀之后，离心、过滤收集上清液，弃沉淀；
(4)盐析沉淀：将步骤(2)收集的乙醇清洗液和将步骤(3)收集的上清液合并，在21℃的温度下，按照1000毫升液体加650克硫酸铵的比例加入硫酸铵，充分搅拌溶解，过滤收集沉淀，弃上清液；
(5)透析除盐：将步骤(4)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析除去硫酸铵，使得透析袋内保留液中的铵根离子小于0.1％，收集透析袋内的保留液；
(6)低浓度乙醇沉淀：在步骤(5)收集的保留液中加入-60℃的预冷乙醇浓度至45％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为5.2，过滤收集上清液，弃沉淀；
(7)高浓度乙醇沉淀：在步骤(6)收集的上清液中补充加入-60℃的预冷乙醇浓度至75％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为4.2，离心收集沉淀，弃上清液；
(8)透析清洗：将步骤(7)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析清洗36小时，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为7.0，收集透析袋内的保留液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素(PMSG)液体制品。
实施例3：一种孕马血清促性腺激素的提纯方法，包括以下步骤：
(1)偏磷酸沉淀：在孕马血清中边搅拌边缓慢加入0.45mol/L偏磷酸HPO3，至溶液pH值为3.3时，停止加酸和搅拌，滤收集沉淀物和上清液；
(2)乙醇清洗：在步骤(1)收集的沉淀物中加入与沉淀物等重量的无水乙醇，搅拌过滤，收集乙醇清洗液，弃沉淀；
(3)辛酸沉淀：在步骤(1)收集的上清液中滴加2mol/L的氢氧化钠调节pH值至4.6；然后按照1000毫升上清液加30毫升辛酸的比例，边搅拌边缓慢加入辛酸，产生沉淀之后，离心、过滤收集上清液，弃沉淀；
(4)盐析沉淀：将步骤(2)收集的乙醇清洗液和将步骤(3)收集的上清液合并，在22℃的温度下，按照1000毫升液体加700克硫酸铵的比例加入硫酸铵，充分搅拌溶解，过滤收集沉淀，弃上清液；
(5)透析除盐：将步骤(4)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析除去硫酸铵，使得透析袋内保留液中的铵根离子小于0.1％，收集透析袋内的保留液；
(6)低浓度乙醇沉淀：在步骤(5)收集的保留液中加入-70℃的预冷乙醇浓度至44％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为5.4，过滤收集上清液，弃沉淀；
(7)高浓度乙醇沉淀：在步骤(6)收集的上清液中补充加入-70℃的预冷乙醇浓度至78％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为4.4，离心收集沉淀，弃上清液；
(8)透析清洗：将步骤(7)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析清洗45小时，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为7.2，收集透析袋内的保留液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素(PMSG)液体制品。
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (2)
1.一种孕马血清促性腺激素的提纯方法，包括以下步骤：
(1)偏磷酸沉淀：在孕马血清中加入偏磷酸，过滤收集沉淀物和上清液；
(2)乙醇清洗：在步骤(1)收集的沉淀物中加入与沉淀物等重量的无水乙醇，搅拌、过滤收集乙醇清洗液，弃沉淀；
(3)辛酸沉淀：在步骤(1)收集的上清液中加入辛酸，搅拌、离心、过滤收集上清液，弃沉淀；
(4)盐析沉淀：将步骤(2)收集的乙醇清洗液和将步骤(3)收集的上清液合并，在20～22℃的温度下，按照1000毫升液体加600～700克硫酸铵的比例加入硫酸铵，充分搅拌溶解，过滤收集沉淀，弃上清液；
(5)透析除盐：将步骤(4)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析除去硫酸铵，收集透析袋内的保留液；
(6)低浓度乙醇沉淀：在步骤(5)收集的保留液中加入乙醇浓度至42～46％，搅拌、过滤收集上清液，弃沉淀；
(7)高浓度乙醇沉淀：在步骤(6)收集的上清液中补充加入乙醇浓度至74～76％，搅拌、离心、过滤收集沉淀，弃上清液；
(8)透析清洗：将步骤(7)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析清洗，收集透析袋内的保留液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素(PMSG)液体制品。
2.按照权利要求1所述的孕马血清促性腺激素的提纯方法，其特征在于：
(1)偏磷酸沉淀：在孕马血清中边搅拌边缓慢加入0.4～0.5mol/L偏磷酸HPO3，至溶液pH值为3.1～3.3时，停止加酸和搅拌，滤收集沉淀物和上清液；
(2)乙醇清洗：在步骤(1)收集的沉淀物中加入与沉淀物等重量的无水乙醇，搅拌过滤，收集乙醇清洗液，弃沉淀；
(3)辛酸沉淀：在步骤(1)收集的上清液中滴加2mol/L的氢氧化钠调节pH值至4.4～4.6；然后按照1000毫升上清液加20～30毫升辛酸的比例，边搅拌边缓慢加入辛酸，产生沉淀之后，离心、过滤收集上清液，弃沉淀；
(4)盐析沉淀：将步骤(2)收集的乙醇清洗液和将步骤(3)收集的上清液合并，在20～22℃的温度下，按照1000毫升液体加600～700克硫酸铵的比例加入硫酸铵，充分搅拌溶解，过滤收集沉淀，弃上清液；
(5)透析除盐：将步骤(4)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析除去硫酸铵，使得透析袋内保留液中的铵根离子小于0.1％，收集透析袋内的保留液；
(6)低浓度乙醇沉淀：在步骤(5)收集的保留液中加入-20～-80℃的预冷乙醇浓度至42～46％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为5.0～5.4，过滤收集上清液，弃沉淀；
(7)高浓度乙醇沉淀：在步骤(6)收集的上清液中补充加入-20～-80℃的预冷乙醇浓度至72～80％，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为4.0～4.4，离心收集沉淀，弃上清液；
(8)透析清洗：将步骤(7)收集的沉淀物包于透析袋内，流水透析清洗22-48小时，用2mol/L氢氧化钠调解pH值为6.8～7.2，收集透析袋内的保留液，得到高纯度的孕马血清促性腺激素(PMSG)液体制品。
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|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |