CN103266127A

CN103266127A - 一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法

Info

Publication number: CN103266127A
Application number: CN201310160840XA
Authority: CN
Inventors: 薛正莲; 苏燕南; 王洲; 马琦亚; 赵世光; 杨超英
Original assignee: Anhui Polytechnic University
Current assignee: Jiangsu haifengda Biotechnology Co.,Ltd.
Priority date: 2013-05-03
Filing date: 2013-05-03
Publication date: 2013-08-28
Anticipated expiration: 2033-05-03
Also published as: CN103266127B

Abstract

本发明提供了一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；其中，制备感受态细胞包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌在LB培养基中活化，将活化后的枯草芽孢杆菌接种于SLB培养基中，振荡培养，培养至OD_600nm=0.7；SLB培养基的制备方法为：将10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，0.5mol山梨醇和蒸馏水充分混匀，并用蒸馏水定容至1L；电击转化包括如下步骤：将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，进行电击，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。应用本发明的方法，转化效率可达8×10⁶cfu/μg，大大提高了枯草芽孢杆菌的转化效率。

Description

一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法

技术领域

本发明涉及细菌转化领域，具体的涉及一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法。

背景技术

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一种重要的工业微生物，其遗传学和生理学已得到深入研究，人们对其遗传背景和生理特性的了解仅次于E.coli。枯草芽孢杆菌能直接将目的基因产物分泌到培养基中，且表达产物可溶、可正确折叠，并具有生物活性，同时表达产物与胞内蛋白分离，无需破碎细胞，利于分离纯化，是极具潜在应用前景的基因表达宿主。

但是在枯草芽孢杆菌工程菌构建过程中，发现能自发形成感受态的菌株极少，而且感受态持续时间短暂，分子克隆效率低，限制外源蛋白在枯草芽孢杆菌中高效表达。目前外源基因导入宿主菌的主要手段是通过感受态法，原生质体转化法和电击转化法，三种方法中电击转化法被认为是转化效率最高的一种。然而电击转化过程中需要平衡转化效率和死亡率的关系，随着电场强度的增加，外源DNA进入宿主细胞的可能性越大，但是死亡率也会相应增加，目前芽孢杆菌电击转化的转化效率最高为1.4×10⁶cfu/μg，还不能满足高效率转化如：构建基因文库的要求。

发明内容

本发明提供了一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法。该方法通过调节细胞培养和电击转化过程中培养基和溶液成分来调节细胞渗透压，提高细胞在高电场强度电击后的存活率而达到提高转化效率的目的。经优化后转化效率可达8×10⁶cfu/μg，比报道技术效率高4.71倍，大大提高了枯草芽孢杆菌的转化效率，为枯草芽孢杆菌的基因工程育种、遗传学及分子生物学研究提供了方便、快速和高效的基因导入方法。

本发明提供的一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；其中，所述制备感受态细胞依次包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌在LB培养基中活化，将活化后的枯草芽孢杆菌接种于SLB培养基中，振荡培养，培养至OD_600nm=0.7；

所述SLB培养基的制备方法为：将10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，0.5mol山梨醇和蒸馏水充分混匀，并用蒸馏水定容至1L；

所述电击转化包括如下步骤：将待转化的质粒与所述感受态细胞混匀并冰浴，进行电击，得到导入所述待转化质粒的重组枯草芽孢杆菌。

所述待转化质粒与所述感受态细胞的配比为：80-120ng所述待转化质粒：6×10⁸个感受态细胞。

所述电击转化还包括在所述电击后进行如下处理的步骤：向电击杯中加入1ml ORM培养基并混匀，振荡培养；所述ORM培养基的制备方法如下：将10g蛋白胨，5g酵母粉，10gNaCl，0.7-0.9mol山梨醇和蒸馏水充分混匀并用蒸馏水定容至1L。

优选地，所述ORM培养基中山梨醇的浓度为0.8mol/L。

所述电击转化还包括在所述电击前进行如下处理的步骤：将制备的感受态细胞用SMG缓冲液吹悬；所述SMG缓冲液的制备方法如下：将0.5mol山梨醇，0.5mol甘露醇，100g甘油溶解于去离子水中，并用去离子水定容至1L。

所述电击转化中，电击的电压为18-21kv/cm。

优选地，所述电击转化中，电击的电压为21kv/cm。

所述待转化的质粒为穿梭载体pHY-P43或plaB-p43。

所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB600或WB700。

本发明提供的一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法，通过一系列改良实验条件来提高枯草芽孢杆菌的转化效率。具体实验过程如下：

电击转化枯草芽孢杆菌的方法：

（一）、制备感受态细胞：

1、取出从4℃冰箱中保藏的枯草芽孢杆菌WB600，挑取至LB液体培养基中，于37℃，200r/min过夜培养10-12小时，活化菌株；

2、用移液枪吸取1mL步骤1的过夜培养物在无菌净化台接种于40mL SLB培养基中，37℃，200r/min振荡培养至OD_600nm=1.0；

3、将步骤2的菌液冰水浴10min后，放入离心管中，4℃、5000r/min离心5min，弃上清，收集细胞；

4、在无菌净化台上用0℃预冷的40mLSG缓冲液（电击转化缓冲液）通过移液枪吹悬步骤3得到的细胞，4℃、5000r/min离心5min，弃上清，收集细胞，漂洗四次；其中SG缓冲液的制备方法为：将0.5 mol山梨醇，100g甘油与去离子水充分混合，并用去离子水定容至1L。

5、在无菌净化台上用2mL SG缓冲液吹悬步骤4得到的细胞，分装于离心管（60μl/管）中，-80℃保存。

（二）、电击转化

1、取50ng pHY-P43质粒DNA，加入到1管步骤一制备的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使pHY-P43质粒DNA和感受态细胞充分混匀，冰浴2min；

2、将完成步骤1 的体系转移至0℃预冷的电击杯（1mm）中，用电转仪进行电击（电压20kv/cm，电容25μF，电阻200Ω，电击1次，时间常数=5ms）；

3、完成步骤2后，立即向电击杯中加入1ml RM培养基（回复培养基），通过移液枪反复轻轻吹打混匀；其中，RM培养基的制备方法为：将10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，0.5 mol山梨醇和蒸馏水充分混匀，用2mol/L NaOH调pH至7.2，用蒸馏水定容至1L，121℃灭菌20min。

4、完成步骤3后，将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，37℃，200r/min振荡培养2小时。

5、将完成步骤4 的培养体系涂布于含有终浓度为50μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL四环素的LB固体培养基平板，37℃，过夜培养。

6、随机挑取生长出来的单克隆，提取质粒琼脂糖凝胶电泳，验证是否转化成功。计数菌落，计算转化率，转化率为每μg质粒DNA产生的转化子数。

经反复实验，上述实验最高转化率平均只能达到5.0×10⁵cfu/μg。

下面将在以上实验的基础上进行优化，具体优化条件如下：

一、枯草芽孢杆菌细胞生长OD值的优化

在上述实验条件的基础上，分别在OD₆₀₀为0.3，0.5，0.7，0.9，1.1，1.3和1.5时收集菌体，进行后续的感受态细胞制作和转化，如图1所示，结果表明，在OD₆₀₀值为0.7时效果最好，转化率平均为9.8×10⁵cfu/μg。

二、穿梭载体加入量的优化

在OD₆₀₀值为0.7时收集细胞用于感受态细胞的制备，在电击转化步骤时分别选择加入20ng，40ng，60ng，80ng，100ng，120ng的穿梭载体进行电转化，其余实验条件与优化前相同。如图2所示，结果表明，加入80ng以上的穿梭载体时，转化率达到平衡为2.3×10⁶cfu/μg。本着不浪费材料的原则，优选加入80ng-120ng穿梭载体。

三、电击后回复培养基的优化

本实验优化了回复培养基中山梨醇的含量。在OD₆₀₀值为0.7时收集细胞用于感受态细胞的制备，在电击转化步骤时加入80ng的穿梭载体进行电转化，电击完成后向电击杯中加入1ml回复培养基，选择的山梨醇浓度分别为0.2mol/L，0.4mol/L，0.6mol/L，0.8mol/L，1mol/L 和1.2mol/L ，其余实验条件与优化前相同。实验结果如图3所示，当山梨醇浓度为0.8mol/L时，转化率达到最大值为3.1×10⁶cfu/μg。

四、电击转化缓冲液的优化

在OD₆₀₀值为0.7时收集细胞用于感受态细胞的制备，在电击转化步骤时加入80ng的穿梭载体进行电转化，电击完成后向电击杯中加入1ml回复培养基，回复培养基中山梨醇浓度为0.8mol/L，选择不同的电击转化缓冲液：SMG、SG、MG、Gly。

SMG缓冲液：0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10%（W/V）甘油，使用去离子水配制，121℃灭菌 20min；

SG缓冲液：0.5 mol/L山梨醇，10%（W/V）甘油，使用去离子水配制，121℃灭菌 20min；

MG缓冲液：0.5 mol/L甘露醇，10%（W/V）甘油，使用去离子水配制，121℃灭菌 20min；

Gly缓冲液：10%甘油，使用去离子水配制，121℃灭菌 20min。

其余实验条件与优化前相同。

如图4所示，结果表明，使用SMG缓冲液作为电转缓冲液时转化率最高，可达4.5×10⁶cfu/μg。

五、电击时电压的优化

在OD₆₀₀值为0.7时收集细胞用于感受态细胞的制备，将制备的感受态细胞用SMG缓冲液重悬，在电击转化步骤时加入80ng的穿梭载体进行电转化，电击完成后向电击杯中加入1ml回复培养基，其中的山梨醇浓度为0.8mol/L，选择不同的电压进行电转化操作：12kv/cm、15kv/cm、18kv/cm、21kv/cm、24kv/cm。其余实验条件与优化前相同。由图5可知，在电压为21kv/cm时，转化率提高至8.0×10⁶cfu/μg。

本发明优化了细胞生长OD₆₀₀值，质粒DNA加量，回复培养基成分，电转缓冲液配方，以及电场强度对枯草芽孢杆菌转化率的影响，在调整了培养条件及渗透压后，提高电击的电压从而达到提高枯草芽孢杆菌的转化率的效果。经实验，其最高转化率为8.0×10⁶cfu/μg，比报道技术效率高4.71倍。

附图说明

图1表示枯草芽孢杆菌细胞生长OD值对转化率的影响；

图2表示穿梭载体加入量对转化率的影响；

图3表示电击后回复培养基成分对转化率的影响；

图4表示电转缓冲液对转化率的影响；

图5表示电场强度对转化率的影响；

图6为穿梭载体pHY-P43图谱；

图7为穿梭载体plaB-p43图谱；

图8为plaB-p43电击转化后质粒酶切验证电泳图谱。

具体实施方式

实施例1

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。如无特殊说明，均为质量百分比。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

一、仪器或设备：

电转仪购自：宁波新芝科器研究所，JY-2000-1A基因导入仪；

振荡培养箱购自：上海智城分析仪器制造有限公司，ZHWY-C2112B；

双人净化工作台购自：苏州净化设备有限公司，SW-CJ-CO型；

移液枪购自：法国Gilson；

高速冷冻离心机购自：上海安亭科学仪器厂，TGL-166。

二、培养基或菌株等

枯草芽孢杆菌WB600由江南大学生物工程学院余晓斌教授（实验室）惠赠；

大肠杆菌JM109由江南大学生物工程学院余晓斌教授（实验室）惠赠；

穿梭载体pHY-p43由江南大学生物工程学院余晓斌教授（实验室）惠赠。

穿梭载体plaB-p43的制备方法为：

以粘质沙雷氏菌PL-06基因组为模板，以PB-1 CAGGGATCCATGAGTATGCCTTTAAGT和PB-2 CCCGAATTCCTGCTGCGCGTAGTG分别为上下游引物，扩增plaB基因。PCR体系和步骤如下：

模板DNA（约1μg/μl） 1μl

PB-1 1μl

PB-2 1μl

10× PCR Buffer 5μl

10mmol/L dNTP 2μl

25mmol/L MgCl₂4μl

Taq DNA 聚合酶(5U/μl) 1μl

dd H₂O 35μl。

总体积为50μl，98℃预变性 5min，95℃变性35s，55℃退火35s，72℃延伸90s，35个循环，72℃延伸8min。

对PCR产物进行测序，结果见序列表中序列1。测序后，将扩增得到的大小约为1.7kb胶回收后用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后与同样酶切的pHY-p43质粒连接。酶切和连接反应的步骤如下所示：

酶切：

DNA 10μl

EcoRⅠ 1μl

BamHⅠ 1μl

Buffer K 5μl

灭菌双蒸水 33μl。

总体积50μl，在37℃温浴2h，之后每50μL反应液加入10μL 6×Loading Buffer终止反应。

连接反应体系：

PCR双酶切产物 12μl

质粒DNA双酶切产物 8μl

Ligase 2μl

10×Ligase Buffer 5μl

灭菌双蒸水 23μl。

总体积为50μl，16℃过夜连接。将连接产物转化至大肠杆菌DH5α，随机挑取单克隆，使用PB-1和PB-2引物扩增plaB基因，确认构建成功后得到重组质粒plaB-p43。pHY-p43质粒图谱见图6，plaB-p43为以上plaB基因插入pHY-p43质粒的EcoR I和BamH I酶切位点，质粒图谱见图7。

氨苄青霉素：储存浓度：50mg/mL，工作浓度：50μg/mL；

四环素：储存浓度：5mg/mL，工作浓度：50μg/mL；

LB液体培养基的制备方法：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）氯化钠，NaOH调pH值至7.2，121℃灭菌20min。蒸馏水配制，W/V：质量/体积比；

LB固体培养基的制备方法：1%（W/V）胰蛋白胨，0.5%（W/V）酵母提取物，1%（W/V）氯化钠，1.5%（W/V）琼脂粉，NaOH调pH值至7.2，121℃灭菌20min。蒸馏水配制，W/V：质量/体积比；

SLB培养基的制备方法：1%（W/V）蛋白胨，0.5%（W/V）酵母粉，1%（W/V）NaCl，0.5mol/L山梨醇，用2mol/L NaOH调pH至7.2，121℃灭菌20min。蒸馏水配制，W/V：质量/体积比，mol/L：摩尔体积比；

ORM培养基的制备方法： 1%（W/V）蛋白胨，0.5%（W/V）酵母粉，1%（W/V） NaCl，0.8mol/L山梨醇，用2mol/L NaOH调pH至7.2，121℃灭菌20min。蒸馏水配制，W/V：质量/体积比，mol/L：摩尔体积比；

RM培养基的制备方法：1%（W/V）蛋白胨，0.5%（W/V）酵母粉，1%（W/V） NaCl，0.5mol/L山梨醇，用2mol/L NaOH调pH至7.2，121℃灭菌20min。蒸馏水配制，W/V：质量/体积比，mol/L：摩尔体积比；

SMG缓冲液：0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10%（W/V）甘油。使用去离子水配制，121℃灭菌 20min；

Gly缓冲液：10%甘油，使用去离子水配制，121℃灭菌 20min。

实施例1、枯草芽孢杆菌的电击转化

一、感受态细胞的制备

2、用移液枪吸取1mL步骤1的过夜培养物在无菌净化台接种于40mL SLB培养基中，37℃，200r/min振荡培养至OD600nm=0.7；

3、将步骤2的菌液冰水浴10min后，放入离心管中， 4℃、5000r/min离心5min，弃上清，收集细胞；

4、在无菌净化台上用0℃预冷的40mLSMG缓冲液通过移液枪吹悬步骤3得到的细胞，4℃、5000r/min离心5min，弃上清，收集细胞，漂洗四次；

5、在无菌净化台上用2mL SMG缓冲液吹悬步骤4得到的细胞，分装于离心管（60μl/管）中，-80℃保存，每管约有6×10⁸个感受态细胞。（用于电转或者化转的感受态细胞一般都会现用现制，如果放在-80℃保存，一般时间不会太长，超过一个月用的时候会影响转化效率。)

二、电击转化

1、取80ng pHY-P43质粒DNA，加入到1管步骤一制备的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使pHY-P43质粒DNA和感受态细胞充分混匀，冰浴2min；

2、将完成步骤1 的体系转移至0℃预冷的电击杯（1mm）中，用电转仪进行电击（电压21kv/cm，电容25μF，电阻200Ω，电击1次，时间常数=5ms）；

3、完成步骤2后，立即向电击杯中加入1ml ORM培养基，通过移液枪反复轻轻吹打混匀；

6、随机挑取生长出来的单克隆，提取质粒琼脂糖凝胶电泳，结果如图8中泳道4所示，在5kb左右可见清晰的质粒条带，说明验证转化成功。计数菌落，计算转化率，转化率为每μg质粒DNA产生的转化子数。得到转化率为8.0×10⁶cfu/μg。

实施例2、枯草芽孢杆菌的电击转化

本实施例与实施例1的不同点在于：穿梭载体选用不同，实施例2中穿梭载体选用plaB-p43，其余实验步骤及条件均相同。

转化率为7.8×10⁶cfu/μg，根据琼脂糖凝胶电泳结果显示如图8中泳道1,2,3所示，DNA条带清晰。

随机挑取生长出来的单克隆，提取质粒分别进行EcoR I单酶切、EcoR I和BamH I双酶切及以PB-1和PB-2为引物PCR扩增plaB基因验证，琼脂糖凝胶电泳结果如图8所示。其中：泳道1表示plaB-p43电击转化后提取质粒单酶切，目的条带为6878bp；

泳道2表示plaB-p43电击转化后提取质粒双酶切，目的条带为5165bp和1713bp；

泳道3表示plaB-p43电击转化后提取质粒PCR验证磷脂酶A1基因，目的条带为1713bp；

泳道4表示pHY-P43电击转化后质粒提取，目的条带 5165bp。

可见清晰的质粒条带和目的基因条带，初步验证转化成功。

并将PCR扩增得到的plaB基因送生工生物（上海）股份有限公司测序，测序结果显示目的基因与操作前基因一致性为100%。因此可知目的基因经转化后，未发生重组、缺失等改变。

枯草芽孢杆菌宿主现在一般为：野生菌株或者胞外蛋白酶缺失菌株：WB600或者WB700等。其中，WB600缺失六种胞外蛋白酶，WB700缺失7种胞外蛋白酶。枯草芽孢杆菌作为宿主有很多优点，但是胞外蛋白酶会降解分泌的蛋白，所以WB600或者WB700是现在应用较多的。

经实验，本发明的电击转化枯草芽孢杆菌的方法可以应用于所有的枯草芽孢杆菌宿主中，包括枯草芽孢杆菌野生菌株和胞外蛋白酶缺失菌株。此时，转化率会稍有差别。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 安徽工程大学

<120> 一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1711

<212> DNA

<213> plaB

<400> 1

atgagtatgc ctttaagttt tacctctgca gtatccccgg tggccgcgat ccctacacct 60

cgcgccgttg ccgagacggc gacggcggcg cagtctgcgg cagcgccggc aaatccggcg 120

ccggtggcca ctccctctca gaactcgctc aatgcgcagg ccctgttgaa tacgctggtc 180

ggcgatatct ccgcggcggc gccgacggcg gcggcagcgc cgggcgtgac ccgggggcag 240

caatcgcagg aaggtgatta tgcgttggcg ctgttggcca aggacgttta tccactgaac 300

ggtcagggtg ccgctgggtt caaccgcttg agcgacagcg cgctgctcgg tttcggcatc 360

gatcccgcca gcctgcacga cgcgggcagc ggtttccagg ccggggttta cagcaacgac 420

aagcagtatg tgttggcgtt tgccggcacc aacgactggc gcgactggct gagcaacgtg 480

cggcaagcga cgggctatga tgatgtgcag tacaatcagg cggttgccgc cgccaaaagc 540

gccaaggcgg tcttcggcga tgcgctggtg atcgccggtc attcgctcgg cggcggtctg 600

gcggccacgg cggcgctggc gaccggcacc gtcgcggtca ccttcaatgc ggccggggtg 660

tcagattaca cgctgaatcg cntgggtatc gatcccgcgg cggcgaagaa agacgccgaa 720

gccggcggca tccgtcgtta cagcgaacaa tatgacatgc tgaccagcac ccaggagtcg 780

acttcgctga tcccggacgc cattggccac aacatcaccc tggccaacaa cgataccctg 840

accggtatcg atgactggcg gccgagcaag catctggatc gcagcctgac ggcgcacggc 900

atcgacaagg tgataagctc gatggcggaa caaaagccgt gggaggcgaa ggccaatgcc 960

tgaagggcgt cgcttgcggc gagcgctggc gatagcctta ctggcgctgg ccgcggtgac 1020

cggtttactg atgatggcta aggagcaaca gatggggcag gagatttcac cgtttgacgg 1080

ccgcggcaac ccggcgctgg ctcaggcggt ggcgcgcggc gatgcgcagg gcatccatgc 1140

gcaggctacg caggatcgct tgcgcgaacg gggcgatcgg caggtcacgc tgttgcagtg 1200

ggcggtgctt tcgcagcagc cggccagcgt gcaggcgtta ctggatctcg gggccgaccc 1260

gtcggtagcg gggctggacg gcaacagcgc gctgcacacc gcggcgatac tgcaagacgc 1320

gcagtatctg cggttactgc tggctgaagg ggcgcaggtg aacgtgcgca atgccgttac 1380

cggcgccacg ccgcttgcgg cggcggtgct ggccgggcgc gaggagcaac tgcggttgtt 1440

gctggcggcc ggggcggaca ccgccctgag cgatcggctg ggggataccc cgctgcatct 1500

ggcggcgaag atcaacgcgc cgcatctggc gctgttgctg ttgcaggccg gggccgatgc 1560

ccaggcgcgc aatcagcagg gttatgcgtt ccagttttat ttctcacaaa cgccggcgca 1620

tttgcagaat gacgagctga aggcgcagtt ccacgagctg gataaatggc tgcaggggcg 1680

ccgcctggcc acgcactacg cgcagcagta a 1711

序列表

<110> 安徽工程大学

<120> 一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1711

<212> DNA

<213> plaB

<400> 1

atgagtatgc ctttaagttt tacctctgca gtatccccgg tggccgcgat ccctacacct 60

cgcgccgttg ccgagacggc gacggcggcg cagtctgcgg cagcgccggc aaatccggcg 120

ccggtggcca ctccctctca gaactcgctc aatgcgcagg ccctgttgaa tacgctggtc 180

ggcgatatct ccgcggcggc gccgacggcg gcggcagcgc cgggcgtgac ccgggggcag 240

caatcgcagg aaggtgatta tgcgttggcg ctgttggcca aggacgttta tccactgaac 300

ggtcagggtg ccgctgggtt caaccgcttg agcgacagcg cgctgctcgg tttcggcatc 360

gatcccgcca gcctgcacga cgcgggcagc ggtttccagg ccggggttta cagcaacgac 420

aagcagtatg tgttggcgtt tgccggcacc aacgactggc gcgactggct gagcaacgtg 480

cggcaagcga cgggctatga tgatgtgcag tacaatcagg cggttgccgc cgccaaaagc 540

gccaaggcgg tcttcggcga tgcgctggtg atcgccggtc attcgctcgg cggcggtctg 600

gcggccacgg cggcgctggc gaccggcacc gtcgcggtca ccttcaatgc ggccggggtg 660

tcagattaca cgctgaatcg cntgggtatc gatcccgcgg cggcgaagaa agacgccgaa 720

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atcgacaagg tgataagctc gatggcggaa caaaagccgt gggaggcgaa ggccaatgcc 960

tgaagggcgt cgcttgcggc gagcgctggc gatagcctta ctggcgctgg ccgcggtgac 1020

cggtttactg atgatggcta aggagcaaca gatggggcag gagatttcac cgtttgacgg 1080

ccgcggcaac ccggcgctgg ctcaggcggt ggcgcgcggc gatgcgcagg gcatccatgc 1140

gcaggctacg caggatcgct tgcgcgaacg gggcgatcgg caggtcacgc tgttgcagtg 1200

ggcggtgctt tcgcagcagc cggccagcgt gcaggcgtta ctggatctcg gggccgaccc 1260

gtcggtagcg gggctggacg gcaacagcgc gctgcacacc gcggcgatac tgcaagacgc 1320

gcagtatctg cggttactgc tggctgaagg ggcgcaggtg aacgtgcgca atgccgttac 1380

cggcgccacg ccgcttgcgg cggcggtgct ggccgggcgc gaggagcaac tgcggttgtt 1440

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Claims

1.一种电击转化枯草芽孢杆菌的方法，包括制备感受态细胞和电击转化两个步骤；其中，所述制备感受态细胞依次包括如下步骤：将枯草芽孢杆菌在LB培养基中活化，将活化后的枯草芽孢杆菌接种于SLB培养基中，振荡培养，培养至OD_600nm=0.7；

所述SLB培养基的组分为：1%（W/V）蛋白胨，0.5%（W/V）酵母粉，1%（W/V）NaCl，0.5mol/L山梨醇，其余为蒸馏水；

2.根据权利要求1所述的电击转化枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述待转化质粒与所述感受态细胞的配比为：80-120ng所述待转化质粒：6×10⁸个感受态细胞。

3.根据权利要求1或2所述的电击转化枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述电击转化还包括在所述电击后进行如下处理的步骤：向电击杯中加入1ml ORM培养基并混匀，振荡培养；所述ORM培养基的组分如下：1%（W/V）蛋白胨，0.5%（W/V）酵母粉，1%（W/V）NaCl，0.7-0.9mol/L山梨醇，其余为蒸馏水。

4.根据权利要求3所述的电击转化枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述ORM培养基中山梨醇的浓度为0.8mol/L。

5.根据权利要求1-4任一所述的电击转化枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述电击转化还包括在所述电击前进行如下处理的步骤：将制备的感受态细胞用SMG缓冲液吹悬；所述SMG缓冲液的组分如下：0.5mol/L山梨醇，0.5mol/L甘露醇，10%（W/V）甘油，其余为去离子水。

6.根据权利要求1-5任一所述的电击转化枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述电击转化中，电击的电压为18-21kv/cm。

7.根据权利要求6所述的电击转化枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述电击转化中，电击的电压为21kv/cm。

8.根据权利要求1-7任一所述的电击转化枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述待转化的质粒为穿梭载体pHY-P43或plaB-p43。

9.根据权利要求1-8任一所述的电击转化枯草芽孢杆菌的方法，其特征在于：所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌WB600或WB700。