CN103235080A

CN103235080A - 一种利用uplc/ms/ms快速测定黑花生种皮中花色苷的方法

Info

Publication number: CN103235080A
Application number: CN2013101750570A
Authority: CN
Inventors: 赵善仓; 李增梅; 陈业兵; 郭长英; 梁京芸; 邓立刚; 蔡达
Original assignee: CENTRAL LABORATORY OF SHANDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE
Current assignee: CENTRAL LABORATORY OF SHANDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCE
Priority date: 2013-05-13
Filing date: 2013-05-13
Publication date: 2013-08-07
Anticipated expiration: 2033-05-13
Also published as: CN103235080B

Abstract

本发明公开了一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法，属于检测技术领域。包括以下步骤：（1）黑花生种皮中花色苷的提取；（2）黑花生种皮中花色苷的净化；（3）黑花生种皮中花色苷的分析测定。本发明可以更快速、更充分的提取黑花生中的花色苷，以更准确地测出不同花色苷的种类和含量，对于揭示其活性功能的物质基础和作用机制具有重要意义，同时为开发富含花色苷的花生品种，提高花生的营养品质和保健功能提供理论依据。

Description

一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体的说是一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法。

背景技术

花色苷是一种天然的水溶性色素，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实等器官的细胞液中，从而使其呈现出红色、蓝色、紫色等颜色。花色苷是由花色素与糖通过糖苷键结合而成的一类多酚类化合物。花色素的基本结构为3,5,7-三羟基-2-苯基苯并吡喃，目前已知的花色素有20多种，但在植物中主要有6种，即矢车菊色素、天竺葵色素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛色素、锦葵色素。花色苷具有一定的营养和保健功效，如抗氧化、抗突变、抗肿瘤与抗动脉硬化等，在食品、医药、化妆品领域有着巨大应用潜力。黑花生种皮中含有大量的花色苷，在促进人类身体健康、延缓衰老和预防心血管疾病方面发挥重要作用。因此，作为一种廉价易得的抗氧化资源，黑花生种皮花色苷具有十分重要的开发价值和广阔的应用前景。

花色苷的粗提物往往有较多的杂质，难于对其进行鉴定，只有将各组分进行分离提纯为单体花色苷后，才能进行鉴定，确定其化学结构。分离纯化的方法主要是层析法，包括纸层析(PC)，薄层层析(TLC)，柱层析(CC)，以及高效液相色谱法(HPLC)等，但前述方法无法对未知物质进行结构鉴定，故不能确定复杂基质中花色苷类化合物的具体种类及其含量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法。本发明可以更快速、更充分的提取黑花生中的花色苷，以更准确地测出不同花色苷的种类和含量，对于揭示其活性功能的物质基础和作用机制具有重要意义，同时为开发富含花色苷的花生品种，提高花生的营养品质和保健功能提供理论依据。

本发明所采用的技术方案为：

一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）黑花生种皮中花色苷的提取

称取0.20g黑花生种皮试样于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL90%甲醇水溶液，涡旋震荡1min，超声提取15min，在4000rmp转速下离心5min，将上清液过滤至150mL烧瓶；依此方法再重复提取2次，每次提取时均加入10mL90Vol%甲醇水溶液，最后合并3次提取的上清液；

所述90Vol%甲醇水溶液中含0.5Vol%甲酸，pH=2.5；

将合并后的上清液在40℃条件下减压浓缩，然后在40℃水浴条件下氮吹浓缩，除去甲醇，再加入5mL0.1Vol%甲酸酸化水，涡旋震荡2min，即得样品溶液；

（2）黑花生种皮中花色苷的净化

将SPEC₁₈柱依次用0.1Vol%甲酸酸化甲醇5mL和0.1Vol%甲酸酸化水5mL活化，注入步骤（1）中样品溶液，SPEC₁₈柱吸附花色苷，然后用0.1Vol%甲酸酸化水10mL淋洗柱，最后用0.1Vol%甲酸酸化甲醇5mL洗脱花色苷，在40℃水浴条件下氮气吹干；用0.1Vol%甲酸酸化水定容至2mL，经0.22μm滤膜过滤，即得待测溶液；

（3）黑花生种皮中花色苷的分析测定

①实验条件的确定

色谱条件：色谱柱：MSC₁₈（2.1mm×150mmI.D.,3.5μm）色谱柱，柱温40℃；流动相A：6Vol%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱；流速：0.5mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；进样量：10μL；记录时间：20min；

质谱条件：离子化模式：大气压电喷雾离子源（ESI），正离子模式；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气流量：60L/h；脱溶剂气流量600L/h；毛细管电压1.5kV；锥孔电压45V；

②按照①中实验条件，注入步骤（1）中所述待测溶液，进行分析测定，采用全扫描、母离子扫描、子离子扫描、多反应监测模式（MRM）确定花色苷种类与含量。

优选的，上述步骤①中所述的梯度洗脱为：

本发明所具有的优点：

（1）建立一种应用UPLC/MS/MS快速分离鉴定黑花生种皮中花色苷的方法，明确了黑花生种皮中的花色苷组分及含量，对于揭示其活性功能的物质基础和作用机制具有重要意义，同时为开发富含花色苷的花生品种，提高花生的营养品质和保健功能提供理论依据。

（2）UPLC/MS/MS操作简便、准确度高、重复性好，而且可对花色苷进行结构鉴定。

（3）采用90Vol%甲醇水溶液（含0.5Vol%甲酸）作为花色苷的提取溶液，以涡旋和超声的混合提取方式，可以更充分、更快速地提取黑花生中的花色苷。

（4）采用SPEC18柱净化，依次用0.1Vol%甲酸酸化甲醇和0.1Vol%甲酸酸化水活化，上样，然后用0.1Vol%甲酸酸化水淋洗柱，最后用0.1Vol%甲酸酸化甲醇洗脱花色苷，氮气吹干，用0.1Vol%甲酸酸化水定容，经0.22μm滤膜过滤。可以获得更优异的净化效果。

（5）采用

MSC₁₈（2.1mm×150mmI.D.,3.5μm）色谱柱，柱温40℃，流动相A：6Vol%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱，流速为0.5mL/min，初始流动相比例为100:0(A:B体积比)，到5min时流动相比例变为95:5，到15min时流动相比例变为75:25，到17min时流动相比例变为95:5，到19min时流动相比例变为100:0。色谱柱和流动相的选择对黑花生种皮花色苷达到了优异的分离效果。

（6）采用全扫描、母离子扫描、子离子扫描、多反应监测模式（MRM）获得了花色苷类化合物的结构信息，从而确定了黑花生种皮中花色苷种类与含量，实现了对黑花生种皮花色苷组成成分的定性和定量分析。

附图说明

附图1不同pH条件下花色苷吸光度曲线图；

附图2黑花生种皮花色苷提取物MS全扫描图；

附图3黑花生种皮花色苷提取物的母离子扫描总离子流图；

附图4黑花生种皮花色苷提取物(11.17min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图5黑花生种皮花色苷提取物(13.74min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图6黑花生种皮花色苷提取物(14.27min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图7黑花生种皮花色苷提取物(15.19min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图8黑花生种皮花色苷提取物(14.16min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图9黑花生种皮花色苷提取物(15.26min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图10黑花生种皮花色苷提取物(14.29min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图11黑花生种皮花色苷提取物(14.03min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图12黑花生种皮花色苷提取物(15.29min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)；

附图13黑花生种皮花色苷提取物(14.33min和15.18min)的子扫描总离子流图(A)和质谱图(B)、(C)。

具体实施方式

为阐明对本发明特征的理解，下面结合实施实例对本发明做进一步阐述。

以下结合实施例对本发明的技术方案进一步说明。

1、仪器与样品

1.1、仪器：超高效液相色谱系统（ACQUITYUltraPerformanceLCWaters公司）配以质谱（MicromassQuattroUltimaIMPT质谱仪Waters公司）、N-EVAP^TM112氮吹仪、WATERS固相萃取仪、

MSC₁₈（2.1mm×150mmI.D.,3.5μm）色谱柱。

1.2、样品：黑花生

2、方法与结果

2.1、黑花生种皮中花色苷的提取

称取0.20g黑花生种皮试样于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL90%甲醇水溶液，涡旋震荡1min，超声提取15min，在4000rmp转速下离心5min，将上清液过滤至150mL烧瓶；依此方法再重复提取2次，每次提取时均加入10mL90Vol%甲醇水溶液，最后合并3次提取的上清液；所述90Vol%甲醇水溶液中含0.5Vol%甲酸，pH=2.5；将合并后的上清液在40℃条件下减压浓缩，然后在40℃水浴条件下氮吹浓缩，除去甲醇，再加入5mL0.1Vol%甲酸酸化水，涡旋震荡2min，即得样品溶液；

花色苷的稳定性与pH有显著的相关性，花色苷在酸性条件下具有显著的稳定。但是如果酸性太强可能导致花色苷水解。pH=2.5时，花色苷的提取率最高；如图1所示。

2.2、黑花生种皮中花色苷的净化

花青素属类黄酮物质的一种，在自然界分布广泛，自然状态下多以花色苷的形式存在，是植物主要水溶性色素之一。花青素的基本结构母核为2-苯基苯并吡喃，吡喃环上的氧原子为4价，有碱的性质，同时结构中含有酚羟基，具有酸的性质，其颜色随着pH不同而改变，在酸性条件下显色较好，呈红色，在中性、近中性条件下呈无色，碱性条件下呈蓝色。花色素苷是极性化合物，易溶于水。一般对于花色苷的分离与净化采用SPEC18柱和sephadex葡聚糖凝胶净化柱的原理是由于凝胶过滤作用，所以大分子的化合物保留弱，先被洗脱下来，小分子的化合物保留强，最后出柱。由于sephadex葡聚糖凝胶净化柱不能把黑花生种皮中非极性杂质取出，因此不选择sephadex柱。

酸性条件下花色苷橙红色，在C18活化、上样、淋洗、洗脱过程直观明显。因此选择SPEC18柱方法操作简便、直观，具有较高的回收率、精密度和灵敏度。

2.3、黑花生种皮中花色苷的分离与鉴定

花色苷的分离与鉴定应用UPLC/MS/MS。采用MSC₁₈（2.1mm×150mmI.D.,3.5μm）色谱柱，柱温40℃，流动相A：6Vol%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱，流速为0.5mL/min，初始流动相比例为100:0(A:B体积比)，到5min时流动相比例变为95:5，到15min时流动相比例变为75:25，到17min时流动相比例变为95:5，到19min时流动相比例变为100:0，进样体积10μL。离子化模式为大气压电喷雾离子源（ESI），正离子模式，离子源温度120℃，脱溶剂气温度450℃，锥孔气流量60L/h，脱溶剂气流量600L/h，毛细管电压1.50kV，锥孔电压45V。分别采用全扫描、母离子扫描、子离子扫描、多反应监测模式（MRM）确定花色苷种类与含量。

按照2.3中实验条件，注入2.2中所述待测溶液，进行分析测定。

2.4、黑花生种皮花色苷全扫描

对黑花生种皮花色苷提取物进行MS全扫描，如图2所示。提取出质谱选择离子共11种，分别为M/Z=611（11.17min）、581（13.74min）、479（14.27min）、565（15.19min）、595（14.16min）、463（15.26min）、625（14.29min）、595（13.42min）、551（15.29min）、465（14.33min、15.17min）。

2.5、黑花生种皮花色苷母离子扫描

未衍生化的糖苷配基主要有6种，即天竺葵色素（Pg）：M/Z=271，矢车菊色素（Cy）：M/Z=287，芍药色素（Pn）：M/Z=301，飞燕草色素（Dp）：M/Z=303，牵牛色素（Pt）：M/Z=317和锦葵色素（Mv）：M/Z=331。设置10V和20V两种碰撞电压，对M/Z=271、287、301、303、317、331的子离子进行母离子扫描，得到其总离子流。对黑花生种皮花色苷提取物进行母离子扫描，其总离子流图如图3所示。

对天竺葵色素（Pg）：M/Z=271的子离子进行母离子扫描，在13.57min出现色谱峰（如图3-D），表明黑花生种皮中含有以天竺葵色素为糖苷配基的花色苷类化合物，但色谱峰丰度较低，含量较少；对矢车菊色素（Cy）：M/Z=287的子离子进行母离子扫描，在11.17min、13.74min出现色谱峰（如图3-E）；对芍药色素（Pn）：M/Z=301的子离子进行母离子扫描，在14.05min、14.27min、15.24min出现色谱峰（如图3-F），表明黑花生种皮中含有以芍药色素为糖苷配基的花色苷类化合物，但色谱峰丰度较低，含量较少；对飞燕草色素（Dp）：M/Z=303的子离子进行母离子扫描，在14.55min、14.98min、15.28min出现色谱峰（如图3-A），表明黑花生种皮中含有以飞燕草色素为糖苷配基的花色苷类化合物，色谱峰丰度较高，含量较高；对牵牛色素（Pt）：M/Z=317的子离子进行母离子扫描，在14.60min、15.19min出现色谱峰（如图3-C），表明黑花生种皮中含有以牵牛色素为糖苷配基的花色苷类化合物，但色谱峰丰度较低；对锦葵色素（Mv）：M/Z=331的子离子进行母离子扫描，未出现色谱峰（如图3-B），表明黑花生种皮中不含锦葵色素为糖苷配基的花色苷类化合物。

2.6、黑花生种皮花色苷子离子扫描

从全扫描图中提取质谱图，得到不同质核比的准分子离子。在10V和20V两种碰撞电压下，分别对这些准分子离子进行子离子扫描。

保留时间为11.17min的花色苷（图4-A），准分子离子M/Z=611，进行子离子扫描得到M/Z=287的子离子（图4-B）。M/Z=287为花青素苷元矢车菊色素的离子碎片，611-287=324糖基为槐二糖，推断为矢车菊素-槐二糖苷。

保留时间为13.74min的花色苷（图5-A），准分子离子M/Z=581，进行子离子扫描得到M/Z=287的子离子（图5-B）。M/Z=287为花青素苷元矢车菊色素的离子碎片，581-287=294糖基为接骨木二糖，推断为矢车菊素-接骨木二糖苷。

保留时间为14.27min的花色苷(图6-A），准分子离子M/Z=479，进行子离子扫描得到M/Z=317的子离子（图6-B）。M/Z=317为花青素苷元牵牛色素的离子碎片，479-317=162糖基为己糖，推断为牵牛色素-己糖苷。

保留时间为15.19min的花色苷(图7-A），准分子离子M/Z=565，进行子离子扫描得到M/Z=317的子离子（图7-B）。M/Z=317为花青素苷元牵牛色素的离子碎片，565-317=248糖基为丙二酰葡萄糖，推断为牵牛色素-丙二酰葡萄糖苷。

保留时间为14.16min的花色苷，准分子离子M/Z=595(图8-A），进行子离子扫描得到M/Z=301的子离子(图8-B）。M/Z=301为花青素苷元芍药色素的离子碎片，595-301=294糖基为接骨木二糖，推断为芍药色素-接骨木二糖苷。

保留时间为15.26min的花色苷，准分子离子M/Z=463(图9-A），进行子离子扫描得到M/Z=301的子离子(图9-B）。M/Z=301为花青素苷元芍药色素的离子碎片，463-301=162糖基为己糖，推断为芍药色素-己糖苷。

保留时间为14.29min的花色苷，准分子离子M/Z=625.33(图10-A），进行子离子扫描得到M/Z=301.34的子离子(图10-B）。M/Z=301为花青素苷元芍药色素的离子碎片，625-301=324糖基为槐二糖，推断为芍药色素-槐二糖苷。

保留时间为13.42min的花色苷，准分子离子M/Z=595(图11-A），进行子离子扫描得到M/Z=271的子离子(图11-B）。M/Z=271为花青素苷元天竺葵色素的离子碎片，595-271=324糖基为槐二糖，推断为天竺葵色素-槐二糖苷。

保留时间为15.29min的花色苷，准分子离子M/Z=551(图12-A），进行子离子扫描得到M/Z=303的子离子(图12-B）。M/Z=303为花青素苷元飞燕草色素的离子碎片，551-303=248糖基为丙二酰葡萄糖，推断为飞燕草色素-丙二酰葡萄糖苷。

保留时间为14.33min、15.17min的花色苷，这两种花色苷类物质具有相似的质谱特性，但其在色谱保留时间上不同。准分子离子M/Z=465(图13-A），进行子离子扫描得到M/Z=303的子离子(图13-B、C）。M/Z=303为花青素苷元飞燕草色素的离子碎片，465-303=162糖基为己糖，推断为飞燕草色素-己糖苷，根据出峰时间的不同，判定含有两种不同的飞燕草色素-己糖苷。

2.7、黑花生种皮花色苷的种类与含量

对黑花生种皮花色苷提取物进行全扫描、母离子扫描和子离子扫描，并通过MRM验证，鉴定出11种不同的花色苷，分别为1#矢车菊素-槐二糖苷、2#天竺葵色素-槐二糖苷、3#矢车菊素-接骨木二糖苷、4#芍药色素-接骨木二糖苷、5#芍药色素-槐二糖苷、6#飞燕草色素-己糖苷、7#牵牛色素-己糖苷、8#飞燕草色素-己糖苷、9#牵牛色素-丙二酰葡萄糖苷、10#芍药色素-己糖苷、11#飞燕草色素-丙二酰葡萄糖苷。其中，6#和8#具有相似的质谱特性，但在色谱保留时间上为不同的花色苷单体。结果如表1所示。

矢车菊素花色苷所占比例为52.71Vol%，为第一主要的花色苷，矢车菊素-接骨木二糖苷所占比例为28.28Vol%，为第一主要单体花色苷。飞燕草色素花色苷所占比例为43.49Vol%，为第二主要的花色苷。牵牛色素花色苷所占比例为2.66Vol%，为第三主要的花色苷。芍药色素花色苷、天竺葵色素花色苷所占比例较低，分别为0.91Vol%和0.23Vol%。表明黑花生种皮的颜色主要由矢车菊素花色苷、飞燕草色素花色苷、牵牛色素花色苷控制。

表1黑花生种皮花色苷种类

Claims

1.一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法，其特征是，包括以下步骤：

（1）黑花生种皮中花色苷的提取

称取0.20g黑花生种皮试样于50mL具塞塑料离心管中，加入10mL90Vol%甲醇水溶液，涡旋震荡1min，超声提取15min，在4000rmp转速下离心5min，将上清液过滤至150mL烧瓶；依此方法再重复提取2次，每次提取时均加入10mL90Vol%甲醇水溶液，最后合并3次提取的上清液；

所述90Vol%甲醇水溶液中含0.5Vol%甲酸，pH=2.5；

（2）黑花生种皮中花色苷的净化

（3）黑花生种皮中花色苷的分析测定

①实验条件的确定

色谱条件：色谱柱：

MSC₁₈色谱柱，色谱柱的尺寸为：2.1mm×150mmI.D.,3.5μm，柱温40℃；流动相A：6Vol%甲酸水溶液，流动相B：乙腈，梯度洗脱；流速：0.5mL/min；洗脱方式：梯度洗脱；进样量：10μL；记录时间：20min；

质谱条件：离子化模式：大气压电喷雾离子源，正离子模式；离子源温度：120℃；脱溶剂气温度：450℃；锥孔气流量：60L/h；脱溶剂气流量600L/h；毛细管电压1.5kV；锥孔电压45V；

②按照①中实验条件，注入步骤（1）中所述待测溶液，进行分析测定，采用全扫描、母离子扫描、子离子扫描、多反应监测模式确定花色苷种类与含量。

2.根据权利要求1所述的一种利用UPLC/MS/MS快速测定黑花生种皮中花色苷的方法，其特征是，所述步骤①中所述的梯度洗脱为：