CN103233027A

CN103233027A - 一种免疫增强型抗大肠杆菌etec重组乳酸菌及其制备方法

Info

Publication number: CN103233027A
Application number: CN2013101445760A
Authority: CN
Inventors: 王春凤; 杨桂连; 佟盼盼; 杨文涛; 郝凤奇
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2013-04-24
Filing date: 2013-04-24
Publication date: 2013-08-07

Abstract

本发明公开了一种免疫增强型抗大肠杆菌ETEC重组乳酸菌及其制备方法，利用DC-pep的靶向诱导功能和FaeG的抗原性，构建了融合基因DC-pep-FaeG，及大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达重组质粒pW425et-DC-pep-FaeG，将重组质粒转化至乳酸杆菌中获得免疫增强型重组乳酸菌。可稳定表达DC-pep-FaeG融合蛋白，该重组乳酸菌通过口服的方式进入消化道定植后，表达的FaeG借助DC-pep的功能被靶向递呈给DCs，有效地诱导机体产生IgG和sIgA，预防ETEC的感染，优于ETEC油苗。生产工艺简便、安全，利于规模化生产，具有广阔的应用前景和良好的经济社会效益。

Description

一种免疫增强型抗大肠杆菌ETEC重组乳酸菌及其制备方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及融合基因DC-pep-FaeG，一种重组DC-pep-FaeG的乳酸菌表达质粒pW425et-DC-pep-FaeG，一种免疫增强型抗大肠杆菌（ETEC）重组乳酸菌及其制备方法。

背景技术

产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)是常见的病原性大肠杆菌，由ETEC引起的仔猪腹泻病发病迅速，发病率和死亡率均较高，是造成养猪业重大经济损失的疾病之一，研究和创制该种疫苗是预防本病发生发展、促进健康养殖的重要保障。

ETEC感染仔猪后，首先通过粘附素与小肠上皮细胞的特异性受体结合，促使ETEC在小肠内定居、繁殖，然后分泌肠毒素引起肠上皮细胞产生一系列的病理变化，从而扰乱细胞内水和电解质的平衡，最后导致仔猪发病甚至死亡。在这个过程中，粘附素介导了大肠杆菌与肠上皮受体结合，构成了ETEC致病的首要条件。粘附素主要是指细菌表面的菌毛，是一种丝状的多聚蛋白结构，介导细菌粘附宿主细胞。K88菌毛是构成粘附素的重要物质，主要由FaeG和一些小亚基构成，FaeG是由数百个重复的蛋白亚单位组成，是K88菌毛的主要蛋白亚基，也是其粘附亚基，促使细菌与小肠粘膜上皮细胞的特异性受体结合，导致K88(+)ETEC在肠道内定植，然后产生毒素，致使仔猪发生腹泻。由于K88(+)ETEC的流行较为普遍，对K88的研究也相对广泛，因此利用K88菌毛研制粘附素疫苗对预防仔猪大肠杆菌腹泻病具有重要意义。Vanden Broeck利用纯化的K88菌毛抗原经口服免疫含有K88受体的仔猪，在其肠道内诱导K88的特异性免疫反应，在血清中检测到IgA和IgM抗体，有效预防了K88(+)ETEC的侵袭。

众所周知，树突状细胞（DCs）是机体功能最强大免疫递呈细胞，DCs在启动获得性免疫中发挥着关键性作用，DCs接触抗原后，对抗原进行识别、捕获和加工，并形成MHC-抗原肽复合物以启动机体的细胞免疫和体液免疫应答。肠道粘膜免疫系统由上皮内淋巴细胞、固有层淋巴细胞和Peyer^，s Patches(PP)等肠相关淋巴组织构成。在肠道内的很多组织区室已经鉴定出了具有专门抗原提呈作用的DCs，包括粘膜固有层(LP)，滤泡相关肠上皮下穹隆，粘膜相关淋巴组织的T细胞丰富区，位于上皮细胞或其下方的DCs可通过M细胞捕捉穿越上皮细胞的各种细菌抗原。因此，DCs对免疫原的识别是疫苗发挥作用的免疫学基础。

树突状细胞诱导肽(DC-targeting peptide,DCpep)是由36个碱基组成的短肽，具有特异性靶向结合DCs的作用，有助于DCs直接、有效的识别并捕获目的抗原，引发肠道内高效的粘膜免疫反应，从而指导和调节获得性免疫。已有研究证实针对丙型肝炎病毒抗原融合DCpep作用于DCs，结果表明诱发机体产生了高效的抗原特异性免疫反应，并发现抗原融合DCpep没有修改DCs的表型和功能，而是介导DCs靶向识别抗原，强化抗原的成熟。

乳酸菌作为体内重要的益生菌，已被国际公认为“安全级”的微生物，利用乳酸菌的这一优势，采用重组DNA技术，构建可稳定表达DCpep与抗原肽融合的重组乳酸菌，在创制口服疫苗方面具有重要的现实意义和潜在的应用价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种免疫增强型预防产肠毒素大肠杆菌（ETEC）感染的重组乳酸菌。

一种融合基因DC-pep-FaeG，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示；

一种融合基因DC-pep-FaeG的制备方法，它包括：

提取ETEC CVCC₂₀₀的内源性质粒，并以其为模板，用引物：

P1： ACAGGTACCATGAAAAAGACTCTGATTGC；

P2：CGAAGCTTTTATGGACGTTGTGGAGTTGAATGGTATGATGGGTAGAATTA

GTAATAAGT；

　　PCR方法扩增。

一种重组DC-pep-FaeG的乳酸菌表达质粒pW425et-DC-pep-FaeG，它是在表达载体pW425et上插入了其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示的基因；

一种免疫增强型抗产肠毒素大肠杆菌感染的重组乳酸菌，它是转化了pW425et-DC-pep-FaeG的乳酸杆菌。

所述的乳酸杆菌为植物乳酸杆菌。

本发明利用DC-pep的靶向诱导功能和FaeG的抗原性，构建大肠杆菌-乳酸菌穿梭表达重组质粒pW425et-DC-pep-FaeG，将重组质粒转化至乳酸杆菌中，获得了免疫增强功能的抗ETEC的重组乳酸杆菌，经过大量增菌培养后，每周灌胃小鼠3次，连续灌服2周，提高2倍剂量，继续灌胃4周，间隔2周后，分别攻菌ETEC 1次，1周后处死小鼠。结果表明，与ETEC油苗相比，重组乳酸杆菌可显著提高小鼠脾脏和淋巴结中CD11c⁺DCs数量、血清中IgG和肠内容物中sIgA含量。

本发明利用FaeG的抗原性和DC-pep靶向诱导DCs的功能，制备了可稳定表达DC-pep-FaeG融合蛋白的免疫增强型重组乳酸菌，该重组乳酸菌通过口服的方式进入消化道定植后，表达的FaeG借助DC-pep的功能被靶向递呈给DCs，有效地诱导机体产生IgG和sIgA，有效预防ETEC的感染。

本发明制备了免疫增强型抗ETEC的重组乳酸菌，其制备方法和生产工艺相对简便，利于规模化生产，具有广阔的应用前景和良好的经济社会效益。

附图说明

图1. DC-pep-FaeG融合基因的PCR扩增；

图2. DC-pep-FaeG回收结果；

图3. pMD18T-DC-pep-FaeG质粒电泳结果；

图4. pMD18T-DC-pep-FaeG双酶切鉴定结果；

图5. pW425et-DC-pep-FaeG双酶切鉴定结果；

图6. 重组乳酸杆菌表达产物检测；

图7. 小鼠IgG抗体水平；

图8. 小鼠肠内容物中sIgA抗体水平；

图9. 小鼠结肠的病理变化；

图10. CD11c＋DCs在脾脏和淋巴结中的表达。

具体实施方式

实施例1DC-pep-FaeG融合基因的获得

（1）引物的设计与合成

根据GenBank上发表的ETEC K88菌毛蛋白亚基FaeG基因序列，利用Primer5.0软件设计引物，在下游引物的5’端插入大小为36bp的DC-pep片段，且上、下游引物分别设计KpnⅠ、HindⅢ酶切位点，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。引物序列如下：

上游引物（P1）：5' ACAGGTACCATGAAAAAGACTCTGATTGC 3'

下游引物（P2）： 5'CGAAGCTTTTA TGGACGTTGTGGAGTTGAATGGTATGATGGGTAGAA TTAGTAATAAGT 3'（斜体为DC-pep片段）

（2）DC-pep-FaeG融合基因的PCR扩增

采用质粒小提试剂盒，按照说明书操作提取ETEC CVCC₂₀₀(血清型O149)的内源性质粒，并以其为模板，应用上述设计的引物，采用PCR方法扩增目的融合基因，结果扩增了大小约为888 bp的融合基因，如图1所示。

PCR反应体系：

PCR运行条件：94℃预变性5 min；94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸1min，共35个循环；72℃再延伸10min。反应结束后，取1μL进行0.8%琼脂糖凝胶电泳检测。

（3）DC-pep-FaeG基因与pMD18T的连接、转化

采用Axygen公司DNA凝胶回收试剂盒，按照说明书操作，对扩增目的基因DC-pep-FaeG进行回收，如图2所示。回收片段与克隆载体pMD18T进行连接。

连接体系：

连接条件：16℃连接过夜。

采用常规CaCl₂法将连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，并筛选重组阳性菌。

（4）pMD18T-DC-pep-FaeG的酶切鉴定及序列分析

按质粒小提试剂盒说明书操作提取筛选疑似阳性克隆子质粒，如图3所示。采用KpnⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶对所提取的质粒载体进行酶切鉴定，酶切体系如下：

反应条件：37℃水浴2 h。结束后，经0.8%琼脂糖凝胶电泳检测表明，成功获得了重组表达载体pMD18T-DC-pep-FaeG，如图4所示。

将经酶切鉴定的重组质粒pMD18T-DC-pep-FaeG送往华大基因科技股份有限公司进行测序，测序结果其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示，经Blast比对分析表明，所扩增的FaeG基因与GenBank登录的序列相似性达99%。

实施例2重组表达质粒pW425et-DC-pep-FaeG的构建

采用KpnⅠ和Hind Ⅲ限制性内切酶分别对pMD18T-DC-pep-FaeG和pW425et进行双酶切，以获得DC-pep-FaeG基因和pW425et大片段；双酶切体系和反应条件同实施例1中（4）所述。pW425et 也称pMG425et，它是在载体pMG36e上插入了thyA 基因（见中国专利CN1482247），采用thyA 基因和红霉素基因为选择压力，可以在乳酸菌和大肠杆菌之间穿梭表达的载体。

试剂盒回收目的基因后，采用T4 DNA连接酶进行连接。

连接体系：

反应条件：16℃连接过夜；次日常规CaCl₂法转化E.coli DH5α感受态，并筛选重组阳性菌。

试剂盒提取重组阳性质粒，按照实施例1中（4）所述，对质粒进行酶切鉴定，结果表明成功构建了重组质粒pW425et-DC-pep-FaeG，如图5所示。

实施例3免疫增强型抗ETEC重组乳酸菌的制备及表达产物检测

（1）乳酸杆菌感受态细胞制备及转化

将-70℃超低温冻存的植物乳酸杆菌37℃孵育至解冻，涂布于MRS平板(含胸苷酸100 μg/mL)，37℃厌氧静止培养过夜。次日，挑取菌落接种于新鲜的10 mL MRS 液体培养基中（含1%甘氨酸），37℃厌氧静止培养至菌体OD₆₀₀值为0.6-0.8。取菌体培养液，按1%-2%剂量接种于新鲜MRS液体培养基中(含1%甘氨酸)，37℃厌氧静止培养，待菌体OD₆₀₀值为0.2-0.3时，收集备用；

将以上收集的菌体培养物冰浴10 min，4℃，6 000 r/min，离心5 min。沉淀用冰冷的清洗缓冲液清洗两次；4℃，6 000 r/min，离心5 min收集沉淀，最后重悬于电击缓冲液中，冰浴5min；

取上述处理的乳酸杆菌感受态100 μL，加入10 μL重组表达载体pW425et-DC-pep-FaeG，轻轻混合后转置冰冷的电极杯中(Φ20 mm)，冰浴5 min后进行高压电转化，条件为电压2.0-2.5 kv，时间2.5-3.0 ms；

高压电击后，将电极杯冰浴5 min，将杯中内容物转置900 μL新鲜的液体MRS培养基中，37℃厌氧静止复苏4-5 h，涂布含有红霉素(400 μg/mL)的MRS平板，37℃厌氧静止培养16-20 h，筛选阳性克隆子。

（2）重组乳酸杆菌中表达载体的鉴定

试剂盒提取阳性重组菌质粒，按照实施例1中（4）所述，对质粒进行酶切鉴定，结果表明成功制备了携带重组质粒pW425et-DC-pep-FaeG的重组乳酸杆菌pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm。

（3）重组乳酸杆菌pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm表达产物的鉴定

按照《分子克隆指南》第3版中SDS-PAGE和Western-blot常规技术方法，对重组菌进行表达产物的检测；Western-blot中所用的一抗是鼠抗K88单克隆抗体(使用PBST 按1：1000稀释)、二抗是HRP标记的兔抗鼠IgG(使用封闭液按1：1000稀释)，结果表明重组乳酸杆菌可稳定表达大小为32Ku的DC-pep-FaeG融合肽，如图6所示。

实施例4重组乳酸菌抗ETEC功能检测

（1）动物分组及处理

将30只6-8周龄的BALB/c小鼠随机分成5组，每组6只(雌雄各半)。分别为PBS组、pW425et/ Lb. planturm组（空载体组）、ETEC灭活油苗组、pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm ^低剂量组、pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm ^高剂量组，将培养好的重组乳酸菌经PBS洗涤3次后，使用PBS重悬菌体沉淀，调整每组小鼠灌胃的菌液浓度，如表1所示，每组均以0.2 ml体积的菌液灌胃，每周灌胃3次，连续灌服2周，提高2倍剂量，继续灌胃4周，间隔2周后，分别攻菌ETEC 1次，第9周处死小鼠，检测各项免疫指标。按照同样的方案灌胃PBS组和pW425et/ Lb. planturm组，分别在第1周、第3周肌肉注射免疫油苗。每周称量小鼠的体重，每周尾静脉取血1次，离心收集血清，并储存于-40℃ 备用。

表1. 动物分组及处理

（2）检测指标及主要方法

1）血清中抗K88特异性IgG的检测

采用常规间接ELISA技术对各组小鼠攻ETEC前、后血清中K88特异性IgG水平进行检测。其中，包被抗原采用纯化K88抗原（稀释度1:100），酶标二抗采用HRP标记的兔抗小鼠IgG（稀释度1:500），采用全自动酶标仪读数。结果表明，重组乳酸菌免疫小鼠后，小鼠血清中特异性IgG水平明显升高。各组于第8周都达到最高水平，pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm ^高剂量组小鼠血清IgG为67.95±5.68μg/mL，稍高于油苗组（65.79±5.91μg/mL），但差异不显著（P>0.05），而pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm ^低剂量组小鼠血清IgG为58.76±6.34μg/mL，均高于PBS组和pW425et/ Lb. planturm组，且差异极显著（P<0.01），攻菌后（第9周）各组小鼠抗体水平明显下降，但重组乳酸菌组IgG的水平仍高于对照组，如图7所示。

2）小鼠肠内容物中特异性sIgA的检测

试验小鼠攻ETEC 1周后处死，打开小鼠腹腔，取各组小鼠小肠相对一致的位置，且长度相等。使用250μL的PBS反复冲洗截下来的小肠部分，并将液体置于离心管中，2000r/min，离心5min，取上清，采用常规间接ELISA技术检测肠内容中K88特异性sIgA水平，采用的抗原和酶标二抗同上所述。结果表明，攻ETEC后灌胃重组乳酸菌小鼠肠内容物中的sIgA水平为pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm ^高剂量组2.23±0.07μg/mL，pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm ^低剂量组1.92±0.11μg/mL，均高于PBS组（0.85±0.06μg/mL）和油苗组（1.56±0.04μg/mL），且差异显著(P<0.01)，如图8所示。

3）重组乳酸菌对小鼠结肠保护作用检测

采用常规组织病理学检测技术，制备小鼠结肠石蜡切片，进行HE染色，显微镜下观察各组小鼠结肠病理变化。结果表明，攻ETEC前PBS(A)组结肠组织上皮细胞完整，肠腺结构清晰，无水肿，无炎性细胞浸润；攻ETEC后PBS(B)组结肠组织病变严重，上皮细胞变性，坏死，可见脱落的上皮细胞，肠腺损伤，模糊不清，且有炎症细胞浸润；攻ETEC后，pW425et/ Lb. planturm组小鼠肠腺部分损伤，上皮细胞轻微脱落；攻ETEC后油苗组小鼠肠腺结构部分模糊，上皮细胞轻微脱落；攻ETEC后，pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm ^低剂量组小鼠肠腺结构清晰，上皮细胞轻微脱落；攻ETEC后，pW425et-DC-pep-FaeG/Lb. planturm ^高剂量组小鼠肠腺结构清晰，上皮细胞未发生脱落，无炎症现象，如图9所示。

4）小鼠脾脏和淋巴结中CD11c⁺DCs数量的检测

攻ETEC 1周后宰杀小鼠，无菌取脾脏和淋巴结，制成细胞悬液，分装于2mL的离心管中，调整细胞数10⁶/mL /管，加入1.5mL FACS缓冲液，2000 r/min离心5 min，弃上清，洗涤两次，加入适量的FACS缓冲液将细胞混匀，每管加10μL的CD11c⁺-PE兔抗小鼠单克隆抗体，4℃下避光孵育1h，加入1.5 mL FACS缓冲液，2000 r/min，离心5min，弃上清，加入1.5 mL FACS缓冲液，混匀，用无菌纱网过滤，加入10μL的10%多聚甲醛固定，上流式细胞仪检测，检测数据采用Flowjo8.8.4软件分析。结果表明，攻菌ETEC后，重组乳酸菌组CD11c^＋分子表达水平高于其他组，且差异显著，表明重组乳酸菌有效提高的DCs的数量和功能，如图10所示。

<110> 吉林农业大学

<120>一种免疫增强型抗大肠杆菌ETEC重组乳酸菌及其制备方法

<160> 1

<210> 1

<211> 888

<212> DNA

<213> 人工

<400> 1

atgaaaaaga ctctgattgc actggcaatt gctgcatctg ctgcatctgg tatggcacat 60

gcctggatga ctggtgattt caatggttcg gtcgatatcg gtggtagtat cactgcagat 120

gattatcgtc agaaatggga atggaaagtt ggtacaggtc ttaatggatt tggtaatgta 180

ttgaatgacc tgaccaatgg tggaaccaaa ctgaccatta ctgttactgg taataagcca 240

attttgttag gccgaaccaa agaagcattt gctacgccag taactggtgg tgtagatgga 300

attcctcata ttgcatttac tgactatgaa ggagcttctg tagtactcag aaaccctgat 360

ggtgaaacta ataaaaaagg tttagcatat tttgttctgc cgatgaaaaa tgcagagggc 420

actaaagttg gttcagtgaa agtgaatgca tcttatgccg gtgtgttagg gagaggtggg 480

gttacttctg cggacgggga gctgctttcg ctttttgccg acgggttgag ctctatcttt 540

tatggtggtt tgccgagggg ttctgaactc tcggctggga gtgccgcagc ggcgcgcaca 600

aagttgtttg gaagtctatc aagagatgat attctcggac agattcaaag agtaaacgca 660

aatattactt ctcttgttga cgtcgcaggt tcttacaggg aaaacatgga gtacactgat 720

ggaaatgttg tttctgctgc ctatgcactg ggtattgcaa acggtcagac tattgaggca 780

acttttaatc aggctgtaac taccagcact cagtggagcg ctccgctgaa cgtagcaata 840

acttattact aattctaccc atcataccat tcaactccac aacgtcca 888

Claims

1.一种融合基因DC-pep-FaeG，其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示。

2.一种融合基因DC-pep-FaeG的制备方法，它包括：

提取ETEC CVCC₂₀₀的内源性质粒，并以其为模板，用引物：

P1： ACAGGTACCATGAAAAAGACTCTGATTGC；

P2：CGAAGCTTTTATGGACGTTGTGGAGTTGAATGGTATGATGGGTAGAATT

AGTAATAAGT；

　　PCR方法扩增。

3.一种重组DC-pep-FaeG的乳酸菌表达质粒pW425et-DC-pep-FaeG，它是在表达载体pW425et上插入了其碱基序列如序列表SEQ ID No.1所示的基因。

4.一种免疫增强型抗产肠毒素大肠杆菌感染的重组乳酸菌，它是转化了权利要求3所述的一种重组DC-pep-FaeG的乳酸菌表达质粒pW425et-DC-pep-FaeG的乳酸杆菌。

5.根据权利要求4所述的一种免疫增强型抗产肠毒素大肠杆菌感染的重组乳酸菌，其特征在于：所述的乳酸杆菌为植物乳酸杆菌。