CN103230589B - 一种纤维蛋白原复合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种纤维蛋白原复合物及其应用。所述的纤维蛋白原复合物由纤维蛋白原、凝血酶原和十一种神经营养因子组成。所述的纤维蛋白原复合物可以用于制备治疗青光眼、垂体瘤、外伤性视神经损伤、手术操作导致的视神经损伤等药物，将该复合物与移植细胞结合可增强移植修复效果。

Description

一种纤维蛋白原复合物及其应用

技术领域

本发明属医用生物材料领域，涉及一种纤维蛋白原复合物及其应用，特别是涉及一种纤维蛋白原复合物及其在用于制备内层视网膜疾病以及其他导致视神经损伤疾病的药物中应用。

背景技术

视神经损伤和青光眼是导致患者失明的两个重要原因。其中，有多重原因可能导致视神经损伤，如外伤、涉及视神经的手术等。目前临床上针对视神经损伤的治疗方法效果较差，只有少部分患者视力略微改善，大部分患者视力无改善。青光眼则是一类有进行性眼压增高导致的眼病，是世界第二大致盲性眼病。目前临床上的治疗方法只能延缓疾病进展，并不能改善患者视力。

无论是视神经损伤还是青光眼，其细胞水平的机制都是视网膜神经节细胞（retinalganglion cells，RGCs）的进行性死亡。RGCs位于视网膜的最内层即节细胞层，RGCs的轴突聚集成束后离开眼球形成视神经，在视交叉与来自另一只眼球的视神经形成视束，并最终投射于外侧膝状体。RGCs之间相互关联并形成相互作用的网络，同时其轴突之间也密切关联。神经元轴突吸收神经营养因子并通过逆向运输将其运送至胞体，所以轴突变性坏死会引起神经元胞体营养不良甚至死亡。极少一部分RGCs或者其轴突变性坏死或功能，就会导致剩余正常的RGCs及其轴突进行性的功能障碍，并最终失代偿使所有细胞凋亡导致患者失明。

同样的道理，因为双眼的视神经在视交叉处混合为视束，所以即使一只眼睛的RGCs或者视神经变性坏死而得不到有效治疗的话，另外一只眼睛的视力也会受到影响甚至失明。因此，即使极少一部分RGCs和/或其轴突变性坏死，如果不及时给与有效的治疗，那么必将导致更多的细胞及其轴突功能障碍，因而临床上迫切需要一种治疗方案来打破这一恶性循环，但遗憾的是现有的治疗策略其效果不佳。哺乳动物视网膜内在的再生能力非常有限，因此治愈视神经损伤及相关视网膜疾病唯一可能的途径就是细胞移植。

细胞移植治疗视神经损伤已经有许多年历史，但收效甚微。绝大部分研究只能做到移植细胞的存活与分化。而移植细胞与宿主细胞的整合以及宿主视觉功能的恢复则效果不明显，甚至完全没有效果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于提供一种纤维蛋白原复合物及其应用，将所述的纤维蛋白原复合物和移植的细胞相结合，用于增强/改善细胞移植治疗视神经损伤效果。

为了达到以上目的，本发明采用以下技术方案来实现。

所述的纤维蛋白原复合物，由纤维蛋白原、凝血酶原和十一种神经营养因子组成。

其中，所述的纤维蛋白原浓度为22-28mg/ml，所述的凝血酶原浓度为22-28U/ml。

所述的十一种神经营养因子及其浓度、生产商分别如下表1所示。

表1

所述的纤维蛋白原复合物采用以下方法制备而成，具体包括以下步骤：

a)配制磷酸盐缓冲液；

b)向步骤(a)得到的磷酸盐缓冲液中加入十一种神经营养因子，混合均匀；

c)向步骤(b)得到的混合液中加入纤维蛋白原和凝血酶原，混合均匀，即得到本发明的维蛋白原复合物。

进一步，将上述制得的纤维蛋白原复合物与移植细胞混合，细胞浓度为100,000-200,000cells/ul，即得一种新型的移植混合物，用于移植治疗视神经损伤。

所述的移植细胞选自：视网膜视神经节细胞、视网膜前体细胞、神经干细胞等。优选地，所述的移植细胞为哺乳动物的诱导多能干细胞；所述的移植细胞的浓度优选为100,000-200,000个/ul。

有益效果：

本申请的发明人经过广泛而深入地研究，首次发现，将移植细胞结合在含有十一种神经营养因子的纤维蛋白原复合物中，能显著增强治疗移植视神经损伤效果。

附图说明

图1为成纤维细胞，蓝色为DAPI染色。

图2为所获取的IPS细胞。

图3为视乳头附近的解剖示意图，图中滴管所示为移植细胞的位置。

图4为结合了本发明移植细胞在视神经损伤处的免疫荧光结果分析。

具体实施方式

以下结合具体实施例进一步详细描述本发明的技术方案，但所述实施例不限制本发明的保护范围。最后应当说明的是，以下实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。

实施例1细胞培养与获取

1.1关于视网膜视神经节细胞（Retinal stem cell，RGC）

视网膜神经节细胞位于视网膜的最内层即节细胞层。RGCs的轴突聚集成束后离开眼球形成视神经，在视交叉与来自另一只眼球的视神经形成视束，并最终投射于外侧膝状体。RGCs之间相互关联并形成相互作用的网络，同时其轴突之间也密切关联。神经元轴突吸收神经营养因子并通过逆向运输将其运送至胞体，所以轴突变性坏死会引起神经元胞体营养不良甚至死亡。极少一部分RGCs或者其轴突变性坏死或功能，就会导致剩余正常的RGCs及其轴突进行性的功能障碍，并最终失代偿使所有细胞凋亡导致患者失明。

1.2移植用细胞的获取

诱导多能干细胞（Induced Pluripotent Stem Cells，IPSC）

通过慢病毒使Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc四个转录因子的异位表达可将小鼠和人的成纤维细胞重编程为诱导多能干细胞。诱导多能干细胞具有和胚胎干细胞同样的特性，能够分化为多种类型的细胞，包括视网膜神经节细胞。

1.2.1用于重编程的成纤维细胞获取如下：

(1)采取大鼠头皮组织，在70%乙醇中浸泡消毒5min，用PBS清洗2遍。

(2)剥取真皮层组织，用无菌小剪刀剪成1mm³的碎片，加入含双抗的PBS清洗2遍。加入胶原酶IV（1mg/mL，溶于D-Hank's缓冲液，Sigma），37℃消化10min（其间轻轻震荡数次）。1000rpm，离心5min后弃上清。向沉淀物中加入适量0.25%胰蛋白酶，37℃下作用5min，再加入含FBS的DMEM终止消化。

(3)将组织块转移至30mm培养皿，加入成纤维细胞培养液，防止组织块漂浮，37℃培养4～5天。

(4)显微镜下观察组织块，当迁移出的成纤维细胞汇合成片，覆盖大约75%的表面时进行传代。

(5)用0.25%Trypsin-EDTA溶液消化，终止消化后收集消化液，得到单细胞悬液，剩余组织块可继续培养。

(6)收集2～3次的细胞悬液离心，用成纤维细胞培养液重悬细胞，调整细胞密度为1×10⁶/mL，接种到培养瓶。

(7)当细胞长至80%融合时进行传代，冻存。用第5代细胞进行诱导重编程，最终获得用于重编程的成纤维细胞，如图1所示。

1.2.2病毒感染成纤维细胞

由于多轮转染（每次间隔12h）能增加转染细胞数量，也能增加每个细胞的拷贝数。可溶性外壳与无功能病毒颗粒可占据细胞受体，因此每次感染间隔12h让细胞休息。病毒预整合复合物（pre-integration complex）只进入分裂活跃的细胞核。

(1)细胞在转染前12～18h铺板，密度为1×10⁶/60mm培养皿。

(2)将携带Oct4、Sox2、Klf4、和c-Myc四个转录因子病毒加入到靶细胞。测定病毒滴度后，用足量含病毒的培养液感染靶细胞。

(3)聚凝胺（polybrene）的终浓度为4μg/mL。最佳终浓度由经验决定，但是一般在2～12μg/ml范围内，过长时间暴露（>24h）对细胞存在毒性。

(4)孵育24h后更换新鲜培养液。

(5)间隔12h后按前述方法再次转染细胞。

(6)第二轮病毒感染后，再用含N2和B27的N3培养液进一步诱导培养。

1.2.3IPS的获取

每天换液直到IPS出现，大约在慢病毒感染一周后能看到，大约在14d左右进行挑选。

(1)移去60mm培养皿中的培养液，加入5mL PBS清洗，吸去PBS，再加入适量培养液。

(2)用20μL的移液器在解剖镜下挑选神经元样细胞，转移至6-well板中，动作尽量轻快，并保持无菌状态。

(3)加入2mL N3培养液，吹打分散为单个细胞，37℃培养直至细胞稳定生长后再冻存细胞。

最终获得IPS细胞，如图2所示。

实施例2纤维蛋白原复合物的制备

去离子水加入NaCl配置成0.8%（w/v）的NaCl溶液10ml，滤头过滤，纤维蛋白素原400mg溶解于其中，依次加入表1所示的各神经营养因子，最后再加入凝血酶原，即得本发明的神经再生生物胶，其中纤维蛋白原的终浓度为22-28U/ml，凝血酵素终浓度为22-28U/ml。该生物胶配置后约15分钟形成，粘稠度高，机械强度较高，孔隙率较大，较易固定于注射部位，适于活体（动物/人类）视神经损伤部位的注射。

实施例3动物实验

3.1实验动物

Sprague Dawley健康大鼠，雌雄不限，体重250g～300g，经裂隙灯显微镜检查，双艟L等大、等圆，对光反应好，无明显眼部疾患，无歪颈。腹腔注射3%戊巴比妥钠液，1ml/kg麻醉大鼠，双目手术显微镜下垂直于睑缘方向剪开上睑中部，直到眶上缘，沿同样方向剪开球结膜和部分穹隆结膜，暴露并分离上直肌，沿上直肌方向钝性分离筋膜暴露视神经，剪断上直肌，显微有齿镊夹上直肌止点处断端，向下方牵引眼球，充分显露视神经，用夹持力为40g的特制小夹在视乳头前3mm处（切断组为视乳头前0.5mm切断视神经），从眼球上方垂直视神经方向夹持视神经4s，此时可见瞳孔逐渐散大。分层缝台结膜和眼睑。

图3为视乳头附近的解剖示意图，主要展示了视网膜视神经节细胞的解剖位置（图中橙色的细胞），图中滴管所示为移植细胞的位置。

3.2动物分组

48只大鼠随机分为A、B、C、D四组。A组12做视神经切断伤，损伤处下注入结合了本发明纤维蛋白原复合物的IPS；B组12做视神经切断，损伤处只注入IPS；C组12只仅做视神经切断，不移植细胞；D组12只仅暴露视神经，不做视神经切断伤。

3.3GFP标记IPS

GFP基因转染及转染细胞增殖能力检测：将RGCs经0.02%EDTA消化并离心后加人EGM-2培养液制成单细胞悬液并行细胞计数。随机将细胞分为3组，每组细胞总数为1×10⁶。将细胞以5×10³/孔接种于96孔板，置于37℃、5%CO₂条件下培养。将2×10⁷U/ml的GFP-慢病毒复合体分别以1:10、1:50、1:100的MOI加入到每组细胞培养板内。轻轻混匀后各孔再加入2ml的EGM-2培养液于37℃、5%CO₂培养箱中培养。每日观察细胞生长情况。分别于培养的48h、4d、6d、8d、10d进行检测，每孔加入5mg/ml MTT溶液20ul，37℃、5%CO₂，条件下孵育4h后终止培养。小心吸尽上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）100ul，平板床振荡10min。在酶联免疫检测仪上测定细胞的吸光度（OD）值，所用实验波长为490nm。

3.4细胞结合纤维蛋白复合物的移植

将上述标记完成的细胞加入本发明实施例2制得的纤维蛋白原复合物中进行混合，得细胞浓度为100,000-200,000cells/ul的移植混合物，按分组植入上述动物模型（模型制作完成后7天）中。并于移植后14天、28天分别观察免疫荧光，结果参看图4，其中横轴代表移植后做免疫荧光的时间，纵轴代表视野内染色轴突的数量。从图4可以看出，结合了本发明的维蛋白原复合物的移植混合物的移植效果无论在近端还是远端，还是在移植后的各个时间点，都比仅移植细胞要好。

Claims (8)

1.一种纤维蛋白原复合物，其特征在于，由22-28mg/ml的纤维蛋白原，22-28U/ml的凝血酶原，和11种神经营养因子组成；所述的11种神经营养因子具体为：(1)脑源性神经营养因子BDNF，45-55μg/ml；(2)神经营养因子NT-3，45-55μg/ml；(3)血小板衍生生长因子PDGF-AA，8-12μg/ml；(4)胰岛素样生长因子IGF-1，8-12μg/ml；(5)表皮生长因子EGF，8-12μg/ml；(6)碱性成纤维细胞生长因子bFGF，4-6μg/ml；(7)睫状神经营养CNTF，8-12μg/ml；(8)胶质细胞源性神经营养因子GDNF，4-6μg/ml；(9)肝细胞生长因子HGF，8-12μg/ml；(10)视黄酸retinoic acid，0.4-0.6μM/ml；(11)蛋白酶抑制剂MDL28170，45-55mM。 

2.包含权利要求1所述的纤维蛋白原复合物的移植混合物。 

3.根据权利要求2所述的移植混合物，其特征在于，所述移植混合物还进一步包括移植细胞。 

4.根据权利要求3所述的移植混合物，其特征在于，所述的移植细胞为视网膜视神经节细胞、视网膜前体细胞，或神经干细胞。 

5.根据权利要求3所述的移植混合物，其特征在于，所述的移植细胞为哺乳动物的诱导多能干细胞。 

6.根据权利要求3、4或5所述的移植混合物，其特征在于，所述的移植细胞的浓度为100000-200000个/ul。 

7.权利要求3所述的移植混合物在用于制备移植治疗视神经损伤药物中的应用。 

8.权利要求1所述的纤维蛋白原复合物在用于制备治疗青光眼、垂体瘤、外伤性视神经损伤、手术操作导致的视神经损伤，和细胞移植结合增强移植修复药物中的应用。