CN103228292A - 针对脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于治疗和预防奈瑟氏球菌疾病的免疫原性组合物和疫苗。本发明的免疫原性组合物包含Hsf(也称为Msf)和Opc奈瑟氏球菌抗原。已经发现这些抗原是两种机制，通过所述机制脑膜炎奈瑟氏球菌结合宿主玻连蛋白(以促进粘附和/或逃避宿主补体介导的杀死)。因此，包含两种抗原的疫苗可以有利地导致免疫应答，所述免疫应答能够更好地杀死奈瑟氏球菌菌株并且以其他方式预防对于疾病发生所需的玻连蛋白相关的奈瑟氏球菌补体介导的杀死耐受性和/或奈瑟氏球菌粘附事件。

Description

针对脑膜炎奈瑟氏球菌的疫苗

技术领域

本发明涉及奈瑟氏球菌(Neisserial)免疫原性组合物和疫苗、它们的生产和这样的组合物在药学中的用途的领域。更具体地，它涉及疫苗组合物，所述疫苗组合物包含Hsf和Opc抗原的组合，其具有降低奈瑟氏球菌病原体的补体介导的杀死耐受性。

背景

细菌中的奈瑟氏球菌菌株是很多人类病变的致病因子，需要开发针对这些致病因子的有效疫苗。特别是，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)和脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)所引起的病变可通过接种疫苗而治疗。

淋病奈瑟氏球菌是淋病的病原体，淋病是世界上最频繁报道的性传播疾病之一，估计每年有6200万例的发病率(Gerbase等人1998 Lancet 351；(增刊3)2-4)。淋病的临床表现包括泌尿生殖道、咽喉或直肠的粘膜炎症和新生儿眼睛感染。妇女中渐增的淋球菌感染可以导致不孕、异位妊娠、慢性盆腔炎疾病和卵管卵巢脓肿形成。败血症、关节炎、心内膜炎和脑膜炎与复杂淋病相关。

大量对抗生素耐受的淋球菌菌株有助于与淋病相关的增加的发病率和并发症。用抗生素治疗淋病的一个有吸引力的替代方案将是使用接种疫苗来预防淋病。目前不存在用于淋病奈瑟氏球菌感染的疫苗。

脑膜炎奈瑟氏球菌是一种重要的病原体，特别是在儿童和年轻人中。败血症和脑膜炎是侵袭性脑膜炎球菌病(IMD)的最严重威胁生命的形式。这种疾病由于其较高的发病率和死亡率已经成为全世界的健康问题。

根据荚膜多糖的抗原差异，已经鉴定出了13种脑膜炎奈瑟氏球菌血清群，最常见的是A、B和C，它们导致全世界90％的该疾病。血清群B是欧洲、美国和拉丁美洲几个国家中脑膜炎球菌病的最常见原因。

已经开发了基于血清群A、C、W和Y的荚膜多糖的疫苗，它们表现出控制脑膜炎球菌病的爆发(Peltola等人，1985 Pediatrics 76；91-96)。然而，血清群B的免疫原性较差，且仅诱导主要IgM同种型的短暂抗体应答(Ala’Aldeen D和Cartwright K 1996，J. Infect. 33；153-157)。因此，目前还没有能够针对导致绝大多数温带国家中大多数该疾病的血清群B脑膜炎球菌的广泛有效的疫苗。尤为严重的是，血清型B疾病在欧洲、澳大利亚和美洲的发生率日益增加，主要是在5岁以下的儿童中。针对血清群B脑膜炎球菌的疫苗的开发提出了具体困难，即由于多糖荚膜与人神经细胞粘附分子的免疫学相似性导致其免疫原性较差。因此，已经将疫苗生产的策略集中于脑膜炎球菌外膜的表面暴露结构，但却已经被这些抗原在菌株之间的显著变异所阻碍。

进一步开发已经导致引入由外膜囊泡制成的疫苗，所述外膜囊泡将含有构成细菌膜的正常内容物的许多蛋白。这些之一是针对脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B和C的VA-MENGOC-BC ® Cuban疫苗(Rodriguez等人1999 Mem Inst. Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro 94; 433-440)。该疫苗设计用于打击在古巴的侵袭性脑膜炎球菌疾病爆发，使用荚膜多糖AC疫苗的接种疫苗项目还没有消除该疾病爆发。流行血清群是B和C，且VA-MENGOC-BC ®疫苗在控制爆发中是成功的，估计83%的疫苗针对脑膜炎奈瑟氏球菌的血清群B菌株是有效的(Sierra等人1990 In Neisseria, Walter Gruyter, Berlin, M. Atchman等人(编辑) p 129-134, Sierra等人1991, NIPH Ann 14; 195-210)。该疫苗针对特定爆发是有效的，但是引发的免疫应答不能保护免于脑膜炎奈瑟氏球菌的其他菌株。

随后在拉丁美洲在由同源和异源血清群B脑膜炎球菌菌株引起的流行病期间进行的效力研究已经显示出在较大儿童和成人中的一些效力，但其在处于感染最大风险中的较小儿童中的效率显著更低(Milagres等人1994, Infect. Immun. 62; 4419-4424)。值得疑问的是这样的疫苗将在具有多菌株地方性疾病的国家如英国将是如何有效的。针对异源菌株的免疫原性研究已经表现出仅仅有限的交叉反应血清杀菌活性，尤其是在幼儿中(Tappero等人1999, JAMA 281; 1520-1527)。

在挪威使用在斯堪的纳维亚流行的那些典型的血清型B分离株开发了第二种外膜囊泡疫苗(Fredriksen等人1991, NIPH Ann, 14; 67-80)。该疫苗在临床试验中进行测试，并且发现在29个月后具有57％的保护效力(Bjune等人1991, Lancet, 338; 1093-1096)。

然而，在疫苗中使用外膜囊泡伴随一些问题。例如，OMV含有毒性脂多糖，并且它们可能含有或菌株特异性或可变表达的免疫显性抗原。已经描述了数个工艺，其可以用于克服外膜囊泡制剂疫苗的一些问题。WO01/09350描述了解决一些这些问题的工艺，其例如通过降低毒性和修饰外膜囊泡上存在的抗原来实现。

当前可用的抗脑膜炎球菌疫苗存在不同的问题。基于蛋白的外膜疫苗倾向于仅针对少数菌株是特异性且有效的。多糖疫苗也是不理想的，因为它们倾向于引发较差且短暂的免疫应答，特别是针对血清群B(Lepow等人 1986; Peltola 1998, Pediatrics 76; 91-96)。

奈瑟氏球菌感染代表相当大的健康护理问题，在淋病奈瑟氏球菌的情况下对其没有疫苗可用，并且在脑膜炎奈瑟氏球菌的情况下可用的疫苗在其保护免于异源菌株的效力和能力中具有限制。

此外，已经认识到，致病性奈瑟氏球菌可以通过用宿主玻连蛋白和因子H包被自身而逃避宿主补体介导的杀死。

很明显，需要开发针对奈瑟氏球菌感染的优异的疫苗，这将改进对目前可用疫苗的效力，并且允许针对更广泛范围菌株的保护。此外，具有失活细菌的补体介导的杀死耐受性能力的疫苗将是特别有用的。

图注

图1. 表达Msf的无荚膜H44/76(GB)衍生物与人Vn结合，无论Opc是否表达。A. 将Vn的活化形式(aVn)固定在ELISA板上，并且用所示的不同Nm表型覆盖。通过使用抗Nm抗血清和碱性磷酸酶缀合的二级抗体评价脑膜炎球菌粘附于aVn包被的板上。B.在反向实验设置中，用aVn覆盖固定的细菌，并且使用多克隆抗Vn抗血清检查蛋白结合。结果来自一式两份实验中的一次代表性实验。C.与人Vn相比，表达Msf的Nm与小鼠、牛、兔Vn的结合。与固定的玻连蛋白结合的表达Msf的细菌的水平类似，在表达Msf的细菌不存在的情况下可以发现可忽略不计的结合(两种表型都是Opc缺陷变体)。

图2. 表达Msf和Opc的脑膜炎球菌经由不同的机制与生长调节素B/aVn的接头区域结合。使用的生物素化的玻连蛋白肽(氨基酸43-68)的序列和取代：VA-26是生物素-VTRGDVFTMPEDEYTVYDDGEEKNNA (SEQ ID NO:15)，VA-26S是生物素-VTRGDVFTMPEDEYsTVYsDDGEEKNNA (SEQ ID NO:16)，VA-26P是生物素-VTRGDVFTpMPEDEYTpVYDDGEEKNNA (SEQ ID NO:17) [Ys = 硫酸化的Y; Tp =磷酸化的T]。(A - C). 使用以生物素化的Vn肽VA-26 (A)、VA-26S (B)或VA-26P (C)包被的ELISA板来评价各种无荚膜的H44/76 (GB系列)表型的结合。包括有和没有Opc表达的Nm菌株C751分离株(Msf-)以强调Opc蛋白的特定需求(Sa E Cunha, Griffiths等人2010)。与需要硫酸化的酪氨酸(只存在于VA-26S中)的Opc相比，表达Msf的Nm与所有3种肽同等结合，并且比Opc-Msf- (A - C)或Msf-Opc+表型(A和C)更明显；后者只结合VA-26S。D. 在ELISA中显示了VA-26S结合的特异性，所述ELISA并入生物素化的Vn肽VA-26S，以及两种无关的30和22个残基的肽SY-30和GS-22(序列如下所示)。E和F. VA-26S (E)或mAb 8E6 (F)对Nm与固定的aVn结合的抑制。ELISA板用2.5µg/ml aVn包被，并且用25µg/ml肽预孵育30 min的细菌覆盖。对于8E6抑制，在添加细菌之前以10 µg/ml将mAb添加至含有aVn的孔。使用抗Nm抗血清和碱性磷酸酶缀合的二级抗体检测Nm结合。

图3. Vn肽VA-26被无荚膜和完全荚膜的脑膜炎球菌中不同菌株的Msf蛋白识别。显示了几种血清群B过表达Msf的Nm的直接结合并且澄清了其表型(还参见表1)。菌株G7-2是英国分离株MO1-240101的衍生物，而G7-3和G7-4是菌株H44/76衍生的；G7-3表达MO1-240101 Msf且G7-4表达菌株B16B6 Msf。通过ELISA测定它们与固定的VA-26的结合。因为Opc不结合该肽，仅可以看到Msf介导的结合。此外，监测分离株中表达的Opc水平并且发现是较低的或可忽略不计的。

图4. Msf与合成的玻连蛋白肽AR-36的直接相互作用。A.将合成生物素化的肽AR-36(跨越人Vn的主要肝素结合区域内的Vn残基A360-R395；参见优先权文件的附录1)和对照肽SY-30(下面显示了AR-36和SY-30序列)固定在extravidin包被的板上，并且用两种无荚膜H44/76 (GB)表型Msf+Opc+ (虚线)和Msf+Opc- (实线)覆盖。使用抗Nm抗血清检测细菌结合。可以看到AR36比对照肽显著更高的结合，并且单独Msf表达似乎对于与肽的结合是足够的，因为Msf+Opc+和Msf+Opc- Nm以相同的程度结合。该数据与Opc可以仅通过经由肝素桥联而靶向HBD的以前的观察结果一致(Sa E Cunha, Griffiths等人2010)。也观察到Msf/Opc双突变体的低水平结合，当其从Msf表达菌的结合水平减去时，显著结合仍然是明显的(B)。

图5. 纯化的重组Msf蛋白结合活化的人血清玻连蛋白，但不结合簇蛋白。A. 将纯化的新鲜制备的重组Msf(活性Msf，A)和变性的Msf蛋白固定在硝酸纤维素上，并且用2.5 µg/ml的aVn或簇蛋白(Cln)覆盖。用多克隆抗Vn抗体或针对簇蛋白的mAb检测以宿主蛋白的结合。纯化的重组Msf当正确折叠时结合人玻连蛋白；结合对于活化的Vn是特异性的，因为它不结合Cln。插图显示了纯化的重组Opc与Vn、但非Cln的相似的特异性结合。B. aVn的Msf浓度依赖性结合。如所示将固定的重组Msf点在硝酸纤维素上，并且用2.5 µg/ml aVn覆盖，并且如上所述检测其结合。

图6. 表达Msf的脑膜炎球菌结合显著水平的来自人血清的aVn；表达Msf的分离株的aVn依赖的血清耐受性。A. 将5x10⁹所示表型的细菌在去补体的10%合并的人血清(PHS)中孵育1h，收获并洗涤，然后通过斑点印迹分析结合的血清蛋白(GB是无荚膜的且G7-4是有荚膜的H44/76菌株)。只有表达Msf的无荚膜和有荚膜的Nm结合通过mAb 8E6结合分析的aVn。B和C. 使用5% PHS如附录2中所述评价无荚膜的H44/76分离株在没有添加Vn的PHS中(在B中显示为–Vn)的相对血清耐受性和在aVn存在的情况下(在B中+Vn)的增加的血清耐受性。四种无荚膜H44/76表型的血清耐受性的比较(B)。当用aVn补充血清时无荚膜的H44/76表达Msf的Nm在10%血清中的血清耐受性的持久性(C)。D. H44/76完全荚膜表型的过表达异源菌株B16B6 Msf的血清耐受性。亲本表型G7-4表达Opc，但水平较低。

图7. Msf以aVn浓度依赖的方式增加血清耐受性。在标准SBA中，将1000个细菌暴露于如所示有或没有添加aVn的PHS(5％)。10 min后将存活细菌铺板，用于计数存活细菌。显示一式三份估计值的平均值和SE。

图8. Msf和/或Opc表达为脑膜炎球菌赋予了相当大的存活潜能。使用其中非表达菌占优势的初始群体评价4种表型(无荚膜的H44/76衍生物GB系列)的相对存活。SBA使用标准条件，但在实验开始时(T=0 min)含有8x10³ cfu/100µl。在10 min暴露于10% PHS或10µg/ml补充aVn的PHS结束时将总的孔内容物铺板，培养且计数。数据是两次单独估计值的平均值，值的范围在平均值的15％之内。

图9. 补体因子C3和C9沉积。将所示的脑膜炎球菌衍生物在有或没有添加aVn的10％PHS中孵育8 min。冷却样品以终止补体沉积，并且在冷PBS中洗涤，然后点样至硝酸纤维素膜上用于用针对C9-新抗原的mAb或多克隆抗C3抗体覆盖。(A)在没有添加aVn的PHS(-Vn)和补充aVn的PHS (+Vn)中在H44/76无荚膜表型的四种衍生物上的MAC沉积。(B)当补充Vn的血清与未补充的PHS相比较时，抗C9和抗C3抗体结合的相对减少。

图10. 有荚膜的表达Msf的MC58和H44/76分离株通过结合aVn延迟MAC沉积。A. 如图9图注中概述的，测定在H44/76和MC58菌株的无荚膜和有荚膜表型上的MAC沉积的比较。有荚膜衍生物暴露于血清15分钟，而无荚膜衍生物暴露8分钟。通过提出与双突变体相比Msf/Opc表型的MAC结合的百分比减少而说明Msf和Opc蛋白的作用。B和C. 如通过使用抗C9单克隆和多克隆抗体而评价的，来自去补体的PHS (DS)、10% PHS或补充10µg/ml aVn 的10% PHS的有荚膜H44/76衍生物G7-4和G7-4Δχ上的MAC沉积。表型G7-4过表达菌株B16B6 Msf且具有低水平的Opc，而G7-4Δχ是Msf++ Opc突变体。

图11. 合成的Vn肽VA-26恢复补充aVn的血清中的MAC沉积。使用图9图注中描述的方法，在去补体的血清(DS)或在如所示没有或有进一步补充物的10% PHS中检查有荚膜H44/76衍生物G7-4Δχ上的MAC沉积。当添加时，活化的Vn以10µg/ml存在且肽VA-26(在图2图注中所示的序列)和MV-14(下面所示序列)以25 µg/ml存在。显示两次代表性实验之一的一式三份估计值的平均值和SE。

MV-14肽序列：Bio-MDFPVDTTEGPQRV (SEQ ID NO:14)。

图12.在有荚膜和无荚膜的表达Msf的表型中不同Opc水平的影响。将菌株MC58和H44/76的不同分离株在有或没有aVn的PHS中孵育，并且在暴露于PHS或PHS+aVn 10 min (无荚膜Nm)和30 min (有荚膜Nm)后测定细菌存活。

发明详述

本发明人已经发现，奈瑟氏球菌Hsf抗原(本文中也称为Msf)结合宿主玻连蛋白，并且该抗原(和与玻连蛋白的Opc结合组合)可以解释奈瑟氏球菌的基于玻连蛋白的补体介导的杀死耐受性。因此，提议如下疫苗，其包含这2种主要耐受性因子(Hsf和Opc)，其可以诱导宿主抗体，所述宿主抗体将靶向这些因子，以便使这些系统失活并促进宿主中奈瑟氏球菌病原体的补体介导的杀死。进一步已知的奈瑟氏球菌耐受性因子是因子H结合蛋白(FHbp)，其结合因子H并且也有助于补体介导的杀死耐受性。因此进一步提议通用疫苗，其进一步包含FHbp以诱导宿主抗体，所述宿主抗体将通常靶向这些因子，以便使基于玻连蛋白和因子H的系统失活并促进宿主中奈瑟氏球菌病原体的补体介导的杀死。

相应地，提供了免疫原性组合物，包含奈瑟氏球菌Hsf和Opc抗原，和任选的奈瑟氏球菌FHbp抗原(其可以使两种已知的免疫学家族A或B中的任一种或两种)。

Hsf抗原可以来自脑膜炎奈瑟氏球菌，特别是血清群B。Hsf抗原可以是多肽，所述多肽包含：

a)SEQ ID NO:2的氨基酸序列(来自Nmen菌株H44/76的Hsf)，

b)与SEQ ID NO:2具有至少80、85、90、95、或99％的序列同一性的氨基酸序列，或

c)SEQ ID NO:2的至少10、15、20、25、30个连续氨基酸的免疫原性片段。

本发明的Hsf抗原能够引发抗体，所述抗体可以抑制人玻连蛋白与SEQ ID NO:2的多肽的结合和/或可以抑制人玻连蛋白与在其外膜内表达SEQ ID NO:2的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。Hsf抗原可以以如下剂量存在于免疫原性组合物中：所述剂量足以在人宿主中引发抗体，所述抗体可以抑制人玻连蛋白与Hsf(例如SEQ ID NO:2的多肽)的结合和/或可以抑制人玻连蛋白与在其外膜内表达Hsf(例如SEQ ID NO:2的多肽)的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。在这方面，可以通过使用本发明的组合物生成的血清[来自人，或任何合适的动物模型来源]寻找结合的抑制而在体外试验中测试血清(例如，使用对于本领域技术人员众所周知或与实施例中描述的那些类似的技术。

Opc抗原可以来自脑膜炎奈瑟氏球菌，特别是血清群B。

Opc抗原可以是多肽，所述多肽包含：

a)SEQ ID NO:4的氨基酸序列(来自Nmen菌株H44/76的Opc)，

b)与SEQ ID NO:4具有至少80、85、90、95、或99％的序列同一性的氨基酸序列，或

c)SEQ ID NO:4的至少10、15、20、25、30个连续氨基酸的免疫原性片段。

本发明的Opc抗原能够引发抗体，所述抗体可以抑制人玻连蛋白与SEQ ID NO:4的多肽的结合和/或可以抑制人玻连蛋白与在其外膜内表达SEQ ID NO:4的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。Opc抗原可以以如下剂量存在于免疫原性组合物中：所述剂量足以在人宿主中引发抗体，所述抗体可以抑制人玻连蛋白与Opc (例如SEQ ID NO:4的多肽)的结合和/或可以抑制人玻连蛋白与在其外膜内表达Opc(例如SEQ ID NO:4的多肽)的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。在这方面，可以通过使用本发明的组合物生成的血清[来自人，或任何合适的动物模型来源]寻找结合的抑制而在体外试验中测试血清(例如，使用对于本领域技术人员众所周知或与实施例中描述的那些类似的技术。

FHbp抗原可以来自脑膜炎奈瑟氏球菌，特别是血清群B。它可以与已知的家族A型或家族B型相关，或者本发明的组合物中可以并入来自两个家族的FHbp。家族分类一般描述于Journal of Infectious Diseases 2009，第200卷，第3期，第379-389页。

本发明的FHbp家族A抗原可以是多肽，所述多肽包含：

a)SEQ ID NO:5的氨基酸序列(来自Nmen菌株8047的FHbp)，

b)与SEQ ID NO:5具有至少70、80、85、90、95、或99％的序列同一性的氨基酸序列，或

c)SEQ ID NO:5的至少10、15、20、25、30个连续氨基酸的免疫原性片段。

本发明的FHbp家族B抗原可以是多肽，所述多肽包含：

a)SEQ ID NO:6的氨基酸序列(来自Nmen菌株MC58的Fhbp)，

b)与SEQ ID NO:6具有至少70、80、85、90、95、或99％的序列同一性的氨基酸序列，或

c)SEQ ID NO:6的至少10、15、20、25、或30个连续氨基酸的免疫原性片段。

本发明的FHbp家族A抗原能够引发抗体，所述抗体可以抑制人因子H与SEQ ID NO:5的多肽的结合和/或可以抑制人因子H与在其外膜内表达SEQ ID NO:5的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。本发明的FHbp家族B抗原能够引发抗体，所述抗体可以抑制人因子H与SEQ ID NO:6的多肽的结合和/或可以抑制人因子H与在其外膜内表达SEQ ID NO:6的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。本发明的FHbp家族A抗原可以以如下剂量存在于免疫原性组合物中：所述剂量足以在人宿主中引发抗体，所述抗体可以抑制人因子H与FHbp家族A(例如SEQ ID NO:5的多肽)的结合和/或可以抑制人因子H与在其外膜内表达FHbp家族A (例如SEQ ID NO:5的多肽)的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。本发明的FHbp家族B抗原可以以如下剂量存在于免疫原性组合物中：所述剂量足以在人宿主中引发抗体，所述抗体可以抑制人因子H与FHbp家族B (例如SEQ ID NO:6的多肽)的结合和/或可以抑制人因子H与在其外膜内表达FHbp家族B(例如SEQ ID NO:6的多肽)的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。在这方面，可以通过使用本发明的组合物生成的血清[来自人，或任何合适的动物模型来源]寻找结合的抑制而在体外试验中测试血清(例如，使用对于本领域技术人员众所周知或与实施例中描述的那些类似的技术。

本发明的抗原可以作为纯化的亚单位抗原存在或存在于外膜囊泡制剂的外膜内。

外膜制剂内的Hsf抗原可以从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株在外膜中以与菌株H44/76中相同或比其更高的水平表达Hsf。其在外膜囊泡内可能被上调(优选重组地上调)。外膜制剂可以从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株具有多于一个拷贝的编码Hsf抗原的hsf基因，或者具有在异源启动子(即通常不驱动该基因表达的启动子)控制下的hsf基因。优选地，异源启动子是比hsf基因启动子更强的启动子。

外膜制剂内的Opc抗原可以从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株在外膜中以与菌株H44/76或菌株C751(在Sa E Cunha等人PLoS Pathogens 第6卷 2010 e1000911中所述的Opc+菌株)中相同或比其更高的水平表达Opc。尽管Opc的表达在脑膜炎奈瑟氏球菌中可以被天然地下调，但是表达Opc的菌株倾向于从鼻咽部分离。此外，可以用于本发明中的表达Opc的菌株/细胞可以使用已知的菌落印迹技术(例如如Rosenqvist等人.I&I 第63卷 1995 第4642-4652页的方法和材料的“Meningococcal strains”部分中所述)容易地发现。

本发明的Opc抗原在外膜囊泡内可能被上调(优选重组地上调)。本发明的外膜制剂可以从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株具有多于一个拷贝的编码Opc抗原的opc基因，或者具有在异源启动子控制下的opc基因。异源启动子还具有比野生型启动子更稳定的潜在优势。优选地，异源启动子是比opc基因启动子更强的启动子。

本发明的一种或多种外膜制剂可以从一种或多种奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株在外膜中以与菌株8047(对于FHbp家族A)或MC58(对于FHbp家族B)中相同或比其更高的水平表达FHbp(Fhbp家族A和/或FHbp家族B)。FHbp(Fhbp家族A和/或FHbp家族B)抗原在一种或多种外膜囊泡内可能被上调(优选重组地上调)。本发明的一种或多种外膜制剂可以从一种或多种奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株具有多于一个拷贝的fhbp(多于一个fhbp家族A和/或多于一个fhbp家族B)基因，所述基因编码FHbp(FHbp家族A和/或FHbp家族B)抗原，或者具有在异源启动子-优选比fhbp(fhbp家族A和/或fhbp家族B)基因启动子更强的启动子的控制下的fhbp(fhbp家族A和/或fhbp的家族B)基因。

可以通过收集由细菌自然脱落的OMV(NOMVs)制备或者可以由去污剂 - 通常是脱氧胆酸盐(DOC)提取本发明的外膜囊泡(OMV)制剂。使用的去污剂(例如DOC)的浓度可以是0-0.5%、0.1-0.4%、或0.2-0.3%，特别是约或恰好0、0.1、0.2、0.3、0.4或0.5% DOC。更高水平将从可以具有反应原性的疱(bleb)去除LOS。更低水平将保留大量的脂蛋白如FHbp。

OMV制剂优选从不能产生(或已经进行工程改造以不产生)荚膜多糖的菌株制备。此外，优选从OMV去除免疫显性的可变抗原以改善免疫应答-例如PorA和/或FrpB。可以通过在OMV生产菌株中缺失msbB和/或htrB基因的功能性表达而减毒本发明的OMV内的LOS。

本发明的免疫原性组合物还可以包含奈瑟氏球菌(例如脑膜炎奈瑟氏球菌)NspA和/或PilC [WO01/09350, WO2004/014418] (在亚单位或外膜囊泡组合物中)。这些蛋白也可以参与结合因子，所述因子可以补充奈瑟氏球菌的补体介导杀死耐受性。

本发明的免疫原性组合物还可以包含一种或多种细菌荚膜多糖或寡糖，特别是源自选自下列的细菌的那些荚膜多糖或寡糖：脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135、流感嗜血杆菌b(Haemophilus influenzae b)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、A组链球菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcas aureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoaus epidermidis)。这些可以与蛋白载体缀合(T-细胞表位的提供者)。

使用本发明的免疫原性组合物，本发明提供了在人宿主中治疗或预防奈瑟氏球菌(脑膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌)疾病的进一步方法(或相关的医疗用途)。鉴于玻连蛋白和因子H可以被奈瑟氏球菌病原体使用以粘附至人内皮细胞并且传递通过进入身体的不同区室中(例如，进入脑膜)，本发明的免疫原性组合物可以用于在预防这样的粘附和/或用于预防脑膜炎奈瑟氏球菌脑膜炎中的使用。本发明的组合物也可以清楚地用于降低奈瑟氏球菌的补体介导的杀死耐受性(通过玻连蛋白和/或因子H结合机制)，和用于奈瑟氏球菌病原体的改进的补体介导的杀死。

还提供了药物组合物，其包含对于本发明的Hsf和Opc特异性的抗体，其可以用于医疗治疗或预防，或本文所述的其他用途。

在本文中具体提到蛋白的情况下，优选地是指天然的、全长蛋白及其天然变体(即，可从奈瑟氏球菌、优选地脑膜炎球菌菌株获得的天然蛋白)，但是它还可包括其抗原片段(特别是在亚单位疫苗的背景下)。这些是含有或包含邻接地取自所述蛋白的氨基酸序列的至少10个氨基酸，优选地20个氨基酸、更优选地30个氨基酸、更优选地40个氨基酸或最优选地50个氨基酸的片段(在本文中常常具体描述)。此外，抗原片段是指与下述抗体免疫反应的片段：针对奈瑟氏球菌全长蛋白产生的抗体，或用奈瑟氏球菌感染哺乳动物宿主产生的抗体。抗原片段还包括这样的片段：当以有效剂量施用时，其引发针对奈瑟氏球菌感染的保护性免疫应答，更优选地，它可保护免于脑膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染，最优选地，它可保护免于脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B感染。

本发明还包括本发明的奈瑟氏球菌蛋白的重组融合蛋白或其片段。这些可将不同的奈瑟氏球菌蛋白或其片段组合在同一多肽中。或者，本发明还包括奈瑟氏球菌蛋白的单一融合蛋白或其片段，作为含有异源序列的融合蛋白，所述异源序列例如T-细胞表位或纯化标签的体供者，例如：β-半乳糖苷酶、谷胱甘肽-S-转移酶、绿色荧光蛋白(GFP)，表位标签诸如FLAG、myc标签、多组氨酸，或病毒表面蛋白如流感病毒血细胞凝集素、破伤风类毒素、白喉类毒素、CRM197。

本发明的抗原

MB(和GNA)参考文献引用参考文献编号，其序列可以从www.neisseria.org访问。

NspA描述于WO96/29412。PilC描述于Mol. Microbiol.1997, 23; 879-892。

Hsf

Hsf (WO99/31132) (NMB 0992) 具有与自体转运蛋白共用的结构：信号序列、过客结构域和用于附着到外膜的锚定结构域。例如，来源于脑膜炎奈瑟氏球菌菌株H44/76的Hsf由下述部分组成：由氨基酸1-51构成的信号序列，表面暴露且含有可变区(氨基酸52-106、121-124、191-210和230-234)的在成熟蛋白(氨基酸52-479)氨基末端的头区，颈区(氨基酸480-509)，疏水的α-螺旋区(氨基酸518-529)，和其中4个跨膜链跨越外膜的锚定结构域(氨基酸539-591)。

虽然全长Hsf可用于本发明的免疫原性组合物中，但是还可以有利地使用各种Hsf截短物和缺失物，这取决于疫苗的类型。

在Hsf用于亚单位疫苗中的情况下，优选的是，使用可溶性过客结构域的部分；例如氨基酸52-479的完全结构域，最优选地其保守部分，例如特别有利的氨基酸134-479的序列。Hsf的优选的形式可以被截短，以缺失在WO01/55182中公开的蛋白的可变区。优选的变体可以包括在WO01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。上述序列和下面描述的那些可在N或C末端的任何一端或两端处延伸或截短最多达1、3、5、7、10或15个氨基酸。

Hsf的优选的片段因此包括Hsf的整个头区，优选地包含氨基酸52-473。Hsf的其他优选的片段包括表面暴露的头区，包括一个或多个下列氨基酸序列：52-62、76-93、116-134、147-157、157-175、199-211、230-252、252-270、284-306、328-338、362-391、408-418、430-440和469-479。

在Hsf存在于外膜囊泡制剂中的情况下，它可被表达为全长蛋白，或优选地作为由氨基酸1-51和134-591的融合体组成的有利的变体(产生氨基酸序列134至C末端的成熟外膜蛋白)。Hsf的优选的形式可被截短，从而缺失WO01/55182中公开的蛋白的可变区。优选的变体可以包括WO01/55182中限定的1、2、3、4、或5个可变区的缺失。优选地，所述第一个和第二个可变区缺失。优选的变体是使氨基酸序列52-237或54-237之间的残基缺失，更优选地使氨基酸52-133或55-133之间的残基缺失。所述成熟蛋白可缺少信号肽。

因此，本发明的一种优选方法是，用于产生疱内缀合的LOS(优选地脑膜炎球菌)的方法，该方法包括下述步骤：在有EDAC/NHS存在下，在pH 7.0-pH 9.0(优选地约pH 7.5)的pH，在1-5% (优选地约3%)蔗糖中，且任选在基本上没有NaCl(如上所述)的条件下，使疱缀合，并从反应混合物中分离缀合的疱。

所述反应随后使用抗-LOS(例如，抗-L2或抗-L3)mAb在反应混合物的Western分离凝胶上进行，其显示随着反应时间的进行，疱中LOS的比例增大，LOS的分子量增加。

使用这种技术可回收的99%疱的产率。

人们发现EDAC是一种极好的疱内交联剂，这是因为它使LOS与OMP充分交联，用于提高LOS T-依赖性免疫原性，但不会使它交联至非常高的程度而导致如滤过率较差、聚集和疱间交联的问题发生。所产生的疱的形态学与未缀合的疱相似(利用电子显微镜)。此外，上述方案避免了发生过度交联(其可降低天然存在于疱表面上的保护性OMP，例如TbpA或Hsf的免疫原性)。

因子H结合蛋白(已知为FHbp、GNA1870、NMB 1870)

在本文中，将FHbp蛋白分成2个家族，A和B。在一个方面，所述家族分类公开在：“Sequence Diversity of the Factor H Binding Protein Vaccine Candidate in Epidemiologically Relevant Strains of Serogroup B Neisseria meningitides. The Journal of infectious diseases 2009, 第200卷, 第3期, 第379-389页”。

在一个方面，在成熟序列的区域136–254上评估家族同一性。在一个方面，基于从成熟蛋白的氨基酸136至C末端的fHbp序列，在相同家族中的蛋白具有> 80%同一性。在一个方面，基于从成熟蛋白的氨基酸136至C末端的fHbp序列，在不同家族中的蛋白具有50 - 75%同一性。

在一个方面，在成熟序列的区域113 - 135上评估家族同一性。在一个方面，基于fHbp的成熟氨基酸序列的区域113 - 135，在相同家族中的蛋白具有> 69%同一性。

在一个方面，基于fHbp的成熟氨基酸序列的区域113 - 135，在不同家族中的蛋白具有< 20%同一性。

在一个方面，通过一个或多个下述氨基酸的存在，可以区分家族A和B:

在一个方面，家族A和B在区域113–135中包含下述共有序列：

家族B序列的一个实例(SEQ ID NO. 6)是菌株MC58。

家族B菌种的其他实例包括：菌株H44/76、M982、M060240006、03s-0408，且其他实例是技术人员众所周知的。

家族A序列的一个实例(SEQ ID NO. 5)是菌株8047：

家族A菌种的其他实例包括：菌株M1239、M981、M08_240117、M97252153，且其他实例是技术人员众所周知的。

Opc

Opc是具有五个表面暴露的环且结合玻连蛋白的β桶家族的跨膜蛋白(Sa E Cunha等人.2010 PLoS Pathogens 第6卷 e1000911; Prince等人.PNAS USA 2002 99:3417-3421)。该蛋白天然是碱性的，并且具有突出的表面环2。可以用于本发明的组合物中(特别是作为亚单位成分)的Opc的免疫原性片段包括这些5个表面暴露的环中的一个或多个 – 特别是参与结合玻连蛋白的环2。Opc的表面环一起可以形成带正电荷的缝隙，所述缝隙可以容纳带负电荷的分子。已经显示Opc在体外结合人上皮细胞上的肝素样分子和硫酸肝素蛋白聚糖(HSPG)。

玻连蛋白是更丰富的血浆蛋白之一，在人中以200-400 μg/mL循环，并且构成血浆总蛋白的0.2-0.5％。

免疫原性组合物

免疫原性组合物是包含至少本发明的Hsf和Opc抗原的组合物，所述组合物当施用于宿主时能够产生免疫应答。优选地，这样的免疫原性制剂能够产生免于奈瑟氏球菌、优选脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌感染的保护性免疫应答。

亚单位组合物

本发明的免疫原性组合物可以是亚单位组合物(或者可以是亚单位组合物与外膜囊泡(或疱)制剂的混合物)。

亚单位组合物是这样的组合物：在混合这些组分形成抗原组合物之前，其中所述组分已经分离和纯化至至少50%，优选地至少60%、70%、80%、90%的纯度。

亚单位组合物可以是水溶性蛋白的水溶液。它们可包含去污剂、优选地非离子型、两性离子型或离子型去污剂，以便使抗原的疏水部分溶解。它们可包含脂质，使得可以形成脂质体结构，使抗原以跨越脂膜的结构呈现。

外膜囊泡制剂

脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B(menB)分泌足量的外膜疱，从而使得能够以工业规模制造它们。外膜囊泡还可经由用去污剂提取细菌细胞的方法制备(参见例如EP 11243)。

本发明的免疫原性组合物还可以包含外膜囊泡制剂，其具有已经上调、优选重组上调的本发明的抗原。这种制剂还可任选地包括LPS免疫型L2和LPS免疫型L3之一或两者。

通过技术人员众所周知的任何方法，可以制备来源于奈瑟氏球菌菌株的疱制剂。优选地使用在下述文献中公开的方法：EP 301992, US 5,597, 572, EP 11243或US 4,271, 147, Frederikson等人(NIPH Annals [1991], 14:67-80), Zollinger等人(J. Clin. Invest. [1979], 63:836-848), Saunders等人(Infect. Immun. [1999], 67:113-119), Drabick等人(Vaccine [2000], 18:160-172)或WO 01/09350 (实施例8)。通常，使用去污剂(优选地脱氧胆酸盐)提取OMV，且任选酶促去除核酸。通过超速离心，任选接着进行大小排阻层析法，实现纯化。如果包括本发明的2种或更多种不同的疱，则它们可在单一容器中组合，以形成本发明的多价制剂(尽管如果本发明的不同疱是处于单独容器中的单独组合物(它们是在同时[同一次拜访从业人员]施用于宿主)，制剂也被认为是多价的)。通常通过0.2 μm滤器过滤而使OMV制剂灭菌，且优选地贮存在蔗糖溶液(例如3％)中，该蔗糖溶液已知可使疱制剂稳定化。

可以通过将基因的附加拷贝插入到衍生出OMV制剂的奈瑟氏球菌菌株中而实现蛋白在外膜囊泡制剂内的上调。或者，可将衍生出OMV制剂的奈瑟氏球菌菌株中的基因启动子交换成更强的启动子。这种技术在WO01/09350中描述。与从未修饰的脑膜炎奈瑟氏球菌(例如菌株H44/76)衍生出的OMV中存在的蛋白水平相比，蛋白的上调将导致OMV中存在更高水平的蛋白。优选地，所述水平高1.5、2、3、4、5、7、10或20倍。

在LPS是OMV中的附加抗原的情况下，使用低浓度的提取去污剂(例如，脱氧胆酸盐或DOC)的方案可优选地用于OMV制备方法中，以便保持高水平的结合的LPS，同时去除特别有毒的、结合较差的LPS。所用DOC的浓度优选地是0-0.5% DOC、0.02-0.4% DOC、0.04-0.3% DOC，更优选地，0.06%-0.2% DOC或0.08-0.15% DOC，最优选地约或恰好0.1%DOC。对于除去LPS，应当使用0.5% DOC。

“更强的启动子序列”是指，增加编码目的抗原的基因转录的调节控制元件。

“上调表达”是指，相对于未修饰的(即天然存在的)疱而言，增加目的抗原表达的任何方式。“上调”的量随特定目的抗原而变化，但不会超出破坏疱的膜完整性的量。抗原的上调是指，与未修饰的疱相比，高至少10％的表达。优选地，高至少50％。更优选地，高至少100％(2倍)。最优选地，高3、4、5、7、10、20倍。

又为了清楚的目的，术语“工程改造细菌菌株以生产更少的所述抗原”或下调是指，相对于未修饰的(即天然存在的)疱而言，优选地通过缺失而减少目的抗原表达(或功能性基因产物的表达)的任何方式，使得表达比未修饰的疱低至少10％。优选地，低至少50％，且最优选地完全缺乏。如果下调的蛋白是酶或功能性蛋白，则下调可通过引入一种或多种突变而获得，所述突变导致酶活性或功能活性降低10%、20%、50%、80%或优选地 100%。

调节奈瑟氏球菌蛋白表达所需的工程改造步骤可以以技术人员已知的各种方式进行。例如，可插入序列(例如，启动子或开放读码框)，并通过转座子插入技术来破坏启动子/基因。例如，为了上调基因的表达，可经由转座子将强启动子插入到基因起始密码子的上游最多达2kb (更优选地上游200-600bp，最优选地上游约400bp)。还可利用点突变或缺失(特别是用于下调基因的表达)。

然而，这种方法可能相当不稳定或不确定，且因此，优选的是经由同源重组事件进行工程改造步骤。优选地，该事件发生在细菌染色体上至少30个核苷酸的序列(重组发生区)和在菌株内转化的载体上至少30个核苷酸的序列(第二重组发生区)之间。优选地，所述区域是40-1000个核苷酸，更优选地100-800个核苷酸，最优选地500个核苷酸)。这些重组发生区应当足够相似，使得它们能够在高度严谨的条件下彼此杂交。

在WO01/09350中描述了用于进行本文所述的遗传修饰事件的方法(如通过重组事件和将其他基因序列引入到奈瑟氏球菌基因组中而将基因上调或下调)。可在奈瑟氏球菌中整合的典型强启动子是porA、porB、IgtF、Opa、p110、lst和hpuAB。PorA和PorB是优选的组成型强启动子。已经确定，PorB启动子活性被包含在与PorB的起始密码子上游的核苷酸-1至-250相对应的片段中。

可变的和非保护性的免疫显性抗原的下调 / 去除

很多表面抗原在细菌菌株中是可变的，且因此仅可保护免于有限的紧密相关的菌株集合。本发明的一个方面覆盖本发明的外膜囊泡，其中其他蛋白的表达减少，或优选地编码一种或多种可变表面蛋白的一种或多种基因缺失。这种缺失会产生生产疱的细菌菌株，当在疫苗中施用时，所述疱具有更强的针对各种菌株的交叉反应性潜能，这是由于保守蛋白(保留在外膜上)对被接种者的免疫系统施加的更强影响。在本发明的疱免疫原性组合物中可下调的奈瑟氏球菌中的这种可变抗原的实例包括PorA、PorB、Opa。

例如，这些可变或非保护性的基因的表达可被下调，或最终被关闭。这具有将免疫系统集中于更好抗原上的优点，所述抗原仅少量存在于疱外表面上。下调还指，上述外膜蛋白的表面暴露的、可变的免疫显性环可被改变或缺失，从而使产生的外膜蛋白免疫显性更低。

在WO01/09350中公开了下调表达的方法。在本发明的疱免疫原性组合物中被下调的优选蛋白组合包括PorA和OpA；PorA和FrpB；OpA和FrpB；PorA和OpA和FrpB。

已知4种不同的Opa基因存在于脑膜炎球菌基因组中(Aho等人，1991 Mol. Microbiol. 5:1429-37)，因此当提到Opa的表达被下调时，它是指，优选地存在于脑膜炎球菌中的1、2、3或(优选地)全部4个基因都被这样下调。可以如WO01/09350所述遗传地，或通过查找很容易发现的、天然的、稳定的脑膜炎球菌菌株而进行这种下调，所述菌株具有较低的或没有来自Opa基因座的表达。使用Poolman等人(1985 J. Med. Micro. 19:203-209)描述的技术，可以发现这种菌株，其中Opa^-细胞具有与表达Opa的细胞不同的表型，这可通过在平板上或显微镜下观察细胞外观而见到。一旦发现，在进行发酵以使Opa缺失后，通过对细胞内容物进行蛋白印迹可以显示出该菌株是稳定的Opa^-。

在通过在铁限制条件下生长而实现外膜囊泡中某些抗原的上调的情况下，可变蛋白FrpB(Microbiology 142; 3269-3274, (1996); J. Bacteriol. 181; 2895-2901 (1999) )也可被上调。发明人已经发现，如WO01/09350所述下调整个FrpB蛋白的表达，或通过使FrpB的一个或多个可变区缺失，在这些环境下下调FrpB表达是有利的。这将确保，由所述免疫原性组合物引发的免疫应答是针对存在于大范围菌株中的抗原。

在本发明的可替代实施方案中，在外膜囊泡中的FrpB被下调，所述外膜囊泡已经从不是在铁限制条件下生长的奈瑟氏球菌菌株制备。

LPS 的解毒

经由WO01/09350公开的LPS解毒方法，可将本发明的免疫原性组合物中的疱解毒。具体地，本发明的LPS解毒方法包括：使WO01/09350中公开的htrB和/或msbB酶被下调/缺失。奈瑟氏球菌的msbB和htrB基因还分别被称作lpxL1和lpxL2 (WO 00/26384)，且通过失去一个仲酰基链的msbB-突变体LOS和失去两个仲酰基链的htrB-突变体LOS，从表型方面表征这些基因的缺失突变。WO 93/14155和WO 95/03327描述了可用于本发明组合物中的多粘菌素B的无毒肽功能性等价物。

这种方法优选地与疱提取方法组合，所述疱提取方法包括使用低水平的DOC、优选地0-0.3%DOC、更优选地0.05%-0.2%DOC、最优选地约或恰好0.1%DOC。

交叉反应性多糖

从有荚膜的革兰氏阴性细菌中分离出细菌外膜疱，常常导致荚膜多糖的共纯化。在某些情况下，这种“污染”材料可证明是有用的，因为多糖可提高由其他疱组分产生的免疫应答。然而在其他情况下，污染性多糖材料在细菌疱制剂中的存在可证明对疱在疫苗中的应用是有害的。例如，已经显示，至少在脑膜炎奈瑟氏球菌的情况下，血清群B荚膜多糖不会赋予保护性免疫，且容易在人类中诱导不利的自身免疫应答。因此，可将本发明的外膜囊泡从细菌菌株中分离出来用于疱生产，所述菌株已被工程改造，使得其没有荚膜多糖。所以所述疱适用于人类。这种疱制剂的特别优选的实例是来源于没有荚膜多糖的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B的疱制剂。

这可通过使用修饰的疱生产菌株实现，在所述菌株中，荚膜生物合成和/或输出所需的基因已损坏。通过(优选地使用上述同源重组技术)使控制区、编码区或两者发生突变(点突变、缺失或插入)，或通过降低这种基因的酶功能的任何其他方式，可以实现编码荚膜多糖生物合成或输出的基因的失活。此外，通过反义过表达或转座子诱变，还可实现荚膜生物合成基因的失活。优选的方法是，使多糖生物合成及输出所需的脑膜炎奈瑟氏球菌cps基因的一部分或全部缺失。就该目的而言，置换质粒pMF121(在Frosh等人1990, Mol. Microbiol. 4:1215-1218中所述)可用于递送使cpsCAD (+ galE)基因簇缺失的突变。

已经质疑针对L3或L2 LPS所产生的抗体的安全性，这是由于与存在于人鞘糖脂中的乳糖-N-新四糖寡糖基团(Galβ1-4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1- )相似的结构的存在。即使已经有很多人安全接种了脱氧胆酸盐提取的含有残余量L3 LPS的囊泡疫苗(G. Bjune等人, Lancet (1991), 338,1093-1096; GVG. Sierra等人, NIPH ann (1991), 14,195-210)，LOS糖末端部分的缺失可有利地防止与存在于人组织表面处的结构的任何交叉反应。在一个优选的实施方案中，lgtB基因的失活会产生中间体LPS结构，其中缺少末端半乳糖残基和唾液酸(突变留下L2和L3 LOS中的4GlcNAcβ1-3Galβ1-4Glcβ1-结构)。这种中间体可在L3和L2 LPS菌株中获得。通过关闭IgtE基因，可以获得LPS的替代性的且次优选的(短的)版本。通过关闭lgtA基因，可以获得LPS的其他替代性的且次优选的版本。如果选择这种lgtA^-突变，优选地还关闭lgtC表达，从而防止形成非免疫原性的L1免疫型。

lgtB^-突变体是最优选的，因为发明人已经发现，这是用于解决安全性问题同时仍然保留仍可诱导杀菌抗体应答的LPS保护性寡糖表位的最佳截短体。

因此，还包含L2或L3制剂(无论是纯化的或在分离的疱中)或脑膜炎球菌疱制剂的本发明的免疫原性组合物通常有利地来源于奈瑟氏球菌菌株(优选地脑膜炎球菌)，所述菌株已被基因工程改造以永久性下调来源于lgtB、lgtA、galE或lgtE基因的功能性基因产物的表达，优选地通过关闭所述基因，最优选地通过使所述基因的启动子和/或开放读码框的全部或部分缺失。

在本发明的上述免疫原性组合物来源于脑膜炎球菌B菌株的情况下，还优选地去除荚膜多糖(其还包含人-样糖结构)。虽然可将很多基因关闭以实现此目的，但是发明人已经有利地显示，优选地已将疱生产菌株进行基因工程改造以永久下调siaD基因的功能性基因产物的表达(即，下调α-2-8聚唾液酸转移酶活性)，优选地通过关闭所述基因，最优选地通过使所述基因的启动子和/或开放读码框的全部或部分缺失。在WO 01/09350中描述了这种失活。siaD(也被称作synD)突变是可从荚膜多糖去除人-相似表位的多种突变中最有利的，因为它，突变中仅有一种对LOS的保护性表位的生物合成没有作用，因此在最终使用LOS作为保护性抗原的方法中是有利的，且对细菌生长的影响最小。因此本发明的优选方面是上述的疱免疫原性制剂，其来源于lgtE^- siaD^-、lgtA^-siaD^-或优选地lgtB^-siaD^-脑膜炎球菌B突变株。

虽然由于上述原因siaD^-突变是优选的，但也可使用关闭脑膜炎球菌B荚膜多糖合成的其他突变。因此，可将疱生产菌株进行基因工程改造以永久下调来源于下列一种或多种基因的功能性基因产物的表达：ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA (等同于synX和siaA)、synB(等同于siaB)或synC(等同于siaC)基因，优选地通过关闭所述基因，最优选地通过使所述基因的启动子和/或开放读码框的全部或部分缺失。lgtE^-突变可与这些突变中的一种或多种相组合。优选地，lgtB^-突变与这些突变中的一种或多种相组合。因此本发明的另一方面是上述的疱免疫原性制剂，其来源于脑膜炎球菌B的这种组合突变株。所述菌株本身是本发明的另一方面。

含有各种lgt基因(包括lgtB和lgtE)的奈瑟氏球菌基因座及其序列是本领域已知的(参见M. P. Jennings等人, Microbiology 1999,145, 3013-3021和其中引用的参考文献,和J. Exp. Med. 180:2181-2190 [1994])。

在把全长(未截短的)LOS用于最终产品中的情况下，希望LOS没有被唾液酸化(因为这种LOS产生针对大多数危险的、侵袭性脑膜炎球菌B菌株的免疫应答，所述菌株也未被唾液酸化)。在这种情况下，使用具有缺失的synA(等同于synX和siaA)、synB(等同于siaB)或synC(等同于siaC)基因的荚膜阴性菌株是有利的，因为这种突变也可导致menB LOS不能被唾液酸化。

在疱制剂中，特别是在用低浓度DOC提取的制剂中，可使用LPS作为本发明的免疫原性组合物中的抗原。然而，可有利地下调/缺失/失活lgtE、lgtA(特别是与lgtC组合)、或优选地lgtB基因/基因产物的酶功能，以便去除人样乳糖-N-新四糖结构。包含用于生物合成LPS寡糖结构的lgt基因的奈瑟氏球菌基因座(及其序列)是本领域已知的(Jennings等人Microbiology 1999 145; 3013-3021和其中引用的参考文献,和J. Exp. Med.180:2181-2190 [1994] )。lgtB(或功能性基因产物)的下调/缺失是优选的，这是因为它留下完整的LPS保护性表位。

在本发明的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B疱制剂中，siaD和lgtB的下调/缺失是优选的(虽然，在脑膜炎球菌B疱生产菌株中也可使用lgtB^-与ctrA^-、ctrB^-、ctrC^-、ctrD^-、synA^-(等同于synX^-和siaA^-)、synB^-(等同于siaB^-)或synC^-(等同于siaC^-)中的任何一个的组合)，得到具有最佳安全性和LPS保护性表位保留的疱制剂。

因此本发明的另一方面是上述疱免疫原性制剂，其来源于脑膜炎球菌B的这种组合突变株。所述菌株本身是本发明的另一方面。

本发明的免疫原性组合物可包括至少1、2、3、4或5种不同的外膜囊泡制剂。当包括两种或更多种OMV制剂时，本发明的至少一种抗原在每种OMV中被上调。这种OMV制剂可来源于相同种类和血清群的奈瑟氏球菌菌株，或优选地来源于不同种类、血清群、血清型、亚血清型或免疫型的奈瑟氏球菌菌株。例如，免疫原性组合物可包含一种或多种含有免疫型L2的LPS的外膜囊泡制剂和一种或多种含有免疫型L3的LPS的外膜囊泡制剂。L2或L3 OMV制剂优选地来源于稳定的菌株，所述菌株在LPS寡糖合成基因座中具有最小的相变异性。

与亚单位组合物组合的外膜囊泡

本发明的免疫原性组合物还可包含亚单位组合物和外膜囊泡。若干抗原由于它们的溶解性而特别适于包括在亚单位组合物中。这样的蛋白的实例包括本发明的FHbp抗原或Hsf过客结构域。外膜囊泡制剂对于携带完整的膜蛋白如本发明的Hsf、NspA、PilC、Opc抗原是理想的。OMVs也可以经由脂蛋白的脂质尾巴携带FHbp。

本发明的免疫原性组合物

本发明的免疫原性组合物可以包含源自脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、B、C、Y、W-135或淋病奈瑟氏球菌的抗原(蛋白、LPS和多糖)。

进一步组合

本发明的免疫原性组合物还可包含细菌荚膜多糖或寡糖。荚膜多糖或寡糖可来源于下列一种或多种：脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和/或W-135、流感嗜血杆菌b(Haemophilus influenzae b)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)、A组链球菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌(Staphylococcas aureus)和表皮葡萄球菌(Stapylocoaus epidermidis)。

本发明的另一个方面是包含本发明的抗原性组合物和其他抗原的疫苗组合，其可有利地用于针对某些疾病状况，包括与病毒或革兰氏阳性细菌有关的那些。

在一种优选的组合中，本发明的抗原性组合物是用下列脑膜炎球菌荚膜多糖或寡糖(其可以是原样的或与蛋白载体缀合)中的1、2、3或优选地全部4种配制：A、C、Y或W-135。优选地，本发明的免疫原性组合物是用A和C；或C；或C和Y配制。这种含有源自脑膜炎奈瑟氏球菌(优选地血清群B)的蛋白的疫苗可有利地用作通用的脑膜炎球菌疫苗。

在另一个优选的实施方案中，本发明的抗原性组合物(优选地用原样的或缀合的脑膜炎球菌荚膜多糖或寡糖A、C、Y或W-135中的1、2、3或全部4种配制(如上所述))是用缀合的流感嗜血杆菌b荚膜多糖或寡糖和/或一种或多种原样的或缀合的肺炎球菌荚膜多糖或寡糖配制。任选地，所述疫苗还可包含一种或多种蛋白抗原，所述蛋白抗原可保护宿主免于肺炎链球菌感染。这种疫苗可被有利地用作通用脑膜炎疫苗。

在另一个优选的实施方案中，本发明的免疫原性组合物是用来源于下述菌株中的一种或多种的荚膜多糖或寡糖配制：脑膜炎奈瑟氏球菌、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌或表皮葡萄球菌。肺炎球菌荚膜多糖抗原优选地选自：血清型1、2、3、4、5、6B、7F、8、9N、9V、10A、11A、12F、14、15B、17F、18C、19A、19F、20、22F、23F和33F (最优选地选自血清型1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F)。另一个优选的实施方案含有流感嗜血杆菌的PRP荚膜多糖。另一个优选的实施方案含有金黄色葡萄球菌的5型、8型或336荚膜多糖。另一个优选的实施方案含有表皮葡萄球菌的I型、II型或III型荚膜多糖。另一个优选的实施方案含有B组链球菌的Ia型、Ic型、II型或III型荚膜多糖。另一个优选的实施方案含有A组链球菌的荚膜多糖，优选地还包括至少一种M蛋白且更优选地多种类型的M蛋白。

本发明的这种荚膜多糖可以是未缀合的，或与载体蛋白缀合，所述载体蛋白诸如破伤风类毒素、破伤风类毒素片段C、白喉类毒素、CRM197、肺炎球菌溶血素、蛋白D(US6342224)。所述多糖缀合物可通过任何已知的偶联技术制备。例如，可经由硫醚键使多糖偶联。这种缀合方法依靠用1-氰基-4-二甲氨基吡啶鎓四氟硼酸盐(CDAP)活化多糖而形成氰酸酯。活化的多糖可因此与载体蛋白上的氨基直接偶联或经由间隔基团偶联。优选地，使用包括形成硫醚键的杂连接化学方法使氰酸酯与己二胺偶联，并使氨基-衍生的多糖与载体蛋白缀合。在PCT公开申请WO93/15760 Uniformed Services University中描述了这种缀合物。

还可通过如US 4365170(Jennings)和US 4673574(Anderson)中描述的直接还原胺化方法来制备缀合物。其他方法描述在EP-0-161-188、EP-208375和EP-0-477508中。其他方法包括：通过碳二亚胺缩合，使脂肪酸酰肼(ADH)衍生的溴化氰活化的多糖与蛋白载体偶联(Chu C.等人，Infect. Immunity，1983 245-256)。当包括寡糖时，优选地缀合它们。

优选的肺炎球菌蛋白抗原是在肺炎球菌外表面上暴露的那些肺炎球菌蛋白(在肺炎球菌的至少部分生命周期内能够被宿主免疫系统识别)，或是由肺炎球菌分泌或释放的蛋白。最优选地，所述蛋白是毒素、粘附素、2-组分信号转导蛋白、或肺炎链球菌的脂蛋白，或其片段。特别优选的蛋白包括，但不限于：肺炎球菌溶血素(优选地通过化学处理或突变而解毒) [Mitchell等人，Nucleic Acids Res. 1990年7月11日:18(13):4010“Comparison of pneumolysin genes and proteins from Streptococcus pneumoniae types 1 and 2.”，Mitchell等人，Biochim Biophys Acta 1989年1月23日；1007(1):67-72，“Expression of the pneumolysin gene in Escherichia coli:rapid purification and biological properties.”，WO 96/05859(A. Cyanamid)、WO 90/06951 (Paton等人)、WO 99/03884(NAVA)]；PspA及其跨膜缺失变体(US 5804193-Briles等人)；PspC及其跨膜缺失变体(WO 97/09994-Briles等人)；PsaA及其跨膜缺失变体(Berry和Paton, Infect Immun 1996年12月；64(12):5255-62，“Sequence heterogeneity of PsaA, a 37-kilodalton putative adhesin essential for virulence of Streptococcuspneumoniae”)；肺炎球菌胆碱结合蛋白及其跨膜缺失变体；CbpA及其跨膜缺失变体(WO 97/41151、WO 99/51266)；甘油醛-3-磷酸-脱氢酶(Infect. Immun. 1996 64:3544)；HSP70 (WO 96/40928)；PcpA (Sanchez-Beato等人，FEMS Microbiol Lett 1998, 164:207-14)；M样蛋白(EP 0837130)和粘附素18627(EP 0834568)。其他优选的肺炎球菌蛋白抗原是在WO 98/18931中公开的那些，特别是在WO98/18930和PCT/US99/30390中选择的那些。

本发明的免疫原性组合物/疫苗还可任选地包含这样的抗原：其提供免于白喉、破伤风和百日咳博德特菌感染中的一种或多种的保护。百日咳组分可以是杀死的全细胞百日咳博德特菌(Pw)或无细胞的百日咳博德特菌(Pa)，其包含来源于PT、FHA和69kDa百日咳杆菌粘附素的至少一种抗原(优选地2种或所有3种)。通常，提供针对白喉和破伤风保护的抗原是白喉类毒素和破伤风类毒素。所述类毒素可以是化学失活的毒素，或通过引入点突变而失活的毒素。

疫苗制剂

本发明的优选实施方案是在疫苗中配制本发明的免疫原性组合物，其也可以包含药学上可接受的赋形剂或载体。

可以通过技术人员众所周知的任何方法实现来自任何上述修饰的菌株的外膜囊泡制剂的制造。优选地，使用EP 301992、US 5,597,572、EP 11243或US 4,271,147中公开的方法。最优选地，被使用WO 01/09350中描述的方法。

疫苗制剂一般地描述在：Vaccine Design (“The subunit and adjuvant approach”(Powell M. F. 和Newman M. J.编) (1995) Plenum Press New York)中。

本发明的抗原组合物在本发明的疫苗制剂中可以佐剂化。合适的佐剂包括铝盐如氢氧化铝凝胶(明矾)或磷酸铝，但还可以是钙盐(特别是碳酸钙)、铁盐或锌盐，或可以是酰化的酪氨酸或酰化的糖、阳离子或阴离子衍生的多糖或聚磷腈的不溶性悬浮液。

可使用的合适的Thl佐剂系统包括单磷酰基脂质A，特别是3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A和单磷酰基脂质A、优选地3-脱-O-酰化单磷酰基脂质A(3D-MPL)与铝盐(优选地磷酸铝)的组合。增强的系统包括单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合，特别是WO 94/00153中公开的QS21与3D-MPL的组合，或如WO 96/33739中公开的反应原性较低的组合物，其中用胆固醇猝灭QS21。WO 95/17210中描述了特别有效的、包含QS21 3D-MPL和生育酚的水包油乳液的佐剂制剂，且其是优选的制剂。

所述疫苗可包含皂苷，更优选地QS21。它还可包含水包油乳液和生育酚。含有未甲基化的CpG的寡核苷酸(WO 96/02555)也是TH1应答的优选诱导剂，且适用于本发明。

本发明的疫苗制剂可用于保护或治疗易于感染的哺乳动物，其中经由全身或粘膜途径施用所述疫苗。这些施用可包括经由肌内、腹膜内、真皮内或皮下途径的注射；或经由粘膜施用给口腔/消化道、呼吸道、泌尿生殖道。因此，本发明的一个方面是使人宿主免疫而免于革兰氏阴性菌感染所引起的疾病的方法，该方法包括：给所述宿主施用免疫保护剂量的本发明的OMV制剂。

选择每个疫苗剂量中的抗原的量，作为在一般接种疫苗者中诱导免疫保护应答且没有明显不利副作用的量。这种量将随所用何种特定免疫原以及如何提供而变化。通常，预期每个剂量将包含1 -100 μg蛋白抗原或OMV制剂，优选地5-50μg，且最一般在5-25 μg的范围内。

通过标准研究可以确定特定疫苗的最佳量，所述标准研究包括：观察受试者中的适当的免疫应答。在初始接种疫苗后，受试者可接受一次或若干次充分间隔的加强免疫。

本发明的疫苗优选地是免疫保护性的且无毒的，并适合用于儿童和青少年使用。

儿科使用是指，在小于4岁大的儿童中使用。

本发明的进一步方面

本发明的另一个方面涉及用于治疗或预防奈瑟氏球菌疾病的方法，包括将保护剂量(或有效量)的本发明的疫苗施用于需要其的宿主。可以有利地预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、B、C、Y、W135和/或淋病奈瑟氏球菌感染。

本发明还包括本发明的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染。同样，奈瑟氏球菌感染涵盖脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、B、C、Y、W-135和/或淋病奈瑟氏球菌的感染。

本发明的另一个方面是，基因工程改造的奈瑟氏球菌菌株，从所述菌株可以衍生出本发明的外膜囊泡(其中至少两种本发明的蛋白被重组地上调，如上所述)。这样的奈瑟氏球菌菌株可以是脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌。

本发明的进一步方面是制备本发明的免疫原性组合物或疫苗的方法。这些包括制备本发明的免疫原性组合物的方法(包括将来自奈瑟氏球菌的至少两种分离的本发明的抗原或蛋白混合在一起的步骤，其可以是以源自本发明的奈瑟氏球菌的疱的形式存在)和制备本发明的疫苗的方法(包括将本发明的免疫原性组合物与药学上可接受的载体组合的步骤)。

此外，本发明包括制备本发明的免疫原性组合物的方法，包括从奈瑟氏球菌培养物分离本发明的外膜囊泡的步骤。这样的方法可以涉及组合至少两种外膜囊泡制剂的进一步步骤，优选地其中至少一种外膜囊泡制剂含有免疫型L2的LPS，和至少一种外膜囊泡制剂含有免疫型L3的LPS。本发明还包括这样的方法，其中外膜囊泡通过用0 - 0.5%的DOC浓度提取而分离。0.3%-0.5%的DOC浓度用于使LPS含量最小化。在其中LPS被保留作为抗原的OMV制剂中，0-0.3%、优选0.05%-0.2%、最优选约0.1％的DOC浓度用于提取。

外膜制剂或 OMPC 或幽灵 (Ghost) 或杀死的全细胞疫苗

发明人预计，对疱制剂和疫苗的上述改进可以容易地扩展到幽灵或杀死的全细胞制剂和疫苗(具有相同的优势)。从其制备疱制剂的本发明的修饰的革兰氏阴性菌株还可以用于制备幽灵或杀死的全细胞制剂。从革兰氏阴性菌株制备幽灵制剂(具有完整包膜的空细胞)的方法是本领域众所周知的(参见例如WO 92/01791)。杀死整个细胞以制备用于疫苗中的灭活的细胞制剂的方法也是众所周知的。因此，对本发明的目的，本文献始终描述的术语‘疱[或OMV]制剂’和‘疱[或OMV]疫苗’以及过程也分别适用于术语‘幽灵制剂’和‘幽灵疫苗’，和‘杀死的全细胞制剂’和‘杀死的全细胞疫苗’。

类似地，本文所述的涉及本发明的外膜囊泡[OMV]制剂或疱制剂的实施方案可以在本文所有情况中同等地应用于任何外膜制剂[本发明的外膜制剂]。这样的外膜制剂从宿主细菌DNA和许多其他细胞质成分纯化。因此，本发明的外膜制剂可以是任何已知类型的膜制剂如疱、OMV、幽灵或外膜复合物(OMPC)。

用于制备用于本发明的外膜制剂中的OMPC的方法是本领域众所周知的，例如，根据Zollinger等人(J. Clin. Invest. [1979], 63:836-848, US4451446, US4601903,或US4695624中描述的方法。

任选地，已经制备了本发明的疱[OMV]，使得疱的LOS含量是3-30、5-25、10-25、15-22％LOS含量，正如使用纯化的LOS作为标准品在SDS-PAGE电泳后通过银染所测量的(参见Tsai, J. Biol. Standardization (1986) 14:25-33的方法)。用0.1%低DOC提取可以实现脑膜炎球菌疱中的20% LOS，这可能丢失地去除了保持的LOS分子，但保留了大多数的抗原。0.5% DOC提取可以导致制剂中的约5% LOS。

任选地，已经制备了本发明的OMPC，使得OMPC的LOS含量低于3、2、1、0.75、0.5、或0.25%。优选地，LOS含量低于1％。

抗体和被动免疫

本发明的另一个方面是，制备用于预防或治奈瑟氏球菌感染的抗体或免疫球蛋白的方法，所述方法包括下述步骤：用本发明的疫苗使受体免疫，并从所述受体分离出免疫球蛋白。通过该方法制备的免疫球蛋白是本发明的另一个方面。包含本发明的免疫球蛋白以及药学上可接受的载体的药物组合物是本发明的另一个方面，其可用于生产药物，所述药物用于治疗或预防奈瑟氏球菌病。用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染的方法是本发明的另一方面，该方法包括下述步骤：给患者施用有效量的本发明的药物制剂。

通常如下制备用于多克隆抗体生产的接种物：将抗原性组合物分散在适于人类使用的生理学耐受的稀释剂(如盐水或其他佐剂)中，从而形成含水组合物。将免疫刺激量的接种物施用给哺乳动物，然后使接种的哺乳动物维持足以使抗原性组合物诱导保护性抗体的一段时间。

通过众所周知的技术，如亲和层析法(Harlow和Lane Antibodies；a laboratory manual 1988)，可以分离抗体至所需的程度。

抗体可包括来源于通常使用的各种动物(例如，山羊、灵长类动物、驴、猪、马、豚鼠、大鼠或人)的抗血清制剂。从所述动物采血，并回收血清。

按照本发明生产的免疫球蛋白可包括完整的抗体、抗体片段或亚片段。抗体可以是任何种类(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的完整免疫球蛋白、嵌合抗体或对本发明的两种或更多种抗原具有双重特异性的杂合抗体。它们还可以是片段，例如F(ab')2、Fab’、Fab、Fv等，包括杂合片段。免疫球蛋白还包括天然的、合成的或基因工程改造的蛋白，它们可通过与特异性抗原结合形成复合体而像抗体一样发挥作用。

可将本发明的疫苗施用给受体，所述受体然后作为免疫球蛋白的来源，所述免疫球蛋白响应于特定疫苗的攻击而产生。然后经由常规的血浆分级分离方法，从如此处理过的受试者所捐献的血浆中获得超免疫球蛋白。将所述超免疫球蛋白施用给另一受试者，从而产生针对奈瑟氏球菌感染的抗性或治疗奈瑟氏球菌感染。本发明的超免疫球蛋白特别可用于在儿童、免疫受损个体中，或需要治疗且个体不会响应于疫苗接种而产生抗体的情况下治疗或预防奈瑟氏球菌病。

本发明的另一方面是药物组合物，它包含对本发明的免疫原性组合物的至少两种组分具有反应性的两种或更多种单克隆抗体(或其片段；优选地人的或人源化的)，该药物组合物可用于治疗或预防革兰氏阴性细菌(优选地奈瑟氏球菌，更优选地脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌，最优选地脑膜炎奈瑟氏球菌血清群B)的感染。

这种药物组合物包含单克隆抗体，所述单克隆抗体可以是任何种类(例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE)的完整免疫球蛋白、嵌合抗体或对本发明的两种或更多种抗原具有特异性的杂合抗体。它们还可以是片段，例如F(ab')2、Fab’、Fab、Fv等，包括杂合片段。

制备单克隆抗体的方法是本领域众所周知的，且可以包括：脾细胞与骨髓瘤细胞的融合(Kohler和Milstein 1975 Nature 256；495; Antibodies-a laboratory manual Harlow and Lane 1988)。或者，通过筛选合适的噬菌体展示文库可获得单克隆Fv片段(Vaughan TJ等人，1998 Nature Biotechnology 16；535)。利用已知方法，可以人源化或部分人源化单克隆抗体。

本专利说明书中引用的所有参考文献或专利申请通过引用并入本文。

发明人的意图为，在每种情况下，本文的术语“包括/包含(comprising)”，“包括/包含(comprise)”和“包括/包含(comprises)”与“由…组成(consisting of)”，“由…组成(consist of)”和“由…组成(consists of)”是任选地可替换的。

本发明的工业应用的方法

除了另有详细描述的地方，使用本领域技术人员众所周知和常规的标准技术进行下列实施例。实施例是说明性的，但并不限制本发明。

实施例1：用于构建在外膜囊泡制剂中使用的脑膜炎奈瑟氏球菌血清群 B 菌株的方法

WO01/09350和WO2004/014418提供了用于制备外膜囊泡和操作外膜囊泡由其衍生的细菌菌株的详细的一般方法。公开了用于下调抗原或基因(如PorA、lgtB、lgtE、frpB、msbB、htrB)、去除荚膜多糖、上调抗原(如Hsf、NspA)的方法。

实施例2：脑膜炎奈瑟氏球菌 Hsf( 本文中 NhhA 或 Msf) 与人玻连蛋白直接相互作用：在宿主细胞粘附和血清耐受性中脑膜炎球菌 Hsf 和 Opc 之间的相互作用

最近，我们已经研究了脑膜炎球菌外膜蛋白的两种主要功能，即遮蔽补体调节分子，从而导致血清耐受性，以及结合细胞受体，这使它们能够穿越鼻咽部和血管接口处的人细胞屏障。在该研究中，我们观察到脑膜炎球菌Hsf(简称Msf)为细菌赋予玻连蛋白(Vn)结合特性。此外，Opc和Msf利用正常人血清(NHS)中的玻连蛋白，以实现互补以及独有的功能。使用合成的Vn肽，我们已经描绘了玻连蛋白的Msf结合区域。与Opc一样，这种相互作用通过抑制C9多聚化和终末补体复合物插入含有Msf的细菌膜而延长脑膜炎球菌在NHS中的存活。因此，当表型的混合物暴露于NHS时，表达Vn-结合蛋白的那些表现出与缺乏它们的表达的那些相比的耐受杀死的显著能力。但是，似乎Msf和Opc在经由结合Vn的细胞粘附和侵袭中不是一样有效的。数据暗示，玻连蛋白结合对于病原体在体内环境中的存活可能是重要特性，细菌已经由其进化出许多不同的粘附机制。该描述的目的是描述在分子水平上的新的相互作用机制和外膜蛋白的功能特性，以及被操纵以帮助存活和屏障穿透的宿主成分。

介绍

脑膜炎奈瑟氏球菌(Nm，脑膜炎球菌)是人特异性细菌。其已进化了许多对其宿主的固有和获得免疫机制的耐受机制，所述机制对于其成功作为集落形成菌(coloniser)和作为具有相当潜能的病原体是关键的。人抗体和补体在控制病原体传播中发挥重要作用，使得在大多数个体中，细菌保持局限于呼吸道粘膜。然而，在这种环境中，细菌也可能遇到人抗体、补体因子和其他血清蛋白。一种机制，通过该机制脑膜炎球菌可以获得对抗体和补体介导的杀死的耐受性，是通过遮蔽补体控制因子，如因子H、补体成分C4结合蛋白或玻连蛋白。对于脑膜炎奈瑟氏球菌已经描述了前两种机制，但是后者仍然未知。我们最近已经发现，Nm可以利用该途径，也用于控制补体功能。

玻连蛋白(Vn)是多功能血浆糖蛋白，其具有重要的补体调节功能。Vn的功能与簇蛋白重叠(Cln，也被称为SP-40，细胞裂解抑制剂)，并且类似Vn，Cln可以阻断终末补体复合物或膜攻击复合物(MAC，C5b-9)插入细胞膜中以防止细胞裂解。发现它们与MAC复合(每种约1个分子/复合物)。Brandtzaeg和同事们(Hogasen，Mollnes等人，1994)检查了在严重脑膜炎球菌疾病过程中玻连蛋白和簇蛋白的水平，并且发现它们的水平在脑膜炎球菌疾病的早期较低，在存活的患者中逐渐平均化。在他们的研究中，低水平的Vn尤其与疾病严重度和凝血、纤溶和补体系统的活化相关。

玻连蛋白在凝血途径中发挥重要作用。例如，它通过结合纤溶酶原激活物抑制物类型-1(PAI-1)和增加其功能使用时间来抑制纤溶。Vn也通过其对抗凝血酶III活性的影响发挥促凝作用。玻连蛋白的许多功能需要在生理配体结合后发生的玻连蛋白的活化或解折叠。在凝血过程中活化的玻连蛋白的水平可以增强，但活化的玻连蛋白被迅速消耗为与其配体的复合物并且清除。因此，在败血症过程中玻连蛋白的整体池降低。然而，玻连蛋白的这样的继续活化也意味着，在脑膜炎球菌败血症过程中，活化或解折叠的玻连蛋白以高于正常水平存在。(玻连蛋白的一些特性显示在优先权文件的附录1中)。

玻连蛋白也促进经由其RGD基序的细胞附着和与整合素的结合。有趣的是，天然的折叠的Vn含有许多隐藏位点或部分暴露位点，包括参与肝素结合的位点以及两个硫酸化的酪氨酸残基(Y56和Y59)，我们已经发现它们对于Opc相互作用是重要的；参见下文。

我们对于Opc和玻连蛋白的研究：几年前，我们描述了玻连蛋白(Vn)与Nm Opc蛋白结合并且增加表达Opc的分离株对于细胞粘附和侵袭的能力(Virji, Makepeace等人.1994; Virji, Makepeace等人.1995)。我们最近的研究已经研究了Opc与玻连蛋白相互作用的机制，并且已经采用了许多技术，包括通过多种脑膜炎球菌分离株的吸附血清(和吸附蛋白的分析)，使用活化的解折叠和天然的折叠形式的玻连蛋白和抑制与活化的玻连蛋白结合的抗体，使用玻连蛋白的合成的酪氨酸硫酸化肽以及含有高亲和力肝素结合结构域的肽，以评价玻连蛋白的Opc靶向的精确机制。我们已经显示，玻连蛋白可以经由在其连接区域(Connecting Region，CR，优先权文件的附录1)中的硫酸化的酪氨酸残基与表达Opc的Nm直接结合(Sa E Cunha, Griffiths等人.2010)。此外，表达Opc的Nm也可以在较小程度上通过涉及肝素的夹心机制与C-末端肝素结合结构域结合。

这样的Opc与玻连蛋白的结合帮助细菌粘附和侵袭人内皮细胞，包括脑微血管内皮细胞。此外，玻连蛋白结合可以帮助表达Opc的细菌变得对补体介导的杀死更加耐受；以前，在我们最近的研究之前，对于脑膜炎球菌还没有研究这种可能性(在IPNC 2008提出的初步数据；待提交的Griffiths和Virji)。

除经由玻连蛋白靶向的Opc依赖的获得血清耐受性以外，我们已经取得了新发现：脑膜炎球菌蛋白Msf，最初称为NhhA/Hsf(参见下文)，也结合玻连蛋白。这，与Opc一样，有助于脑膜炎球菌的增加的血清耐受性。这是定义由Msf提供的血清耐受性机制的首次研究，并且我们的观察结果在下文简述。

对于脑膜炎球菌Msf的研究

在Nm菌株MC58中将命名为nhhA的基因(奈瑟氏球菌hia同系物，(Peak, Srikhanta等人.2000))鉴定为大肠杆菌的粘附素AIDA-I的同系物。随后发现其与流感嗜血杆菌的Hi和Hsf粘附素更加密切相关(相似性：Hsf, 74%；Hia, 67%；AIDA-I, 47%)。该基因存在于所有检查的(85/85)Nm菌株的研究，并且通过Western印迹分析，显示其在测试的大多数菌株中表达，尽管表达水平不同。似乎nhhA存在于脑膜炎球菌中但非淋球菌中。此外，因为它与流感嗜血杆菌表面纤丝Hsf最相似，我们已经优选使用术语Msf(脑膜炎球菌表面纤丝)。数项研究已经显示，重组Msf是免疫原性的且引发杀菌抗体，并且恢复期血清含有抗Msf抗体。

2008年7月，在我的实验室，我们开始关于Msf的潜在功能的研究。我们研究了Msf在与人细胞外基质和血清蛋白的结合中的潜在作用。在初始研究中，我们评价了表达Msf的脑膜炎球菌是否更加血清耐受，因为这是可以通过血清蛋白如玻连蛋白的结合获得的一种特性。通过使用Msf充足和Msf缺陷的Nm和平行分析Opc分离株(因为Opc本身在如上文所述的玻连蛋白结合和在血清耐受性中具有突出的作用)，我们可以观察到Msf+Opc+与Msf+ Opc-脑膜炎球菌相比的增加的血清耐受性。菌株MC58表达可检测水平的Msf，尽管这些没有达到在工程改造以过表达Msf的H44/76分离株中发现的水平。此外，通过使用菌株MC58的Msf突变体，我们能够显示Msf和Opc在对正常人血清杀菌特性的增加的耐受性中的作用。这些观察结果引导我们检查血清玻连蛋白通过Msf的潜在靶向。下列结果用来表明a)表达Msf的无荚膜和有荚膜的脑膜炎球菌分离株对玻连蛋白的结合，b) Msf可以靶向的玻连蛋白的区域，c) 通过与人Vn的活化形式的结合获得的血清耐受性和d) 经由Vn靶向的血清耐受性的机制涉及补体因子C9多聚化和裂解孔形成的抑制。因此，通过Msf或Opc的玻连蛋白靶向可以通过控制补体作用的最后关键阶段而抑制所有主要补体途径活性。

结果

Msf是玻连蛋白结合蛋白，表明Opc缺陷的表达Msf的分离株与人玻连蛋白的结合。

由于Vn主要以封闭构象作为新生蛋白在血液中循环，我们研究了更高丰度的天然Vn (nVn)和较低丰度的Vn的解折叠的活化形式(aVn)与表达Msf的Nm结合的潜力。从初始研究显而易见的是，可以在储存后自发地进行构象变化的天然Vn制剂以低水平与表达Msf以及表达Opc的Nm结合。(值得注意的是，可以通过使用只结合活化Vn的构象依赖的单克隆抗体(mAb)监测活化的玻连蛋白的水平。) 正如我们以前已经建立的用于Opc相互作用的Vn的活化形式的绝对要求(Sa E Cunha, Griffiths等人.2010)，观察结果表明，表达Msf的Nm也可以使用与Opc结合的类似机制。在这些研究中，我们可以确立，我们使用的nVn制剂含有约25％解折叠的mAb 8E6结合成分。同时，表达Opc或Msf的细菌与这种nVn制剂的结合是发现的与Vn的完全活化的制剂的结合的~30%。因此，可以得出结论，Msf优先结合Vn的构象活化形式。

使用Opc和Msf表达充足或缺陷的Nm衍生物，我们检查了它们与aVn结合的能力。在ELISA中，当无荚膜H44/76衍生物的整个细胞悬浮液(表1)覆盖在固定的aVn上时，与不具有任一种粘附素的那些相比，任一种粘附素充足的脑膜炎球菌的显著增加的结合是立刻显而易见的(图1A)。此外，双表达菌在最大程度上与aVn结合，尽管Msf+Opc+的结合水平并不总是Msf+Opc-和Opc+Msf-表型显示的结合水平的累加并且取决于实验设置(图1 A和B)。

Nm分离株与来自动物来源的玻连蛋白的结合。

玻连蛋白结构是高度保守的，并且源自人、小鼠、兔和牛的血清蛋白共享广泛的结构相似性。为了研究来自动物来源的蛋白是否同样被识别为人Vn，将玻连蛋白的肝素亲和纯化的制剂固定在ELISA板上并且测定细菌结合。在每种情况下，表达Msf的Nm与固定的活化的玻连蛋白结合(图1C)。这些观察结果表明，在感染的动物模型中或当在实验程序中使用动物血清时，这些不同来源的玻连蛋白可以和来自人血清的玻连蛋白一样有效地被某些脑膜炎球菌表型遮蔽。

表 1. 在研究中使用的脑膜炎奈瑟氏球菌衍生物和它们的主要特征。

‘Opc-’是指自然产生的Opc缺陷的变体。

‘Opc+’是指自然产生的高表达Opc的变体。

‘Δχ’是指Opc突变体。

‘Msf++’是指为了过表达Msf而工程改造的衍生物(下面的GB系列)。

‘Msf+’ 是指具有中等水平的Msf表达(<50％GB中的表达水平)的天然变体。

‘Δμ’是指Msf变体。

人玻连蛋白上Msf的结合区域的表征

为了评价这两种蛋白可以靶向蛋白的哪些区域，使用几种合成的玻连蛋白肽。以前，显示Opc结合至Vn的酪氨酸硫酸化区域。使用跨越残基V43-A68的肽(VA-26)、其硫酸化衍生物VA-26S(在Y56和Y59硫酸化)和其磷酸化肽VA-26P(在T50和T57磷酸化)显示由VA-26S但非VA-26或VA-26P对Opc与aVn的结合的特异性抑制(Sa E Cunha, Griffiths等人.2010)。在目前的研究中使用这些肽来评价是否肽的任何区域可以被Msf识别。

在直接结合研究中，可以看到表达Msf的衍生物与所有三种固定的生物素化肽的显著结合(图2 A-C)。相比之下，如以前观察到的，表达Opc的Msf- Nm仅与VA-26S显著结合(Sa E Cunha, Griffiths等人.2010)。在用固定的肽VA-26S和两种与Vn没有序列相似性的无关肽SY-30和GS-22的ELISA中显示了VA-26S与Msf和Opc两者的特异性结合。没有看到任一对照肽的结合(图2D)。

为了证实玻连蛋白参与Msf和Opc相比与Vn的结合，使用应当抑制Msf和Opc结合(从上述研究)的VA-26S肽和已知抑制Opc结合的8E6 mAb (Sa E Cunha, Griffiths等人.2010)来评价细菌的结合。事实上，如预期的，VA-26S和8E6消除了Opc与aVn的结合，因为Opc与Vn的直接结合仅仅发生在酪氨酸硫酸化区域(Sa E Cunha, Griffiths等人.2010)。然而，用VA-26S仅仅观察到Ms结合的30％降低，甚至用mAb 8E6观察到更低(10％)的降低。在Msf+Opc+表型的情况下，该肽和8E6两者都比用Msf+Opc-衍生物更有效。总体而言，该数据表明，i) 在同时表达这些蛋白的表型中Msf和Opc两者都与aVn结合，ⅱ) Msf结合区域可以部分位于人玻连蛋白的V43-A68区域内，和iii)单独的VA-26S肽对于消除Msf与aVn的结合是不够的。因此，可能的是，与VA-26S相比，Vn提供更完全或更天然的表位和/或单体肽不能与多聚体活化的Vn很好地竞争。此外，aVn上的其他位点也可能被Msf直接靶向。

Vn肽VA-26被不同菌株的Msf蛋白识别。

在已知的Msf蛋白间，MO1-240101和B16B6菌株的Msf蛋白在结构上与H44/76最不相似(尽管它们的总的同一性>85%；参见附录4)。为了评价它们结合合成的VA-26肽的能力，在ELISA中使用来自过表达这些蛋白的Nm衍生物的全细胞细菌裂解物。与VA-26结合的水平与表达的Msf的水平的差异相关，而不是与Msf蛋白之间的小结构差异相关(图3)。

Msf具有与玻连蛋白肝素结合结构域结合的潜能。

几种细菌直接或间接地与人Vn的基本肝素结合结构域(HBD)结合。我们已经显示，Opc可以通过经由肝素的桥接与aVn HBD结合(参见优先权文件的附录1)。为了研究直接或间接相互作用是否经由Msf发生，我们使用跨越主要肝素结合位点、即Vn的C末端区域的Vn残基A360-R395的合成的生物素化的肽AR36，并且检查无荚膜的H44/76分离株的结合。与Opc相反，Msf与HBD肽直接结合(图4)。

纯化的Msf蛋白结合活化的玻连蛋白，但不结合簇蛋白。

为了评价Msf和aVn之间的相互作用，在大肠杆菌中表达重组的His-标签的Msf的过客结构域(passenger domain)(rMsf)，并且在天然条件下进行其纯化。简而言之，收获细菌，重悬浮于Tris缓冲液中，超声，并且通过离心除去细胞碎片。然后将上清液与Ni-NTA琼脂糖混合，填充至柱子中，洗涤，用含有咪唑的Tris-缓冲液洗脱rMsf，并且透析过夜。如图5中所示，一般发现这样的Msf制剂是功能上有活性的，并且与活化的人玻连蛋白结合。保存几个月的一些Msf制剂已经失去了活性，并且使用这样的制剂作为对照。

血清玻连蛋白与Msf分离株的结合和活化的玻连蛋白依赖的血清耐受性

为了评价表达Msf的Nm是否与来自人血清的Vn结合，将细菌与血清孵育，洗涤，并且使用针对人蛋白的特异性抗体评价aVn、纤连蛋白或簇蛋白的结合。如图6A所示，表达Msf的Nm与来自血清的aVn显著结合，但不与纤连蛋白或簇蛋白显著结合。此外，为了评价aVn是否增加表达Msf的Nm的血清耐受性，将H44/76的几种表型暴露于血清，并且用10％血清或补充10µg/ml aVn的10％血清测试细菌存活。(在此处所述的大多数研究中，在血清杀菌测定(SBA)中，使用来自以前没有脑膜炎球菌病的病史的四位个体的合并的正常人血清(PHS)；SBA的方法描述于附录2中)。有趣的是，Msf或Opc表达导致表达Msf/Opc的表型相比于不表达所述蛋白的那些的增加的血清耐受性，在这些实验中没有累加效果(图6)。然而，重要的是，Msf或Opc表达对于血清耐受性的aVn依赖的增加是需要的(图6B和C)。为了表明变体B16B6 Msf在血清耐受性中的作用并评价其在有荚膜表型中的效力，在SBA中也使用表达异源B16B6 Msf的H44-76有荚膜衍生物。活化的Vn也增加了该表型的血清耐受性(图6D)。

表达Msf的分离株的血清耐受性的活化的玻连蛋白浓度依赖的增加。

在一定范围的aVn浓度进行的SBA中获得了aVn与表达Msf的表型的增加的血清耐受性的关联的进一步显示。这些实验使用Msf+和Msf- H44/76无荚膜衍生物。由于它们精细的血清敏感性，在这些实验中使用5% NHS。在这样的有限抗体的情况下，aVn当以16µg/ml(测试的最大值，图7)存在时使血清杀死减半。

最合适表型研究。

为了显示表达Msf或Opc的表型在正常人血清中的存活优势，混合菌株H44/76衍生物，使得初始群体包含70％非表达菌至30％的单一表达菌或相等比例的双表达菌(图8A)。暴露于10% PHS(有或没有添加的aVn)10 min后，将存活菌铺板并且确定集落形成单位(cfu)。首先，具有添加的aVn的PHS中的总的存活菌比单独的PHS中的那些超过6-7倍。其次，在10分钟内，表达一种或两种玻连蛋白结合蛋白的表型占优势，使得它们一起构成PHS中或aVn补充的PHS中总群体的>90%(图8C和D)。群体结构的检查揭示，表达Msf/Opc的表型Opc+:Msf+:Opc/Msf+的比例从1：1：1增加至约4：1.8：3.5。因为每个表型的存活也将取决于可能含有阻断抗体的血清的抗体组成，值得注意的是，使用来自随机选择的供体的血清，可以显示这两种蛋白在增加脑膜炎球菌的血清耐受性中的精细效力。存活群体的最终概况的相似性(图8C和D)也反映了在未补充的PHS和补充aVn的PHS中相似的存活机制。

Msf/Opc与活化的Vn的相互作用影响终末补体C5b-9沉积，但不影响C3沉积。

活化的Vn与其生理配体包括C5b-7和C5b-9终末补体复合体结合。在C5b-9 (MAC)形成过程中其与C9组分的结合抑制C9的多聚化，防止形成C9裂解孔进入目标膜，并且因此防止细胞裂解。在C9多聚化过程中，显示在C9上的新抗原。使用针对C9新抗原的单克隆抗体(本实验)以及识别MAC复合物中的C9的多克隆抗体(图10中所示的数据)来评价在aVn添加至PHS后与细菌膜结合的C9水平。为了评价在补充aVn的PHS中血清杀菌活性的观察到的降低是否主要是由于补体途径的终末阶段的抑制，还使用多克隆抗C3抗体评价添加的Vn对C3沉积在细菌上的影响。图9中所示的数据表明用添加的aVn对MAC沉积的特定控制。

表达Msf/Opc的有荚膜表型与aVn的结合也导致MAC插入细胞膜的抑制。

在进一步的研究中，使用表达它们各自的Msf蛋白的有荚膜菌​​株MC58和无荚膜的H44/76 (图10A)和表达异源B16B6 Msf的有荚膜H44/76衍生物(图10B)测定具有不同Msf蛋白的无荚膜和有荚膜衍生物上的MAC沉积。

首先，在SBA(使用补充aVn的PHS)中不同的MC58和H44/76表型的比较显示，与Msf-Opc-衍生物相比，当表达Opc和/或Msf时低得多的MAC沉积(图10A)。

在进一步的实验中，检查了与有荚膜G7-4衍生物结合的C9，再次显示在补充aVn的PHS中C9结合的减少。

脑膜炎球菌-玻连蛋白相互作用的抑制：合成的玻连蛋白肽恢复MAC沉积。

如从图2中提出的研究显而易见的，跨越玻连蛋白残基V43 - A68的合成肽(例如，VA-26)显著抑制Msf与aVn的相互作用。为了评价这样的肽在恢复细菌上MAC沉积中的效力，在MAC沉积测定中使用VA-26，该测定也包括对照肽MV-14(图11)。与其在抑制aVn与Msf的相互作用中的作用一致，VA-26但非对照肽MV-14恢复MAC沉积。

Msf与SMB中的Vn/aVn的接头区域的结合没有导致人细胞整合素的靶向。

我们已经显示，玻连蛋白可以在Nm上的Opc和内皮细胞整合素之间形成桥联，以增加细菌细胞粘附和侵袭。然而，在我们目前的研究中，我们没有观察到类似的表达Msf的Nm的细胞靶向。有证据表明，在Msf/Opc双表达表型中，Msf可以抑制Opc介导的细胞相互作用(数据未显示)。似乎，Msf靶向的Vn的区域是酪氨酸硫酸化的Opc结合位点的上游，并且可以重叠Vn的‘RGD’细胞结合区。这可以解释表达Msf的表型的内皮细胞结合的缺乏。此外，由于它们在玻连蛋白上结合位点的紧密邻近，Opc依赖的细胞粘附也可以被Msf阻碍。

最后评论

补体耐受性对于粘膜和粘膜下环境成功集落形成是必要特性，并且人鼻咽部的频繁集落形成者脑膜炎奈瑟氏球菌已经进化了几种策略用于此目的。这些包括对于脑膜炎球菌常见的表面唾液酸的精细运用，其帮助通过复杂机制的抗体和补体逃避，其中一些涉及分子模拟。另一种常见策略必需经由许多外膜蛋白遮蔽宿主补体逃避蛋白，所述外膜蛋白包括浑浊蛋白(opacity protein)Opc、被称为GNA1870的蛋白(LP2086)或因子H结合蛋白(fHbp)、奈瑟氏球菌表面蛋白A(NspA)和孔蛋白PorA。已经显示这些蛋白与不同宿主分子如玻连蛋白(Opc)、因子H(fHbp和NspA)和C4bP (PorA)结合，尽管后者的结合在生理盐浓度没有发生。Vn、fH和C4BP控制补体途径的不同阶段：fH通过延缓C3转化酶的形成和解离预形成的C3转化酶而下调替代途径(AP)；C4BP对于经典途径(CP)C4转化酶具有类似作用；而玻连蛋白通过防止终末C5b-9膜攻击复合物(MAC)插入细胞膜而发挥其在所有补体途径汇集的补体沉积的终末阶段的作用。因此，脑膜炎球菌与Vn的结合可以为细菌(甚至在免疫宿主中)提供相当大的优势。我们已经显示，Msf，如同Opc，是具有耐受补体攻击的能力的玻连蛋白结合蛋白。在这样做时，这项研究已经鉴定了整体补体耐受性的新的且重要的机制。

Msf在宿主细胞接触后可以被上调(Sjolinder, Eriksson等人.2008) (Hartman, Virji和Heyderman, IPNC 2002)。此外，数项研究已经显示，重组Msf是免疫原性的且引发杀菌抗体，并且恢复期血清含有抗Msf抗体。作为在感染过程中可以具有特殊功能的免疫原性蛋白，建立蛋白在集落形成和疾病中的潜能是重要的。抗体和补体在针对脑膜炎球菌的防御中发挥关键作用，在感染过程中Msf蛋白的上调和其耐受所有补体途径作用的潜能使之成为用于深度研究的重要靶分子。

其宿主靶标如玻连蛋白和其对于这些相互作用所需特征的鉴定，从下列几点来看将是有益的。保留可以引发阻断抗体的疫苗候选如Msf的结构特征可能是特别有益的，因为这些抗体，通过抑制玻连蛋白遮蔽，可以增加所有抗体针对细菌的效力，并且可以自身充当杀菌抗体。此外，由于如附录3所述低/中等水平的Opc可以帮助血清耐受性，疫苗制剂中的Opc和Msf可以一起作用以控制范围广泛的强毒脑膜炎球菌菌株的传播。

附录

2. 血清杀菌测定(SBA)

(内源抗体和补体)

细菌悬浮液在Dulbecco磷酸盐缓冲盐水中制备，计数，并且将新鲜解冻的人血清的所需稀释物立即添加至100μl体积中的10³个细菌。在37℃在CO2培养箱中孵育后(通常对于无荚膜脑膜炎球菌为10 min并且对于有荚膜脑膜炎球菌为30 min)，将细菌悬浮液的稀释物铺板在琼脂上以确定存活细菌的数量。然后通过与以类似方式暴露于去补体血清的细菌数量比较而计算百分比杀死(56℃, 30 min)。

3. 关于不同 Opc 水平对有荚膜和无荚膜的表达 Msf 的表型的影响的进一步研究。

Opc水平在体内可以变化，并且提示粘膜分离菌中的蛋白水平是高的，而在血液分离菌中，它们倾向于是低的。为了评价Opc水平对血清耐受性的影响，使用两个系列的衍生物来代表体内形成集落和疾病表型。

系列的MC58无荚膜衍生物表达的Msf水平是过表达H44/76衍生物中表达的水平的约30％。值得注意的是，H44/76和MC58 Msf是相同的，并且Opc蛋白在所有脑膜炎球菌中在很大程度上是不变的(同一性显示在附录4中)。在两种菌株中，如下图中所示选择具有一定范围表达水平的Opc衍生物。在具有低/中等表达的MC58中，Msf单独增加血清耐受性(在补充aVn的PHS中15％更大的存活，参见Opc突变体

，图12A)。在两个系列的分离菌中，渐增的Opc水平在PHS中在中等程度上帮助血清耐受性，并且在补充aVn的PHS中剧烈得多。也明显的是，在无荚膜和有荚膜背景两者中，低于最高水平的Opc足以大大增加血清耐受性(图12)。

4. 显示各种脑膜炎球菌菌株的 Opc 和 Msf 相关性的表格

Claims (84)

1.免疫原性组合物，包含奈瑟氏球菌Hsf和Opc抗原。

2.权利要求1的免疫原性组合物，进一步包含奈瑟氏球菌FHbp抗原。

3.权利要求1或2的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原来自脑膜炎奈瑟氏球菌，特别是血清群B。

4.权利要求1-3的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原是包括下列的多肽：

a) SEQ ID NO:2的氨基酸序列，

b) 与SEQ ID NO:2具有至少80、85、90、95、或99％的序列同一性的氨基酸序列。

5.权利要求1-4的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原是多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:2的至少10、15、20、25、30个连续氨基酸的免疫原性片段。

6.权利要求1-5的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原、多肽、氨基酸序列或免疫原性片段能够引发抗体，所述抗体可以结合SEQ ID NO:2的多肽和/或可以在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达SEQ ID NO:2的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌。

7.权利要求1-6的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原、多肽、氨基酸序列或免疫原性片段能够引发抗体，所述抗体可以抑制人玻连蛋白与SEQ ID NO:2的多肽的结合和/或可以抑制人玻连蛋白与在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达SEQ ID NO:2的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。

8.权利要求1-7的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原以如下剂量存在于所述免疫原性组合物中，所述剂量足以在人宿主中引发抗体，所述抗体可以抑制人玻连蛋白与Hsf(例如SEQ ID NO:2的多肽)的结合和/或可以抑制人玻连蛋白与在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达Hsf(例如SEQ ID NO:2的多肽)的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。

9.权利要求1-8的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原作为亚单位抗原存在。

10.权利要求1-8的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原存在于外膜制剂或外膜囊泡制剂的外膜内。

11.权利要求10的免疫原性组合物，其中所述外膜制剂已经从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株在外膜中以与菌株H44/76中相同或比其更高的水平表达Hsf。

12.权利要求10或11的免疫原性组合物，其中所述Hsf抗原已经在外膜制剂或囊泡内被上调(优选重组地上调)。

13.权利要求12的免疫原性组合物，其中所述外膜制剂已经从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株具有多于一个拷贝的编码Hsf抗原的hsf基因，或者具有在异源启动子控制下的hsf基因。

14.权利要求13的免疫原性组合物，其中所述异源启动子是比hsf基因启动子更强的启动子。

15.权利要求10-14的免疫原性组合物，其中所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂已经使用脱氧胆酸盐(DOC)提取步骤进行制备，其中使用的DOC的浓度为0-0.5%、0.1-0.4%、或0.2-0.3%，特别是约或恰好0、0.1、0.2、0.3、0.4 或0.5% DOC。

16.权利要求10-15的免疫原性组合物，其中衍生所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调lgtB、galE或lgtE中的一种或多种的表达。

17.权利要求10-16的免疫原性组合物，其中衍生所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂的宿主细胞不能合成荚膜多糖，并且优选地已经进行工程改造以下调(和优选地缺失) siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA (等同于synX和siaA)或synB (等同于siaB和synC (等同于siaC)中的一种或多种、优选siaD的表达。

18.权利要求10-17的免疫原性组合物，其中衍生所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调(和优选地缺失)PorA和/或FrpB的表达。

19.权利要求10-18的免疫原性组合物，其中衍生所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调(和优选地缺失) msbB和/或htrB的表达。

20.权利要求1 -19的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原来自脑膜炎奈瑟氏球菌，特别是血清群B。

21.权利要求1-20的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原是包括下列的多肽：

a) SEQ ID NO:4的氨基酸序列，

b) 与SEQ ID NO:4具有至少80、85、90、95、或99％的序列同一性的氨基酸序列。

22.权利要求1-21的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原是多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:4的至少10、15、20、25、30个连续氨基酸的免疫原性片段。

23.权利要求1-22的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原、多肽、氨基酸序列或免疫原性片段能够引发抗体，所述抗体可以结合SEQ ID NO:4的多肽和/或可以结合在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达SEQ ID NO:4的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌。

24.权利要求1-23的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原、多肽、氨基酸序列或免疫原性片段能够引发抗体，所述抗体可以抑制人玻连蛋白与SEQ ID NO:4的多肽的结合和/或可以抑制人玻连蛋白与在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达SEQ ID NO:4的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。

25.权利要求1-24的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原以如下剂量存在于所述免疫原性组合物中，所述剂量足以在人宿主中引发抗体，所述抗体可以抑制人玻连蛋白与Opc (例如SEQ ID NO:4的多肽)的结合和/或可以抑制人玻连蛋白与在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达Opc (例如SEQ ID NO:4的多肽)的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。

26.权利要求1-25的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原作为亚单位抗原存在。

27.权利要求1-27的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原存在于外膜制剂或外膜囊泡制剂的外膜内。

28.权利要求27的免疫原性组合物，其中所述外膜制剂已经从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株在外膜中以与菌株H44/76或菌株C751中相同或比其更高的水平表达Opc。

29.权利要求27或28的免疫原性组合物，其中所述Opc抗原已经在外膜制剂或外膜囊泡内被上调(优选重组地上调)。

30.权利要求29的免疫原性组合物，其中所述外膜制剂已经从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株具有多于一个拷贝的编码Opc抗原的opc基因，或者具有在异源启动子控制下的opc基因。

31.权利要求30的免疫原性组合物，其中所述异源启动子是比opc基因启动子更强的启动子。

32.权利要求30或31的免疫原性组合物，其中所述异源启动子比所述opc基因启动子更稳定地表达所述opc基因。

33.权利要求27-32的免疫原性组合物，其中所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂已经使用脱氧胆酸盐(DOC)提取步骤进行制备，其中使用的DOC的浓度为0-0.5%、0.1-0.4%、或0.2-0.3%，特别是约或恰好0、0.1、0.2、0.3、0.4 或0.5% DOC。

34.权利要求27-33的免疫原性组合物，其中衍生所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调lgtB、galE或lgtE中的一种或多种的表达。

35.权利要求27-34的免疫原性组合物，其中衍生所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂的宿主细胞不能合成荚膜多糖，并且优选地已经进行工程改造以下调(和优选地缺失) siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA (等同于synX和siaA)或synB (等同于siaB和synC (等同于siaC)中的一种或多种、优选siaD的表达。

36.权利要求27-35的免疫原性组合物，其中衍生所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调(和优选地缺失)PorA和/或FrpB的表达。

37.权利要求27-36的免疫原性组合物，其中衍生所述外膜制剂或所述外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调(和优选地缺失) msbB和/或htrB的表达。

38.权利要求2 -37的免疫原性组合物，其中所述FHbp抗原来自脑膜炎奈瑟氏球菌，特别是血清群B。

39.权利要求2 -38的免疫原性组合物，其中所述来自家族A的FHbp和/或来自家族B的FHbp存在于所述免疫原性组合物中。

40.权利要求39的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族A抗原是包括下列的多肽：

a) SEQ ID NO:5的氨基酸序列，

b) 与SEQ ID NO:5具有至少70、80、85、90、95、或99％的序列同一性的氨基酸序列。

41.权利要求39或40的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族A抗原是多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:5的至少10、15、20、25、30个连续氨基酸的免疫原性片段。

42.权利要求39-41的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族A抗原、多肽、氨基酸序列或免疫原性片段能够引发抗体，所述抗体可以结合SEQ ID NO:5的多肽和/或可以结合在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达SEQ ID NO:5的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌。

43.权利要求39-42的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族A抗原、多肽、氨基酸序列或免疫原性片段能够引发抗体，所述抗体可以抑制人因子H与SEQ ID NO:5的多肽的结合和/或可以抑制人因子H与在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达SEQ ID NO:5的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。

44.权利要求39-43的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族A抗原可以以如下剂量存在于所述免疫原性组合物中，所述剂量足以在人宿主中引发抗体，所述抗体可以抑制人因子H与FHbp家族A(例如SEQ ID NO:5的多肽)的结合和/或可以抑制人因子H与在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达FHbp家族A (例如SEQ ID NO:5的多肽)的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。

45.权利要求39-44的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族B抗原是包括下列的多肽：

a) SEQ ID NO:6的氨基酸序列，

b) 与SEQ ID NO:6具有至少70、80、85、90、95、或99％的序列同一性的氨基酸序列。

46.权利要求39 -45的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族B抗原是多肽，所述多肽包含SEQ ID NO:6的至少10、15、20、25、30个连续氨基酸的免疫原性片段。

47.权利要求39-46的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族B抗原、多肽、氨基酸序列或免疫原性片段能够引发抗体，所述抗体可以结合SEQ ID NO:6的多肽和/或可以结合在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达SEQ ID NO:6的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌。

48.权利要求39-47的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族B抗原、多肽、氨基酸序列或免疫原性片段能够引发抗体，所述抗体可以抑制因子H与SEQ ID NO:6的多肽的结合和/或可以抑制人因子H与在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达SEQ ID NO:6的多肽的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。

49.权利要求39-48的免疫原性组合物，其中所述FHbp家族B抗原可以以如下剂量存在于所述免疫原性组合物中，所述剂量足以在人宿主中引发抗体，所述抗体可以抑制人因子H与FHbp家族B(例如SEQ ID NO:6的多肽)的结合和/或可以抑制人因子H与在脑膜炎奈瑟氏球菌细菌外膜内表达FHbp家族B(例如SEQ ID NO:6的多肽)的脑膜炎奈瑟氏球菌细菌的结合。

50.权利要求2 -49的免疫原性组合物，其中所述FHbp(Fhbp家族A和/或FHbp家族B)抗原作为亚单位抗原存在。

51.权利要求2-50的免疫原性组合物，其中所述FHbp(Fhbp家族A和/或FHbp家族B)抗原存在于一种或多种外膜制剂或外膜囊泡制剂的外膜内。

52.权利要求2-51的免疫原性组合物，其中所述一种或多种外膜制剂已经从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株在外膜中以与菌株8047(对于FHbp家族A)或MC58(对于FHbp家族B)中相同或比其更高的水平表达FHbp(Fhbp家族A和/或FHbp家族B)。

53.权利要求51或52的免疫原性组合物，其中所述FHbp(Fhbp家族A和/或FHbp家族B)抗原已经在一种或多种外膜制剂或外膜囊泡内被上调(优选重组地上调)。

54.权利要求53的免疫原性组合物，其中所述一种或多种外膜制剂已经从奈瑟氏球菌(特别是脑膜炎奈瑟氏球菌)菌株制备，所述菌株具有多于一个拷贝的编码所述FHbp(FHbp家族A和/或FHbp家族B)抗原的fhbp(fhbp家族A和/或fhbp家族B)基因，或者具有在异源启动子控制下的fhbp(fhbp家族A和/或fhbp家族B)基因。

55.权利要求54的免疫原性组合物，其中所述异源启动子是比所述fhbp(fhbp家族A和/或fhbp家族B)基因启动子更强的启动子。

56.权利要求51-55的免疫原性组合物，其中所述一种或多种外膜制剂或所述一种或多种外膜囊泡制剂已经使用脱氧胆酸盐(DOC)提取步骤进行制备，其中使用的DOC的浓度为0-0.5%、0.1-0.4%、或0.2-0.3%，特别是约或恰好0、0.1、0.2、0.3、0.4 或0.5% DOC，特别是最高达0.3、0.2或0.1% DOC。

57.权利要求51-56的免疫原性组合物，其中衍生所述一种或多种外膜制剂或所述一种或多种外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调lgtB、galE或lgtE中的一种或多种的表达。

58.权利要求51-57的免疫原性组合物，其中衍生所述一种或多种外膜制剂或所述一种或多种外膜囊泡制剂的宿主细胞不能合成荚膜多糖，并且优选地已经进行工程改造以下调(和优选地缺失) siaD、ctrA、ctrB、ctrC、ctrD、synA (等同于synX和siaA)或synB (等同于siaB和synC (等同于siaC)中的一种或多种、优选siaD的表达。

59.权利要求51-58的免疫原性组合物，其中衍生所述一种或多种外膜制剂或所述一种或多种外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调(和优选地缺失)PorA和/或FrpB的表达。

60.权利要求51-59的免疫原性组合物，其中衍生所述一种或多种外膜制剂或所述一种或多种外膜囊泡制剂的宿主细胞已经进行工程改造以下调(和优选地缺失) msbB和/或htrB的表达。

61.权利要求1-60的免疫原性组合物，进一步包含脑膜炎奈瑟氏球菌NspA和/或PilC (在亚单位或外膜囊泡制剂或外膜囊泡组合物中)。

62.权利要求1-61的免疫原性组合物，进一步包含一种或多种细菌荚膜多糖或寡糖。

63.权利要求62的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖或寡糖衍生自选自下列的细菌：脑膜炎奈瑟氏球菌血清群A、C、Y和W-135、流感嗜血杆菌b、肺炎链球菌、A组链球菌、B组链球菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。

64.权利要求62-63的免疫原性组合物，其中所述荚膜多糖或寡糖与蛋白缀合。

65.权利要求1-64的免疫原性组合物，包含佐剂。

66.权利要求65的免疫原性组合物，包含铝盐、氢氧化铝或磷酸铝。

67.权利要求65或66的免疫原性组合物，包含3D-MPL。

68.疫苗，包含权利要求1-67的免疫原性组合物和药学上可接受的载体。

69.用于治疗或预防奈瑟氏球菌疾病的方法，包括将保护剂量的权利要求68的疫苗施用于需要其的宿主。

70.权利要求69的方法，其中预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染。

71.权利要求68的疫苗在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染。

72.权利要求71的用途，其中预防或治疗脑膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染。

73.权利要求1-68的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗或预防奈瑟氏球菌感染。

74.权利要求73的免疫原性组合物或疫苗，其用于治疗或预防脑膜炎奈瑟氏球菌和/或淋病奈瑟氏球菌感染。

75.权利要求1-68、73、74的免疫原性组合物或疫苗，其用于预防奈瑟氏球菌粘附于内皮细胞或用于在预防奈瑟氏球菌粘附于内皮细胞中使用。

76.权利要求1-68、73-75的免疫原性组合物或疫苗，其用于预防脑膜炎奈瑟氏球菌脑膜炎或用于在预防脑膜炎奈瑟氏球菌脑膜炎中使用。

77.权利要求1-68、73-76的免疫原性组合物或疫苗，其用于降低奈瑟氏球菌补体介导的杀死耐受性或用于在降低奈瑟氏球菌补体介导的杀死耐受性中使用。

78.权利要求1-68、73-77的免疫原性组合物或疫苗，其用于预防人玻连蛋白与脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌病原体的结合或用于在预防人玻连蛋白与脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌病原体的结合中使用。

79.权利要求1-68、73-78的免疫原性组合物或疫苗，其用于预防人因子H与脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌病原体的结合或用于在预防人因子H与脑膜炎奈瑟氏球菌或淋病奈瑟氏球菌病原体的结合中使用。

80.制备权利要求1-68、73-79的免疫原性组合物和疫苗的方法，包括将所述Hsf和Opc抗原混合在一起的步骤。

81.制备权利要求1-68、73-79的免疫原性组合物和疫苗的方法，包括分离包含所述Hsf和/或所述Opc抗原的外膜制剂或外膜囊泡的步骤。

82.权利要求81的方法，包括将包含所述Hsf抗原的分离的外膜制剂或分离的外膜囊泡与包含所述Opc抗原的分离的外膜制剂或分离的外膜囊泡混合的步骤。

83.药物组合物，包含对于权利要求1-68、73-79的免疫原性组合物和疫苗的所述Hsf和所述Opc抗原特异性的抗体。

84.权利要求83的药物组合物，其用于根据权利要求73-79的使用的用途。

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