CN103169753B - 木鳖子活性提取物在制备抗呼吸系统肿瘤药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属制药领域，涉及中药材木鳖子活性提取物的新的药用用途，具体涉及木鳖子活性提取物在制备治疗呼吸系统肿瘤药物中的应用，尤其是在治疗非小细胞肺癌中的用途。本发明通过细胞及动物实验，结果显示木鳖子活性提取物通过诱导人肺癌A549细胞凋亡、阻滞细胞生长周期、抑制荷瘤BALB/c裸鼠模型的肿瘤生长的作用治疗非小细胞肺癌。所述的木鳖子活性提取物可作为治疗药物应用于呼吸系统肿瘤，尤其是非小细胞肺癌的治疗。

Description

木鳖子活性提取物在制备抗呼吸系统肿瘤药物中的应用

技术领域

本发明属制药领域，涉及中药材木鳖子活性提取物的新的药用用途，具体涉及木鳖子活性提取物在制备治疗呼吸系统肿瘤药物中的应用，尤其是在治疗非小细胞肺癌中的用途。

背景技术

据统计报道，肺癌是目前我国发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non small cell lung cancer，NSCLC)约占肺癌人群的87％。由于早期具有隐蔽性，大多数NSCLC患者发现时已是晚期，半数以上的患者错过了手术切除机会，抗肿瘤药物的应用对提高疗效、改善患者的生存状态以及延长生存期发挥着举足轻重的作用。目前，临床上用于治疗NSCLC的药物主要是进口的细胞毒类药物，这类药物不仅价格昂贵，而且有难以避免的选择性差、毒副作用强、易产生耐药等缺点。因此，立足于传统的中草药资源，研发高效低毒的抗肺癌的中药新药具有重要的社会和经济意义。

中药木鳖子(Cochinchina momordica seed)是葫芦科植物木鳖(Momordicacochinchinesis(Lour.)Spreng)的干燥成熟种子，最早记载于宋《开宝本草》(公元973年)，主产于广西、四川、湖北、河南、安徽、浙江、福建、广东、贵州、云南等地。据《现代中药大辞典》记载，木鳖子性味苦、微甘，有毒，入肝、脾、胃经，具散结消肿，攻毒疗疮功效，常用于疮疡肿毒，乳痈，瘰疬，痔漏，干癣，秃疮。

迄今，未见有关木鳖子提取物用于制备治疗肺癌药物的报道。

发明内容

本发明的目的是提供中药材木鳖子中的活性提取物新的药用用途，具体涉及一种中药材木鳖子中的活性提取物在制备治疗呼吸系统肿瘤药物中的用途，尤其是在制备治疗非小细胞肺癌药物中的用途。

本发明的木鳖子活性提取物通过下述方法制得：

将木鳖子中药材粉碎得到木鳖子中粉，取木鳖子中粉100g，用500ml乙酸钠溶液(20mM，pH 5.0)在冰箱中4℃冷藏提取过夜，离心后滤液冻干得提取物，于-20℃冰箱中保存备用。将提取得到的木鳖子提取物冻干粉用水溶解后，离心过滤除去少量不溶杂质，用色谱法进行进一步的分离(如图1所示)，色谱条件是：色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150×10mm，5μm)；柱温：室温；流动相：A：0.05％甲酸B：90％乙腈+10％水(含0.045％甲酸)；流速：2ml/min；进样量：1000μL；检测器：紫外可变波长检测器(VWD)，检测波长254nm。

洗脱方式：梯度洗脱(如表1所示)，收集26-40min馏分，合并收集液冻干后于-20℃冰箱中保存备用。

表1木鳖子提取物梯度洗脱时间表

本发明的木鳖子活性提取物进行了细胞培养实验，检测木鳖子提取物在体外对人非小细胞肺癌A549细胞的作用，实验结果表明，所述的木鳖子提取物通过诱导细胞凋亡和阻滞细胞生长周期能显著抑制肺癌细胞的增殖(如图2，图3，图4所示)。

本发明的木鳖子活性提取物进行了体内试验，通过A549荷瘤BALB/c裸鼠模型实验，检测木鳖子提取物在体内对人非小细胞肺癌A549的作用，取木鳖子活性提取物2mg/Kg和20mg/Kg腹腔注射给药，以5-氟尿嘧啶10mg/Kg为阳性对照，隔日1次，共12次，设A.空白对照组；B.木鳖子活性提取物2mg/Kg组；C.木鳖子活性提取物20mg/Kg组，结果显示，肿瘤体积增值率与空白对照组相比，*：p＜0.05；**：p＜0.01。实验结果表明，所述的木鳖子提取物能显著随着木鳖子提取物给药剂量的增加，肿瘤的体积和重量较对照组显著减小(如图5所示)。

本发明的实验结果表明，所述的木鳖子提取物可作为药物制剂的原料用于制备抗呼吸系统肿瘤药物，尤其制备治疗人非小细胞肺癌的药物。

附图说明

图1木鳖子提取物色谱分离图，

其中的色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150×10mm，5μm)；柱温：室温；流动相：A：0.05％甲酸B：90％乙腈+10％水(含0.045％甲酸)；流速：2ml/min；进样量：1000μL；检测器：紫外可变波长检测器(VWD)，检测波长254nm。

图2木鳖子提取物对人肺癌细胞A549的增殖抑制作用，图中显示：与空白对照组相比，*：p＜0.05；#：p＜0.01。

图3采用PI染色和流式细胞仪检测木鳖子提取物对A549细胞生长周期的影响，图中显示：不同浓度木鳖子提取物处理A549细胞48h。A.Control；B.0.1mg/L；C.0.2mg/L，D.0.4mg/L。

图4采用Hoechst 33258染色和PI/Annexin V双染检测CMS提取物对A549细胞凋亡的作用，图中显示：不同浓度木鳖子提取物提取物处理A549细胞48h。A.Hoechst 33258染色；B.PI/Annexin V双染。

图5木鳖子提取物对A549荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响，图中显示：肿瘤体积增值率与空白对照组相比，*：p＜0.05；**：p＜0.01。

具体实施方式

实施例1制备木鳖子活性提取物

将木鳖子中药材粉碎得到木鳖子中粉，取木鳖子中粉100g，用500ml乙酸钠溶液(20mM，pH 5.0)在冰箱中4℃冷藏提取过夜，离心后滤液冻干得提取物，于-20℃冰箱中保存备用。将提取得到的木鳖子提取物冻干粉用水溶解后，离心过滤除去少量不溶杂质，用色谱法进行进一步的分离(如图1所示)，色谱条件是：色谱柱：YMC-Pack ODS-A(150×10mm，5μm)；柱温：室温；流动相：A：0.05％甲酸B：90％乙腈+10％水(含0.045％甲酸)；流速：2ml/min；进样量：1000μL；检测器：紫外可变波长检测器(VWD)，检测波长254nm。

洗脱方式：梯度洗脱(如表1所示)，收集26-40min馏分，合并收集液冻干后于-20℃冰箱中保存备用。

表1木鳖子提取物梯度洗脱时间表

实施例2木鳖子提取物体外抗肿瘤作用试验

将对数生长期的A549细胞接种于96孔板中，分为空白对照组、卡铂对照组和木鳖子提取物处理组(0.01、0.05、0.1、0.2、0.4mg/ml)，37℃培养48h后进行MTT检测，计算细胞增殖增殖率。结果显示，随着剂量增加，木鳖子提取物显著抑制A549细胞增殖(如图2所示)。

实施例2.木鳖子提取物抑制A549细胞生长周期的作用试验

将对数生长期的A549细胞接种于96孔板内，加入木鳖子提取物处理48h后，离心收集细胞，PBS洗2次，加入预冷的70％乙醇固定过夜。离心收集细胞，PBS洗1次，加入溴化乙锭(PI)避光孵育30分钟，用流式细胞仪检测，结果用ModFit软件分析。结果显示，随着剂量增加，木鳖子提取物将A549细胞阻滞于G2/M期(如图3所示)。

实施例3.木鳖子提取物诱导A549细胞生长凋亡的作用试验

将A549将细胞接种于24孔板，加入木鳖子提取物处理48h后，加入终浓度为5μg/ml的Hoechst33342溶液，室温避光放置5分钟。弃培养基，4％甲醛固定10min，吸弃，PBS洗涤1-2次，加入1ml PBS。荧光显微镜下观察凋亡细胞大小、形态。另外，离心收集A549细胞，用预冷PBS漂洗1次，加入AnnexinV-FITC混合均匀，室温避光温育10min。PBS洗1次，加入适量PI，用流式细胞仪进行细胞凋亡定量检测。结果显示，木鳖子提取物具有明显诱导A549细胞凋亡的作用(如图4所示)。

实施例4.木鳖子提取物体内抗肿瘤作用试验

将对数生长期的A549细胞接种于裸鼠颈背部皮下，待肿瘤长至8-10mm时，取出瘤组织，切成约1×1mm的组织块，接种于裸鼠颈背部皮下。待移植瘤平均直径约3-4mm后，测量肿瘤结节的长径、短径，计算肿瘤体积，随机分为对照组(生理盐水)、5-氟尿嘧啶对照组(10mg/kg)及木鳖子提取物处理组(2.0和20mg/kg)，隔日腹腔注射给药4周。每4天测量1次肿瘤体积和体重，最后取肿瘤组织称重，计算肿瘤体积增值率。结果显示，随着木鳖子提取物剂量增加，A549移植瘤的体积明显减小(如图5所示)。

Claims (1)

1.木鳖子活性提取物在制备抗非小细胞肺癌药物中的用途；所述的木鳖子活性提取物通过下述方法制备：

1)样品制备

木鳖子中粉，用乙酸钠溶液20mM,pH 5.0在冰箱中4℃冷藏提取过夜，离心后滤液冻干得提取物F；

2)样品分离与纯化

采用半制备型的液相色谱柱，其填料为十八烷基键合相硅胶，高效液相系统采用半制备型的紫外检测器以及高压泵，流动相采用A:0.05％甲酸B:90％乙腈+10％水，其中含0.045％甲酸，梯度洗脱，依照岀峰情况和保留时间收集，得有效部位；

色谱条件是：色谱柱：YMC-Pack ODS-A 150×10mm，5μm；柱温：室温；流动相：A:0.05％甲酸B:90％乙腈+10％水，其中含0.045％甲酸；流速：2ml/min；进样量：1000μL；检测器：紫外可变波长检测器，检测波长254nm；

洗脱方式：梯度洗脱，收集26-40min馏分，合并收集液冻干后于-20℃冰箱保存备用。