CN103160529A - 一种培育转基因杂交水稻的方法 - Google Patents
一种培育转基因杂交水稻的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103160529A CN103160529A CN2013100852011A CN201310085201A CN103160529A CN 103160529 A CN103160529 A CN 103160529A CN 2013100852011 A CN2013100852011 A CN 2013100852011A CN 201310085201 A CN201310085201 A CN 201310085201A CN 103160529 A CN103160529 A CN 103160529A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- paddy rice
- transgenic paddy
- fusion gene
- sequence
- line
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 169
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 169
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 35
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title abstract 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 159
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims abstract description 103
- 230000017730 intein-mediated protein splicing Effects 0.000 claims abstract description 49
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 claims abstract description 37
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims abstract description 35
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims description 167
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 106
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 78
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 27
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 26
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 20
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- 108010013829 alpha subunit DNA polymerase III Proteins 0.000 claims description 18
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 18
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 13
- 210000003763 chloroplast Anatomy 0.000 claims description 13
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 13
- XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N glyphosate Chemical compound OC(=O)CNCP(O)(O)=O XDDAORKBJWWYJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 9
- 239000005562 Glyphosate Substances 0.000 claims description 8
- 229940097068 glyphosate Drugs 0.000 claims description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000008676 import Effects 0.000 claims description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 17
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 abstract description 3
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 abstract description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 abstract 1
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 24
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 18
- PXUQTDZNOHRWLI-OXUVVOBNSA-O malvidin 3-O-beta-D-glucoside Chemical compound COC1=C(O)C(OC)=CC(C=2C(=CC=3C(O)=CC(O)=CC=3[O+]=2)O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)=C1 PXUQTDZNOHRWLI-OXUVVOBNSA-O 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 12
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 11
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 11
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 11
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 206010020649 Hyperkeratosis Diseases 0.000 description 9
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 8
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 7
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 7
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 7
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- 241000192593 Synechocystis sp. PCC 6803 Species 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 230000014107 chromosome localization Effects 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 3
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 3
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 3
- 238000009402 cross-breeding Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000002390 adhesive tape Substances 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 230000016434 protein splicing Effects 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 101150028074 2 gene Proteins 0.000 description 1
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150029019 ATP6 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 235000007516 Chrysanthemum Nutrition 0.000 description 1
- 244000189548 Chrysanthemum x morifolium Species 0.000 description 1
- 108010008532 Deoxyribonuclease I Proteins 0.000 description 1
- 241000186394 Eubacterium Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 206010021929 Infertility male Diseases 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 208000007466 Male Infertility Diseases 0.000 description 1
- 101100102380 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) vma-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010068086 Polyubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 108030003004 Triphosphatases Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000007846 asymmetric PCR Methods 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940027138 cambia Drugs 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M diclofenac potassium Chemical compound [K+].[O-]C(=O)CC1=CC=CC=C1NC1=C(Cl)C=CC=C1Cl KXZOIWWTXOCYKR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 1
- 230000003760 hair shine Effects 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N hygromycin A Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@H](C(=O)C)O[C@@H]1Oc1ccc(\C=C(/C)C(=O)N[C@@H]2[C@@H]([C@H]3OCO[C@H]3[C@@H](O)[C@@H]2O)O)cc1O YQYJSBFKSSDGFO-FWAVGLHBSA-N 0.000 description 1
- 108010002685 hygromycin-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical compound O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000028745 meiotic gene conversion Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002175 menstrual effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 101150077280 mt-atp6 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 238000009401 outcrossing Methods 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012772 sequence design Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003934 vacuole Anatomy 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了一种培育转基因杂交水稻的方法。该方法包括如下步骤：将目的基因拆成5’端和3’端两部分，分别与Intein的N端和C端剪接区的序列连接，形成融合基因A和融合基因B，将两融合基因分别导入三系杂交体系的保持系和恢复系，或者两系杂交体系的不育系和恢复系，杂交后获得杂交种，所得杂交种同时含两个基因片段，在intein介导的蛋白剪接下，两无活性的蛋白片段重新组装成完整有活性的目标蛋白，赋予杂交种目标性状。这样两亲本中虽含有部分基因片段，但不具功能，不会产生转基因飘流引起的环境安全问题，杂交种的花粉虽能扩散出去，但同时含两个基因片段的概率大大降低，很大程度上降低了转基因飘流频率，且还能避免自留种，更好的保护知识产权。
Description
技术领域
本发明属于转基因生物安全技术领域，涉及一种培育转基因杂交水稻的方法，特别涉及一种培育安全转基因杂交水稻的方法。
背景技术
杂种优势是自然界普遍存在的现象。杂交育种就是通过不同品种间的杂交，在杂交后代的分离群体中筛选集合双亲优良性状的个体并最终形成品种。但由于长期定向选择，种内可用的优异基因逐渐减少，通过常规杂交育种方法选育能够满足人们需求的优良品种正面临很大的挑战，于是育种家们开始寻求将丰富的生物资源库中的优异基因用于杂交育种的新方法和新途径。
植物转基因技术的迅猛发展，为育种家们提供了培育优质杂交种的新方法。利用转基因技术培育杂交种，不但可以实现1个或多个目标基因的定向转移，而且能打破有利基因和不利基因的连锁，缩短育种进程。但转基因飘流及其可能引起的环境后果等转基因安全性问题越来越受到人们的关注，已成为限制转基因杂交种应用的瓶颈问题之一。因此，探寻培育安全的转基因杂交种的新方法势在必行。
蛋白内含肽（Intein）是一类介导翻译后蛋白剪接的内部蛋白元件，前体蛋白中Intein催化一系列反应，将其自身从前体蛋白中移去，并将两侧称为Extein的蛋白片段以正常的肽键连接起来形成成熟蛋白，这个过程称为蛋白剪接。蛋白剪接是一个非常快速的过程，Intein-Extein连接处的3个保守的氨基酸残基直接参与蛋白的拼接反应，包括Intein N末端的Ser或Cys（基序A的第一个氨基酸），Intein C末端的Asn或Gln(基序G的最后一个氨基酸)，C-extein起始端的Ser、Thr或Cys。Intein首先是在酵母中发现的。1990年Kane等[Kane PM,Yamashiro CT,Wolczyk DF,Neff N,GoeblM,Stevens TH(1990)Protein splicing converts the yeast TFP1gene product to the69-kDsubunit of the vacuolar H(+)-adenosine triphosphatase.Science250:651–657]在研究酵母（Saccharomyces cerevisiae)）液泡H(+)2ATPase的69kD亚基基因vma1时，首次发现蛋白质的自我剪接现象。Intein普遍存在于三界生物系统（古细菌、真细菌和真核生物）中，目前在InBase库中注册的intein已有580多个（http://www.neb.com/neb/inteins.html）。Intein一般由128-1650个氨基酸残基所组成，含有高度保守的基序A、B、F和G[Noren CJ,Wang J,Perler FB(2000)Dissecting the chemistry ofprotein splicing and its applications.Angew Chem Int Ed Engl39(3):450–466]。根据Intein是否含有居家核酸内切酶（homing endonuclease）结构域，可将其分为大Intein和小Intein，大Intein含有居家核酸内切酶结构域、N端和C端剪接域，其中居家核酸内切酶结构域不参与蛋白剪接，推测其功能是通过自导引的机制来促进Intein的转移[Gimble FS,Thorner J(1992)Homing of a DNA endonuclease gene by meiotic geneconversion in Saccharomyces cerevisiae.Nature357:301–306]。另外，根据N端和C端剪接域是否为共价连接，可将Intein分为cis-splicing inteins和trans-splicing inteins[Wu H,Xu MQ,Liu XQ(1998)Protein trans-splicing and functional mini-Inteins of acyanobacterial DnaB Intein.Biochim Biophys Acta1387:422–432]。
发明内容
本发明的目的是提供一种培育转基因杂交水稻的方法。
本发明所提供的培育转基因杂交水稻的方法，具体包括如下步骤：
（1）将目的基因分成5’端序列和3’端序列两部分；在所述目的基因的5’端序列的3’末端直接连接内含肽（intein）的N端剪接区的核苷酸序列，形成融合基因片段A；在所述目的基因的3’端序列的5’末端直接连接内含肽（intein）的C端剪接区的核苷酸序列，形成融合基因片段B；
（2）为如下I）或II）：
I）为如下a1）-a5）：
a1）将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者中的一个导入水稻三系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；另一个导入所述水稻三系杂交体系中的保持系，得到转基因水稻保持系；
a2）通过确定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中的拷贝数（可采用Southern杂交检测）及在染色体上的插入位点（可进行染色体定位分析），得到满足如下条件的所述转基因水稻恢复系和所述转基因水稻保持系，分别记作转基因水稻恢复系-1和转基因水稻保持系-1：
所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中均以单拷贝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中所位于的染色体编号相同；
a3）筛选（如抗生素压力筛选）获得转基因水稻恢复系-1纯合系和转基因水稻保持系-1纯合系；
a4）将步骤a3）所得的转基因水稻保持系-1纯合系与所述水稻三系杂交体系中的不育系杂交，获得含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的转基因水稻不育系；
a5）将步骤a3）所得的转基因水稻恢复系-1纯合系与步骤a4）所得的转基因水稻不育系杂交，获得同时含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的转基因杂交水稻；
II）为如下b1）-b4）：
b1）将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者中的一个导入水稻两系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；另一个导入所述水稻两系杂交体系中的不育系，得到转基因水稻不育系；
b2）通过确定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中的拷贝数（可采用Southern杂交检测）及在染色体上的插入位点（可进行染色体定位分析），得到满足如下条件的所述转基因水稻恢复系和所述转基因水稻不育系，分别记作转基因水稻恢复系-1和转基因水稻不育系-1：
所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中均以单拷贝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中所位于的染色体编号相同；
b3）筛选（如抗生素压力筛选）获得转基因水稻恢复系-1纯合系和转基因水稻不育系-1纯合系；
b4）将步骤a3）所得的转基因水稻恢复系-1纯合系与转基因水稻不育系-1纯合系杂交，获得同时含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的转基因杂交水稻。
在本发明的一个实施例中，具体是将所述融合基因片段A导入所述水稻三系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；将所述融合基因片段B导入所述水稻三系杂交体系中的保持系，得到转基因水稻保持系。
在本发明中，所述内含肽具体为来自于集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）的DnaE内含肽。
在蛋白水平上，所述DnaE内含肽的N端剪接区的氨基酸序列具体为序列表中序列1。所述DnaE内含肽的C端剪接区的氨基酸序列为序列表中序列2。
在基因水平上，所述DnaE内含肽的N端剪接区的核苷酸序列具体为序列表中序列3。所述DnaE内含肽的C端剪接区的核苷酸序列为序列表中序列4。
在本发明中，所述目的基因具体为具有草甘膦抗性的G2-aroA基因；所述G2-aroA基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
进一步，所述G2-aroA基因的所述5’端序列为序列5的第1-885位；所述G2-aroA基因的所述3’端序列为序列5的第886-1335位。
在本发明的一个实施例中，所述水稻三系杂交体系中的恢复系具体为水稻品种中恢8006；所述水稻三系杂交体系中的保持系具体为水稻品种内香2B；所述水稻三系杂交体系中的不育系具体为水稻品种内香2A。
在本发明中，所述方法步骤a1）或b1）中，将所述融合基因片段A或所述融合基因片段B导入所述水稻三系杂交体系中的恢复系或所述水稻三系杂交体系中的保持系，具体是通过导入含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的重组表达载体实现的；
进一步，含有所述融合片段A的所述重组表达载体具体为在植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点（如Hind III和EcoR I之间）处自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、融合基因片段A、nos终止子后所得的重组质粒；含有所述融合片段B的所述重组表达载体具体为在植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点（如Hind III和EcoR I之间）处自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、融合基因片段B、nos终止子后所得的重组质粒。
其中，所述ubi启动子的核苷酸序列为序列表中序列6所示；所述叶绿体导肽的核苷酸序列为序列表中序列7所示；所述nos终止子的核苷酸序列为序列表中序列8所示。
本发明具有如下优点：本发明采用两个基因片段分别导入三系杂交体系的恢复系和保持系，或两系杂交体系的恢复系和不育系中，这样在杂交时，亲本A和亲本B的花粉虽仍可随风传播，但其花粉中只带有单个基因片段，即使飘流至其它非转基因作物或近缘种，也不会产生有功能的完整目的蛋白。杂种F1的花粉虽仍可随风传播，但两个基因片段随花粉同时飘流出去的频率很低，使得基因飘流频率可降低到阈值允许范围内，从而达到培育安全转基因杂交种的目的。
附图说明
图1为重组表达载体基因表达框示意图。其中，A为含有融合基因片段A的重组表达载体pEnIn；B为含有融合基因片段B的重组表达载体pICEC。A、B中UbiP均表示玉米多聚泛素蛋白基因Ubiqutin启动子；CTS均表示菊花Rubisco小亚基的叶绿体信号肽；NosT均表示胭脂碱合成酶基因Nos的终止子；35SP均表示花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子；hptII均表示潮霉素磷酸转移酶基因，提供潮霉素抗性；PolyA Signal均表示多聚腺苷酸加尾信号；RB均表示T-DNA右边界；LB均表示T-DNA。
图2为不同类型转基因水稻的PCR检测结果。其中，A为转基因水稻中恢8006/pEnIn；B为转基因水稻内香2B/pICEC。A和B中，泳道M均为Trans100bp DNA分子量标准；泳道1-15（或16）均为阳性待测转基因水稻。
图3为不同类型转基因水稻的Southern检测结果。其中，B’为转基因水稻内香2B/pICEC。具体的，1：Ec-1/EcoRI；2：Ec-1/XhoI；3：Ec-5/EcoRI；4：Ec-5/XhoI；5：Ec-28/EcoRI；6：Ec-28/XhoI；7：Ec-8/EcoRI；8：Ec-8/XhoI；9：转基因水稻内香2B/pCAMBIA1300/EcoRI（阴性对照）；10：pICEC（阳性对照）。D’为转基因水稻中恢8006/pEnIn。具体的，1：En-1/EcoRI；2：En-1/XhoI；3：En-6/EcoRI；4：En-6/XhoI；5：En-9/EcoRI；6：En-9/XhoI；7：En-12/EcoRI；8：En-12/XhoI；9：En-34/EcoRI；10：En-34/XhoI；11：转基因水稻中恢8006/pCAMBIA1300/EcoRI（阴性对照）；12：pEnIn（阳性对照）。
图4为T1代转基因杂交种的草甘膦抗性筛选结果。其中左图为T1代转基因杂交种，右图为转基因水稻中恢8006/pEnIn。
图5为T1代转基因杂交种的PCR检测结果。具体的，泳道1为DNA分子量标准Trans5K DNA Marker；泳道2为T1代转基因杂交种扩增融合基因片段EnIn；泳道3为中恢8006/pCAMBIA1300扩增融合基因片段EnIn；泳道4为以水代替模板扩增融合基因片段EnIn；泳道5为T1代转基因杂交种扩增融合基因片段ICEC；泳道6为内香2B/pCAMBIA1300扩增融合基因片段ICEC；泳道7为水代替模板扩增融合基因片段ICEC。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例中未详细说明的操作步骤参照《分子克隆实验指南》第三版相应部分（J.萨姆布鲁克D.W.拉塞尔著，科学出版社）或参阅所用试剂盒的说明书。
植物表达载体pCAMBIA1300：购自澳大利亚CAMBIA公司。
植物表达载体pBI121：上海希匹吉生物技术有限公司，货号CPC087
水稻恢复系中恢8006：记载在“曹立勇，沈希宏，占小登等.杂交水稻新品种国稻6号的选育及栽培技术.粮食作物，2008（3）：55-56”一文，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
水稻不育系内香2A及其保持系内香2B：记载在“任鄄胜，李仕贵，肖培村等.水稻线粒体基因atp6启动子突变导致的一种细胞质雄性不育型.西南农业学报，2009（22）：544-549”一文，公众可从中国农业科学院生物技术研究所获得。
玉米品种郑单958：购自北京德农种业有限公司。
Impactvector1.4质粒：购自Wageningen UR（荷兰）。
pMD19-T质粒：购自六合通经贸有限公司（产品目录号：D102A）。
所用培养基配方如下表：
实施例1、用于杂交的不同类型转基因水稻的获得
一、重组表达载体的构建
1、融合基因片段EnIn和IcEc的获得
利用PCR方法将G2-aroA基因分成5’端和3’端两部分，并分别与来自于集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）的DnaE内含肽（intein）的N端剪接区的核苷酸序列和C端剪接区的核苷酸序列连接，形成融合基因片段EnIn和IcEc。具体如下：
以序列表中序列5所示的G2-aroA基因为模板，利用引物G2-5’-up和G2-5’-down进行PCR扩增，获得含有G2-aroA基因的5’端序列的DNA片段；利用引物G2-3’-up和G2-3’-down进行PCR扩增，获得含有G2-aroA基因的3’端序列的DNA片段。以序列表中序列3所示的来自于集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）的DnaE内含肽的N端剪接区的编码核苷酸序列为模板，利用引物DnaE-5’-up和DnaE-5’-down进行PCR扩增，获得含有DnaE内含肽的N端剪接区序列的DNA片段；以序列表中序列4所示的来自于集胞藻6803（Synechocystis sp.PCC6803）的DnaE内含肽的C端剪接区的编码核苷酸序列为模板，利用引物DnaE-3’-up和DnaE-3’-down进行PCR扩增，获得含有DnaE内含肽的C端剪接区序列的DNA片段。
G2-5’-up：5’-GGCCATGGATGGCGTGTTTGCCTGATGA-3’（下划线部分为Nco I的识别位点，其后的序列为序列5的第1-20位）；
G2-5’-down：5’-GAAGTCCTGCGCGGCTACGC-3’（序列5的第866-885位的反向互补序列）；
G2-3’-up：5’-TTTAACATATCC-ACCCAGCCCGACGCCAAGGC-3’（“-”前的序列为序列4的第112-123位；“-”后的序列为序列5的第886-905位）；
G2-3’-down：5’-CCGGAGCTC-TCAGTCGTTTAGGTGAACGCCCAGG-3’（下划线部分为Sac I的识别位点，“-”后的序列为序列5的第1311-1335位的反向互补序列）；
DnaE-5’-up：5’-GCGCAGGACTTC-AAATTTGCTGAATATTGCCT-3’（“-”前的序列为5的第874-885位；“-”后的序列为序列3的第1-20位）；
DnaE-5’-down：5’-GGCGAGCTCTTAT-TTAATTGTCCCAGCGTCAAG-3’（下划线部分为Sac I的识别位点，“-”后的序列为序列3的第364-384位的反向互补序列）；
DnaE-3’-up：5’-GGCCATGGATGGTTAAAGTTATCGGTCG-3’（下划线部分为NcoI的识别位点，其后的序列为序列4的第1-20位）；
DnaE-3’-down：5’-GGATATGTTAAAGCAGTTAG-3’（序列4的第104-123位的反向互补序列）；
以上述PCR获得的含有G2-aroA基因的5’端序列的DNA片段，与含有DnaE内含肽的N端剪接区序列的DNA片段的混合物为模板，利用引物G2-5’-up和DnaE-5’-down进行PCR扩增，获得二者的融合基因片段，将所得融合基因片段命名为EnIn。以上述PCR获得的含有G2-aroA基因的3’端序列的DNA片段，与含有DnaE内含肽的C端剪接区序列的DNA片段的混合物为模板，利用引物DnaE-3’-up和G2-3’-down进行PCR扩增，获得二者的融合基因片段，将所得融合基因片段命名为IcEc。
2、重组表达载体的构建
（1）重组载体pUBI121的构建
以玉米品种郑单958的基因组DNA为模板，利用如下引物ubi-F和ubi-R进行PCR扩增，以期得到ubi启动子。
ubi-F：5’-AAGCTTGCATGCCTGCAGTGCAGCGT-3’（下划线部分为Hind III的识别位点，其后的序列为序列6的第1-20位）；
ubi-R：5’-GGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGAAG-3’（下划线部分为BamH I的识别位点，该序列的第8-27位为序列6的第1095-2014位的反向互补序列）
用限制性内切酶Hind III和BamH I双酶切PCR产物，回收酶切产物（大小约为2014bp），与经过同样双酶切的pBI121载体的骨架片段（大小约为188937bp）相连，将连接产物转化大肠杆菌DH5α后，摇菌提取质粒，测序。将经测序表明在pBI121载体的酶切位点Hind III和BamH I之间插入了序列表中序列6所示的DNA片段的重组质粒命名为pUBI121。
（2）重组载体p121-ST的构建
根据Impactvector1.4质粒中的叶绿体导肽序列设计引物IF和IR，为构建载体方便，在引物IF的5’端增加了BamH I酶切位点，在引物IR的5’端增加了Bgl II、NcoI和SacI酶切位点。以IF和IR为引物，以Impactvector1.4质粒为模板进行PCR扩增，一期获得叶绿体导肽。
IF：5’-CTGGATCCATGGCCTCGATCTCTTCCTC-3’（下划线部分为BamH I的识别位点，其后的序列为序列7的第1-20位）；
IR：5’-CTGAGCTCAT-AGATCT-CCATGGACTTCTTCAA ACCCAATGGT-3’（下划线部分依次为SacI、Bgl II和NcoI的识别位点，自粗体A后的序列为序列7的第270-288位的反向互补序列）
将PCR产物与pMD19-T质粒相连，连接后挑选阳性克隆测序，将测序表明含有序列表中序列7所示DNA片段（叶绿体导肽）的重组质粒命名为p19-ST。
用限制性内切酶BamH Ⅰ和Sac Ⅰ双酶切p19-ST载体，回收酶切目的片段（大小约为288bp），与经过同样双酶切的步骤（1）构建的重组载体pUBI121的骨架片段（大小约为189057bp）相连，将连接产物转化大肠杆菌DH5α后，摇菌提取质粒，测序。将经测序表明在pUBI121载体的酶切位点BamH Ⅰ和Sac Ⅰ之间插入了序列表中序列7所示的DNA片段的重组质粒命名为p121-ST。
（3）重组载体p121-ENIN和p121-IcEc的构建
用限制性内切酶NcoI和SacI分别双酶切步骤1所得的融合基因EnIn和IcEc，回收酶切产物后，分别与经过同样双酶切的步骤（2）构建的重组载体p121-ST的骨架片段（大小约为189345bp）相连，将连接产物转化大肠杆菌DH5α后，摇菌提取质粒，测序。
将经测序表明在p121-ST载体的酶切位点NcoI和SacI之间插入了所述融合基因EnIn的重组质粒命名为p121-ENIN。将经测序表明在p121-ST载体的酶切位点NcoI和SacI之间插入了所述融合基因IcEc的重组质粒命名为p121-IcEc。
（4）重组表达载体pEnIn和pICEC的构建
用限制性内切酶Hind III和EcoR I分别双酶切步骤（3）构建得到的重组载体p121-ENIN和p121-IcEc，回收目的片段（对应p121-ENIN和p121-IcEc的目的片段大小依次约为3827bp和3131bp）后，分别与经过同样双酶切的pCAMBIA1300载体的骨架片段（大小约为8958bp）相连，将连接产物转化大肠杆菌DH5α后，摇菌提取质粒，测序。
将测序正确且含有融合基因片段EnIn（序列5的第1-885位+序列3，“+”表示直接连接）的重组质粒命名为pEnIn；将测序正确且含有融合基因片段IcEc（序列4+序列5的第886-1335位，“+”表示直接连接）的重组质粒命名为pICEC。重组表达载体pEnIn和pICEC的基因表达框如图1所示，外源基因前面带有Rubisco小亚基的叶绿体导肽，并由ubi启动子驱动，3’末端为nos终止子（来源于pBI121质粒），筛选标记基因为hpt（来源于pCAMBIA1300质粒）。具体的，重组表达载体pEnIn为在植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点Hind III和EcoR I之间自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、融合基因片段EnIn、nos终止子后所得的重组质粒；重组表达载体pICEC为在植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点Hind III和EcoR I之间自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、融合基因片段IcEc、nos终止子后所得的重组质粒。其中，所述ubi启动子的核苷酸序列为序列表中序列6所示；所述叶绿体导肽的核苷酸序列为序列表中序列7所示；所述nos终止子的核苷酸序列为序列表中序列8所示。
二、不同类型转基因水稻的获得及鉴定
1、不同类型重组农杆菌的获得
将步骤一获得的重组表达载体pEnIn、pICEC和空载体pCAMBIA1300用电击的方式分别转入农杆菌EHA105（Biovector Co.,LTD,Biovector-375）中。按照如下方法对转化后的重组农杆菌进行鉴定：1）提取重组农杆菌的质粒，冻融法回转至大肠杆菌TOP10；2）提取含有重组质粒的大肠杆菌TOP10的质粒，用BamHI和SacI酶切，同时酶切重组表达载体pEnIn和pICEC，通过比较酶切结果确定重组农杆菌的正确性。将酶切鉴定正确的重组农杆菌进行测序验证。将经鉴定表明含有融合基因片段EnIn（序列5的第1-885位+序列3，“+”表示直接连接，目的条带大小约为1269bp）的重组农杆菌命名为EHA105/pEnIn。将经测序表明含有融合基因片段IcEc（序列4+序列3的第886-1335位，“+”表示直接连接，目的条带大小约为573bp）的重组农杆菌命名为EHA105/pICEC。将转入空载体pCAMBIA1300的重组农杆菌命名为EHA105/pCAMBIA1300。
2、不同类型转基因水稻的获得
（1）将水稻恢复系中恢8006，以及水稻不育系内香2A的保持系内香2B的成熟种子脱去颖壳，置于无菌三角瓶中，用浓度为40%（40g/100ml）的次氯酸钠水溶液灭菌30～40min，然后用无菌水冲洗3～4次。将种子置于无菌的滤纸上30min晾干多余水分，接种于愈伤组织诱导培养基中，15～20粒/皿，置于光照培养箱中培养。诱导愈伤的时间约40～50天。
（2）将重组农杆菌EHA105/pEnIn和EHA105/pICEC分别置于28℃培养过夜，待其浓度达到OD600值为0.60～0.80之间时，4℃、3000rpm、离心10min，之后将菌体重悬至100ml的AA液体培养基中，使菌液的OD600值为0.10～0.20之间，待用。
（3）用重组农杆菌EHA105/pEnIn菌液侵染水稻恢复系中恢8006的愈伤组织，用重组农杆菌EHA105/pICEC菌液侵染水稻不育系内香2A的保持系内香2B的愈伤组织，侵染30分钟，期间不时用手轻摇。倒掉菌液，把愈伤颗粒用勺子取出，置于铺有无菌滤纸的培养皿中，40～50min，直到表面菌液被晾干。共培养培养基平板中放一张滤纸，把阴干的愈伤组织颗粒铺在上面，封好平皿，25～28℃暗培养三天。
（4）共培养结束后，将愈伤组织转移到选择培养基上培养10～15天后继代一次。挑取从原愈伤组织表面生长出来的新的抗性愈伤组织，转移到预分化培养基上。
（5）28℃黑暗下预分化培养7天。选择奶白色，表面光滑的愈伤组织转移到分化培养基上，28℃分化培养：先在黑暗下培养3天，然后在持续冷光照下培养15～20天。
（6）将从抗性愈伤组织再生出的幼苗转移到生根培养基上，持续光照培养15天，生长状况良好的幼苗直接转移到大田种植。将得到的转入重组农杆菌EHA105/pEnIn的水稻恢复系中恢8006命名为中恢8006/pEnIn；将得到的转入重组农杆菌EHA105/pICEC的水稻不育系内香2A的保持系内香2B命名为内香2B/pICEC。
实验同时设置转入重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300的水稻恢复系中恢8006，和转入重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300的水稻不育系内香2A的保持系内香2B作为空载体对照。将得到的转入重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300的水稻恢复系中恢8006命名为中恢8006/pCAMBIA1300；将得到的转入重组农杆菌EHA105/pCAMBIA1300的水稻不育系内香2A的保持系内香2B命名为内香2B/pCAMBIA1300。
3、不同类型转基因水稻的鉴定
（1）PCR鉴定
将获得的转基因水稻中恢8006/pEnIn、内香2B/pICEC、中恢8006/pCAMBIA1300和内香2B/pCAMBIA1300分别进行PCR分子鉴定。同时以未转基因的中恢8006和内香2A保持系内香2B作为对照。
检测融合基因片段EnIn的引物为R1、L1，对应模板为转基因水稻中恢8006/pEnIn、中恢8006/pCAMBIA1300的基因组DNA（空载体对照）、水稻品种中恢8006的基因组DNA（未转基因对照）；检测融合基因片段ICEC的引物为R2、L2，对应模板为转基因水稻内香2B/pICEC、内香2B/pCAMBIA1300的基因组DNA（空载体对照）、内香2A保持系内香2B的基因组DNA（未转基因对照）；
R1：5’-CGAGATTGATGGTGGTTTGTCC-3’（序列5的第567-588位）
L1：5’-GTCAACAAGTCCAGTTGCCTAG-3’（序列3的第281-302位的反向互补序列）
R2：5’-GCATCTTTGATATCGGTCTG-3’（序列4的第41-60位）
L2：5’-GGTCTTGAATGCGAATGCC-3’（序列5的第1243-1261位的反向互补序列）
检测结果如图2所示，以R1、L1为引物对转基因水稻中恢8006/pEnIn、中恢8006/pCAMBIA1300的基因组DNA（空载体对照）、水稻品种中恢8006的基因组DNA（未转基因对照）进行PCR扩增，只有转基因水稻中恢8006/pEnIn扩增得到大小约为621bp的目的条带，而空载体对照和未转基因对照均没有目的条带；以R2、L2为引物对转基因水稻内香2B/pICEC、内香2B/pCAMBIA1300的基因组DNA（空载体对照）、水稻不育系内香2A保持系内香2B的基因组DNA（未转基因对照）进行PCR扩增，只有转基因水稻内香2B/pICEC扩增得到大小约为436bp的目的条带，而空载体对照和未转基因对照均没有目的条带。
（2）Southern检测
选用的杂交试剂盒是Thermo公司的生物素探针标记试剂盒
BiotinRandom Prime Labeling Kit（Number17075）及化学发光杂交检测试剂盒
Chemiluminescent Hybridization and Detection Kit（Number17097）。
提取转基因水稻中恢8006/pEnIn（不同植株用En-x表示）和内香2B/pIcEc（不同植株用Ec-x表示）的基因组DNA，利用限制性内切酶EcoR I和Xho I分别进行过夜单酶切，每组酶切反应中基因组总量在200μg以上。电泳后进行转膜、洗膜和预杂交。用限制性内切酶Nco I和Sac I双酶切重组表达载体pEnIn和pICEC，分别回收1.2kb和0.5kb的DNA条带，作为标记探针。按照试剂盒说明对探针进行标记。为了计算标记探针的产量，使用Thermo Scientific NanoDrop2000C测量该探针溶液的OD260、OD280的吸光值，获得质量浓度。预杂交结束后加入标记好的探针进行杂交，杂交条件为55℃过夜。过夜结束后用1×严谨洗膜液（试剂盒随附）按照200μl/cm2膜面积加入到杂交瓶中，55℃洗膜单次15～20min，共计3次。将膜至于发光检测工作液（等体积混合Luminol Enhancer溶液和Peroxide（过氧化氢）溶液，试剂盒随附）中孵育5min（RT），将湿润的膜置于干净的保鲜膜上，包好，赶走气泡，不要有褶皱。将膜用胶带固定于X光片夹的增感屏上，含有DNA的一面朝上；在暗室中压上一张大小合适的X光片，用胶带固定两角，上面再放一张增感屏，扣紧X光片夹，-70℃曝光数小时至数天。最后将X光胶片浸没与显影液中直到看到清晰的目的条带，然后浸没与酸性定影液中定影5～10min，用清水冲洗胶片，晾干保存。
Southern检测结果如图3所示，转基因水稻样品En-1、En-12、En-34、Ec-28、Ec-5、Ec-8基因组DNA经EcoR I和Xho I单酶切后，都只能杂交得到1条DNA条带，证明这些转基因水稻为单拷贝插入。
（3）染色体定位分析
利用Tail-PCR方法对步骤（2）鉴定为单拷贝的转基因水稻进行了侧翼序列克隆，并进行染色体定位分析，具体如下：
选用TaKaRa公司的Genome Walking Kit（TaKaRa Code：D316）进行插入片段侧翼序列的克隆。根据pCAMBIA1300载体左边界附近的潮霉素筛选标记基因设计三条同向且退火温度较高的特异性引物hptII-tail-1、hptII-tail-2和hptII-tail-3，与试剂盒中提供的四种经过独特设计的退火温度较低的简并引物，即AP1、AP2、AP3、AP4进行热不对称PCR反应，通过三次巢式PCR反应获取已知序列的侧翼序列，具体操作参见试剂盒说明书进行。将得到的侧翼序列与水稻基因组序列进行比对后确定外源基因在染色体上的定位。
hptII-tail-1：5’-GCTCCAACAATGTCCTGACGGACAATGG-3’
hptII-tail-2：5’-GCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAG-3’
hptII-tail-3：5’-GGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATC-3’
结果显示，转基因水稻En-1和Ec-28中外源基因（融合基因片段EnIn或融合基因片段ICEC）都插入到了9号染色体上。
4、转基因水稻En-1和Ec-28纯合系的筛选
收获转基因水稻En-1和Ec-28的种子后进行播种，于3叶期喷施浓度为75mM的潮霉素水溶液，所有自交后代均能正常生长（即所有后代均具潮霉素抗性）的亲本植株为纯合系，经过连续2代筛选，最终获得转基因水稻En-1（恢复系）和Ec-28（保持系）的纯合系植株。
实施例2、安全转基因杂交水稻的获得
一、转基因杂交水稻的获得
将实施例1得到的转基因水稻Ec-28纯合系（保持系）与水稻品种内香2A（不育系）杂交，获得含有融合基因片段ICEC的不育系，记作内香2A-B。
将实施例1得到的转基因水稻En-1纯合系（恢复系）与内香2A-B（不育系）杂交，获得期待同时含有2个目的基因片段（融合基因片段EnIn和融合基因片段ICEC）的转基因杂交水稻，收获T1代杂交种。
二、转基因杂交水稻的鉴定
1、T1代杂交苗草甘膦抗性鉴定
将步骤一得到的T1代转基因杂交种播种，5M行长、3行区，3次重复，密度：60×35cm，3-5叶期喷施2000ppm的农达（Roundup，41%的草甘膦），7天后开始观察实验结果。同时以转基因水稻中恢8006/pEnIn作为对照。
结果如图4所示，步骤一得到的T1代转基因杂交种100%表现抗性，而作为对照的转基因水稻中恢8006/pEnIn全部死亡。可见，在intein介导的蛋白剪接作用下，两个无活性的蛋白片段重新组装成完整有活性的目标蛋白（草甘膦抗性蛋白），赋予了杂交种目标性状。
2、T1代杂交苗的PCR分子鉴定
以检测融合基因片段EnIn的引物R1、L1，以及检测融合基因片段ICEC的引物R2、L2，对T1代杂交苗的基因组DNA进行PCR扩增。对于引物R1、L1，同时设置以中恢8006/pCAMBIA1300基因组DNA为模板，以及以水为模板的对照；对于引物R2、L2，同时设置以内香2B/pCAMBIA1300基因组DNA为模板，以及以水为模板的对照。
结果如图5所示，对于T1代杂交苗，两对引物的PCR反应可分别得到大小约为621bp和436bp）的两个目的条带，而对照均没有目的条带产生。这一结果证明，步骤一得到的转基因杂交水稻同时含有2个目的基因片段（融合基因片段EnIn和融合基因片段ICEC）。
3、转基因安全性鉴定
以获得的T1代杂交水稻（花期）为父本，以水稻品种内香2A（不育系）为母本进行杂交，收获种子后播种，，5M行长、3行区，3次重复，密度：60×35cm，3-5叶期喷施2000ppm的农达（Roundup，41%的草甘膦），7天后开始观察实验结果。结果显示，杂交后代全部死亡，证明杂交后代不具有草甘膦抗性，证明在100%异交率的情况下，杂交后代中同时含有2个基因片段的频率为0。
Claims (10)
1.一种培育转基因杂交水稻的方法，包括如下步骤：
（1）将目的基因分成5’端序列和3’端序列两部分；在所述目的基因的5’端序列的3’末端直接连接内含肽的N端剪接区的核苷酸序列，形成融合基因片段A；在所述目的基因的3’端序列的5’末端直接连接内含肽的C端剪接区的核苷酸序列，形成融合基因片段B；
（2）为如下I）或II）：
I）为如下a1）-a5）：
a1）将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者中的一个导入水稻三系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；另一个导入所述水稻三系杂交体系中的保持系，得到转基因水稻保持系；
a2）通过确定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中的拷贝数及在染色体上的插入位点，得到满足如下条件的所述转基因水稻恢复系和所述转基因水稻保持系，分别记作转基因水稻恢复系-1和转基因水稻保持系-1：
所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中均以单拷贝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻保持系基因组中所位于的染色体编号相同；
a3）筛选获得转基因水稻恢复系-1纯合系和转基因水稻保持系-1纯合系；
a4）将步骤a3）所得的转基因水稻保持系-1纯合系与所述水稻三系杂交体系中的不育系杂交，获得含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的转基因水稻不育系；
a5）将步骤a3）所得的转基因水稻恢复系-1纯合系与步骤a4）所得的转基因水稻不育系杂交，获得同时含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的转基因杂交水稻；
II）为如下b1）-b4）：
b1）将所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者中的一个导入水稻两系杂交体系中的恢复系，得到转基因水稻恢复系；另一个导入所述水稻两系杂交体系中的不育系，得到转基因水稻不育系；
b2）通过确定所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中的拷贝数及在染色体上的插入位点，得到满足如下条件的所述转基因水稻恢复系和所述转基因水稻不育系，分别记作转基因水稻恢复系-1和转基因水稻不育系-1：
所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中均以单拷贝的形式插入，并且所述融合基因片段A和所述融合基因片段B，两者在所述转基因水稻恢复系或所述转基因水稻不育系基因组中所位于的染色体编号相同；
b3）筛选获得转基因水稻恢复系-1纯合系和转基因水稻不育系-1纯合系；
b4）将步骤a3）所得的转基因水稻恢复系-1纯合系与转基因水稻不育系-1纯合系杂交，获得同时含有所述融合基因片段A和所述融合基因片段B的转基因杂交水稻。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述内含肽为来自于集胞藻6803的DnaE内含肽。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述DnaE内含肽的氨基酸序列为序列表中序列1。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述DnaE内含肽的所述N端剪接区的氨基酸序列为序列1；所述DnaE内含肽的所述C端剪接区的氨基酸序列为序列2。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述DnaE内含肽的所述N端剪接区的核苷酸序列为序列3；所述DnaE内含肽的所述C端剪接区的核苷酸序列为序列4。
6.根据权利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：所述目的基因为具有草甘膦抗性的G2-aroA基因；所述G2-aroA基因的核苷酸序列如序列表中序列5所示。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述G2-aroA基因的所述5’端序列为序列5的第1-885位；所述G2-aroA基因的所述3’端序列为序列5的第886-1335位。
8.根据权利要求1-7中任一所述的方法，其特征在于：所述水稻三系杂交体系中的恢复系为水稻品种中恢8006；所述水稻三系杂交体系中的保持系为水稻品种内香2B；所述水稻三系杂交体系中的不育系为水稻品种内香2A。
9.根据权利要求1-8中任一所述的方法，其特征在于：所述方法中，步骤a1）或b1）中，将所述融合基因片段A或所述融合基因片段B导入所述水稻三系杂交体系中的恢复系或所述水稻三系杂交体系中的保持系，是通过导入含有所述融合基因片段A或所述融合基因片段B的重组表达载体实现的。
10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述方法中，含有所述融合片段A的所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点处自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、所述融合基因片段A、nos终止子后得到的重组质粒；含有所述融合片段B的所述重组表达载体为在植物表达载体pCAMBIA1300的多克隆位点处自上游到下游依次插入ubi启动子、叶绿体导肽、所述融合基因片段B、nos终止子后得到的重组质粒。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310085201.1A CN103160529B (zh) | 2013-03-18 | 2013-03-18 | 一种培育转基因杂交水稻的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201310085201.1A CN103160529B (zh) | 2013-03-18 | 2013-03-18 | 一种培育转基因杂交水稻的方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103160529A true CN103160529A (zh) | 2013-06-19 |
| CN103160529B CN103160529B (zh) | 2014-10-15 |
Family
ID=48584063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201310085201.1A Expired - Fee Related CN103160529B (zh) | 2013-03-18 | 2013-03-18 | 一种培育转基因杂交水稻的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103160529B (zh) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103828710A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-06-04 | 南京农业大学 | 一种高效率菊花杂交育种效率的方法 |
| CN106350536A (zh) * | 2016-08-28 | 2017-01-25 | 浙江大学 | 一种植物杂交体系及其应用 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1247699A (zh) * | 1999-09-10 | 2000-03-22 | 四川农业大学水稻研究所 | 化学去杂杂交水稻制种技术 |
| US20030013148A1 (en) * | 2000-02-04 | 2003-01-16 | Evans Thomas C. | Method for producing circular or multimeric protein species in vivo or in vitro and related methods |
| CN101899489A (zh) * | 2009-05-27 | 2010-12-01 | 南京大学 | 利用内含肽反式剪接模式化生产融合蛋白质 |
| CN102220356A (zh) * | 2011-04-02 | 2011-10-19 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种利用基因拆分控制转基因飘流的方法 |
| CN102643804A (zh) * | 2012-04-12 | 2012-08-22 | 北京奥瑞金种业股份有限公司 | 一种培育耐草甘膦转基因玉米的方法 |
-
2013
- 2013-03-18 CN CN201310085201.1A patent/CN103160529B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1247699A (zh) * | 1999-09-10 | 2000-03-22 | 四川农业大学水稻研究所 | 化学去杂杂交水稻制种技术 |
| US20030013148A1 (en) * | 2000-02-04 | 2003-01-16 | Evans Thomas C. | Method for producing circular or multimeric protein species in vivo or in vitro and related methods |
| CN101899489A (zh) * | 2009-05-27 | 2010-12-01 | 南京大学 | 利用内含肽反式剪接模式化生产融合蛋白质 |
| CN102220356A (zh) * | 2011-04-02 | 2011-10-19 | 中国农业科学院生物技术研究所 | 一种利用基因拆分控制转基因飘流的方法 |
| CN102643804A (zh) * | 2012-04-12 | 2012-08-22 | 北京奥瑞金种业股份有限公司 | 一种培育耐草甘膦转基因玉米的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 孔宁: "基因拆分限控转基因漂流的研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 基础科学辑》, no. 10, 15 October 2008 (2008-10-15), pages 006 - 6 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103828710A (zh) * | 2014-03-18 | 2014-06-04 | 南京农业大学 | 一种高效率菊花杂交育种效率的方法 |
| CN106350536A (zh) * | 2016-08-28 | 2017-01-25 | 浙江大学 | 一种植物杂交体系及其应用 |
| CN106350536B (zh) * | 2016-08-28 | 2021-02-12 | 浙江大学 | 一种植物杂交体系及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103160529B (zh) | 2014-10-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2414657T3 (es) | Acontecimiento de planta de maíz MON87460 y composiciones y procedimientos para la detección del mismo | |
| RU2707527C2 (ru) | Растение маиса dbn9936 и способ применения в детектировании его последовательности нуклеиновой кислоты | |
| CN102604940B (zh) | 转基因玉米事件ie034外源插入片段旁侧序列及其应用 | |
| CN104830845B (zh) | 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9878的核酸序列及其检测方法 | |
| CN113201531B (zh) | 转基因玉米事件lw2-1及其检测方法 | |
| EA017638B1 (ru) | Модифицированный полипептид с дикамба-монооксигеназной активностью, кодирующая его молекула нуклеиновой кислоты и способы их применения | |
| CN101495635A (zh) | 对应于转基因事件mon89034的玉米植物和种子及其检测和使用方法 | |
| KR20120003853A (ko) | 벼의 17053 트랜스제닉 사건 및 이의 이용 방법 | |
| CN104878094B (zh) | 用于检测除草剂耐受性玉米植物dbn9888的核酸序列及其检测方法 | |
| CN105567682A (zh) | 转基因大豆事件b4j8049外源插入片段旁侧序列及其应用 | |
| CN104878091A (zh) | 用于检测玉米植物dbn9978的核酸序列及其检测方法 | |
| CN109971880B (zh) | 用于检测玉米植物dbn9508的核酸序列及其检测方法 | |
| CN103667211A (zh) | 影响雄性生育力的蛋白质、其编码基因及用途 | |
| RU2712730C2 (ru) | Растение кукурузы dbn9858, устойчивое к гербициду, и нуклеотидная последовательность и способ для ее выявления | |
| CN104878092A (zh) | 用于检测玉米植物dbn9953的核酸序列及其检测方法 | |
| CN103160529B (zh) | 一种培育转基因杂交水稻的方法 | |
| CN105200067A (zh) | 水稻转化事件g6h1及其特异性pcr鉴定方法 | |
| CN101993481B (zh) | 一种与植物耐逆相关的蛋白及其编码基因与应用 | |
| CN104830983B (zh) | 用于检测玉米植物dbn9968的核酸序列及其检测方法 | |
| CN109266647A (zh) | 水稻二化螟为害诱导型启动子及其应用 | |
| CN106062192A (zh) | 玉米细胞质雄性不育(cms)s型恢复基因rf3 | |
| CN110283807A (zh) | 一种玉米α-淀粉酶及其编码基因与应用 | |
| CN103261419B (zh) | 一种调控植物花粉育性的构建体及其使用方法 | |
| AU2015375393A1 (en) | Brassica napus seed specific promoters identified by microarray analysis | |
| CN103819544B (zh) | 植物耐旱相关蛋白AtPR1及其编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141015 |