CN103159830A

CN103159830A - 脂肽类化合物

Info

Publication number: CN103159830A
Application number: CN 201110422222
Authority: CN
Inventors: 饶敏; 靳旭; 戈梅; 夏兴; 阮丽军; 张芸; 罗敏玉; 朱丽
Original assignee: Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC; Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Current assignee: Shanghai Laiyi Biomedical Research And Development Center LLC; Zhejiang Medicine Co Ltd Xinchang Pharmaceutical Factory
Priority date: 2011-12-15
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-06-19
Anticipated expiration: 2031-12-15
Also published as: CN103159830B

Abstract

本发明提供了两种新型的脂肽化合物，其结构式为：

Description

脂肽类化合物

技术领域

本发明涉及新化合物，具体地说，是关于两种新型脂肽类化合物及其制备方法和应用

背景技术

随着致病菌耐药性问题的日益严峻，临床上对新抗生素的需求也显得更为迫切。为了应对这一局面，人们一方面对已有抗生素进行改造，另一方面也加快了新型抗生素筛选的步伐。Alexandra

等在2002年从Streptomyces sp.Tü6075分离得到了两组脂肽类化合物arylomycins，包括arylomycins A和arylomycins B(Schimana，Gebhardt et al.2002)。它们都属于六肽化合物，含有相同肽链(D-Me-Ser-D-Ala-Gly-L-Me-Hpg-L-Ala-L-Tyr)，不同的是，arylomycins B中的Tyr含有-NO₂取代基。

2004年，Mark Paetzel等获得了arylomycin A2与Escherichia coli I型信号肽酶结合复合物

分辨率的晶体结构，研究发现arylomycin A2的C端可与信号肽酶催化活性中心的Ser和Lys残基侧链形成氢键，同时arylomycin A2形成β-折叠结构模拟信号肽酶底物的结合(Paetzel，Goodall et al.2004)。I型信号肽酶(SPase I，EC 3.4.21.89)是一种广泛存在于真细菌细胞膜中的丝氨酸蛋白酶，负责将前蛋白N-端的信号肽切除，对细菌的生存和生长至关重要。SPase I被抑制后，会造成分泌蛋白在细胞膜上的大量积累并最终导致细菌死亡(Dalbey and Wickner1985)。一直以来，病原菌蛋白酶抑制剂被认为药物发展的一个方向，但是对人体的毒害性降低了这些抑制剂最终成药的可能性。区别于经典的Ser/His/Asp催化机制，SPase I利用独特的Ser/Lys催化二元体机制，这就意味着SPase I抑制剂有着更高的特异性，对真核细胞有着更低的毒性。同时，由于催化活性中心位于细胞膜外侧，I型信号肽酶被认为是一种很有潜力的抗生素筛选靶标。虽然已经得到了arylomycin A2与Escherichia coli SPase I结合复合物的晶体结构，但在最初生物活性研究中，arylomycins只对Streptococcus pneumonia、Staphylococcus epidermidis及土壤微生物Rhodococcus opacus、Brevibacillus brevis有抗菌活性，而对大多的病原菌如Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa没有活性，这大大限制了其成为药物的可能性。但2010年有研究发现，Staphylococcus aureus、Escherichia coli和Pseudomonas aeruginosa之所以对arylomycins表现出耐药性，是由于这些病原菌的SPase I催化活性中心的Ser突变为Pro从而导致两者的亲和力降低。通过对自然界中厚壁菌门、放线菌们、变形菌门、拟杆菌门及疣微菌门衣原体属中SPase I相应位置Pro突变的分布研究表明，很多自然界中的细菌不存在Pro突变而对arylomycins表现为敏感，如革兰氏阳性边病原菌Streptococcus pneumoniae、Streptococcus pyogenes、S.haemolyticus及革兰氏阴性病原菌Chlamydia trachomatis等(Smith，Roberts et al.2010)。因此arylomycins 作为广谱性抗生素有着广阔的应用前景。

除了加工与生存及生长相关蛋白，I型信号肽酶与其它生命活动如细菌耐药性、细菌毒素的分泌等，也有着密切关系。例如，一些病原菌由于能分泌β-内酰胺酶而对β-内酰胺类抗生素产生耐药性，而研究表明arylomycins类似物lipoglycopeptides能抑制S.aureus β-内酰胺酶的分泌(Kulanthaivel，Kreuzman et al.2004)。因此除了直接作为抗生素使用，arylomycins还能够调节细菌毒性或者使得病原菌变得对其它抗生素敏感，这将大大扩大arylomycins应用范围(Roberts，Smith et al.2007)。

本发明的申请人从小链霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC No.4027的发酵液中分离到了arylomycin A2和arylomycin A4，结构如图1所示，并获得了其生物合成基因簇。arylomycins的一个显著特点是肽链中第四位的甲基HPG和第六位的Tyr通过联芳键连接形成一个三肽的环形结构。在糖肽类抗生素中，如万古霉素和balhimycin的七肽中，第五位的HPG和第七位的Dpg之间也通过联苯键连接，并且证明其由oxyC基因编码P450酶的催化形成(Bischoff，Pelzer et al.2001)。在arylomycins的基因簇中aryC基因编码P450酶，推测其负责甲基HPG与Tyr之间联苯键的形成。通过对aryC基因的敲除一方面证明aryC的基因功能，另一方面探索通过对后修饰基因敲除以获得新的脂肽类化合物。

发明内容

本发明的申请人在对小链霉菌(Streptomyces parvus)CGMCC No.4027的aryC基因缺失突变株的代谢产物的研究过程中，分离得到了两种化合物，经结构鉴定为两种新的脂肽类化合物。

因此，本发明的首要目的是提供两种新的脂肽化合物。

本发明的第二个目的是提供所述脂肽化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供所述脂肽化合物的应用。

本发明的脂肽化合物的结构式为：

其中，R为iso-C12或anteiso-C13。

根据本发明，所述脂肽化合物是由小链霉菌CGMCC No.4027的aryC基因缺失突变株发酵制得。

根据一个优选实施例，所述发酵的发酵培养条件为：

发酵温度28～30℃，发酵时间4～6天；

种子培养基：葡萄糖2％，可溶性淀粉8％，黄豆饼粉5％，磷酸氢二钾0.02％，pH 7.0～7.5；

摇瓶用发酵培养基：黄豆饼粉2.4％，糊精3.2％，葡萄糖0.6％，磷酸氢二钾0.02％，氯化钠0.15％，pH7.0～7.5；

发酵罐用发酵培养基：糊精6％，黄豆饼粉2％，磷酸氢二钾0.02％，氯化钠0.15％，pH 7.0～7.5。

根据一个优选实施例，所述制备方法还包括将发酵液经大孔树脂吸附和制备型HPLC分离的步骤。

本发明的脂肽化合物具有抗菌活性，可用于制备抑制革兰氏阳性菌的药物。

根据本发明的优选实施例，所述革兰氏阳性菌为革兰氏阳性球菌。

根据本发明的优选实施例，所述革兰氏阳性球菌为藤黄八叠球菌与金黄色葡萄球菌。

本发明的脂肽化合物经数据库(SCI finder和DNP)搜索确认两种化合物都是首次发现。

附图说明

图1为arylomycin A2及arylomycin A4的化学结构示意图。

图2为aryC基因缺失双交换突变株PCR筛选结果图。其中，M为Marker；1为以原始菌株染色体为模板的PCR产物；2为空白对照，以无菌水代替模板；3～11为以双交换菌株染色体为模板的PCR产物。

图3为原始菌株和aryC基因缺失突变株发酵液HPLC分析结果图。其中，I为原始菌株；II为aryC基因缺失突变株。

图4为本发明的化合物1和2的制备液相色谱图。

图5为本发明的化合物1的高分辨质谱图。

图6为本发明的化合物2的高分辨质谱图。

图7为本发明的化合物1的MS/MS谱图。

图8为本发明的化合物2的MS/MS谱图。

图9为本发明的化合物1的紫外扫描谱图。

图10为本发明的化合物2的紫外扫描谱图。

图11为本发明的化合物1的氢谱图。

图12为本发明的化合物1的碳谱图。

图13为本发明的化合物1的二维谱谱图，其中(a)为cosy谱图，(b)为dept谱图，(c)为HMBC谱图，(d)为HMQC谱图。

图14为本发明的化合物2的氢谱图。

图15为本发明的化合物2的碳谱图。

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。

本发明所用的菌种为小链霉菌(Streptomyces parvus)，已于2010年7月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.4027。

实施例1、aryC基因缺失突变株的构建

设计引物：

p450_u-F(5’-AAGCTTGACCGGTCGGTGAAGTCCA-3’)；

p450_u-R(5’-CTGCAGTGGAGAAGGTCCGGTGGTCG-3’)；和

引物：

p450_d-F(5’-CTGCAGCGAGCGCATCGAGATTCC-3’)；

p450_d-R(5’-TCTAGAAACGCCCCTTCGATCTCGC-3’)；

分别PCR扩增aryC的上、下游片段p450_u、p450_d。

PCR反应体系(50μl)：PrimerSTAR HS DNA聚合酶(2.5U/μl)0.5μl、2×GC缓冲液25μl、dNTP(浓度各为2.5mM)4μl、引物(20mM)各0.5μl、Streptomyces parvus CGMCC No.4027总DNA 1μl、dH₂O 18.5μl。

反应条件为：94℃预变性3min；94℃变性1min，58～68℃复性30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。

低熔点胶回收预期大小DNA片段后分别与pMD18-T载体连接，得到pMD18-T-p450_u和pMD18-T-p450_d，转化E.coli DH5a，提取质粒并测序验证。然后pMD18-T-p450_u质粒经HindIII和Pst I酶切，回收p450_u片段；pMD18-T-p450_d质粒用Pst I和Xba I酶切，回收p450_d片段；将p450_u、p450_d与经过HindIII和Xba I酶切的pKC1139连接得到重组质粒pKC1139-p450_u-p450_d。重组质粒转化E.coli ET12567。

将含有待接合转移质粒的E.coli ET1256737℃过夜培养，取200μl菌液至装有20ml LB培养基的250ml三角瓶中，37℃培养3～4h至OD₆₀₀达到0.5左右。然后将菌液转移至50ml离心管中4000rpm离心5min收集菌体，并用等体积的新鲜LB洗涤两次，然后重悬于2ml LB中，作为大肠杆菌供体细胞。取-70℃保存的S.parvus CGMCC No.4027孢子悬液一管8000rpm离心2min，去上清，用1ml的2×YT培养基洗涤两次，重悬于500ml 2×YT培养基中，50℃水浴10min。待冷却后加入500μl大肠杆菌供体细胞，混匀，涂布于含有10mM MgCl₂的MS平板上，28℃培养16～20h。在平板表面覆盖1ml无菌水(含0.5mg/ml萘啶酮酸和1mg/ml安普霉素)，用涂布棒涂匀并吹干，28℃培养3～4天。

挑取接合子至含50μg/ml安普霉素的MS平板37℃培养2～3天。然后挑取单菌落接种于液体TSB培养基，28℃培养三代。菌液适当稀释后涂布于MS平板，挑选对安普霉素敏感的单菌落得到双交换菌株，利用引物p450_u-F和p450_d-R进行PCR验证。共得到3株突变株，筛选结果如图2所示，其中，5、7、10为突变株，其余为回复突变。

本领域的技术人员容易理解，以上基因敲除的操作为常规手段，上述方法可以重复实施，且都可以获得预期的突变株。

实施例2、aryC基因缺失突变株的发酵产物分析

2.1、液体发酵

将S.parvus CGMCC No.4027及实施例1中获得的aryC基因突变株的新鲜斜面孢子接种于种子培养基，220rpm振荡培养44h。然后以8％接种量转入液体发酵培养基，28℃，220rpm振荡培养5天。

2.2、发酵液处理

取800μl 2.1中获得的发酵液，然后加入等体积的无水甲醇，混匀，4℃放置30min，12000rpm离心15min。取上清进行HPLC分析。

2.3、HPLC分析

将2.2中获得的发酵液处理上清进行HPLC分析，具体条件如下：

流动相：A相：乙腈-缓冲液(10∶90)

B相：乙腈-缓冲液(45∶55)

缓冲液：0.5％(NH₄)H₂PO₄

梯度条件如表所示：

时间min	0	15	17
				A％	25	0	0
B％	75	100	100

分析用柱：Hypersil C184.6×250mm 5μm

柱温：30℃

检测波长：223nm

流速：1.5mL/min

2.4、原始菌株及aryC基因缺失突变株的发酵产物分析

按照2.1～2.3中所述的方法将原始菌株及aryC基因缺失突变株发酵后采用HPLC分析代谢产物。结果如图3所示，和原始菌株相比(图3I)，aryC敲除后，突变株不能合成arylomycin A2和arylomycin A4，而生成了两个新化合物(图3II中分别标为compound A和compound B)，保留时间相对arylomycin A2和arylomycin A4更短。

实施例3、化合物的制备

3.1、发酵

将实施例1中获得的S.parvus CGMCC No.4027的aryC基因突变株接种到高氏一号斜面培养基上，于28～30℃培养四天后，转入装有经121℃高压灭菌30min的种子培养基的三角瓶中，置于摇床进行种子培养，其中，摇床转速为200～230rpm，温度为28～30℃，培养时间为46～50h。种子培养结束后再转入装有已灭菌的发酵培养基的三角瓶内，转种量4％，进行摇瓶发酵培养，摇床转速150～300rpm，温度为28～30℃，培养6天后，发酵结束。

经种子培养后也可转入装有已灭菌的发酵培养基的5L玻璃发酵罐内。转种量4％，在发酵罐内进行发酵，搅拌转速为300～500rpm，温度控制在28～30℃，通气量为7～9L/min，培养4～6天后结束发酵。

3.2、样品分离精制

将3.1中发酵后得到的发酵液置于4℃冰箱中过夜，沉淀蛋白。之后将发酵液于4℃、4000rpm离心30min。弃下层沉淀，上清液用大孔吸附树脂吸附，大孔吸附树脂可以采用XAD-1600，SP850，或JD-1，于静态或动态进行吸附皆可，吸附时间不少于3小时。吸附后用两倍柱体积的纯水、10％、30％、50％、75％、100％乙醇依次洗脱，粗品集中在75％乙醇洗脱液中。粗品液用旋转蒸发仪于40℃减压浓缩，再采用中压系统进行粗制。条件如下：粗品浓缩液用45％乙腈稀释10倍，12000rpm离心10min，上清为进样样品。上样量为15～25ml，采用中压柱(型号：Biotage Si 25+M 1603-2，USA)进行分离，柱温自然，流动相为45％乙腈500ml，等度洗脱。流速约3～5ml/min，样品集中于300～500ml的洗脱液中。洗脱液用旋转蒸发仪于40℃减压浓缩后采用Agilent 1100双元泵制备液相系统进行制备，收集到的制备液于40℃旋蒸浓缩至干获得目标化合物纯品。

液相制备条件如下：

制备柱：YMC-Pack-ODS-A 5μm 10×250mm

柱温：35℃

检测器：DAD(210nm，223nm，254nm，280nm)

流速：3ml/min

进样量：60μl

流动相及洗脱条件：

时间(min)	A(0.05％甲酸水溶液)	B(乙腈)
			0	50	50
20	35	65

结果如图4所示，截取保留时间为17.55min和14.17min的物质，分别命名为化合物1和化合物2，用于以下结构鉴定，两物质均为淡黄色粉末，易溶于甲醇、乙醇、水、乙腈。

实施例4、化合物的结构鉴定

经高分辨质谱检测，图谱如图5、图6所示，化合物1的精确分子量为677.4084，化合物2的精确分子量为663.3886。

经Masslynx软件中分子式的推算功能，化合物1的分子式推测为C₃₄H₅₅N₅O₉，化合物2的分子式推测为C₃₃H₅₃N₅O₉。

经紫外扫描与MS/MS检测，两个化合物的MS/MS图谱(如图7、图8所示)和紫外吸收图谱(如图9、图10所示)相似，表明两化合物为结构同系物。

进一步，结合化合物1的氢谱(图11)、碳谱(图12)及二维谱(图13)、及核磁数据(表1)对其结构进行分析。

表1、化合物1的NMR核磁数据

通过解析，确定了所有碳原子和氢原子的归属，得到了小链霉菌的次级代谢产物化合物1的结构如下：

由于化合物2与化合物1为结构同系物，结合两化合物的H、C谱信息分析表明差别仅在于侧链上的亚甲基-CH₂，在确定化合物1的结构的基础上，结合对化合物2的氢谱(图14)、碳谱(图15)及核磁数据(表2)对其结构进行分析。

表2、化合物2的NMR核磁数据

通过解析，确定了所有碳原子和氢原子的归属，得到了小链霉菌的次级代谢产物化合物2的结构如下：

以上分析确证了化合物1和2的结构，经数据库(SCI finder和DNP)搜索确认两化合物都是新化合物。

实施例5、化合物的抑菌活性

藤黄八叠球菌CMCC28001和金黄色葡萄球菌ATCC6538的菌悬液(5×10⁷/ml)各加100μl于25ml细菌琼脂培养基，倒平板，待培养基凝固后，将加有两样品的纸敏片置于表面。加有样品的纸敏片的制备方法如下：取样品液(5mg/ml)，加样20μl于纸片上。纸片直径6.5mm。

载样平板于37℃培养12～20h后，化合物1与化合物2对藤黄八叠球菌抑菌圈直径分别为8.2mm与7.7mm，对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径分别为9.8mm与8.6mm，显示两化合物均对藤黄八叠球菌和金黄色葡萄球菌具有抗菌活性，且化合物1的活性要大于化合物2。