CN103159772A - 荧光素内酰胺一氧化氮荧光探针的制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于荧光素内酰胺衍生物的一氧化氮分子荧光探针的制备方法及其用途。以4-氯(或氟)间苯二酚和邻苯二甲酸酐在氯化锌催化下熔融反应生成二氯(或氟)代荧光素衍生物，经酰氯化后与邻苯二胺反应合成荧光素内酰胺衍生物，产物用柱层析进行分离提纯。此荧光素内酰胺在水溶液中无荧光，当与一氧化氮反应开环水解生成有荧光的荧光素衍生物，荧光强度随着一氧化氮浓度的增大而增强。探针的激发波长和发射波长在可见光区，对一氧化氮检测具有高的专一性和灵敏度，适用pH范围宽，可用于水溶液中和组织细胞中微量一氧化氮的检测。
Description
技术领域
本发明涉及微量一氧化氮的测定技术领域，具体地说是一种基于荧光素内酰胺衍生物的一氧化氮分子荧光探针的制备和应用。
背景技术
一氧化氮(NO)作为一种重要的生物信息分子，在生命过程中发挥着重要的生理作用。目前，NO被认为是生命必需的调节分子，它在心血管系统，中枢和外周神经系统及免疫系统中起关键的作用。而且NO是植物体中普遍存在的关键信号分子，参与植物的生长、发育和抗病防御等多种生理过程。要研究阐明NO的生理功能和病理机制，就必需快速灵敏检测体内或体外产生的NO的浓度及其时空分布。因此建立高灵敏度、高选择性检测组织和细胞内NO的分析方法具有重要意义(文献1：Koshland D E.The Molecule ofthe Year，Science，1992，258：1861-1861；文献2：张灯青，赵圣印，刘海雄，一氧化氮荧光分子探针，化学进展，2008，20(9)：1396-1405；文献3：张丽丽，周杰，植物体中一氧化氮的检测方法及其应用，植物生理学通讯，2007，43(5)：921-927)。目前NO的检测方法主要有荧光法、电化学法、化学发光法、电子自旋共振波谱法和紫外-可见光谱法等，其中荧光法灵敏度高、选择性好、操作简单的特点，荧光检测若和显微镜连用能够实现对细胞内和细胞外NO的成像，达到高的时空分辨率，因此是目前最为理想的检测方法之一(文献2；文献4：张娴，王红，梁淑彩，张华山，检测生理内源性一氧化氮分子探针的研究及应用进展，分析科学学报，2002，18(6)：513-517)。基于荧光法的NO荧光分子探针主要有两种机理，一种是基于过渡金属的NO传感器，另一种是基于光诱导电子转移(PET)机理的NO传感器(文献5：Gunnlaugsson T，Ali H D P，GlynnMetal Fluoreseent Photoindueed eleetrontransfer(PET)sensors for anions：From design to Potential applieation，Joumal of Fluoreseenee，2005，15(3)：287-299)。但这类荧光探针的主要缺点是：探针合成过程复杂、产率低；探针本身的空白信号会降低NO检测的灵敏度，或者干扰成像；探针对目标分子缺乏明显的发色行为。因此，在选择性、灵敏性及基于新的发光机理等方面还需要改进和发展。Zheng Hong和XU Jin-Gou等人报道了一种基于罗丹明螺旋内酰胺的NO分子荧光探针，它是通过NO与罗丹明B螺旋内酰胺进行开环反应，所生成的产物再水解成有荧光的罗丹明B，从而实现对NO的探测，该探针合成方法简单，本身无荧光，有利于提高NO检测的灵敏度和生物成像(文献6：H.Zheng，G.Q.Shang，S.Y.Yang，X.Gao，J.G.Xu.Fluorogenic and chromogenic rhodamine spirolactam based probe for nitric oxide by spiro ring opening reaction，Organic Letters，2008，10(12)：2357-2360)。
本发明合成了二氯代或二氟代荧光素，然后与邻苯二胺反应制备荧光素内酰胺衍生物，用作一氧化氮分子荧光探针，检测体外微量一氧化氮，并用于大鼠巨噬细胞中一氧化氮的检测。
发明内容
本发明的目的是提供一种基于荧光素内酰胺衍生物的一氧化氮分子荧光探针的制备和应用。所发明荧光素内酰胺衍生物结构如下式所示： 
其中：X＝Cl，F
制备方法的主要步骤如下：
(1)以氯化锌为催化剂，由4-氯(或氟)间苯二酚与邻苯二甲酸酐熔融反应生成二氯(或二氟)代荧光素；
(2)二氯(或二氟)代荧光素与二氯亚砜反应生成二氯(或二氟)代荧光素酰基氯；
(3)以DCC/DMAP(N，N′-二坏己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶)为催化剂，二氯(或二氟)代荧光素酰基氯与邻苯二胺在乙腈中反应生成荧光素内酰胺衍生物，粗产物用柱层析法分离提纯。
本发明的荧光探针有如下优点：
1.合成方法简单，产率高，易提纯，原料易得，成本低，产品稳定易保存；
2.探针本身无荧光，背景干扰小，灵敏度高，适用pH范围宽且荧光稳定，可适用于生理pH范围内NO的检测；
3.对NO的选择性高，与其它活性氧物作用时儿乎不产生荧光信号；
4.探针的荧光激发和发射波长在可见光区，对活性组织损伤小，可用于活性组织细胞中NO的检测。
附图说明
图1是所述荧光素内酰胺衍生物的合成路线图。
图2是探针与NOC13反应前后的荧光变化图，A代表二氟荧光素内酰胺，B代表二氯荧光素内酰胺。
图3是反应体系pH值对探针与NOC13反应前后的荧光强度变化图。
图4是探针与各种活性氧物(ROS)反应的荧光荧光强度变化图。
图5是不同浓度NOC13与探针A反应后的荧光强度变化图。λex＝484nm，探针浓度(10μmol/L)，PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH7.40)，反应温度37℃，NOC13浓度分别为2.0，5.0，7.0，10，20，30，50μmol/L。
图6是不同浓度NOC13与探针B反应后的荧光强度变化图。λex＝510nm，探针浓度(10μmol/L)，PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH7.40)，反应温度37℃，NOC13浓度分别为1.0，5.0，7.0，10，20，30，50，100μmol/L。
图7是荧光强度-二氟荧光素浓度线性关系图。
图8是细胞浓度与二氟荧光素浓度关系曲线图。
具体实施方式
下面具体实施例是结合技术方案和附图对本发明作进一步说明，但本发明不受下列实施例的严格限定。
实施例1：荧光素内酰胺衍生物的合成
荧光素内酰胺衍生物的合成路线如图1所示，具体操作过程如下：
(1)将4-氟间苯二酚16.00g(0.125mol)，氯化锌15.02g(0.110mol)和邻苯二甲酸酐7.50g(0.05mol)加入到研钵中充分研磨混合均匀，将混合物加入到装有机械搅拌装置的三口烧瓶中，油浴加热逐渐升温至120℃使之熔融，开动搅拌，继续升温至150℃反应2h，随后升温至160℃，搅拌反应至熔融物固化不能被搅动为止。冷却至室温，向三口烧瓶中加入180mL0.6mol/L的盐酸，回流1h。趁热抽滤，将滤饼用80mL热水回流30min，趁热抽滤并用热水将滤饼充分洗涤至中性，然后在真空干燥箱中50℃抽真空干燥一夜，得到棕褐色产物二氟荧光素19.48g。
(2)在室温下，将二氟荧光素1.57g(4.5mmol)加入到15mL二氯亚砜中。加磁子搅拌回流3h，然后冷却至室温，得到荧光素酰基氯的粗产物，利用旋转蒸发仪进行浓缩。
(3)将二氟荧光素酰基氯溶于12mL乙腈中(溶液a)，将3.24g邻苯二胺(30mmol)和催化剂DCC/DMAP(N，N′-二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶)溶解于10mL乙腈中(溶液b)。将溶液a滴加到溶液b中，室温搅拌反应4h。旋蒸出溶剂浓缩，得到二氟荧光素内酰胺的粗产物，利用柱层析进行分离提纯(乙酸乙酯∶石油醚＝1∶5)，得到的二氟荧光素内酰胺白色固体，产率约65％。
二氯荧光素内酰胺合成方法与上述方法相似。
二氟荧光素内酰胺的结构表征：1H NMR(500MHz，CDCl3)：δ/ppm3.606(s，2H)，6.084-6.100(d，J＝8.0Hz，1H)，6.464-6.495(t，1H)，6.625-6.641(d，J＝8.0Hz，1H)，6.735-6.753(d，J＝9.0Hz，2H)，7.000-7.030(t，1H)，7.118-7.133(d，J＝7.5Hz，1H)，7.185(s，2H)，7.636-7.659(m，2H)，8.081-8.095(d，J＝7Hz，1H)；IR(KBr压片)：υ(cm-1)：3432(N-H)，3054(O-H)，1769(-CON-)，1607(Ar-H)，1477，1414，1277(Ar-N)，1235.1191(Ar-OH)，1075，1014(Ar-F)，928，872，796，747，699(ArF-H)。
二氯荧光素内酰胺的结构表征：1H NMR(500MHz，CDC13)：δ/ppm3.600(s，2H，-NH2)，6.465-6.496(t，1H)，6.622-6.638(d，J＝8.0Hz1H)，6.938-7.029(t，3H)，7.118-7.133(d，J＝7.5Hz，1H)，7.239(s，2H)，7.640-7.963(m，2H)，8.099-8.113(d，J＝7.0Hz1H)；IR(KBr压片)：)(cm-1)：3647(N-H)，3430(O-H)，1755(-CON-)，1606(Ar-H)，1496，1439，1341，1288(Ar-N)，1269， 1215(Ar-OH)，966，879，766，699，678(ArCl-H)。
实施例2：探针及其与NO反应后产物的荧光性质测定
1.配制工作溶液：
(1)PBS缓冲溶液的配制：准确称取1.56g NaH2PO4，取适量溶液(H2O-CH3CN＝80∶20，v/v)溶解，然后定容至100mL容量瓶中，配制成0.1mol/L NaH2PO4溶液；同样方法，准确称取3.58gNa2HPO4配制成0.1mol/L Na2HPO4溶液。在pH计的测定下将二者根据不同比例配制成所需pH值的0.1mol/L PBS缓冲溶液。
(2)NOC-13溶液(0.01mol/L)：NOC-13用适量适量蒸馏水溶解，然后pH7.4的PBS缓冲溶液在棕色容量瓶中定容，放于冰箱中冷藏保存。其它浓度使用时用缓冲溶液逐级稀释。
(3)二氟(或氯)荧光素内酰胺溶液(10μmol/L)：二氟(或氯)荧光素内酰胺先用适量乙腈溶解，然后用pH7.4的PBS缓冲溶液定容、稀释，置于冰箱中保存。
2.荧光测试：
(1)荧光光谱性质：
用F4500荧光检测仪进行荧光检测，扫描范围为400-600nm，扫速速度为1200nm/min，狭缝宽度为2.5。探针与NOC13反应后溶液经3D扫描后得到的实验数据为：探针A(二氟荧光素内酰胺)最大激发波长λe、＝484nm，最大发射波长为λem＝514nm；探针B(二氯荧光素内酰胺)的最大激发波长λe、＝510nm，最大发射波长为λem＝523nm。
向10mL比色管中一次加入内酰胺溶液(100μmol/L，1mL)，NOC13溶液(103μmol/L，1mL)，用PBS缓冲溶液(pH＝7.4)定容至刻度，摇匀，37℃水浴反应30mmin，进行荧光测试，探针A(二氟荧光素内酰胺)和B(二氯荧光素内酰胺)的激发波长分别为484nm和510nm，探针与载体反应前后的荧光信号变化如图2所示。探针本身在缓冲溶液中无荧光，加入载体反应后，荧光强度迅速增强。
(2)pH值对荧光强度的影响：
分别测试探针在不同pH缓冲溶液中与NOC13反应前后的荧光强度变化，探针的浓度(1μmol/L)，NOC13浓度(100μmol/L)，反应温度37℃，反应时间30min。反应体系pH值对探针与NOC13反应后荧光强度的影响如图3所示。对于A，当pH值在2.5～4.8之间，荧光强度随pH值的增大而迅速增强，当pH值达4.8后，荧光强度达到最大且不再随pH值的增加而改变；对于B，pH值在3～6.3之间时，荧光强度随pH值的增大而迅速增强，当pH值达6.3后，荧光强度达到最大且不再随pH值的增加而改变。表明探针在弱酸性、中性、弱碱性缓冲溶液中均可使用。
(3)探针对NO测定的选择性：
将H2O2(1.0mmol/L)，·OH(1.0mmol/L H2O2与100μmol/L (NH4)2Fe(SO4)2反应制得)，O2 -(100μmol/L KO2)，NO2 -(100μmol/L NaNO2)，NO3 -(100μmol/L NaNO3)，ONOO-(100μmol/L NaONOO)加入到10mL比色管中，加入1mL探针溶液(10μmol/L)，用pH7.4的缓冲溶液定容至刻度，在37℃下反应30min后进行荧光测试，结果如图4所示。可见探针对NO测定具有良好的选择性。
3.使用探针测定水溶液中的NO浓度：
不同浓度NOC13与探针A反应后的荧光强度变化如图5所示。λex＝484nm，探针浓度(10μmol/L)，PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH7.40)，反应温度37℃，NOC13浓度分别为2.0，5.0，7.0，10，20，30，50μmol/L。
不同浓度NOC13与探针B反应后的荧光强度变化如图6所示。λex＝510nm，探针浓度(10μmol/L)，PBS缓冲溶液(0.1mol/L，pH7.40)，反应温度37℃，NOC13浓度分别为0.2，0.5，1.0，2.5，5.0，7.5，10，15，20，30，45，55μmol/L。
可见，荧光强度随NO浓度的增加而增强，据此可测定水溶液中NO的浓度。
4.使用探针A测定细胞中NO：
(1)二氟荧光素浓度-荧光强度曲线的测定：将二氟荧光素配成浓度范围为0～200nmol/L的缓冲溶液(pH＝7.4)，测定其荧光强度，λex＝484nm，λem＝514nm，二氟荧光素浓度-荧光强度曲线如图5所示，二氟荧光素浓度-荧光强度呈线性关系。
(2)使用探针A测定大鼠巨噬细胞中NO
将大鼠巨噬细胞在含有10％小牛血清，1％青霉素和1％链霉素的DMEM培养液中制备成细胞数分别为0.38×106个/mL、0.80×106个/mL、1.75×106个/mL、4.45×106个/mL、10.45×106个/mL、21.3×106个/mL的悬浊液。在37℃，5％CO2条件下贴壁培养4h。在37℃下将细胞用探针二氟荧光素内酰胺(探针的最终浓度均为60mol/L)孵育1.5h，离心(4000r/min)5min，收集细胞，用生理盐水充分洗涤以除去未进入细胞的探针分子，然后将收集后的细胞用HEPES-NaOH缓冲溶液重新悬浮，缓冲溶液的用量与培养细胞的DMEM培养液的体积相同。在冰浴中进行超声波粉碎8min，然后离心(4000r/min)10min分离，收集上清液，进行荧光测试。由所测的荧光强度据二氟荧光素浓度-荧光强度曲线求出二氟荧光素浓度，然后以细胞数为横坐标，以反应生成的二氟荧光素的量(nmol/L)为纵坐标作图，如图8所示。可见，生成二氟荧光素的量随着细胞数的增大即细胞中NO浓度的增大而增大。探针A能够进入细胞中，较为灵敏稳定地检测大鼠巨噬细胞内的NO含量。
Claims (3)
1.一种基于荧光素内酰胺衍生物的一氧化氮分子荧光探针，其特征在于其结构式为： 
其中：X＝Cl，F 。
2.如权利要求1所述的荧光素内酰胺衍生物的制备方法包括以下主要步骤：
步骤一：以氯化锌为催化剂，由4-氯(或氟)间苯二酚与邻苯二甲酸酐熔融反应生成二氯(或二氟)代荧光素；
步骤二：二氯(或二氟)代荧光素与二氯亚砜反应生成二氯(或二氟)代荧光素酰基氯；
步骤三：以DCC/DMAP(N，N′-二环己基碳二亚胺/4-二甲氨基吡啶)为催化剂，二氯(或二氟)代荧光素酰基氯与邻苯二胺在乙腈中反应生成荧光素内酰胺衍生物。
3.如权利要求1所述的荧光素内酰胺衍生物作为一氧化氮分子荧光探针用于弱酸性、中性、弱碱性缓冲溶液中检测水溶液和细胞组织中微量一氧化氮。
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