CN103145770B - 一种从山茶花花卉中提取多酚的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种从山茶花花卉中提取多酚的方法，其特征在于包括以下步骤：（1）山茶花粉末制备；（2）浸提液的制备；（3）树脂吸附。本发明公开了本发明一种从山茶花花卉中提取多酚的方法，具有制备方法简单、操作方便和成本低廉等特点，能充分的利用山茶花花卉的资源提纯度高的取多酚，合理的利用资源，符合了变废为宝的研发目标。

Description

一种从山茶花花卉中提取多酚的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体的说，涉及一种从山茶花花卉中提取多酚的方法。

背景技术

植物中的多酚类是具多个酚基的化合物，常包括黄烷醇类、花色苷类、黄酮类、黄酮醇类和酚酸类等。目前研究较多的天然多酚类是从食用茶叶中得到的属黄烷醇类的茶多酚，许多研究表明其为一种天然抗氧化剂，具有能清除自由基、阻止脂质过氧化、提高机体免疫力和延缓衰老等生物作用；另报道其还具有抗辐射和抑制癌细胞增殖的作用。为此，茶多酚被开发应用于食品保鲜防腐，延长食品保质期，保护食品中营养成分，并且无毒副作用，食用安全。之外，也有从芒果、龙眼、甘蔗、苹果、石榴等水果中获取多酚类。山茶花（Camelliajaponica）也是富含多酚类的一种植物，在老四川地区广泛种植，用于城市景观绿化供人们观赏，也是获取多酚类的一种天然资源。尽管许多研究表明从山茶花的叶片中成功提取获得了多酚类，但是，其花中的多酚类提取研究至今未见有报道，而且每年山茶花的花卉因凋落而未被利用和白白浪费掉了。

现有技术的缺点：目前尚未有从山茶花花卉中提取多酚的研究，山茶花作为观赏性植物，资源充足，却没有有效得到利用，造成了资源的浪费。

发明内容

为解决以上技术问题，本发明的目的在于提供一种能快速有效的从山茶花卉中提取多酚的方法。

本发明目的是这样实现的：一种从山茶花花卉中提取多酚的方法，其关键在于包括以下步骤：

（1）山茶花粉末制备：摘取花开正艳的山茶花，洗净，放冰箱冻存，然后用冻干机冻干，研磨后过18目筛，最后封口袋装好-20℃保存；

（2）浸提液的制备：称取山茶花粉末，加入体积浓度为60%的乙醇，山茶花粉末重量与乙醇水溶液体积的比为1:35，放在80℃水浴中浸提20min后，过滤；滤液于35℃，0.09KPa条件下减压蒸馏除去乙醇，然后用蒸馏水稀释到浓度2～3mg.mL^-1，再过0.45um的滤膜，最后得到浸提液；

（3）树脂吸附：

a：将乙醇浸泡树脂3～4h，然后放掉，用同样的方法反复浸泡清洗树脂，直到在出口洗涤液中加入3倍量的水不显浑浊为止，然后用清水充分淋洗至无明显乙醇气味为止，然后将树脂装入树脂柱中；

b：将准备好的浸提液按1～1.5ml.min^-1的流速加到树脂柱上端，上样完毕后，用体积浓度为5%的乙醇洗脱杂质及未结合的多酚，以1～1.5ml.min^-1的流速洗脱体积3BV；再用体积浓度为80%的乙醇洗脱多酚，以1～1.5ml.min^-1的流速洗脱体积3～4BV，收集洗脱液，然后将收集到的多酚洗脱液减压蒸馏后，冷冻干燥，最后得到暗红色的具有金属光泽的多酚粉末。

上述步骤（3）中所述树脂为DM301大孔树脂。

上述步骤（2）浸提液的制备中最佳参数的选取：

1）不同溶剂对多酚浸出率的影响

称取1.000g山茶花，分别加入蒸馏水，体积浓度为50%甲醇，体积浓度为50%乙醇三种提取剂各25mL，70℃温浴20min，过滤，滤液定容至50mL，取1mL测定多酚浸出率，每组做三个重复，结果如图2所示。由图2可见，不同溶剂提取的多酚含量差别较大，依次为50%乙醇﹥蒸馏水﹥50%甲醇，所以下一步采用乙醇作为浸提溶剂。

2）乙醇浓度对多酚浸出率的影响

称取1.000g山茶花，分别加入40%、50%、60%、70%、80%、90%六种体积浓度的乙醇各25mL，70℃温浴20min，过滤，滤液定容至50mL，取1mL测定多酚浸出率，结果如图3所示。由图3可见，乙醇浓度由40%增加到60%时，浸出率逐步增大，60%时浸出率达到最大，再增加乙醇浓度，浸出率则逐渐下降。所以选择60%的乙醇作为浸提溶液。

3）浸提次数对茶多酚浸出率的影响

称取1.000g山茶花，按体积浓度为60%乙醇25mL，70℃20min的条件浸提一次、两次、三次，过滤，收集滤液定容至100mL，每组做三个重复，每组的浸出率如图4所示。由图4见，浸提一次后山茶花中的多酚已大部分被浸提出来，而浸提二次和三次对多酚的浸出率贡献不大，所以从资源利用率考虑，实验选择浸提一次。

4）料液比对多酚浸提率的影响

分别称取1.000g山茶花，加入不同体积的体积浓度为60%的乙醇，70℃浸提20min后过滤，滤液定容至50mL，取1mL测定多酚浸出率，每组做三个重复，结果如图5所示。从图5可见，随着浸提溶剂用量的增加，多酚的浸出率不断增大，当料液比为1:30时浸出率达到最大，再增加浸提剂用量时，多酚的浸出率变化不大，所以选择1:30为最佳的料液比。

5）温度对多酚浸提的影响

称取1.000g山茶花，加入体积浓度为60%乙醇30mL，分别置于50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃下，浸提20min，过滤，滤液定容至50mL，取1mL测定多酚的浸出率，每组做三个重复，结果如图6所示：从50℃升高到80℃时，浸出率逐渐增大，80℃达到最大，再升高温度浸出率反而降低，可能是高温使多酚氧化加快。所以选择80℃为浸提的最佳温度。

6）时间对多酚浸提的影响

称取1.000g山茶花，加入体积浓度为60%乙醇30mL，置于80℃下保温不同时间，做三个重复，观察时间对多酚浸出率的影响，结果见图7。由图7可知，随着时间的增加浸出率不断升高，保温30min时，多酚浸出率达到最大，再延长提取时间浸出率反而降低，这可能是因为多酚在高温状态下持续越久，氧化就越多，所以选择30min为最佳浸提时间。

7）正交试验结果

综合上述因素，实验选取乙醇浓度、温度、时间、料液比作为考察因素见表1，并进行多酚的提取实验，测定多酚浸出率，结果见表2。

表1考察因素与水平对比表

表2正交试验结果表

从表2可见，乙醇浓度、温度、时间、料液比各因素对多酚浸出率贡献大小依次为料液比＞温度＞乙醇浓度＞时间，最佳组合为：A₂B₂C₁D₃，因此本方法步骤（2）中浸提液的制备选择以60%的乙醇，温度80℃，保温时间20min，料液比1:35的条件进行浸提最为合适。

上述步骤（3）树脂吸附中最佳参数的选取：

1）最佳流速的选取

将浓度为2.77mg/mL的山茶花多酚样液上已处理好的大孔树脂吸附柱，分别控制流速在0.5mL/min、1.0mL/min、1.5mL/min、2mL/min、2.5mL/min、3mL/min，测定不同的上样流速对吸附量的影响，结果见图8。

由图8可见，在流速为0.5mL/min时，吸附量达到峰值，为22.73mg/g，但上样体积较大，循环周期较长；当流速上升到2mL/min时，吸附量较低；当流速升为3mL/min时，吸附量仅为10.28mg/g。综合考虑，流速取1-1.5mL/min时吸附量大，且稳定。

2）最佳洗脱剂浓度的选取：

将浓度为2.57mg/mL的山茶花多酚样液按1.5mL/min的上样流速进行吸附实验，吸附完毕后，先用5%的乙醇溶液洗掉杂质和未结合的多酚，再用不同浓度的乙醇洗脱山茶花多酚，实验结果见图9。

由图9可知，当乙醇浓度由30%增加到80%时，解吸率从55.23%增加到95.76%，再增加乙醇浓度，解吸率增加缓慢。因此从资源利用率与解吸率两方面的因素考虑，本实验选择80%的乙醇进行洗脱。

3）洗脱体积的选取

为观察解吸效果，将已完成吸附的树脂，先用5%的乙醇溶液洗掉杂质和未结合的多酚，然后用80%的乙醇进行洗脱，流速为0.5mL/min,解吸曲线见图6。由图6可知，当洗脱体积达到4BV时，已基本将山茶花多酚洗脱出来。因此从资源利用率灯方面考虑，本实验选择洗脱的最佳体积范围为3～4BV。

有益效果：

本发明一种从山茶花花卉中提取多酚的方法，具有制备方法简单、操作方便和成本低廉等特点，能充分的利用山茶花花卉的资源提纯度高的取多酚，合理的利用资源，符合了变废为宝的研发目标。

附图说明

图1为本发明的流程图；

图2为不同溶剂对多酚浸提率影响的柱形图；

图3为作为浸提溶液的乙醇浓度对多酚浸提率影响的折线图；

图4为浸提次数对多酚浸提率影响的折线图；

图5为料液比对多酚浸提率影响的折线图；

图6为温度对多酚浸提率影响的折线图；

图7为时间对多酚浸提率影响的折线图；

图8为流速对吸附量影响的折线图；

图9为作为洗脱液的乙醇浓度对解吸效果影响的折线图；

图10为山茶花多酚动态洗脱曲线；

图11为没食子酸标准曲线。

具体实施方式

实施例1：

一种从山茶花花卉中提取多酚的方法，包括以下步骤：

（1）山茶花粉末制备：摘取花开正艳的山茶花，洗净，放冰箱冻存，然后用冻干机冻干，研磨后过18目筛，最后封口袋装好-20℃保存；

（2）浸提液的制备：称取1.000g的山茶花粉末，加入35ml的体积浓度为60%的乙醇，放在80℃水浴中浸提20min后，过滤；所得滤液于35℃，0.09KPa的条件下减压蒸馏除去乙醇，然后用蒸馏水稀释到浓度为2.5mg.mL^-1，再过0.45um的滤膜，得到浸提液；

（3）DM301大孔树脂吸附：

a：称取20.0g大孔树脂，用乙醇浸泡DM301大孔树脂4h，然后放掉，用同样的方法反复浸泡清洗DM301大孔树脂，直到在出口洗涤液中加入3倍量的水不显浑浊为止，然后用清水充分淋洗DM301大孔树脂至无明显乙醇气味为止，然后将DM301大孔树脂装入树脂柱中；

b：将准备好的浸提液按1.5ml.min^-1的流速加到树脂柱上端，当流出液浓度是上样液浓度的1/10时，上样液已开始泄露，停止上样，再用5%的乙醇洗脱杂质及未结合的多酚，以1ml.min^-1的流速洗脱体积3BV；再用80%的乙醇洗脱多酚，以1ml.min^-1的流速洗脱体积3BV，收集洗脱液，再将DM301大孔树脂用清水充分淋洗至无明显乙醇气味，然后再进行吸附洗脱过程。最后将收集到的多酚洗脱液减压蒸馏后，冷冻干燥，最后得到暗红色的具有金属光泽的多酚粉末。

采用福林酚检测法GB/T8313-2008，测定山茶花多酚的纯度：称取0.01195g山茶花多酚，定容至200ml，配制浓度为10，20，30，40，50ug/ml的没食子酸，分别移取没食子酸标准液、水（作空白对照）及山茶花多酚溶液样品体积各1ml于刻度试管内，在每个试管内分别加入5.0ml10%的福林酚，摇匀；反应3-8min内，加入4.0ml7.5%Na₂CO₃溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下放置60min。用10mm比色皿。在765nm波长条件下用分光光度计测定吸光度（A）；根据没食子酸工作液的吸光度与各工作液的没食子酸浓度，制作标准曲线，见图11。在765nm波长条件下用分光光度计测定样品吸光度为0.310，比较样品吸光度和标准工作液的吸光度，按公式：

计算得到山茶花多酚的纯度为89.45%。

实施例2：

一种从山茶花花卉中提取多酚的方法，包括以下步骤：

（1）山茶花粉末制备：摘取花开正艳的山茶花，洗净，放冰箱冻存，然后用冻干机冻干，研磨后过18目筛，最后封口袋装好-20℃保存；

（2）浸提液的制备：称取5.000g的山茶花粉末，加入175ml的60%乙醇，放在80℃水浴中浸提20min后，过滤；所得滤液于35℃，0.09KPa的条件下减压蒸馏除去乙醇，然后用蒸馏水稀释到浓度为2.50mg.mL^-1，再过0.45um的滤膜，得到浸提液；

（3）DM301大孔树脂吸附：

a：称取20.0g大孔树脂，用乙醇浸泡DM301大孔树脂3h，然后放掉，用同样的方法反复浸泡清洗DM301大孔树脂，直到在出口洗涤液中加入3倍量的水不显浑浊为止，然后用清水充分淋洗DM301大孔树脂至无明显乙醇气味为止，然后将DM301大孔树脂装入树脂柱中；

b：将准备好的浸提液按1.5ml.min^-1的流速加到树脂柱上端，当流出液浓度是上样液浓度的1/10时，上样液已开始泄露，停止上样，再用5%的乙醇洗脱杂质及未结合的多酚，以1ml.min^-1的流速洗脱体积3BV；再用80%的乙醇洗脱多酚，以1ml.min^-1的流速洗脱体积4BV，收集洗脱液，再将DM301大孔树脂用清水充分淋洗至无明显乙醇气味，然后再进行吸附洗脱过程。最后将收集到的多酚洗脱液减压蒸馏后，冷冻干燥，最后得到暗红色的具有金属光泽的多酚粉末。

采用福林酚检测法GB/T 8313-2008，测定山茶花多酚的纯度：称取0.01499g山茶花多酚，定容至200ml，配制浓度为10，20，30，40，50ug/ml的没食子酸，分别移取没食子酸标准液、水（作空白对照）及山茶花多酚溶液各1ml于刻度试管内，在每个试管内分别加入5.0ml 10%的福林酚，摇匀；反应3-8min内，加入4.0ml7.5%Na₂CO₃溶液，加水定容至刻度，摇匀，室温下放置60min。用10mm比色皿。在765nm波长条件下用分光光度计测定吸光度（A）；根据没食子酸工作液的吸光度与各工作液的没食子酸浓度，制作标准曲线，见图11。在765nm波长条件下用分光光度计测定样品吸光度为0.392，比较样品吸光度和标准工作液的吸光度，按公式：

计算得到山茶花多酚的纯度为90.18%。

Claims (1)

1.一种从山茶花花卉中提取多酚的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)山茶花粉末制备：摘取花开正艳的山茶花，洗净，放冰箱冻存，然后用冻干机冻干，研磨后过18目筛，最后封口袋装好-20℃保存；

(2)浸提液的制备：

称取山茶花粉末，加入体积浓度为60％的乙醇，山茶花粉末重量与乙醇水溶液体积的比为1:35，放在80℃水浴中浸提20min后，过滤；滤液于35℃，0.09KPa条件下减压蒸馏除去乙醇，然后用蒸馏水稀释到浓度2～3mg.mL^-1，再过0.45um的滤膜，最后得到浸提液；

(3)树脂吸附：

a：将乙醇浸泡树脂3～4h，然后放掉，用同样的方法反复浸泡清洗树脂，直到在出口洗涤液中加入3倍量的水不显浑浊为止，然后用清水充分淋洗至无明显乙醇气味为止，然后将树脂装入树脂柱中；

b：将准备好的浸提液按1～1.5ml.min^-1的流速加到树脂柱上端，上样完毕后，用体积浓度为5％的乙醇洗脱杂质及未结合的多酚，以1～1.5ml.min^-1的流速洗脱体积3BV；再用体积浓度为80％的乙醇洗脱多酚，以1～1.5ml.min^-1的流速洗脱体积3～4BV，收集洗脱液，然后将收集到的多酚洗脱液减压蒸馏后，冷冻干燥，最后得到暗红色的具有金属光泽的多酚粉末；

所述树脂为DM301大孔树脂。