CN103131537A - 灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法及其应用。该方法是将将灰树花子实体在无菌条件下接种于分离琼脂平板，待菌丝长满平板后，接种至种子培养基继续培养，得到灰树花接种物；将灰树花接种物接种于发酵培养基继续培养，得到灰树花菌丝体发酵产物，蒸馏萃取得到提取液，干燥即得到灰树花深层发酵的菌丝体挥发油。本发明方法简单，实施容易，来源稳定，成本低廉，应用到卷烟中，产生良好的加香效果。

Description

灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法及其应用

技术领域

本发明属于香料加工领域，具体涉及一种灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法及其应用。 

背景技术

担子菌（Basidiomycetes）是不同于植物、动物的一类重要高等真核生物，资源极其丰富，包括灰树花、茯苓、香菇、灵芝等重要的珍稀药用菌。担子菌可以产生一系列多样性极为丰富的香味化合物。曾有研究报道利用香菇为原料可开发天然烟用香料，这表明担子菌有望成为天然烟用香料的新来源。然而，由于大多数担子菌栽培极为困难，产量低，因此在香料行业中的应用并不多见。 

灰树花(Griflola frondosa)隶属担子菌亚门，层菌纲-无隔担子菌亚纲，非褶菌目，多孔菌科，树花菌属，又名贝叶多孔菌、栗子蘑、莲花菌，是一种食、药兼用的珍稀担子菌，作为一种名贵食材，在亚洲地区尤其在日本受到普遍欢迎，具有调节肝功能、调节免疫、抗氧化、抗肿瘤及抗HIV病毒等作用。一直以来，灰树花菌丝体中的多糖、多酚等抗氧化活性成分受到研究者的广泛关注，而对灰树花挥发性香味成分的研究较少，其在卷烟中加香的应用尚未见报道。 

尽管上世纪七十年代以来，灰树花已实现人工栽培，但产量不高，价格昂贵，因而很难成为工业生产的原料来源。菌丝体深层发酵（Submerged Fermentation, SmF）技术是一种快速获取担子菌原料的生物技术，具有生产周期短、易于大规模生产及产品质量稳定等优点，是替代栽培原料的一个有效途径。利用深层发酵技术获取灰树花烟用添加剂，原料来源不受季节、气候等自然因素的影响，保证原料来源的稳定性，而且成本低廉，为担子菌烟用添加剂的工业化应用奠定了基础。 

发明内容

本发明目的是针对现有技术的上述不足，提出了一种灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法及其应用。 

为解决上述技术问题，本发明所设计的一种灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法，包括以下步骤： 

1）将灰树花子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取小块组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度28℃静置培养7天，待菌丝长满平板后，在无菌条件下用接种钩挑取带有菌丝的琼脂3~5块，接种至种子培养基，在温度28℃，转速150r/min条件下，培养7d，得到灰树花接种物； 

2）按体积比5~15%将灰树花接种物接种于发酵培养基，在温度26~30℃，通气量为0.8~1.0dm³/min，转速120~150r/min条件下，培养4~7d，进行深层发酵，获得灰树花菌丝体发酵产物； 

3）按体积比1∶1~3将灰树花菌丝体发酵产物，加入蒸馏萃取装置一端容器中，装置的另一端容器中按体积比1∶1~3装有二氯甲烷，50~60℃水浴加热，同时蒸馏萃取4~8h，得到提取液； 

4）将步骤3）中提取液真空浓缩至体积不再发生变化，溶剂全部挥发时停止浓缩，用无水硫酸钠进行干燥，放置2~5h小时后过滤，即得到灰树花深层发酵的菌丝体挥发油。 

进一步地，所述的步骤1）中，分离琼脂平板配方为：马铃薯：200g/L，蔗糖：20g/L，琼脂粉：30g/L。 

再进一步地，所述的步骤1）中，种子培养基配方为：马铃薯：200g/L，蔗糖：20g/L。 

再进一步地，所述的步骤1）中，发酵培养基的配方为：马铃薯：200g/L，麸皮8g/L，蔗糖20g/L，硫酸锰2.5g/L，硫酸镁1.5g/L。 

本发明还提供了一种所述的灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的应用，其特征在于：所述的灰树花深层发酵的菌丝体挥发油作为天然烟草添加剂加入重组烟叶中，加入重组烟叶中质量比为0.01～0.5‰。 

本发明的优点是： 

本发明方法简单，实施容易，来源稳定，成本低廉，应用到卷烟中，产生良好的加香效果。

具体实施方式

下面列举一部分实施例对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述，有必要在此指出以下具体实施例只是对本发明的进一步说明，不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明做出的一些非本质的修改和调整，仍属于本发明的保护范围。 

实施例1 

1）将灰树花子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取小块组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度28℃静置培养7天，待菌丝长满平板后，在无菌条件下用接种钩挑取带有菌丝的琼脂3块，接种至种子培养基，在温度28℃，转速150r/min条件下，培养7d，得到灰树花接种物； 

2）按体积比5%将灰树花接种物接种于发酵培养基，在温度30℃，通气量为1.0dm³/min，转速120r/min条件下，培养7d，进行深层发酵，获得灰树花菌丝体发酵产物； 

3）按体积比1∶3将灰树花菌丝体发酵产物，加入蒸馏萃取装置一端的圆底烧瓶中，装置的另一端容器中按体积比1∶1装有二氯甲烷的平底烧瓶，60℃水浴加热，同时蒸馏萃取8h，得到提取液； 

4）将步骤3）中提取液真空浓缩至体积不再发生变化，溶剂全部挥发时停止浓缩，用无水硫酸钠进行干燥，放置2h小时后过滤，即得到灰树花深层发酵的菌丝体挥发油。 

本实施例和其他实施例使用的培养基相同，制作方法如下： 

所述1）中分离琼脂平板配方为：马铃薯200g，加入水1000ml，100℃蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加食用蔗糖20g，琼脂粉30g，在121℃灭菌20min后，在无菌条件下倒入无菌平皿。 

所述1）中种子培养基配方为：马铃薯200g，加入水1000ml，100℃蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加食用蔗糖20g，在121℃灭菌20min。 

所述步骤2）中发酵培养基的配方为：马铃薯200g，加入水1000ml，100℃蒸煮20分钟，双层纱布过滤马铃薯蒸煮液，添加8g麸皮，食用蔗糖20g，硫酸锰2.5g，硫酸镁1.5g，在121℃灭菌20min。 

实施例2 

1）将灰树花子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取小块组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度28℃静置培养7天，待菌丝长满平板后，在无菌条件下用接种钩挑取带有菌丝的琼脂5块，接种至种子培养基，在温度28℃，转速150r/min条件下，培养7d，得到灰树花接种物； 

2）按体积比15%将灰树花接种物接种于发酵培养基，在温度26℃，通气量为0.8dm³/min，转速150r/min条件下，培养4d，进行深层发酵，获得灰树花菌丝体发酵产物； 

3）按体积比1∶1将灰树花菌丝体发酵产物，加入蒸馏萃取装置一端的圆底烧瓶中，装置的另一端容器中按体积比1∶3装有二氯甲烷的平底烧瓶，50℃水浴加热，同时蒸馏萃取4h，得到提取液； 

4）将步骤3）中提取液真空浓缩至体积不再发生变化，溶剂全部挥发时停止浓缩，用无水硫酸钠进行干燥，放置5h小时后过滤，即得到灰树花深层发酵的菌丝体挥发油。 

实施例3 

1）将灰树花子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取小块组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度28℃静置培养7天，待菌丝长满平板后，在无菌条件下用接种钩挑取带有菌丝的琼脂4块，接种至种子培养基，在温度28℃，转速150r/min条件下，培养7d，得到灰树花接种物； 

2）按体积比10%将灰树花接种物接种于发酵培养基，在温度28℃，通气量为0.9dm³/min，转速140r/min条件下，培养6d，进行 深层发酵，获得灰树花菌丝体发酵产物； 

3）按体积比1∶2将灰树花菌丝体发酵产物，加入蒸馏萃取装置一端的圆底烧瓶中，装置的另一端容器中按体积比1∶2装有二氯甲烷平底烧瓶，56℃水浴加热，同时蒸馏萃取54h，得到提取液； 

4）将步骤3）中提取液真空浓缩至体积不再发生变化，溶剂全部挥发时停止浓缩，用无水硫酸钠进行干燥，放置3h小时后过滤，即得到灰树花深层发酵的菌丝体挥发油。 

实施例4 

以实施例1为例，将实施例1得到灰树花挥发油用美国Agilent公司产（6890N/5975C）气相质谱联用仪进行分析，分析条件如下： 

色谱柱：DB-WAX毛细管柱(30m×250μm×0.25μm)；载气：He；流量：1.0mL/min；分流比：5∶1；进样量：1μL；升温程序：进样口温度220℃，起始温度40℃，停留1min，以10℃/min升至250℃，最后停留15min。EI电离能量：70eV；离子源温度：250℃；质谱接口温度：280℃；扫描质量范围：40～500m/z。 

采用NIST05检索谱库法定性，峰面积归一化法定量。 

灰树花菌丝体挥发油的GC-MS图谱，从中共鉴定出来29种挥发性化合物，其中醛酮类占4.51%，酯类占17.49%，酸类占65.27%，其他占1.8%，29种挥发性化合物的峰面积占总峰面积的89.07%。其中含量比较高的有：9,12-十八碳二烯酸（37.95%）、棕榈酸（13.09%）、1,2-苯二甲酸二异辛酯（10.60%）、棕榈油酸（4.38%）、糠醛（3.03%）、2-呋喃甲酸甲酯（2.89%）、吡啶（1.00%）。 

表1显示了29种挥发性化合物的种类及相对含量。其中醛酮类化合物主要有：糠醛（3.03%）、苯乙醛（0.59%）、苯甲醛（0.28%）及己醛（0.2%）等。醛类化合物是烟草中重要的香味物质，一般具有愉快的香气。糠醛是醛酮化合物中含量最高的物质，可赋予烟草坚果、酚香、酒香的香味，还可以改善烟气吃味。苯甲醛具有类似苦杏仁的芳香气味，与烟草香味协调和合，从而增强烟草香味的自然风味。 

表1GC-MS法检测到的灰树花菌丝体挥发性化合物及其相对含量 

灰树花菌丝体挥发油中的酯类化合物包括2,4-己二烯酸甲酯（0.08%）、苯甲酸甲酯（0.45%）、烟酸甲酯（0.42%）、9，12—十八碳二烯酸甲酯（0.16%）和2-呋喃甲酸甲酯（2.89%）等。一般情况下，挥发性的酯类物质具有明显的香味。有些高级脂肪酸的甲酯和乙酯可以使烟叶的香味变得醇和。低级脂肪酸的甲酯和乙酯具有水果香、酒香、脂肪香和蜡香，具有烤烟的香气特征。 

酸类化合物是灰树花菌丝体挥发油中含量最高的物质，如9，12-十八碳二烯酸(37.95%)、棕榈酸(13.09%)、顺式-9-十六碳烯酸（4.38%）及十四烷酸（0.18%）等。虽然长链的脂肪酸对烟气的香味没有特别明显的直接作用，但是可以调节烟草的酸碱度，使吸味醇和，还可以增加烟气的浓度，从而间接影响烟气的香味，其在烟气中起着重要的平衡作用。比如棕榈酸、9，12-十八碳二烯酸等高级脂肪酸均有增加烟气甜味、蜡味、丰满度、粗糙感和刺激性的作用。此外，灰树花菌丝体挥发油中还含有少量的杂环化合物，如吡啶、2-甲基呋喃等。这些吡啶类化合物（例如检测到的吡啶）可以增加烟气香味的丰满度。 

实施例5 

分别秤取灰树花菌丝体挥发油0.1g、1.0g、5.0g，均用70%乙醇 稀释至10g，对应秤取3个10kg的同一品种未加料未加香的烤烟烟丝，采用封闭式雾化喷施方法，分别施加于烟丝中。 

对处理后的三种烟丝，以及未加料未加香烟丝分别卷制成四种规格一致的卷烟样品，用于卷烟感官质量评价，感官质量评价方法采用GB5606.4-2005标准方法和文字描述相结合。 

表2灰树花菌丝体挥发油的感官质量评价表 

灰树花菌丝体挥发油应用于卷烟产品中，可以降低刺激性，增加烟气顺畅感，增强烟香。施加量为0.01‰时，可以增加香气的飘逸感，烟香协调，烟气顺滑，口腔湿润感增加。施加量0.1‰时，香气飘逸，药草香韵显露，协调性略有下降。施加量为0.5‰时，有明显的药草气息。 

Claims (5)

1.一种灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法，包括以下步骤：

1）将灰树花子实体在无菌条件下从菌柄部位剪取小块组织片段，接种于分离琼脂平板，在温度28℃静置培养7天，待菌丝长满平板后，在无菌条件下用接种钩挑取带有菌丝的琼脂3-5块，接种至种子培养基，在温度28℃，转速150r/min条件下，培养7d，得到灰树花接种物；

2）按体积比5~15%将灰树花接种物接种于发酵培养基，在温度26~30℃，通气量为0.8~1.0dm³/min，转速120~150r/min条件下，培养4~7d，进行深层发酵，获得灰树花菌丝体发酵产物；

3）按体积比1∶1~3将灰树花菌丝体发酵产物，加入蒸馏萃取装置一端容器中，装置的另一端容器中按体积比1∶1~3装有二氯甲烷，50~60℃水浴加热，同时蒸馏萃取4~8h，得到提取液；

4）将步骤3）中提取液真空浓缩至体积不再发生变化，溶剂全部挥发时停止浓缩，用无水硫酸钠进行干燥，放置2~5h小时后过滤，即得到灰树花深层发酵的菌丝体挥发油。

2.根据权利要求1所述的灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法，其特征在于：所述的步骤1）中，分离琼脂平板配方为：马铃薯：200g/L，蔗糖：20g/L，琼脂粉：30g/L。

3.根据权利要求1所述的灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法，其特征在于：所述的步骤1）中，种子培养基配方为：马铃薯：200g/L，蔗糖：20g/L。

4.根据权利要求1所述的灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的制备方法，其特征在于：所述的步骤1）中，发酵培养基的配方为：马铃薯：200g/L，麸皮8g/L，蔗糖20g/L，硫酸锰2.5g/L，硫酸镁1.5g/L。

5.一种根据权利要求1所述的灰树花深层发酵的菌丝体挥发油的应用，其特征在于：所述的灰树花深层发酵的菌丝体挥发油作为天然烟草添加剂加入重组烟叶中，加入重组烟叶中质量比为0.01～0.5‰。