CN103125380A - 一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，抑制蝴蝶兰组织褐化的方法包括以下步骤：取材，选取蝴蝶兰种子萌发出的花梗为组织培养的外植体；消毒，对外植体进行清洗和消毒，70％酒精浸泡30s、0.5％的次氯酸钠溶液浸泡10min；培养，将消毒后的外植体放入培养基中，培养时间为60天。本发明提供的抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，操作简单，抑制褐化效果好，操作简单，抑制褐化效果好，为控制蝴蝶兰组织培养中的褐变提供有效的解决方法。

Description

一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法
技术领域
本发明涉及一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法。
背景技术
蝴蝶兰观赏价值极高，素有“兰花皇后”之美誉，倍受国内外消费者亲睐。然而，兰科植物种子非常细小，不含有为种子萌发提供营养的胚乳或其他组织，在自然条件下很难萌发，而且蝴蝶兰为单茎气生兰，分株繁殖系数很低，所以组织培养是其主要的繁殖方式。在园林植物组织培养过程中褐化现象是普遍存在的，它与菌类污染、过度含水化(即玻璃化)并称为植物组织培养的三大难题，而控制褐化比控制污染和玻璃化更加困难。蝴蝶兰就是在组织培养过程中比较容易出现褐化现象的园林植物之一。褐变产物抑制了原球茎的启动、生长和小苗的再生，严重时会导致整个外肢体变褐死亡，如何克服褐变是其组培快繁成功与否的关键，对蝴蝶兰褐化的研究显得十分迫切。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于克服上述现有技术之不足，提供一种操作简单，抑制褐化效果好，为控制蝴蝶兰组织培养中的褐变提供有效的解决方法。
按照本发明提供的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法采用的主要技术方案为：包括以下步骤：
取材，选取蝴蝶兰种子萌发出的花梗为组织培养的外植体；
消毒，对外植体进行清洗和消毒，70％酒精浸泡30s、0.5％的次氯酸钠溶液浸泡10min；
培养，将消毒后的外植体放入培养基中，培养和观察60天。
本发明提供的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法还具有如下附加技术特征：
所述培养基为MS(Murashige-Skoog)培养基、VW培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基和MS纸桥培养基，培养条件为培养条件为黑暗预处理培养10d，培养温度为(25±2)℃。每升各基本培养基均加入激素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)：5mg和萘乙酸(NAA)：0.5mg。
所述MS(Murashige-Skoog)培养基组分为：大量元素，1.65g/LNH4NO3、1.90g/L KNO3、0.17g/L KH2PO4、0.1807g/L MgSO4·7H2O、0.332g/LCaCl2(2H2O)；微量元素，22.3mg/L MgSO4·4H2O、6.2mg/L N3BO3、8.6mg/LZnSO4·7H2O、0.83mg/L KI、0.25g/L Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、0.025mg/L CoCl·6H2O；27.8mg/L FeSO47H2O、37.3mg/L Na2-EDTA；维生素，肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、L-甘氨酸2mg/L、VB6 0.5mg/L、VB10.1mg/L；蔗糖30g/L、琼脂12g/L，以MS培养基作为参照。
所述VW培养基包括组分和附加成分，所述组分为KNO3 525mg/L、NH4SO4500mg/L、KH2PO4 250mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、Ca3(PO4)2 200mg/L、MnSO4·4H2O 7.5mg/L、FeSO47H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、蔗糖20g/L、琼脂18g/L，所述附加成分为活性炭(AC)(1-3)g/L和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(1-3)g/L，柠檬酸(100-300)mg/L和抗坏血酸(VC)(100-300)mg/L。
1/2MS培养基的组分为将所述的大量元素中的成分每升所加的质量减小一半，其他元素不变。
1/4MS培养基的组分为所述的MS培养基中所添加的大量元素减少到四分之一，其他元素不变。
MS纸桥培养基的组分为所述的MS培养基中不添加琼脂，其他成分不变。
采用本发明提供的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法来的有益效果为：本发明操作简单，抑制褐化效果好，为控制蝴蝶兰组织培养中的褐变提供有效的解决方法。
具体实施方式
本发明无需增加专业设备，操作方便，抑制褐化效果好，为控制蝴蝶兰组织培养中的褐变提供有效的解决方法。
下面对本发明的实施例作进一步详细说明：
一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，它采用如下步骤：
步骤一，选取蝴蝶兰种子萌发出的花梗作为组织培养的外植体；
步骤二，对采用花梗作为外植体用洗洁精清洗，70％酒精浸泡30s、0.5％的次氯酸钠溶液浸泡10min；
步骤三，将消毒后的花蕾放入培养基中，培养条件为黑暗预处理培养10d，培养观察60d，培养温度为(25±2)℃。每升各基本培养基均加入激素6-BA：5mg和NAA：0.5mg。培养基的有效成分为：所述MS(Murashige-Skoog)培养基组分见下表，以MS培养基作为参照。
MS大量元素：(10×)(g)
Figure BSA00000624170400031
MS微量元素：(100×)(mg)
 MnSO4·   H3BO3   ZnSO4·   KI   Na2MoO4·  CuSO4·   CoCl·
  4H2O   7H2O   2H2O   5H2O   6H2O
  1L   2230   620   860   83   25   2.5   2.5
Fe-EDTA：(100×)(mg)
 FeSO47H2O   Na2-EDTA
  1L  2780   3730
MS维生素：(100×)(mg)
Figure BSA00000624170400041
MS培养基配方
Figure BSA00000624170400042
所述VW培养基包括组分和附加成分，所述组分见下表，所述附加成分为活性炭(AC)(1-3)g/L和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(1-3)g/L，柠檬酸(100-300)mg/L和抗坏血酸(VC)(100-300)mg/L。
Figure BSA00000624170400043
Figure BSA00000624170400051
1/2MS培养基的组分为将所述的大量元素中的成分每升所加的质量减小一半，其他元素不变。
1/4MS培养基的组分为所述的MS培养基中所添加的大量元素减少到四分之一，其他元素不变。
MS纸桥培养基的组分为所述的MS培养基中不添加琼脂，其他成分不变。
不同培养基对花梗褐化的影响
Figure BSA00000624170400052
实验表明蝴蝶兰花梗在VW培养基上的褐化率低于其他四种培养基，VW培养基是一种低盐培养基，较适合兰花的组织培养，虽然褐化率不是最低的，但是诱导率是最高的，所以VW是蝴蝶兰诱导的最适培养基，本发明将选用VW培养基进行下一步的附加剂对褐化的影响研究。
不同吸附剂和抗氧化剂对花梗褐化的影响
Figure BSA00000624170400053
Figure BSA00000624170400061
根据以上数据显示，在VW培养基上加入吸附剂AC 2g/L对褐化的抑制效果最佳，褐化率只有15.73％，当加入抗氧化剂VC的浓度为300mg/L时，褐化抑制效果较为理想，褐化率为17.34％。

Claims (7)

1.一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，其特征在于，包括以下步骤：
取材，选取蝴蝶兰种子萌发出的花梗为组织培养的外植体；
消毒，对外植体进行清洗和消毒，70％酒精浸泡30s、0.5％的次氯酸钠溶液浸泡10min；
培养，将消毒后的外植体放入培养基中，培养和观察60天。
2.根据权利要求1所述的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，其特征在于：所述培养基为MS(Murashige-Skoog)培养基、VW培养基、1/2MS培养基、1/4MS培养基和MS纸桥培养基，培养条件为培养条件为黑暗预处理培养10d，培养温度为(25±2)℃。每升各基本培养基均加入激素6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)：5mg和萘乙酸(NAA)：0.5mg。
3.根据权利要求1所述的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，其特征在于：所述MS(Murashige-Skoog)培养基组分为：大量元素，1.65g/L NH4NO3、1.90g/L KNO3、0.17g/L KH2PO4、0.1807g/L MgSO4·7H2O、0.332g/LCaCl2(2H2O)；微量元素，22.3mg/L MgSO4·4H2O、6.2mg/L N3BO3、8.6mg/LZnSO4·7H2O、0.83mg/L KI、0.25g/L Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、0.025mg/L CoCl·6H2O；27.8mg/L FeSO47H2O、37.3mg/L Na2-EDTA；维生素，肌醇100mg/L、烟酸0.5mg/L、L-甘氨酸2mg/L、VB6 0.5mg/L、VB10.1mg/L；蔗糖30g/L、琼脂12g/L，以MS培养基作为参照。
4.根据权利要求1所述的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，其特征在于：所述VW培养基包括组分和附加成分，所述组分为KNO3 525mg/L、NH4SO4 500mg/L、KH2PO4 250mg/L、MgSO4·7H2O 250mg/L、Ca3(PO4)2 200mg/L、MnSO4·4H2O 7.5mg/L、FeSO47H2O 27.8mg/L、Na2-EDTA 37.3mg/L、蔗糖20g/L、琼脂18g/L，所述附加成分为活性炭(AC)(1-3)g/L和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)(1-3)g/L，柠檬酸(100-300)mg/L和抗坏血酸(VC)(100-300)mg/L。
5.根据权利要求3所述的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，其特征在于：1/2MS培养基的组分为将所述的大量元素中的成分每升所加的质量减小一半，其他元素不变。
6.根据权利要求3所述的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，其特征在于：1/4MS培养基的组分为所述的MS培养基中所添加的大量元素减少到四分之一，其他元素不变。
7.根据权利要求3所述的一种抑制蝴蝶兰组织褐化的方法，其特征在于：MS纸桥培养基的组分为所述的MS培养基中不添加琼脂，其他成分不变。
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