CN103122351A - 突变的酿酒酵母起始转录因子基因及其表达载体和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了突变的酿酒酵母起始转录因子基因及其表达载体和应用。本发明涉及一种从重组酿酒酵母中克隆的突变的酿酒酵母起始转录因子基因，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所编码的转录因子氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。本发明构建了包含有该突变的酿酒酵母起始转录因子基因的重组表达载体，进一步将所构建的重组表达载体转化到酿酒酵母中获得重组酿酒酵母；所获得的重组酿酒酵母能利用木糖生产乙醇、高效共发酵木糖和葡萄糖且能够消除酵母发酵中葡萄糖抑制现象。

Description

突变的酿酒酵母起始转录因子基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明涉及一种与酿酒酵母(Saccharomyces.cerevisiae)共发酵木糖和葡萄糖产乙醇相关的转录因子及其编码基因，尤其涉及突变的酿酒酵母起始转录因子基因及其编码的转录因子，本发明还涉及含有所述突变基因的重组表达载体及重组宿主细胞，本发明进一步涉及它们在酿酒酵母利用木糖生产乙醇并高效共发酵木糖和葡萄糖以及消除酵母发酵中葡萄糖抑制的应用，属于真菌的转录因子领域。

背景技术

酿酒酵母(S.cerevisiae)是真核微生物，细胞壁厚、固醇含量高，与细菌相比对乙醇及木质纤维素水解物中毒性因子的耐受性较高，能在低pH、严格厌氧条件下快速发酵葡萄糖生产乙醇，副产物少，对纤维素水解液中的抑制物有较高的抗性。酿酒酵母全基因组测序已完成，是迄今为止研究最透彻的真核微生物，也是乙醇发酵的研究重点和首要目标微生物。利用酿酒酵母以生物质为原料制取的工业乙醇，作为一种清洁的可再生能源，是替代石油等化石燃料的必然趋势，酿酒酵母拥有可以代谢木糖的各种酶，但是天然酿酒酵母几乎不表达关键酶，因此不能有效利用木糖发酵生产乙醇。为实现以上目标，许多人进行过将木糖代谢途径引入酿酒酵母的尝试，一类是将酿酒酵母与其它可代谢木糖的酵母进行细胞融合，筛选出可以代谢木糖的融合子，另一类是利用基因工程手段转化携带木糖外源基因的质粒到酿酒酵母当中，从而获得一种可以以混合糖为原料产乙醇的基因工程菌。但是获得的重组菌仅是在受体菌株中过量表达或删除与木糖代谢有关的少数几个关键酶基因，造成了细胞的糖代谢流失衡，因此构建得到的重组菌株也未能投入商业化生产。

因而本领域人员认为这些单基因或几个基因的改造或某种的基因缺失或者扩增，只是改变了细胞的局部元件或是重新设计调节了细胞网络代谢产物的平衡系统，而这些人为的改变在细胞自身的代谢调节下往往不能达到人们所期望的结果，并没有解决木糖代谢途径中的复杂问题。因此可利用生物信息学的方法和手段以及日趋完善的分子生物学技术对其进行基因操作和代谢网络的重构。全局转录机制工程(Global transcription machinery engineeringgTME)技术正是通过基因工程改变转录因子序列从而影响整个转录水平以获得优化的表型。对gTME重组菌株的发酵研究表明，重组菌株不仅可以高效利用木糖，还可以同时利用木糖和葡萄糖，木糖醇产量低，并且厌氧条件下有一定的乙醇产量，因此，分离转录起始因子的突变序列并对该突变序列的分析可以为了解酵母高效利用木糖提供可靠的研究线索。

发明内容

鉴于上述状况，本发明人经锐意研究，从重组酿酒酵母菌株spt15-25出发，克隆、分离得到转录因子spt15的突变基因序列spt15-6，通过对获得的spt15突变基因序列spt15-6的分析研究以及与出发酿酒酵母菌株YPH499中含有的未发生突变的原始转录因子spt15基因序列进行对比，并将从重组酿酒酵母菌株spt15-25分离克隆得到的spt15的突变全基因通过基因工程手段重组至出发菌株YPH499中验证该spt15的突变基因在酿酒酵母利用木糖并高效共发酵木糖和葡萄糖以及消除酵母发酵中葡萄糖抑制现象中的应用。

本发明目的之一在于提供一种突变的酿酒酵母起始转录因子基因；

本发明目的之二在于提供一种突变的酿酒酵母起始转录因子；

本发明的目的之三在于构建一种含有所述突变的酿酒酵母起始转录因子基因的重组表达载体以及含有该重组表达载体的重组宿主细胞；

本发明的目的之四是将突变的酿酒酵母起始转录因子基因以及含有该突变基因的重组表达载体转化到酿酒酵母得到重组酿酒酵母，所获得的重组酿酒酵母能够利用木糖或/和葡萄糖作为碳源生产乙醇。

为实现上述目的，本发明一方面提供一种从重组酿酒酵母(Recombinant Saccharomyces cerevisiae)中克隆得到的突变的酿酒酵母起始转录因子基因spt15-6，其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

本发明进一步提供了上述突变的酿酒酵母起始转录因子基因spt15-6所编码的酿酒酵母起始转录因子，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：

(a)SEQ ID No.2所示的氨基酸；

(b)将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No.2所示酿酒酵母起始转录因子功能或活性的蛋白变体。

优选的，本发明所述的酿酒酵母起始转录因子为SEQ ID No.2所示的氨基酸。

所述的“多个”通常意味着2-8个，优选为2-4个，这取决于转录因子三维结构中氨基酸残基的位置或氨基酸的种类；所述的“替换”是指分别用不同的氨基酸残基取代一个或多个氨基酸残基；所述的“缺失”是指氨基酸残基数量的减少，也即是分别缺少其中的一个或多个氨基酸残基；所述的“插入”是指氨基酸残基序列的改变，相对天然分子而言，所述改变导致添加一个或多个氨基酸残基。

本发明所述的蛋白变体可由遗传多态性或人为操作产生，这些操作方法通常为本领域所了解。例如，可通过DNA的突变来制备转录因子的氨基酸序列变体或片段，其中由于诱变或改变多核苷酸的方法为本领域所习知。其中，保守的取代是将一种氨基酸残基替换成具有相似性质的另一种氨基酸。

本发明将突变的酿酒酵母起始转录因子基因spt15-6可操作的与表达调控元件相连接，构建获得重组表达载体或表达盒；由此，本发明进一步构建了一种包含该突变的酿酒酵母起始转录因子基因spt15-6的重组表达载体或表达盒及含有该重组表达载体或表达盒的重组宿主细胞或转化体。

所述重组表达载体或表达盒包括启动子、突变的酿酒酵母起始转录因子基因spt15-6、终止子；其中，突变的酿酒酵母起始转录因子基因spt15-6位于启动子的下游，终止子在spt15突变全基因序列的下游。

可以采用任何一种适宜的转化方法将所述的重组表达载体转化到酵母细胞中，得到重组酵母细胞或转化体；所述的转化方法包括：醋酸锂法、Ti质粒、Ri质粒、电穿孔法、微粒轰击等转化方法。

本发明将所构建的包含突变的酿酒酵母起始转录因子基因spt15-6的重组表达载体或表达盒转化到不能利用木糖的酿酒酵母出发菌株(例如：YPH499菌株)中获得重组酿酒酵母菌株，获得的重组酿酒酵母菌株能在木糖为唯一碳源的培养基上生长，说明突变的酿酒酵母起始转录因子基因spt15-6确实对酿酒酵母的糖代谢起到了优化的作用，将其转化到酿酒酵母菌株中能提高酵母的木糖利用以及葡萄糖、木糖共利用的效率。与出发酵母菌株相比，本发明所构建的重组菌株YPH499-spt15-6可以利用木糖，生长优于出发菌株，在木糖或是木糖和葡萄糖同为碳源时也并没有造成木糖醇的积累，糖利用率较高，但重组菌葡萄糖发酵乙醇产量却低于出发菌株，这表明糖代谢途径中的酶可能发生了变化。本发明所构建的重组酿酒酵母不仅可以很好地利用木糖，而且在利用混和糖时，表现出不受代谢阻遏的影响，可以同时代谢木糖与葡萄糖，没有明显的二次生长现象。生物质的组成都是混和糖，若能够利用这种解决葡萄糖代谢阻遏的机理对充分利用生物质原料具有重要意义。

酿酒酵母发酵木糖产乙醇的途径已研究清楚，途径中的醛糖还原酶(AR)、木糖醇脱氢酶(XDH)、木酮糖激酶(XK)、丙酮酸脱羧酶(PDC)和乙醇脱氢酶(ADH)是关键酶，这些酶活性的高低，对酿酒酵母在木糖为唯一碳源时，细胞的生长与乙醇的产量有很大的影响。

通过测定出发菌株(YPH499)和重组酵母菌株(YPH499-spt15-6)厌氧木糖乙醇发酵途径中最关键的酶：醛糖还原酶(AR)、木糖醇脱氢酶(XDH)、木酮糖激酶(XK)、丙酮酸脱羧酶(PDC)以及乙醇脱氢酶(ADH)酶活变化，发现重组酿酒酵母(YPH499-spt15-6)代谢木糖的AR、XDH、XK的酶活性都有明显提高，PDC活性变化极弱，而ADH的酶活减少57.14％。

环腺苷酸(cAMP)是代谢阻遏现象中的关键因子，它与分解代谢物活化蛋白(CAP)结合，促使RNA多聚酶与基因启动子结合而开始转录；cAMP浓度低时影响其与CAP结合，转录不能发生。观察重组酿酒酵母YPH499-spt15-6胞内cAMP浓度，可以了解木糖与葡萄糖利用与cAMP控制基因转录的关系。实验结果发现，重组酿酒酵母相对于出发菌YPH499，发酵稳定期cAMP浓度保持在一个高度，可以解除葡萄糖代谢阻遏的影响。

本发明所涉及到的术语定义。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术及科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解相同的含义。虽然在本发明的实践或测试中可使用与本文所述者类似或等效的任何方法、装置和材料，但现在描述优选方法、装置和材料。

术语“严谨杂交条件”意指在所属领域中已知的低离子强度和高温的条件。通常，在严谨条件下，探针与其靶序列杂交的可检测程度比与其它序列杂交的可检测程度更高(例如超过本底至少2倍。严谨杂交条件是序列依赖性的，在不同的环境条件下将会不同，较长的序列在较高温度下特异性杂交。通过控制杂交的严谨性或洗涤条件可鉴定与探针100％互补的靶序列。对于核酸杂交的详尽指导可参考有关文献(Tijssen，Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Probes，″Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid assays.1993)。更具体的，所述严谨条件通常被选择为低于特异序列在规定离子强度pH下的热熔点(Tm)约5-10℃。Tm为在平衡状态下50％与目标互补的探针杂交到目标序列时所处的温度(在指定离子强度、pH和核酸浓度下)(因为目标序列过量存在，所以在Tm下在平衡状态下50％的探针被占据)。严谨条件可为以下条件：其中在pH7.0到8.3下盐浓度低于约1.0M钠离子浓度，通常为约0.01到1.0M钠离子浓度(或其它盐)，并且温度对于短探针(包括(但不限于)10到50个核苷酸)而言为至少约30℃，而对于长探针(包括(但不限于)大于50个核苷酸)而言为至少约60℃。严谨条件也可通过加入诸如甲酰胺的去稳定剂来实现。对于选择性或特异性杂交而言，正信号可为至少两倍的背景杂交，视情况为10倍背景杂交。例示性严谨杂交条件可如下：50％甲酰胺，5×SSC和1％SDS，在42℃下培养；或5×SSC，1％SDS，在65℃下培养，在0.2×SSC中洗涤和在65℃下于0.1％SDS中洗涤。所述洗涤可进行5、15、30、60、120分钟或更长时间。

术语“核苷酸”意指单股或双股形式的脱氧核糖核苷酸、脱氧核糖核苷、核糖核苷或核糖核苷酸及其聚合物。除非特定限制，否则所述术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，所述类似物具有类似于参考核酸的结合特性并以类似于天然产生的核苷酸的方式进行代谢。除非另外特定限制，否则所述术语也意指寡核苷酸类似物，其包括PNA(肽核酸)、在反义技术中所用的DNA类似物(硫代磷酸酯、磷酰胺酸酯等等)。除非另外指定，否则特定核酸序列也隐含地涵盖其保守修饰的变异体(包括(但不限于)简并密码子取代)和互补序列以及明确指定的序列。特定而言，可通过产生其中一个或一个以上所选(或所有)密码子的第3位经混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现简并密码子取代(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；和Cassol等人，(1992)；Rossolini等人，Mol Cell.Probes8：91-98(1994))。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中互换使用以意指氨基酸残基的聚合物。即，针对多肽的描述同样适用于描述肽和描述蛋白且反之亦然。所述术语适用于天然产生氨基酸聚合物以及其中一个或一个以上氨基酸残基为非天然编码氨基酸的氨基酸聚合物。如本文中所使用，所述术语涵盖任何长度的氨基酸链，其包括全长蛋白(即抗原)，其中氨基酸残基经由共价肽键连接。

术语“转录因子”是一群能与基因5`端上游特定序列专一性结合，从而保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。

术语“转化子”或“重组宿主菌株”意指包含本发明转录因子Spt15-6的突变全基因的重组质粒载体的受体细胞，而不管使用何种方法进行插入以产生受体细胞，例如直接吸取、转导或所属领域中已知的其它方法。

术语“转化”：将外源基因序列引入到宿主细胞或有机体的方法。

术语“可操作的连接”指两个或更多个元件之间功能性的连接，可操作的连接的元件可为邻接或非邻接的。

附图说明

图1是源于重组酿酒酵母spt15-25的突变的转录因子基因spt15-6的PCR扩增产物图；

图2是出发菌株YPH499和重组菌YPH499-spt15-6利用不同碳源的生长曲线；

图3是出发菌株YPH499和重组菌YPH499-spt15-6的糖利用曲线；

图4是出发菌株YPH499和重组菌YPH499-spt15-6乙醇产量图；

图5是标品液相色谱图；

图6是水解液液相色谱图；

图7cAMP标准曲线图。

图8是菌株YPH499、spt15-25和YPH499-spt15-6胞内cAMP含量变化图。

图9是本发明的总技术路线图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

实施例1  突变的转录因子spt15基因的克隆及序列分析

一、重组酿酒酵母spt15-25的构建

克隆单倍体酿酒酵母BY4742基因组的起始转录因子spt15，得到正确的转录因子spt15基因，以其为模板进行突变。通过改进的易错PCR条件来获得较高的突变率，获得转录因子spt15基因突变库，利用穿梭质粒pYX212构建的T载体简单高效地转化突变库在不能以木糖为唯一碳源发酵的酿酒酵母YPH499中表达，获得能够利用木糖的重组酿酒酵母spt15-25。

二、突变的转录因子spt15基因的克隆

从重组酵母菌株spt15-25中提取基因组DNA作为模板，再根据重组酵母菌株基因组数据信息设计引物，采用PCR获得目的片段。

1、重组酵母菌株spt15-25基因组DNA的提取

从新鲜斜面上接一环spt15-25种入YPAD培养基，30℃、200r/min培养14h，离心收集菌体，采用北京天根公司基因组DNA提取试剂盒提取。具体步骤如下：

(1)取1500μL菌液加入离心管；

(2)12000rpm，离心1min，弃上清；

(3)重复步骤(1)，(2)；

(4)向菌体中加入150μL裂解液LB，充分混匀重悬细胞沉淀，加20μL溶菌酶，振荡至彻底混匀，37℃处理1.5h；

(5)12000rpm离心5min，收集沉淀；

(6)向溶液中加入200μL缓冲液GA悬浮沉淀，用移液器充分吹打混匀；

(7)加入20μL蛋白酶K溶液，20μLRNaseA溶液，颠倒混匀，室温放置5min；

(8)加入220μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，尖端离心去除管盖内壁水珠；

(9)加入220μL无水乙醇，充分颠倒混匀；

(10)将上一步所得到溶液和絮状沉淀加入吸附柱CB2中，12000rpm，离心30s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；

(11)向吸附柱CB2中加入500μL去蛋白液GD，12000rpm，离心30s，倒掉废液，吸附柱放入收集管中；

(12)向吸附柱CB2中加入700μL漂洗液GW，12000rpm，离心30s，倒掉废液；

(13)向吸附柱CB2中加入500μL漂洗液GW，12000rpm，离心30s，倒掉废液；

(14)将吸附柱CB2放回废液收集管中，12000rpm，离心2min。将吸附柱CB2置于室温2min；

(15)将吸附柱CB2转入一个干净的离心管仲，向吸附膜中间部位滴加30μL经65℃预热的ddH2O，室温放置2min，12000rpm，离心30s；

(16)离心得到的溶液再加入吸附柱中，室温放置2min，12000rpm，离心2min，洗脱基因组。

2、spt15-6基因DNA序列的扩增

引物序列如下：

SPT15_Sense：5′

-TCGAGTGCTAGCAAAATGGCCGATGAGGAACGTTTAAAGG-3′

SPT15_Anti：5′

-CTAGCGGTCGACTCACATTTTTCTAAATTCACTTAGCACA-3′

PCR反应体系为：dNTPMixture200umol/L、Taq聚合酶2.5u、引物各30pmol、10×扩增缓冲液10ul，加三蒸水至100ul；

PCR反应条件如下：94℃解链5min，94℃变性60s，53℃退火60s，72℃延伸2min；反应进行30个循环，最后一个循环延伸时间为10min。

三、突变的转录因子spt15基因序列的分析

将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后胶回收纯化，PCR产物电泳检测在0.7kb左右有一明显条带(图1)，从图1中可以看到，该条带非特异性扩增不明显。将回收产物与pMD18-T vector(TaKaRa)载体连接，经大肠杆菌DH-5α转化，挑取单克隆测序，得到P6、P8、P9、P10、P14五条变异序列。其中P6即为spt15-6，其核苷酸序列见SEQID No.1。

突变spt15基因的五条序列与原酿酒酵母spt15基因序列的比对结果可以看到：

P6(SEQ ID No.1)的23位由腺苷酸(A)突变为尿苷酸(G)赖氨酸变成精氨酸，102位由A突变为G色氨酸不变，末尾少27个碱基；

P8前面缺少103个碱基，95位由A突变为G色氨酸不变，466位由胞嘧啶(C)突变为胸腺嘧啶(T)苯丙氨酸突变为丝氨酸，592位由C突变为T脯氨酸突变为亮氨酸；

P9的163位A突变为T赖氨酸突变为终止子，705位的T缺失造成移码突变；

P10的224位碱基由C突变为T，465位由C突变为T，末尾缺失15个碱基，使相对应的原氨基酸序列中74位的苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代，末尾缺失5个氨基酸；

P14的26位多出一个G造成移码突变，第546位T突变成C。这些突变引起了酿酒酵母转录水平的变化，从而使重组菌利用木糖并加快了对葡萄糖的利用速率，无阻遏现象，以及乙醇的生成速率等表型的改变。

实施例2  突变基因重组表达载体的构建

(1)表达载体的T载体pYX212-T构建：平末端加T法ECOR V酶切pYX212成平末端利用高效Taq酶加dTrp72℃温浴连接45min。Takara胶回收试剂盒回收纯化质粒DNA带；T₄连接酶160℃自连，试剂盒回收线性DNA，得到pYX212.T并估计其浓度。

(2)spt15-6突变基因重组表达载体的构建：将P6(SEQ IDNo.1)、P8、P9、P10、P14五条突变基因的PCR产物经1.0％琼脂糖凝胶电泳分离回收，通过T₄DNA连接酶分别与pYX212-T于160℃连接，得到重组载体pYX212-spt15-6、pYX212-spt15-8、pYX212-spt15-9、pYX212-spt15-10和pYX212-spt15-14。

实施例3转化子的获得和鉴定

将重组载体pYX212-spt15-6、pYX212-spt15-8、pYX212-spt15-9、pYX212-spt15-10和pYX212-spt15-14采用醋酸锂法转化至不能利用木糖的酿酒酵母YPH499，得到5种转化子，YNB(不含尿嘧啶)木糖培养基鉴定，除pYX212-spt15-9转化的重组菌外，其它四种重组载体所转化的重组菌都能够在以木糖为唯一碳源的培养基上生长。四种重组菌中P6、P10生长情况较好，以P6重组菌YPH499-spt15-6(SEQ ID No.1)为对象进行研究，其在筛选培养基上的生长情况和在水解液平板上生长情况中可以看到，重组菌YPH499-spt15-6可以在两种培养基上都能够很好地生长。

试验例1不同碳源对出发菌株YPH499和重组菌YPH499-spt15-6生长的影响

出发菌株YPH499(含有突变前的酵母起始转录因子spt15)不能在以木糖为唯一碳源的培养基上生长。出发菌株YPH499和重组菌YPH499-spt15-6的生长情况表现为：YPH499-spt15-650g/L混合糖＞YPH499-spt15-650g/L葡萄糖＞YPH499-spt15-650g/L木糖＞YPH49950g/L葡萄糖，说明重组菌YPH499-spt15-6能在完全培养基中更好的生长，同时它在混合糖中的生长最好，葡萄糖中次之，木糖中生长速率在发酵后期迅速变快。YPH499在混合糖中生长最差，表现出了葡萄糖阻遏现象(图2)。试验结果说明突变的起始转录因子spt15-6改变了出发菌株YPH499的生长特性。

试验例2不同碳源对出发菌株YPH499和重组菌YPH499-spt15-6糖利用的影响

以葡萄糖(50g/L)为唯一碳源，发酵68h，YPH499和YPH499-spt15-6都将葡萄糖全部消耗。以木糖和混合糖为碳源，发酵72h，YPH499-spt15-6的糖利用率为：82.0％(50g/L木糖)，80.4％(50g/L混合糖中的木糖)，100％(50g/L混合糖中的葡萄糖，56h时耗光)，其木糖利用率均达到80％以上，葡萄糖全部耗光。混合糖发酵时，木糖和葡萄糖同时开始利用，但对葡萄糖的利用明显优于木糖(图3)。

试验例3出发菌株YPH499和重组菌YPH499-spt15-6的木糖醇产量

YPH499和YPH499-spt15-6在完全培养基(完全培养基的主要组成：酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L)中厌氧发酵，木糖醇产量极低，都在HPLC最低检测限(0.7g/L)以下，说明YPH499-spt15-6在木糖代谢途径中副产物木糖醇很少积累。

试验例4出发菌株YPH499和重组菌YPH499-spt15-6的乙醇产量

出发菌YPH499和重组菌YPH499-spt15-6以不同糖培养基厌氧发酵产乙醇。由图4显示：在50g/L的葡萄糖和混合糖中，出发菌株YPH499分别在74h和45h，达到其最大乙醇产量20.1和7.6g/L，乙醇生成速率为0.27和0.17g/(Lh)(最大乙醇浓度/时间)；在50g/L的葡萄糖、木糖和混合糖中，YPH499-spt15-6在25h，96h和96h，达到其最大的乙醇产量14.5g/L，6.8g/L，10.5g/L，乙醇平均生成速率为0.58，0.07和0.11g/(Lh)，在50g/L的葡萄糖中的乙醇产率相对于YPH499提高了2.15倍。YPH499-spt15-6在50g/L的葡萄糖中，25h达到其最大值，随着时间的增长有一定量的乙醇消耗；在木糖和混合糖中随着时间的增长乙醇产量逐渐增加。YPH499-spt15-6在葡萄糖中的乙醇产量明显高于其在木糖中的产量，造成的原因：一方面，葡萄糖的糖醇理论转化率(0.51)高于木糖的糖醇理论转化率(0.46)；另一方面YPH499-spt15-6的实际葡萄糖利用率(100％)高于木糖利用率(82.0％)。在50g/L的葡萄糖中YPH499的乙醇产量高于YPH499-spt15-6，可能的原因是YPH499-spt15-6的菌体浓度明显大于YPH499，YPH499-spt15-6用来菌体生长所消耗的葡萄糖量高于YPH499所消耗的葡萄糖量。

试验例5重组菌YPH499-spt15-6关键酶酶活测定试验

(1)醛糖还原酶(AR)的活性测定

木糖还原酶消耗NADPH将木糖还原为木糖醇并生成NADP。NADPH在340nm处有吸收峰，而NADP在此波段没有吸收。参照Walfridsson等人方法并加以修改，3ml反应体系中包括：0.1mol/L磷酸钾缓冲(pH7.0)，0.2mol/L D-木糖，0.008mmol/L NADPH，以及适量粗酶液，在340nm下每分钟检测吸光度的下降值。

(2)木糖醇脱氢酶(XDH)的活性测定

木糖醇脱氢酶以NAD+为辅助因子，催化木糖醇生成木酮糖和NADH。NADH在340nm有最大吸收峰，可以通过检测单位时间酶反应体系在340nm处吸光度的增量计算出木糖醇脱氢酶的酶活。3mL反应体系由以下溶液混合而成：200mmol/L NAD+，2mol/L木糖醇溶液，10mmol/L MgCl₂溶液，0.1mol/L Tris-HCl缓冲(pH8.4)以及适量粗酶液。反应从加入底物2mol/L木糖醇开始。

(3)木酮糖激酶(XK)的活性测定

XK的酶反应液为：0.1mol/L Tris-HCl缓冲(pH7.0)，50mmol/L氨基乙酸，50mmol/L氯化钾，1mmol/L EDTA，10mmol/L氰化钾，10mmol/L氟化钠，1mmol/L磷酸烯醇式丙酮酸，5mmol/L氯化镁，0.4mol/L ATP，0.3mmol/L NADH，25U乳酸脱氢酶和25U丙酮酸激酶，0.1mL粗酶液，无菌水稀释至0.5mL。反应从加入1mmol/L木酮糖开始。

(4)丙酮酸脱羧酶(PDC)的活性测定

酶活检测步骤：1mL缓冲液含100mmol/L MOPS(pH6.5)0.45mL，5mmol/L焦磷酸硫胺素0.1mL，50mmol/L MgCl₂0.1mL，1.6mmol/LNADH0.05mL，14U ADH0.1mL和粗酶液0.1mL；最后加入0.1mL50mmol/L丙酮酸钠后立即用分光光度计在340nm处读数，计算每分钟还原NADH的μmol数即为一个酶活力单位，则比酶活为U/mg。

(5)乙醇脱氢酶(ADH)的活性测定

参考Bert L.Vallee等人的方法，3mL酶活反应体系为：0.1mol/L Tris-HCl缓冲(pH8.8)2.5mL，30mmol/L NAD+200μL，粗酶液25μL；最后加入底物15mol/L乙醇100μL开始反应。30℃在340nm处检测吸光度的增值。比酶活单位定义为：每毫克蛋白每分钟生成NADH的μmol数，即U/mg。蛋白浓度的测定粗酶液中的蛋白浓度用Bradford方法测定，以牛血清蛋白为标样。

表1是关键酶的测定结果，从表1可以看出，重组菌YPH499-spt15-6在木糖培养基上AR的比活达到0.67U/mg，文献曾报道毕赤酵母P.stipitis CBS5773的木糖还原酶酶活为0.56U/mg，相比之下本发明重组菌YPH499-spt15-6的酶活提高了19.64％。XDH酶活与P.stipitis CBS5773的XDH比活0.25U/mg接近。这说明重组菌YPH499-spt15-6可以很好的转化木糖为木酮糖。Marko等人的研究结果表明，酿酒酵母自身木酮糖激酶活性较低，限制了木糖分解代谢。沈煜等人的研究也表明，木酮糖激酶的高效表达对木糖发酵生产乙醇有促进作用。重组菌YPH499-spt15-6的XK酶活比对照菌株提高了近一倍，使木酮糖充分进入PPP途径。PDC酶活性变化不大，但是ADH酶活性减少57.14％，这造成了重组菌乙醇产量的降低

表1关键酶的测定结果

试验例6出发菌株和重组菌株胞内cAMP变化观察试验

分别将出发菌株YPH499和重组菌株YPH499-spt15-6取相同量体积发酵液，破碎取上清测定胞内cAMP含量。

准确称取5mg cAMP，用娃哈哈纯净水溶解并定容于50mL容量瓶，分别精确量取1，2，4，6，8，10mL母液用纯净水定容于10mL容量瓶，每个标样经0.45μm醋酸纤维滤膜过滤。用DI ONEX U3000高效液相色谱进行检测，Chromeleon version6.80工作站，色谱条件：DIONEX Acclaim120C18柱，紫外检测波长：259nm，柱温30℃，流动相为甲醇∶磷酸盐缓冲液＝10∶90(V/V)，进样量50μL，流速为0.8mL/min。标品液相色谱图见图5。从图6和图7中可以看到，cAMP得到很好的分离。

由图8可以看出：出发菌株YPH499在木糖和葡萄糖混合发酵时cAMP含量最低；快速生长期时所选菌株cAMP含量都维持在一个较高的水平；进入稳定生长期，重组菌YPH499-spt15-6的cAMP浓度变化不大，比较稳定；出发菌株YPH499在5％葡萄糖培养基上迅速下降。发酵过程中由于重组菌YPH499-spt15-6胞内cAMP浓度的保持，由此消除了葡萄糖代谢产物的抑制作用。

以上结合具体实施方案对本发明进行了说明。不过，这些实施方案仅是对本发明进行了详细的说明，不过这些说明并不对本发明的保护范围构成任何限制。本领域技术人员理解，在不超出或偏离本发明保护范围的情况下，本发明的技术方案及其实施方式有多种修饰、改进或等价物，这些均应落入本发明的保护范围内。

文中提及的所有文献，在此全文引入作为参考。

Claims (10)

1.突变的酿酒酵母(Recombinant Saccharomyces cerevisiae)起始转录因子基因，其特征在于：其核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。

2.突变的酿酒酵母(Recombinant Saccharomyces cerevisiae)起始转录因子，其特征在于，其氨基酸序列为(a)或(b)所示：

(a)SEQ ID No.2所示的氨基酸；

(b)将SEQ ID No.2所示的氨基酸通过一个或多个氨基酸残基的替换、缺失或/和插入而衍生得到的仍具有SEQ ID No.2所示酿酒酵母起始转录因子功能或活性的蛋白变体。

3.含有权利要求1所述突变的酿酒酵母(RecombinantSaccharomyces cerevisiae)起始转录因子基因的重组表达载体。

4.一种重组表达载体，其特征在于，包括：启动子、SEQ IDNo.1所示的基因、终止子；其中SEQ ID No.1所示的基因位于启动子的下游，所述终止子在SEQ ID No.1所示的基因的下游。

5.含有权利要求3或4所述重组表达载体的重组宿主细胞。

6.按照权利要求5所述的重组宿主细胞，其特征在于：所述的重组宿主细胞是重组酿酒酵母(Recombinant Saccharomycescerevisiae)细胞。

7.权利要求1所述的突变的酿酒酵母(RecombinantSaccharomyces cerevisiae)起始转录因子基因在酿酒酵母利用木糖生产乙醇中的应用。

8.权利要求1所述的突变的酿酒酵母(RecombinantSaccharomyces cerevisiae)起始转录因子基因在消除酵母发酵中葡萄糖抑制的应用。

9.权利要求2所述的突变的酿酒酵母(RecombinantSaccharomyces cerevisiae)起始转录因子在酿酒酵母利用木糖生产乙醇中的应用。

10.权利要求2所述的突变的酿酒酵母(RecombinantSaccharomyces cerevisiae)起始转录因子在消除酵母发酵中葡萄糖抑制的应用。

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