CN103115882A - 一种检测h2o2的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种检测H2O2的方法。本发明将联乙炔单体组装成囊泡，利用H2O2引发囊泡内联乙炔单体聚合产生光学信号，应用于H2O2的检测。为了提高检测灵敏度和检测效率，加入辣根过氧化物酶辅助催化。本发明紫外分光光度计检测光学信号可以得到H2O2的检测线达80×10-6M，本发明具有响应快、灵敏性高、重现性高、操作简单及工艺绿色环保的优点。
Description
技术领域
本发明属于生物传感和生物分析领域，涉及一种检测H2O2的方法，具体涉及利用联乙炔囊泡检测H2O2的方法。
背景技术
过氧化氢是一种重要的细胞代谢产物。最新研究表明，过氧化氢在生命体系过程作为信号分子参与多种生物学效应启动，同时与其他大分子其反应，其含量的表达与心血管疾病、肿瘤、神经元损伤等相关。在临床诊断上，过氧化氢是大多数氧化还原反应的重要产物。过氧化氢在工业上常用作漂白剂和清洗剂，但其残留物严重危害环境。因此，发展一种工艺简单、灵敏、重现性及稳定性好的过氧化氢检测方法对生命健康、环境领域具有重要的意义。
现有技术主要包括荧光法、化学发光法、高效液相色谱法，基于酶传感的电化学方法等。然而，在应用于H2O2的检测时，这些方法仍然存在检测线高、分析时间长、重复性不好、仪器昂贵、工艺复杂等缺陷。
申请人在前期工作中，首次发现H2O2释放出的羟基自由基可特异性的作用于联乙炔单体，使联乙炔囊泡聚合而产生显色反应，从而为发明一种廉价、简便、稳定性好、灵敏度高、重现性好、分析时间短的H2O2的检测技术提供了理论支持。
发明内容
本发明的技术目的在于提供一种全新的过氧化氢检测方法，为了达到技术目的，本发明的技术方案为：
一种检测H2O2的方法，其特征在于，首先用联乙炔单体制成联乙炔囊泡，于联乙炔单体囊泡溶液中加入待测样品，至显色反应结束，测定反应体系在620至680nm处的吸光值，以测得样品中是否含有H2O2。
本发明所述的检测H2O2的方法，其特征在于，在联乙炔囊泡溶液中加入辣根过氧化物酶后再加入待测H2O2样品。
其中，加入辣根过氧化物酶（HRP）的技术目的是加快过氧化氢对羟基自由基的释放速率，从而提高检测灵敏度和检测效率；不应该理解为辣根过氧化物酶作用于联乙炔单体囊泡溶液而产生了显色反应。
本发明所述的检测H2O2的方法，其特征在于，显色反应的时间为0.5至4h。
本发明所述的检测H2O2的方法，其特征在于，所述联乙炔单体囊泡溶液的制作步骤为：
（1）取联乙炔单体溶于氯仿中，过0.45 μm滤膜，旋转蒸发去除氯仿，加蒸馏水，配制联乙炔单体摩尔含量为0.2至2 mmol/L的溶液；
（2）将上述混合物于60至90℃下探头超声5至30 min，得到联乙炔单体囊泡溶液。
本发明具有以下有益效果：提供了一种全新的、廉价、简便、稳定性好、灵敏度高、重现性好、分析时间短的过氧化氢检测方法。
本发明的技术原理为，联乙炔囊泡在羟基自由基的作用下发生聚合反应，聚合反应生成的聚联乙炔在波长为620-680nm处有特征吸收峰，通过检测反应后吸收峰的有无，便可以检测过氧化氢的有无。本发明的技术原理图如图1所示。
附图说明
图1为联乙炔囊泡检测过氧化氢原理图。
图2为联乙炔囊泡检测H2O2的实物图。
图3为联乙炔检测过氧化氢的吸光度全波长扫描图。
图4为聚联乙炔囊泡特征吸光值的对数值和H2O2浓度的对数值之间的线性关系图。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明检测H2O2的方法进行详细说明。
实施例1
本实施例说明联乙炔单体囊泡的制备过程。
取联乙炔单体溶于氯仿中，过0.45 μm滤膜，旋转蒸发去除氯仿，加蒸馏水，配制联乙炔单体摩尔含量为0.2 mmol/L的溶液；将联乙炔单体溶液于60℃下探头超声5 min，得到联乙炔囊泡溶液。
实施例2
本实施例说明联乙炔单体囊泡的另一制备过程。
取联乙炔单体溶于氯仿中，过0.45 μm滤膜，旋转蒸发去除氯仿，加蒸馏水，配制联乙炔单体摩尔含量为2 mmol/L的溶液；将联乙炔单体溶液于90℃下探头超声30 min，得到联乙炔囊泡溶液。
实施例3
本实施例说明联乙炔单体囊泡的另一制备过程。
取联乙炔单体溶于氯仿中，过0.45 μm滤膜，旋转蒸发去除氯仿，加蒸馏水，配制联乙炔单体摩尔含量为0.5 mmol/L的溶液；将联乙炔单体溶液于70℃下探头超声10 min，得到联乙炔囊泡溶液。
实施例4
本实施例说明联乙炔单体囊泡的另一制备过程。
取联乙炔单体溶于氯仿中，过0.45 μm滤膜，旋转蒸发去除氯仿，加蒸馏水，配制联乙炔单体摩尔含量为1.1 mmol/L的溶液；将联乙炔单体溶液于80℃下探头超声20 min，得到联乙炔囊泡溶液。
实施例5
本实施例说明联乙炔囊泡检测H2O2的具体实施步骤。
取实施例1的联乙炔囊泡溶液，加入不同浓度梯度（0μmol/l、80μmol/l、400μmol/l、1.6mmol/L、8mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、200mmol/L）的纯H2O2溶液，反应温度为室温，反应时间为4h，结束后对反应体系做全波长扫描。
囊泡溶液与H2O2溶液反应结果如附图2所示。结果显示，随着待测浓度的增加，溶液蓝色程度呈现规律性的加深。而浓度为零时，溶液与原囊泡溶液颜色一致。
对该组反应溶液做全波长扫描，扫描结果如附图3所示。结果显示，反应产物于波长为620-680nm波段有特征吸收峰。
实施例6
本实施例说明纯H2O2溶液与联乙炔单体囊泡溶液在辣根过氧化物酶存在时的反应步骤以及结果。
取实施例1的联乙炔囊泡溶液，加入辣根过氧化物酶，加入不同浓度梯度（0μmol/l、80μmol/l、400μmol/l、1.6mmol/L、8mmol/L、40mmol/L、50mmol/L、200mmol/L）的纯H2O2溶液，反应温度为室温，反应时间为0.5h，结束后对反应产物做全波长扫描。
囊泡溶液与H2O2溶液反应结果显示，随着待测浓度的增加，溶液蓝色程度呈现规律性的加深。而浓度为零时，溶液与原囊泡溶液颜色一致。取H2O2的0μmol/l的反应后的溶液做全波长扫描，没有发现特征吸收峰。
实施例7
本实施例说明利用检测H2O2来测定血样中糖化血红蛋白的浓度的步骤以及结果。
人体糖化血红蛋白糖基在葡萄糖氧化酶作用下释放出H2O2，在临床诊断上通常通过对H2O2进行定量，进而测定糖化血红蛋白的浓度。
按照实施例6进行检测反应，将反应时间延长为1小时。反应结束后，于紫外波长为660nm处分别测定反应溶液的吸光度值，获得聚联乙炔囊泡特征吸光值与H2O2溶液浓度的对数值之间的线性关系图，如附图4所示。
按照现有技术对血样进行前处理，获得含有H2O2的待测样，购买罗氏公司糖化血红蛋白酶法试剂盒（YZB/USA 1940-2006），用该试试剂盒定量测得该血样中糖基血红蛋白与血红蛋白比为6.5%。
按照现有技术对血样进行前处理，获得含有H2O2的待测样，购买宁波美康生物科技有限公司酶法试剂盒（YZB/国 1706－2006），用该试剂盒定量测得该血样中糖基血红蛋白与血红蛋白比为6.4%。
按照现有技术对血样进行前处理，获得含有H2O2的待测样，取实施例1所述联乙炔单体囊泡溶液，加入辣根过氧化物酶，再加入处理过的待测样品，反应时间为1h。于紫外波长为660nm处测得吸光度值，带入本实施例线性关系图4中，用该试试剂盒定量测得该血样中糖基血红蛋白与血红蛋白比为6.4%。
以上所述的实施方式仅仅是对本发明技术的优选实施方式进行的描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明技术的精神前提下，本领域工程技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明的权利要求书确定的保护范围内。
Claims (4)
1.一种检测H2O2的方法，其特征在于，首先用联乙炔单体制成联乙炔囊泡，于联乙炔囊泡溶液中加入待测样品，至显色反应结束，测定反应体系在620至680nm处的吸光值，以测得样品中是否含有H2O2。
2.根据权利要求1所述的一种检测H2O2的方法，其特征在于，在联乙炔囊泡溶液中加入辣根过氧化物酶后，再加入待测H2O2样品。
3.根据权利要求2所述的一种检测H2O2的方法，其特征在于，显色反应的时间为0.5至4h。
4.根据权利要求1所述的一种检测H2O2的方法，其特征在于，所述联乙炔囊泡溶液的制作步骤为：
（1）取联乙炔单体溶于氯仿中，过0.45 μm滤膜，旋转蒸发去除氯仿，加蒸馏水，配制联乙炔单体摩尔含量为0.2至2 mmol/l的溶液；
（2）将上述混合物于60至90℃下探头超声5至30 min，得到联乙炔单体囊泡溶液。
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