CN103096918B - 治疗试剂的cns递送 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了有效的和较少侵入性的方法，用于递送治疗试剂至所述中枢神经系统(CNS)。在一些实施方案中，本发明提供了方法，包括步骤：向正患有或者易患伴有溶酶体酶水平或者活性降低的溶酶体贮积症的受试者鞘内施用包含溶酶体酶替代酶的组合物。

Description

治疗试剂的CNS递送
相关申请的交叉引用
本申请要求美国临时申请序列号61/358,857(2010年06月25日提交)、61/360,786(2010年7月1日提交)、61/387,862(2010年9月29日提交)、61/435,710(2011年1月24日提交)、61/442,115(2011年2月11日提交)、61/476,210(2011年4月15日提交)、和61/495,268(2011年6月9日提交)的优先权；其中每个的整体通过参考的方式并入本文。与该申请相关的美国申请：名称为“乙酰肝素N-硫酸酯酶CNS递送的方法和组合物，”于同日提交；“艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的CNS递送的方法和组合物，”于同日提交；“β-半乳糖脑苷脂酶CNS递送的方法和组合物，”于同日提交；“芳基硫酸酯酶A的CNS递送的方法和组合物，”于同日提交；“Sanfilippo综合症类型B的治疗，”于同日提交；其中每个的整体通过参考的方式并入本文。
背景技术
酶替代治疗(ERT)包括向受试者全身施用天然或重组衍生的蛋白质和/或酶。批准的疗法主要是通过静脉向受试者施用，并且对于治疗潜在的酶缺乏症的躯体症状有效。由于所述静脉施用的蛋白质和/或酶在进入所述中枢神经系统(CNS)的细胞和组织内的有限分布，具有CNS病因学的所述疾病的治疗尤其具有挑战性，因为所述静脉施用的蛋白质和/或酶没有充分穿过血-脑屏障(BBB)。
所述血-脑屏障(BBB)是由内皮细胞构成的体系，其功能是保护所述中枢神经系统(CNS)使免于遭受在所述血流中的有害物质，例如细菌、大分子(例如蛋白质)和其它亲水性分子，通过限制这种物质穿过所述BBB的扩散并进入所述潜在的脑脊髓液(CSF)和CNS。
有几种绕过所述BBB的方式，以增强治疗试剂的脑递送，包括直接的颅内注射、所述BBB的短暂通透性、以及修饰活性剂以改变组织分布。治疗试剂完全绕过所述血管直接注射进入脑组织，但是主要有患并发症(传染、组织损伤、免疫应答)的风险，所述并发症由颅内注射、以及所述活性剂从所述施用位点的轻度扩散所引起。到目前为止，蛋白质直接施用进所述脑物质中不能实现显著的治疗效果，因为扩散障碍和可以被施用的治疗体积有限。对流协助扩散已经通过放置在所述脑实质中的导管研究，使用缓慢的、长期的输液(Bobo，等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A91，2076-2080(1994)；Nguyen，等J.Neurosurg.98，584-590(2003))，但是没有使用这种方法进行长期治疗的批准疗法。另外，大脑内导管的放置是非常侵入性的，并且作为临床替代不太理想。
鞘内(IT)注射，或者施用蛋白质到所述脑脊髓液(CSF)，也已经被尝试，但是没有产生成功的治疗。在这种治疗方法中的主要的挑战是所述活性剂倾向于非常紧密地绑定在脑室室管膜衬里，其阻止了随后的扩散。目前，通过直接施用到所述CSF以治疗脑遗传性疾病，还没有批准的产品。
事实上，很多人都认为在大脑表面扩散的障碍、以及缺乏有效和便捷的递送方式，极大地妨碍了在大脑中任何疾病达到足够的治疗效果。
许多溶酶体贮积症影响神经系统，从而在用传统治疗方法治疗这些疾病中表现出独特的挑战。在受影响的个体的神经元和脑膜中往往在大量聚集糖胺聚糖(GAG)，导致各种形式的CNS症状。迄今为止，还没有成功地以任何方式治疗由溶酶体疾病导致的CNS症状。
因此，仍然非常需要有效地将治疗试剂递送到大脑。更具体地讲，非常需要更有效地递送活性剂到中枢神经系统，用于治疗溶酶体贮积症。
发明概述
本发明提供了有效和较少侵入性的直接递送治疗试剂到中枢神经系统(CNS)的方法。部分上，本发明基于意外发现的基础上，即溶酶体贮积症的替代酶可以直接以高浓度(例如，大于约3mg/ml，4mg/ml，5mg/ml，10mg/ml或更多)引入到有需要治疗的受试者的脑脊髓液(CSF)中，使得所述酶有效和广泛地在各表面之间扩散并在所述脑的各区域之间贯通，包括深部脑区域。更令人惊讶的是，本发明人已经证明可以使用简单的生理盐水或缓冲液为基础的制剂会达到如此高浓度蛋白的递送，而不诱发实质性的不利影响，如在所述受试者中严重的免疫反应。因此，本发明提供了高效、临床可取的和患者友好型的方法，用于直接CNS递送以治疗具有CNS组分，特别是溶酶体贮积症的各种疾病和紊乱。本发明在CNS靶向领域和酶替代疗法中代表了显著的进步。
此外，本发明向有需要治疗的受试者提供了鞘内(IT)施用治疗试剂(例如替代酶)的方法。在一些实施方案中，替代酶可以是重组的、基因活化的或天然酶。如本文使用的，所述术语“鞘内施用”，“鞘内注射”，“鞘内递送”，或符合语法的等价表达，是指注射到所述脊椎管(围绕所述脊髓的鞘内空间)中。在一些实施方案中，根据本发明，“鞘内施用”或“鞘内递送”是指通过腰区或腰部的IT施用或递送，即腰部的IT施用或递送。如本文使用的，所述术语“腰部”或“腰区”，是指在第三和第四腰椎(下背部)之间的区域，更包含所述L2-S1区的脊椎。可以预期的是所述腰部IT施用或递送区分超过小脑延髓池递送(即，通过小脑周围和下方的空间注入，通过在头骨和脊椎顶部之间的开口)，因为根据我们的发明，腰椎IT施用或递送提供到远端椎管的更好及更有效的递送，而此外，小脑延髓池递送，通常不良好地递送至远端脊椎管。
在一个方面，本发明提供的方法包括步骤：向正患有或者易患伴有溶酶体酶水平或者活性降低的溶酶体贮积症的受试者鞘内施用组合物，所述组合物包括所述溶酶体酶的替代酶，所述替代酶浓度大于约5mg/ml(例如，大于6mg/ml、7mg/ml、8mg/ml、9mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、75mg/ml，或100mg/ml)。
在一些实施方案中，所述组合物进一步包括一种或多种(i)缓冲剂，(ii)表面活性剂，或(iii)渗透压调节剂。在一些实施方案中，所述组合物具有大约为3.0-8.0的pH(例如，4.0-7.5、5.0-7.5、5.5-7.7、5.5-7.0、6.0-7.0、6.5-7.5、6.5-7.0，或5.5-6.5)。在一些实施方案中，所述组合物包括在制剂中的替代酶，所述制剂不合成CSF。
在一些实施方案中，所述组合物在单一的剂量下施用，体积小于约15mL(例如，小于约10mL、9mL、8mL、7mL、6mL、5mL、4mL、3mL、2mL、1.5mL，1.0mL或0.5mL)。
在一些实施方案中，所述鞘内施用的组合物在受试者中不产生导致实质性的不利影响。在某些实施方案中，所述鞘内施用的组合物不导致适应性T-细胞介导的免疫应答。
在又一个方面中，本发明提供的方法包括步骤：向正患有或者易患伴有溶酶体酶水平或者活性降低的溶酶体贮积症的受试者施用组合物，所述组合物包括溶酶体酶替代酶，其施用包括在缺乏并发免疫抑制治疗时的所述组合物的鞘内施用。在一些实施方案中，所述方法不涉及治疗的受试者的免疫耐受诱导。在某些实施方案中，所述方法不涉及使用T-细胞免疫抑制剂预处理或预调节所述受试者。
在进一步的方面中，本发明提供的方法，包括步骤：向正患有或者易患伴有溶酶体酶水平或者活性降低的溶酶体贮积症的受试者，以治疗有效剂量，鞘内施用包括溶酶体酶替代酶的组合物，并且施用间隔，使得在一个或多个脑、脊髓和外周器官组织中达到溶酶体酶正常水平或活性的至少约10％(例如，至少约15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％，或95％)。
在一些实施方案中，所述酶递送至的所述一种或多种脑组织包括脑膜组织。在一些实施方案中，所述脑膜组织选自：软脑膜、硬脑膜、蛛网膜组织。
在一些实施方案中，所述酶递送至的所述一种或多种脑组织包括大脑组织。在某些实施方案中，所述大脑组织中为大脑的表面或浅部组织。在某些实施方案中，所述大脑的表面或浅部组织选自：软脑膜组织、大脑皮质带状组织、海马、在所述大脑的表面距所述表面4mm以内的组织、Virchow Robin空间、VR空间的血管、所述海马、脑下表面的下丘脑部分、所述视神经和神经束、嗅球和突起物、及其组合。
在一些实施方案中，所述酶递送的所述大脑组织为大脑的深部组织。在某些实施方案中，所述大脑的深部组织选自大脑皮质丝带的内部组织、在所述大脑表面距所述表面以下4mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下6mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下10mm的组织、所述间脑、下丘脑、丘脑、腹侧丘脑(prethalamus)，以及底丘脑、后脑、大脑脚、红核、颅神经III核、深部灰质、豆状核、基底神经节、尾状核、豆状核、杏仁核、苍白球，及其组合。
在一些实施方案中，所述酶递送至的所述一种或多种脑组织包括所述小脑组织。在某些实施方案中，所述小脑组织选自分子层组织、浦肯野氏细胞层组织、颗粒细胞层组织、小脑脚、及其组合。在一些实施方案中，所述小脑组织是所述小脑的深部组织。在某些实施方案中，所述小脑的深部组织选自：浦肯野氏细胞层组织、颗粒细胞层组织、小脑深部白质组织和小脑深部核组织。
在一些实施方案中，所述酶递送至的所述一种或多种脑组织包括脑干组织。在某些实施方案中，所述脑干组织选自脑干白质组织和/或脑干核组织。
在一些实施方案中，所述酶递送至的所述脊髓的一种或多种组织是脊髓的表面或浅部组织。在某些实施方案中，所述脊髓的表面或浅部组织选自：软脑膜、所述束状的白质、和在所述脊髓的表面距所述表面4mm以内的组织。在一些实施方案中，所述所述脊髓的一种或多种组织是所述脊髓的深部组织。在某些实施方案中，所述脊髓的所述深部组织选自：脊髓灰质和室管膜细胞、以及在所述脊髓表面距所述表面以下4mm的组织。
在一些实施方案中，所述酶递送至的所述一种或多种脑组织包括表面或者浅部组织。在某些实施方案中，所述表面或者浅部组织选自：软脑膜、硬脑膜、和脑膜的蛛网膜组织、软脑膜组织、大脑皮质带状组织、在所述大脑的表面距所述表面4mm以内的组织、及其组合。
在一些实施方案中，所述酶递送至的组织包括深部组织。在某些实施方案中，所述深部脑组织选自：所述大脑的深部白质、所述脊髓的深部灰质、胼胝体、脑室周围组织、丘脑、基底神经节、间脑、海马伞、在大脑皮质丝带以下的组织、在所述大脑表面距所述表面以下4mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下6mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下10mm的组织、浦肯野氏细胞层、颗粒细胞层组织、小脑深部白质组织和小脑深部核组织及其组合。
在一些实施方案中，所述治疗有效剂量的范围从0.005mg/kg脑重量至100mg/kg脑重量。在某些实施方案中，所述治疗有效剂量大于1mg/kg脑重量(例如大于5、10、15、20、25、30、35、40、45、或者50mg/kg脑重量)。在某些实施方案中，所述治疗有效剂量大于10mg/kg脑重量。在某些实施方案中，所述治疗有效剂量大于30mg/kg脑重量。
在一些实施方案中，所述施用间隔为每两周一次。在一些实施方案中，所述施用间隔为每月一次。在一些实施方案中，所述施用间隔为每两月一次。在一些实施方案中，所述施用间隔为每月两次。在一些实施方案中，所述施用间隔为每周一次。在一些实施方案中，所述施用间隔是每周两次或数次。在一些实施方案中，所述施用是持续的，例如通过持续灌注泵。
在另一方面中，本发明提供了方法包括步骤：施用至正患有或者易患伴有溶酶体酶水平或者活性降低的溶酶体贮积症的受试者，包含溶酶体酶替代酶的组合物，其中施用包括所述组合物的鞘内施用，以使得所述替代酶被递送到深部脑组织，在所述外部表面以下至少5mm(例如至少6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、或者在所述外部表面以下更深)。在一些实施方案中，所述替代酶被递送至在所述外部表面以下至少10mm的深部脑组织。在某些实施方案中，所述替代酶特别地被递送到所述深部脑组织的细胞溶酶体。
在一些实施方案中，所述酶递送至的所述深部脑组织选自：所述大脑的深部白质、所述脊髓的深部灰质、胼胝体、脑室周围组织、丘脑、海马伞、所述大脑皮质丝带以下的组织、在所述大脑表面距所述表面以下4mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下6mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下10mm的组织、浦肯野氏细胞层、颗粒细胞层组织、小脑深部白质组织、和小脑深部核组织、及其组合.
在又一方面中，本发明提供的方法包括步骤：向正患有或者易患伴有溶酶体酶水平或者活性降低的溶酶体贮积症的受试者鞘内施用组合物，所述组合物包含由人类细胞制备的所述溶酶体酶的替代酶。
在一些实施方案中，所述溶酶体贮积症选自：天冬氨酰葡萄糖胺尿症，胆固醇脂沉积病，沃尔曼病，胱氨酸病，Danon病，法布里病，Farber脂肪肉芽肿病，Farber病，墨角藻糖苷酶缺乏病，半乳糖唾液酸沉积症I/II型，戈谢病类型I/II/III，球细胞脑白质营养不良，克拉伯病，糖原贮积症II，庞贝氏症，GM1-神经节苷脂沉积症类型I/II/III，GM2-神经节苷脂沉积症类型I，泰-萨克斯病，GM2-神经节苷脂沉积症类型II，桑德霍夫病，GM2-神经节苷脂沉积症，α-甘露糖苷过多症类型I/II，β-甘露糖苷过多症，异染性脑白质营养不良，粘脂糖症类型I，唾液酸沉积症类型I/II，粘脂糖症类型II/III，粘脂糖症类型IV，I-细胞病，粘脂糖症类型IIIC假胡尔勒氏多种营养不良，黏多糖贮积症类型I，黏多糖贮积症类型II，亨特综合症，黏多糖贮积症类型IIIA，Sanfilippo综合症类型A、B、或D(黏多糖贮积症类型IIIB，黏多糖贮积症类型IIIC，黏多糖贮积症类型IIID)，黏多糖贮积症类型IVA，莫基奥综合症，黏多糖贮积症类型IVB，黏多糖贮积症类型VI，黏多糖贮积症类型VII，Sly综合症，黏多糖贮积症类型IX，多种硫酸酯酶缺乏症，神经元蜡样脂褐质沉积症，CLN1Batten病，CLN2Batten病，尼曼匹克病类型A/B，尼曼匹克病类型C1，尼曼匹克病类型C2，致密性成骨不全症，Schindler病类型I/II，戈谢病和唾液酸贮积病。
在一些实施方案中，所述溶酶体贮积症选自：Hunters综合症、异染性脑白质营养不良(MLD)病、Sanfilippo综合症类型A、Sanfilippo综合症类型B、和球细胞脑白质营养不良(GLD)病。在某些实施方案中，所述替代酶选自重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)、芳基硫酸酯酶A(ASA)、乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Naglu)和β-半乳糖苷酶(GLC)。在一些实施方案中，所述替代酶含有甘露糖-6-磷酸(M6P)残基。在一些实施方案中，所述替代酶是包含溶酶体靶向部分的融合蛋白。
在一些实施方案中，所述替代酶被递送至神经元、胶质细胞、血管周细胞和/或脑膜细胞。在某些实施方案中，所述替代酶被进一步递送至在所述脊髓中的神经元。
在一些实施方案中，所述鞘内施用进一步导致在外周靶组织中所述替代酶的全身递送。在某些实施方案中，所述外周靶组织选自：肝脏、肾脏和/或心脏、内皮、骨髓和骨髓来源的细胞、脾脏、肺脏、淋巴结、骨和软骨、卵巢和睾丸。
在一些实施方案中，所述鞘内施用导致所述替代酶在脑靶组织、脊髓神经元和/或外周靶组织中的溶酶体定位。在一些实施方案中，所述鞘内施用导致GAG贮存在所述脑靶组织、脊髓神经元和/或外周靶组织中的减少。在某些实施方案中，所述GAG贮存相对于对照，以至少20％、40％、50％、60％、80％、90％、1-倍、1.5-倍或者2-倍地减少。
在一些实施方案中，所述鞘内施用导致在神经元中的液泡化减少。在一些实施方案中，所述神经元包括浦肯野细胞。
在一些实施方案中，所述鞘内施用导致在所述脑靶组织、脊髓神经元和/或外周靶组织中所述替代酶的酶活性增加。在某些实施方案中，所述酶活性相对于对照，以至少1-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍或者10-倍地增加。在某些实施方案中，所述增加的酶活性至少约10nmol/hr/mg、20nmol/hr/mg、40nmol/hr/mg、50nmol/hr/mg、60nmol/hr/mg、70nmol/hr/mg、80nmol/hr/mg、90nmol/hr/mg、100nmol/hr/mg、150nmol/hr/mg、200nmol/hr/mg、250nmol/hr/mg、300nmol/hr/mg、350nmol/hr/mg、400nmol/hr/mg、450nmol/hr/mg、500nmol/hr/mg、550nmol/hr/mg或者600nmol/hr/mg。
在一些实施方案中，所述酶活性在所述腰区中增加。在某些实施方案中，在所述腰区中所述增加的酶活性至少约500nmol/hr/mg、600nmol/hr/mg、700nmol/hr/mg、800nmol/hr/mg、900nmol/hr/mg、1000nmol/hr/mg、1500nmol/hr/mg、2000nmol/hr/mg、3000nmol/hr/mg、4000nmol/hr/mg、5000nmol/hr/mg、6000nmol/hr/mg、7000nmol/hr/mg、8000nmol/hr/mg、9000nmol/hr/mg、或者10,000nmol/hr/mg。
在一些实施方案中，所述溶酶体贮积症伴有周边症状，并且所述方法进一步包括向所述受试者静脉施用所述替代酶。在某些实施方案中，所述静脉施用没有比每周施用更频繁(例如没有比两周一次，每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、或者每六个月一次更频繁)。在某些实施方案中，所述静脉施用没有比每月施用更频繁，例如每周两次、每周一次、每隔一周、或者每月两次。在一些实施方案中，静脉和鞘内施用在同一天执行。在一些实施方案中，所述静脉和鞘内施用不在彼此的一定时间内执行，例如不执行：在至少2天以内、在至少3天以内、在至少4天以内、在至少5天以内、在至少6天以内、在至少7天以内、或者在至少一周以内。在一些实施方案中，静脉和鞘内施用按照交替的时间表执行，例如每周一次、每隔一周、每月两次或者每月一次交替施用。在一些实施方案中，鞘内施用替代在施用时间表上的静脉施用，例如在每周一次、每隔一周、每月两次、或者每月一次进行静脉施用的时间表中，在该时间表中的每第三次或第四次或第五次施用可以用鞘内施用代替静脉施用。在一些实施方案中，静脉施用代替在施用时间表上的鞘内施用，例如在每周一次、每隔一周、每月两次、或者每月一次进行鞘内施用的时间表中，在该时间表中的每第三次或第四次或第五次施用可以用静脉施用代替静脉施用。在一些实施方案中，静脉和鞘内施用是连续地执行的，例如首先静脉施用(例如每周一次、每隔一周、每月两次、每月一次，给药持续两周、一个月、二个月、三个月、四个月、五个月、六个月或者一年或者更久)，然后鞘内施用(例如每周一次、每隔一周、每月两次、或每月一次给药，持续超过两周、一个月、二个月、三个月、四个月、五个月、六个月或者一年或者更久)。在一些实施方案中，首先执行鞘内施用(例如每周一次、每隔一周、每月两次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次给药，持续两周、一个月、二个月、三个月、四个月、五个月、六个月或者一年或者更久)，然后静脉施用(例如每周一次、每隔一周、每月两次、或每月一次给药，持续超过两周、一个月、二个月、三个月、四个月、五个月、六个月或者一年或者更久)。
在一些实施方案中，所述溶酶体贮积症伴有周边症状，并且所述方法包括鞘内施用所述替代酶，但不涉及向所述受试者静脉施用所述替代酶。在某些实施方案中，所述替代酶的所述鞘内施用减轻或者减少所述受试者酶替代缺陷的一种或多种周边症状。
在另一方面中，本发明提供了治疗Hunters综合症的方法，包括步骤：向有需要治疗的受试者以治疗有效剂量、鞘内施用重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)，并且施用间隔使得Hunters综合症的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面减轻，或者延缓发生。在一些实施方案中，所述Hunters综合症的至少一种症状或特征为：认知障碍；白质病变；在所述脑实质中扩张的血管周围间隙、神经节、胼胝体、和/或脑干；萎缩症；和/或脑室扩大。
在又一方面中，本发明提供了治疗异染性脑白质营养不良(MLD)病的方法，包括步骤：向有需要治疗的受试者鞘内施用治疗有效剂量的重组芳基硫酸酯酶A(ASA))，并且施用间隔使得所述MLD病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面减轻，或者延缓发生。在一些实施方案中，所述MLD病的至少一种症状或特征为：颅内压增高、脑外积水、在中枢和周围神经系统髓鞘中和在内脏器官中的硫酸糖脂积累、进行性的脱髓鞘、在所述CNS和PNS以内的轴突损失、和/或运动和认知功能障碍。
在又一方面中，本发明提供了治疗Sanfilippo综合症类型A(SanfilippoA)病的方法，包括步骤：向有需要治疗的受试者以治疗有效剂量、鞘内施用重组的乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)酶，并且施用间隔使得至少Sanfilippo A病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面减轻，或者延缓发生。.
在另一方面中，本发明提供了治疗Sanfilippo综合症类型B(SanfilippoB)病的方法，包括步骤：向有需要治疗的受试者以治疗有效剂量、鞘内施用重组的α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Naglu)，并且施用间隔使得Sanfilippo B病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面减轻，或者延缓发生。
在一些实施方案中，所述Sanfilippo A或者Sanfilippo B病的至少一种症状或特征是听力损失、言语发展障碍、运动技能缺陷、肌肉运动活动过度、进行性的认知障碍、攻击性和/或睡眠障碍。
在一些实施方案中，所述重组Naglu酶是包括Naglu和溶酶体靶向部分的融合蛋白。在某些实施方案中，所述溶酶体靶向部分是IGF-II。
在另一方面中，本发明提供了治疗球细胞脑白质营养不良(GLD)病的方法，包括步骤：向有需要治疗的受试者以治疗有效剂量、鞘内施用重组的β-半乳糖苷酶(GLC)，并且施用间隔使得所述GLD病的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面减轻，或者延缓发生。在一些实施方案中，所述GLD病的至少一种症状或特征是：易怒、抽搐、心智衰退、耳聋、失明、肌阵挛性癫痫发作、过度肌肉紧张、发育迟缓、发育技能的退化、过敏症、震颤、运动失调、痉挛状态、发作性严重呕吐、脑白质营养不良、大脑萎缩症、球细胞的发育受损和/或脱髓鞘。
在又一方面中，本发明提供了鞘内施用设备，包括流体进入端口；空心体，所述空心体具有与所述流体进入端口液体连通的第一流体孔口以及配置插入到脊髓中的第二流体孔口；和固定机构，所述固定机构用于固定所述空心体在所述脊髓中的插入。在一些实施方案中，所述固定机构包括安装在所述空心体表面的一个或多个球形门柄、以及可调节覆盖所述一个或多个球形门柄的缝合环。在一些实施方案中，所述流体进入端口是包括贮液囊。在某些实施方案中，所述流体进入端口是可植入的。在某些实施方案中，所述流体进入端口是可注射的端口。在一些实施方案中，所述流体进入端口是机械泵。
如在这个申请中使用的，所述术语“大约”和“约”是等价使用的。在本申请中使用的任何具有或不具有大约/约的数字，其意思是打算覆盖被在相关技术领域的普通技术人员所意识到的任何正常波动。
本发明的其它特征、目标和优点在下面的详细描述中是显而易见的。应该理解，尽管详细地描述，为了表明本发明的实施方案，仅仅是以解说的方式给出，而不是加以限制。现有技术的技术人员从所述详细的描述中，显而易见地得到在本发明范围以内的多种变化和修改。
附图概述
所述附图仅供说明的目的，而不是用于限制。
图1图解了具有固定机构的鞘内药物递送设备(IDDD)的示例图。
图2A描述了在患者体内的示例性位置，其中IDDD可以放置；图2B描述了鞘内药物递送设备(IDDD)的多种组件；以及图2C描述了在IT-腰部注射的患者体内的示例性插入位置。
图3描述了示例性结果，其概述了在成年猴中测试的媒介物。
图4描述了示例性结果，其图解了在hGalC的绝热板中(作为pH的函数)hGalC的稳定性。
图5描述了示例性结果，其图解了hGalC的比活性作为pH的函数
图6描述了示例性结果，其图解了hGalC的绝热板作为盐浓度的函数.
图7描述了示例性结果，其图解了GalC运行沉降速度，比较了在5mM磷酸钠(pH6.0缓冲剂)中的不同离子强度。图7A描述了示例性结果，其使用50mM NaCl和hGalC。图7B描述了示例性结果，其图解了150mMNaCl和hGalC。图7C描述了示例性结果，其图解了500mM NaCl和hGalC。图7D描述了示例性结果，其图解了150mM NaCl和小鼠GalC。
图8描述了示例性结果，其图解了GalC AUC性能作为盐浓度的函数(1mg/mL GalC，5mM磷酸钠，pH6.0)(Y轴＝s*g(s*)；X轴＝s*)。
图9描述了示例性结果，其图解了在通用缓冲液(pH6.0)中hGalC的系列稀释(Y-轴＝＜g(s*)/C0＞(1/svedberg)；X-轴＝s*(svedbergs)).
图10描述了示例性结果，其图解了GalC AUC性能作为pH的函数(1mg/mL，3mM柠檬酸盐、磷酸盐和硼酸盐缓冲液，具有50mM NaCl)。
图11描述了示例性结果，其图解了从WDA分析得到的基线读数，在最高浓度、pH6.0、5mM磷酸钠和150mM NaCl中。
图12描述了示例性结果，其图解了从WDA分析得到的强调读数，在最高浓度、pH6.0、5mM磷酸钠和150mM NaCl中。
图13图形化地比较并覆盖了基线和强调的GalC样品。
图14描述了示例性结果，其图解了存在1％NaTC中的hGalC的系列稀释。
图15描述了示例性结果，其图解了存在1％NaTC中的hGalC的系列稀释(1.0mg/mL和0.3mg/mL)。
图16描述了示例性结果，其图解了在不同的缓冲液和pH中的hGalC(1mg/mL)的固有荧光。
图17描述了示例性结果，其图解了hGalC的圆形二色性作为pH的函数。
图18描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、血液和红血球中的放射性的组平均浓度。
图19描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药后，雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、脾脏中的放射性的平均组浓度。
图20描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一静脉弹丸注射后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、脾脏中的所述放射性的平均组浓度。
图21描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药和静脉弹丸注射之后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、心脏、肾脏、肝脏、肺脏、脾脏中的放射性的平均组浓度。
图22描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清和多种组织(脂肪组织(肾脏脂肪)、肾上腺、骨(大腿骨)、肌肉(骨骼的)、坐骨神经))中的放射性的平均浓度。
图23描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一静脉弹丸注射后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清和多种组织(脂肪组织(肾脏fast)、肾上腺、骨(大腿骨)、肌肉(骨骼的)、坐骨神经))中的放射性的平均浓度。
图24描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药和静脉弹丸注射之后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清和组织(脂肪组织(肾脏fast)、肾上腺、骨(大腿骨)、肌肉(骨骼的)、坐骨神经))中的放射性的平均浓度。
图25描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药之后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、脑脊髓液和多种其它组织中的放射性的平均浓度。
图26描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一静脉弹丸注射之后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、脑脊髓液和多种其它组织中的放射性的平均浓度。
图27描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药和静脉弹丸注射之后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、脑脊髓液和组织中的放射性的平均浓度。
图28描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药之后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清和组织中的放射性的平均浓度。
图29描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一静脉弹丸注射之后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清和组织中的放射性的平均浓度。
图30描述了示例性结果，其图解了在125I-hGalC的单一鞘内给药和静脉弹丸注射之后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清和组织中的放射性的平均浓度。
图31描述了示例性结果，其图解了rmGalC的IP施用减少了在twitcher小鼠中的脑鞘氨醇半乳糖苷水平。数据表示平均值±SEM，n＝4只小鼠每个处理组。
图32描述了示例性结果，其图解了增加的存活率与仅ICV和ICV/IPrmGalC疗法.
图33描述了示例性结果，其图解了在twitcher小鼠中，在rmGalC的ICV和ICV/IP注射后，脑鞘氨醇半乳糖苷显著减少。
图34描述了示例性结果，其图解了在用40ug的rmGalC处理的twitcher小鼠中观察到组织学标记物的改善。胶质纤维酸性蛋白(GFAP)作为星形胶质细胞标记物使用。Iba1作为小胶质细胞/巨噬细胞标记物使用。溶酶体相关膜蛋白-1(LAMP-1)作为溶酶体标记物使用。
图35描述了示例性结果，其图解了在rmGalC或媒介物的单一ICV注射后，鞘氨醇半乳糖苷再累积。
图36描述了示例性结果，其图解了在用单一ICV注射rmGalC(以PND19/20)处理的twitcher小鼠中的存活率。数据表示n＝8每组。
图37描述了示例性结果，其图解了用rmGalC和rhGalC进行ICV/IP处理小鼠的存活率。
图38描述了示例性结果，其图解了单一ICV注射rmGalC和rhGalC处理小鼠的步态分析。
图39描述了示例性结果，其图解了在twitcher小鼠中对rmGalC或rhGalC的抗原应答。
图40描述了示例性结果，其图解了在天然的和rhGalC-处理的GLD狗的所述CSF中的鞘氨醇半乳糖苷水平。
图41描述了示例性结果，其图解了用组1多克隆抗体在所述大脑中IT注射GalC的IHC染色。
图42描述了示例性结果，其图解了用组2抗体在所述大脑中IT注射GalC的IHC染色。
图43描述了示例性结果，其图解了用小鼠单克隆抗体在所述大脑中IT注射GalC的IHC染色。
图44描述了示例性结果，其图解了用小鼠单克隆抗体在所述大脑中IT注射GalC的IHC染色。
图45描述了示例性结果，其图解了用小鼠单克隆抗体在所述肝脏中IT注射GalC的IHC染色。
图46描述了示例性结果，其图解了用组2多克隆抗体在所述肝脏中IT注射GalC的IHC染色。
图47描述了示例性结果，其图解了在所述脑中的平均GalC活性。
图48描述了示例性结果，其图解了在所述肝脏中的平均GalC活性。
图49描述了示例性结果，其图解了在所述脑中GalC免疫染色，10X。
图50描述了示例性结果，其图解了在所述脑中GalC免疫染色，40X。
图51描述了示例性结果，其图解了活化小胶质细胞的Iba染色，40X。
图52描述了示例性结果，其图解了在所述脑中LFB/PAS染色，10X。
图53图解了示例性的I2S IHC，证明了：在鞘内注射3剂量的I2S后，在所述大脑和小脑皮层(包括覆盖所述脑(箭头头部)表面的一层脑膜细胞)中的神经元(箭头)中检测到I2S。在2剂量注射的脑中，I2S IHC染色较弱(照片未显示)。在媒介物对照动物的所述脑中，对于任何类型的细胞，没有观察到阳性I2S染色，40X。
图54描述了在鞘内-腰椎I2S注射后，在IKO小鼠的脑中的病理的示例性揭露。H&E染色的脑组织显示了(在所述媒介物对照动物中)大量的细胞储存液泡(箭头)。在2剂量(照片未显示)和3剂量注射小鼠中，在整个脑中，细胞液泡化都减少。在所述3剂量注射小鼠中，发现显著的减少(40X)。
图55描述了LAMP-1示例性的免疫组织化学染色，在2剂量(照片未显示)和3剂量的I2S治疗之后，在所述脑中，溶酶体活性有显著的减少(与媒介物对照小鼠相比)。所述减少的特征为：在所述整个脑所述区域中，LAMP-1阳性细胞的数量较少、以及染色强度变较轻(40X)。
图56图解了示例性的形态计量结果，通过比较在野生-类型(WT)、媒介物未处理的、以及I2S(2和3剂量)的小鼠之间的平均LAMP-1阳性区域(在所述大脑皮层(皮层)、尾状核(CP)、丘脑(TH)、白质(WM)和小脑(CBL)中)，证实了：在被评估脑的所有区域中的所述LAMP-1阳性染色中，有显著的减少。数据以平均值±s.d显示。#＝P＜0.05；*＝P＜0.01；**＝P＜0.001。
图57描述了脑细胞示例性的电子显微照片，其示出了在超微结构水平的病理改善。媒介物处理小鼠神经元具有层状的内含物、斑马体样结构和含有贮存颗粒材料(插入)的液泡，其在I2S注射的小鼠中减少。媒介物处理小鼠的少突胶质细胞示出了大的低电子密度贮存粒(箭头)，并且I2S-注射小鼠的少突胶质细胞具有最小的液泡化。比例尺：在神经元中，2μm；在少突胶质细胞中，500nm。
图58描述了示例性免疫组织化学结构，证明：在鞘内注射3剂量的I2S后，在所述肝脏的窦状腺细胞中，检测到I2S。在2剂量注射的肝脏中，2S IHC染色较弱(照片未显示)。在媒介物对照动物的所述肝脏中，没有观察到阳性I2S染色(40X)。
图59描述了来自肝脏的示例性组织。通过H&E染色揭示了严重的细胞液泡化和异常高的溶酶体活性，并且在媒介物对照动物中发现强烈的LAMP-1免疫染色(与WT类型相比)。在用2照片未显示)或者3剂量的I2S治疗进行鞘内治疗后，发现细胞液泡化和LAMP-1免疫染色显著减少。H&E染色揭示了细胞质内液泡化几乎完全消失，伴随接近正常的肝脏细胞结构(H&E，40X；LAMP-1，20X)。
图60描述示例性的组织，示出了3mg治疗组动物的大脑。在脑膜细胞中观察到阳性I2S染色(4X)。
图61描述了示例性的组织，示出了30mg治疗组动物的大脑。在神经元和脑膜细胞中观察到阳性I2S染色(4X)。
图62描述了示例性的的组织，示出了100mg治疗组动物的大脑。在神经元和脑膜细胞中观察到阳性I2S染色比在3和30mg处理动物中更强(4X)。
图63描述了示例性的的组织，示出了150mg治疗组动物的大脑。观察到大群体的神经元，并且是I2S阳性，伴随强烈阳性脑膜细胞。
图64描述了示例性的组织，示出了I2S阳性的神经元和胶质细胞、以及脑膜细胞(在所述大脑的层I以内)，在30mg治疗组动物中(40X)。
图65描述了示例性的组织，示出了I2S阳性的神经元和胶质细胞、以及血管周细胞(在所述大脑的层III以内)，在30mg治疗组动物中(40X)。
图66描述了示例性的组织，示出了I2S阳性的神经元和胶质细胞(在所述大脑的层VI以内，靠近白质)，在30mg治疗组动物中(40X)。
图67描述了示例性的组织，示出了强烈阳性的I2S染色，在150mg治疗组动物的神经元中(100X)。
图68描述了示例性的组织，示出了颈部脊髓的I2S免疫染色，在150mg治疗中(4X)。
图69描述了示例性的组织，示出了腰椎脊髓的I2S免疫染色，在150mg治疗组动物中(4X)。
图70描述了示例性的组织，示出了meningial细胞、胶质细胞和外延的/周边的/神经内膜(结缔组织细胞)的强烈阳性I2S免疫染色，在150mg治疗组动物的所述腰椎切片中(40X)。
图71描述的图像示出了在150mg治疗组动物的腰椎脊髓中的神经元为强烈的I2S阳性(40X)。
图72描述来自肝脏的示例性结果(从3mg治疗组动物)。只有窦状腺细胞为I2S阳性(40X)。
图73描述来自肝脏的示例性结果(从30mg治疗组动物)。窦状腺细胞和肝细胞为I2S阳性(40X)。
图74描述来自肝脏的示例性结果(从100mg治疗组动物)。在窦状腺细胞和肝细胞中，I2S免疫染色为强烈阳性(40X)。
图75描述来自肝脏的示例性结果(从150mg治疗组动物)。在窦状腺细胞和肝细胞中，识别I2S染色为强烈阳性(40X)。
图76描述来自心脏的示例性结果(从3mg治疗组动物)。I2S免疫染色为阴性(40X)。
图77描述来自心脏的示例性结果(从30mg治疗组动物)。间质细胞为I2S阳性(40X)。
图78描述来自心脏的示例性结果(从100mg治疗组动物)。观察到I2S的阳性间质细胞染色(40X)。
图79描述来自心脏的示例性结果(从150mg治疗组动物)。观察到I2S的阳性间质细胞染色(40X)。
图80描述来自肾脏的示例性结果(从3mg治疗组动物)。I2S免疫染色为阴性(40X)。
图81描述来自肾脏的示例性结果(从30mg治疗组动物)。血管小球和间质细胞为I2S阳性。
图82描述来自肾脏的示例性结果(从100mg治疗组动物)。观察到血管小球和间质细胞I2S染色增加(40X)。
图83描述来自肾脏的示例性结果(从150mg治疗组动物)。观察到近端肾小管、血管小球和间质细胞的阳性I2S染色(40X)。
图84图解了免疫组织化学(IHC)研究的结果，其评估了每周使用剂量的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)的食蟹猴CNS组织。正如根据(IHC)所测定的，在整个所述CNS中有细胞沉积。在所述灰质中I2S被检测到，以剂量依赖型的方式，在所有组的(大脑、小脑、脑干和脊髓的)所述神经元中。在所更高剂量组的表面灰质中，大量的大脑神经元对I2S染色为阳性，在所述表面皮层中(图84A)。I2S在神经元中检测到(在所述丘脑(图84B)、海马(图84C)、尾状核(图84D)和脊髓(图84E)中)。Meningial和血管周细胞也为I2S染色阳性(图84F)。所述确定的比例尺对应于25um。
图85通过图表地比较了艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)在所述颅池和脊髓池中的清除率，通过标绘I2S在这种池中相对于施用后的时间的量。
图86图解了鞘内施用艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)至非人类灵长类，在6个月时间内的剂量依赖的灰质沉积。所述图解的染色强度对应于艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶在所述丘脑中的累积。在目前的图86中，所述细胞核通过DAPI复染，并且似乎为蓝色，所述蛋白质(I2S)似乎为绿色。
图87图解了鞘内施用艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)至非人类灵长类，在单一注射后和在多注射后，在6个月时间段内的剂量依赖的累积。所述图解的染色强度对应于I2S蛋白质在所述大脑皮层的累积。
图88表明了艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)的细胞定位(在灵长类的整个所述大脑)。图88A图解了脑组织(从所述灵长类大脑提取)的横截面剖视图，而图88B图解了所述范围的特定区域对应于在图88A中识别切片的：白质组织的三个区域(用W1、W2和W3指代)，接近脑室的白质(VW)和表面灰质(SG)组织。
图89A-D图解了在6个月的时间段每月注射后，鞘内施用艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)至灵长类的神经元和少突胶质细胞细胞、以及轴突连接。特别地，图89A、图89B、图89C和图89D说明了灵长类脑组织的细丝染色，在鞘内施用艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)，并分别对应于所述三个区域的白质(W1、W2和W3)、和表面灰质区域(SG)，在图87B中识别。图89A图解了在所述白质(W1)组织中，鞘内施用I2S的少突胶质细胞吸收。图89B和图89C分别图解了在所述W2和W3白质组织中的少突胶质细胞吸收和轴突连接。图89D图解了在所述表面灰质组织中(SG)，鞘内施用I2S的神经元吸收。
图90图解了非人类灵长类，在靠近脑室的白质(VW)中，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶的细胞识别(在顶部左侧的箭头)。如在重叠图像中所描述的(在底部右侧的箭头)，所述艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶与髓磷脂不相关联(顶部右侧)。在存在的所述图90中，所述核通过DAPI(底部左侧)蛋白质(I2S)复染，在顶部左侧方框出现。
图91图解了健康比格犬组织中的染色，所述比格犬被脑室内地(ICV)或者鞘内地(IT)施用单一注射的艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)。如在图像a-h中描述的，I2S在整个所述灰质(IT和ICV组两者都)广泛地分布，如通过免疫组织化学(IHC)测定的。图像a和b图解了，在所述大脑皮层中，神经元对于I2S为阳性，在所有6个神经元层中，从所述表面分子层至所述深部内层(IT和ICV组两者都)。图像c和d图解了，在所述IT和ICV组中的小脑皮层中，在神经元(包括浦肯野细胞)中检测到I2S。相似地，图像e和f图解了，在IT和ICV组中，在所述海马中都有大量的神经元对于I2S为阳性。最终，图像g和h表明，(在包括IT和ICV组两者中)I2S-阳性神经元在所述丘脑和尾状核中发现。在所述存在的图91中，I2S染色用箭头指示。
图92比较性地图解了艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶基因敲除小鼠(IKO)的胼胝体组织，所述小鼠未处理、或者被鞘内施用I2S。如所描述的，在所述I2S-处理IKO小鼠的胼胝体和穹窿组织中，所述处理的IKO小鼠表现某种溶酶体贮积症的细胞液泡化特征减少。
图93A图解了存在的溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)(一种溶酶体疾病病理学生物标记物)的显著减少，在所述处理IKO小鼠的表面大脑皮层(图93A)中，相对于所述未处理IKO对照小鼠(图93B)，在20X和40X的放大倍数。
图94描述了示例性的鞘内药物递送设备(IDDD)。
图95描述了示例性的低调鞘内植入入口系统。
图96描述了示例性的鞘内药物递送设备(IDDD)。
图97描述了示例性的鞘内药物递送设备(IDDD)，其允许在家施用以进行CNS酶替代治疗(ERT)。
图98是示例性的图解，其示出了：在神经元(浦肯野细胞)中，在单一大脑内注射艾杜硫酶(idursulfase)的液泡化影响。
图99是示例性的图解，其示出了：在所述脑中的I2S活性(与剂量和区域相关)。
图100是示例性的图解，其示出了艾杜硫酸酯(在不同深度的大脑皮层)的免疫组织化学定位。
图101是示例性的图解，其示出了在猴子脊髓中的I2S活性，在鞘内给药艾杜硫酶后。
图102为示例说明，显示了鞘内注射艾杜硫酶后，猴子肝脏、心脏和肾脏的I2S活性。
图103描述了增加的Hunter-IT试验程序的示例性图表。
图104为示例性的图解，显示了在30mg剂量后，在脑组织中的各个部分的I2S浓度测量值。同样地，不同图对应于不同的测量时间。
图105为示例性的图解，显示了在施用后随着时间的推移，以各种产品浓度通过不同施用途径的I2S浓度的测量值。
如图106描述了在t＝5小时，IV、IT-L，或ICV给药后，食蟹猴中124I-标记的艾杜硫酶-IT的PET显像。
图107为示例性的图解，显示了静脉内施用后，血清中的ASA浓度数据。
图108为示例性的图解，显示了IT腰椎施用后，血清中的ASA浓度数据。
图109为示例性的图解，显示了IV施用后，CSF中的ASA浓度。
图110为示例性的图解，显示了IT-腰部施用后，CSF中的ASA浓度。
图111描述了在治疗后，脑组织、脑膜、浸润(中、高剂量组，两种性别)中的示例性显微照片。
图112描述了在治疗后，脑组织、脑膜、浸润(中、高剂量组，两种性别)中的另一示例性显微照片。
图113描述了在治疗后，脑组织、血管周围，浸润(中等剂量雄性，高剂量雌性)的示例性显微照片。
图114描述了用rhASA1治疗后，免疫耐受MLD小鼠脊髓的示例性Alcian蓝染色以及由Alcian蓝染色动物颈部脊髓(在1、8、15和22天接受鞘内注射rhASA，剂量为520mg/kg的脑重量或媒介物对照)所确定的硫脑苷酯减少的说明。正如所表明的那样，用鞘内注射rhASA治疗导致减少硫脑苷酯在脊髓中的积累，包括在所述脊髓的颈部区域。
图115示出了经rhASA1治疗的免疫耐受MLD小鼠的Alcian蓝染色脊髓切片的示例性形态分析；以及如形态分析物所确定的，在全脊髓(T-脊髓)、总灰质(T-GM)、腰椎灰质(L-GM)、颈椎灰质(C-GM)、总白质(T-WM)，腰椎白质(L-WM)，和脊髓白质(C-WM)中的Alcian蓝光密度的结果说明。正如所表明的那样，与媒介物对照相比，用rhASA治疗的动物，观察到统计学显著的Alcian染色减少。
图116描述了用rhASA1治疗的免疫耐受MLD小鼠白质(海马伞)LAMP染色的示例性减少，描绘的示例性结果说明了在海马伞中如免疫组化法测定的LAMP-1水平。放大倍率＝20X。正如所表明的那样，用rhASA鞘内注射治疗导致在脑白质中LAMP-1的减少。
图117示出了以rhASA1治疗的免疫耐受MLD小鼠脑的LAMP染色的示例性形态计量分析，并且结果说明了用20mg/kg静脉内rhASA、300mg/kg脑重量鞘内rhASA、520mg/kg脑重量静脉内的rhASA治疗的动物胼胝体(CC)、海马伞(F)、小脑白质(CB-WM)和脑干(BS)，或媒介物对照的LAMP-1染色强度。
图118为示例性说明，显示了在每隔一周(EOW)IT给药为期6个月(主要的尸检)后，媒介物给药的青少年食蟹猴脑钻孔的ASA浓度。
图119为示例性的图解，显示了在rhASA1的EOW IT给药(1.8mg/剂为期6个月(主要的尸检))后，青少年食蟹猴脑钻孔的ASA浓度。
图120为示例性的图解，显示了rhASA1的EOW IT给药(6.0mg/剂为期6个月(主要的尸检))后，青少年食蟹猴脑钻孔的ASA浓度。
图121为示例性的图解，显示了rhASA1的EOW IT给药(18.6mg/剂为期6个月(主要的尸检))后，青少年食蟹猴脑钻孔的rhASA浓度。
图122为示例性的图解，显示了rhASA1的EOW IT给药(PBS-对照)(为期6个月(主要的尸检))后，青少年食蟹猴脑钻孔的rhASA浓度。
图123为示例性的图解，显示了媒介物的EOW IT给药(为期6个月(主要的尸检))后，青少年食蟹猴脑钻孔的rhASA浓度。
图124为示例性的图解，显示了rhASA1的EOW IT给药(1.8mg/剂为期6个月(主要的尸检))后，青少年食蟹1猴脑钻孔的rhASA浓度。
图125为示例性的图解，显示了rhASA1的EOW IT给药(6.0mg/剂为期6个月(主要的尸检))后，青少年食蟹猴脑钻孔的rhASA浓度。
图126为示例性的图解，显示了rhASA1的EOW IT给药(18.6mg/剂为期6个月(主要的尸检))后，青少年食蟹猴脑钻孔的rhASA浓度。
图127为示例性的图解，显示了从选定的脑表面钻孔的rhASA浓度，对于设备对照、媒介物、1.8mg、6.0mg和18.6mg处理的动物。(单独的雄性和雌性、设备对照数据从恢复的尸检获得，所有其它数据从主要的尸检获得)。
图128为示例性的图解，显示了从选定的脑深部白质区域钻孔的rhASA浓度，对于设备对照、媒介物、1.8mg、6.0mg和18.6mg处理的动物。(单独的雄性和雌性、设备对照数据从恢复的尸检获得，所有其它数据从主要的尸检获得)。
图129为示例性的图解，显示了从选定的脑深部灰质区域钻孔的rhASA浓度，对于设备对照、媒介物、1.8mg、6.0mg和18.6mg处理的动物。(单独的雄性和雌性、设备对照数据从恢复的尸检获得，所有其它数据从主要的尸检获得)。
图130为示例性的图解，显示了从多个区域的选定钻孔中的rhASA浓度，对于设备对照、媒介物、1.8mg、6.0mg和18.6mg处理的动物。(联合的雄性和雌性、设备对照数据从恢复的尸检获得，所有其它数据从主要的尸检获得)。
图131为示例性的图解，显示了在青少年食蟹猴的脊髓切片中rhASA的浓度，在EOW IT给药为期6-个月(恢复期尸检)。
图132为示例性的图解，显示了在青少年食蟹猴的肝脏中rhASA的浓度，在EOW IT给药为期6-个月(047-021)(恢复期尸检)。
图133为示例性的图解，显示了脑钻孔的解剖学定位：在所述皮层下的WM、脑室周围WM(以及深部白质)、以及皮层下的WM。
图134为示例性的图解，显示了脑钻孔的解剖学定位：在胼胝体和胼胝体周围皮层下的WM、内囊-GPi、内囊-尾状核、深部白质、皮层下的WM和皮层、豆状核、和颞皮层下的WM和皮层。
图135为示例性的图解，显示了脑钻孔的解剖学定位：在所述深部灰质、深部WM(额叶脑室周围和皮层下的)、以及皮质下白质和皮层-表面的失状。
图136为示例性的图解，显示了脑钻孔的解剖学定位：在胼胝体和胼胝体周围皮层下的WM、深部皮层下的WM、深部灰质、脑室周围WM，皮层下的WM和海马。
图137为示例性的图解，显示了脑钻孔的解剖学定位：在胼胝体和和深部WM中。
图138为示例性的图解，显示了脑钻孔的解剖学定位：在皮层下的WM-枕骨脑叶和小脑白质，包括齿状核(WM)。
图139A-G图解在从成年和青少年食蟹猴的脑组织钻孔提取的组织中，重组人类芳基硫酸酯酶A(ASA)的浓度，其被施用媒介物、1.8mgrhASA或者18.6mg rhASA。图139A-G的每个对应于在图134中描述的脑组织区域。
图140A和图140B为示例性的图解，示出了在从成年和青少年食蟹猴的脑组织深部白质(图140A)或深部灰质(图140B)中，其被鞘内施用(IT)或者脑室内施用(ICV)，重组人类芳基硫酸酯酶A(ASA)的浓度的比较。
图141A显示了自青少年(年龄＜12个月龄)食蟹猴(IT-施用18.6或1.8mg剂量的重组人芳基硫酸酯酶A(rhASA))钻孔的多个组织检测到的ASA浓度。如图140A-B二者所示，递送到组织的ASA浓度在2.5ng/mgrhASA之内、或否则超过其的目标治疗浓度。脑组织的所述解剖区域的对应于每一个在图140A和图140B所示的钻孔编号：皮层下的白质(1)；脑室周围白质和深部白质(2)；皮层下白质(3)；皮层下白质(4)；内囊(5)；内囊尾状核(6)；深部白质(7)；皮层下白质和皮质(8)；豆状核(9)；颞皮层下白质和皮质(10)，深部灰质(11)，深部灰质(12)，额叶脑室周围&皮层下的(13)；皮层下白质，皮质表面的perifalxian(14)；胼胝体和胼胝周围皮层下白质(15)；深部皮层下的白质(16)；深部灰质(17)；深部灰质(18)；脑室周围白质(19)；深部皮层下的白质(20)；海马(21)；胼胝体(22)；深部白质(23)；皮层下的白质，枕骨脑叶(24)；和小脑白质(25)。
图142A图解了从IT-施用1.8mg的ASA的食蟹猴提取的深部白质组织的区域。图142B图解了深部白质组织的免疫染色，以及在相关细胞中的ASA分布。在图142B中，所述蛋白质(ASA)在所述右侧底部方框中指出。图142C图解了所述IT-施用ASA，其显示了：在食蟹猴深部白质组织的细胞器共定位，特别是在溶酶体中。在图142C中，所述ASA免疫染色在所述顶部左侧方框中指出。
图143比较了：在IT-或者ICV-施用这种标记ASA至食蟹猴之后的24小时，124I-标记的芳基硫酸酯酶A(ASA)的分布(使用PET扫描)。
图144图解了在紧随ICV施用至食蟹猴之后，124I-标记的ASA的分布，并且比较了在2-5小时以内IT-施用的124I-标记的ASA的分布。如所演示的，IT-施用递送所述124I-标记的ASA至与所述ICV施用显示相同的初始房室(池和近端脊柱)。
图145描述了在小鼠模型中，示例性的ICV和IT施用。
图146A描述了示例性的结果，其说明了在6个月的给药后，HNS作为时间的函数的CSF浓度(在1.5、4.5和8.3mg剂量)。图146B详述了示例性的结果，其说明了在所述CSF中的抗HNS浓度，在为期6个月的(在1.5、4.5和8.3mg剂量，在猴子中)IT施用之后。显示的数据组合了雄性和雌性。图146C详述了示例性的结果，其说明了在所述CSF中的抗HNS浓度，在为期6个月的(在1.5、4.5和8.3mg剂量，在猴子中)IT施用之后(在6个月的给药之后)。显示的数据组合了雄性和雌性。所述两个最高浓度(32,205ng/mL和15,467ng/mL)，在IT给药6(在8.3mg的HNS)之后，被从绘图排除，因为在预给药6没有采集到CSF样本。
图147描述了示例性结果，其说明了来自所述脑的脑膜和软组织的组织切片的代表性图像(用苏木精和曙红染色)。图147A描述了示例性结果，其说明了在DC猴子中，嗜中性细胞局部浸润至IT导管的低-能量视野。图147B描述了示例性结果，其说明了在高剂量(8.3mg/剂)猴子的脑膜中，嗜酸性细胞浸润的高能量视野；浸润的总体严重程度于所述中等剂量(4.5mg/剂)组相似(未显示)。图147C描述了示例性结果，其说明了低剂量(1.5mg/剂)猴子的高能量视野，其显示了在血管周空间(脑实质)中的嗜酸性细胞。图147D描述了示例性结果，其说明了低剂量猴子(1.5mg/剂)，其显示了在血管周空间和邻近软组织中的嗜酸性细胞。图147E描述了示例性结果，其说明了在低剂量组动物的脊髓软组织(通过箭头表示)中的嗜酸性细胞；在所述区域中的神经元是正常的。图147F描述了示例性结果，其说明了在低剂量(1.5mg/剂)猴子中，嗜酸性细胞和小胶质细胞区域(箭头表明嗜酸性细胞；所述方框表明小胶质细胞的区域)。在所述神经元中有几个大的神经元，所有这些是正常的。比例尺：200um。
图148描述了示例性结果，其说明了在猴子脊髓和脑中的HNS酶活性。图148A/B描述了示例性结果，其说明了在(A)雄性和(B)雌性猴子的脊髓中的活性。切片-3＝腰椎，切片3，6＝胸部的，以及切片9＝颈部的；0＝导管尖端。图148C/D描述了示例性结果，其说明了在(C)雄性和(D)雌性猴子的脑中的HNS活性。切片从吻端至尾端进行编号(3至15)。所有组织样本的手机在所述末次给药后的约24小时，或者在所述末次给药的4周(对于所述恢复期动物)。DC，设备对照。所述数据呈现形式为平均值±SEM，n＝4猴子(每个治疗组)。
图149描述了示例性结果，其说明了在猴子脑和肝脏中的酶活性。图149A描述了示例性结果，其说明了在所述高剂量(8.3mg/剂)组猴子脑中的HNS活性分布。显示了：所述脑的表面、深部、和非常深部(脑室周围)区域的活性倍数-变化，与内源性水平(DC组)的比较。所有的组织样品的收集，在末次给药后的约24小时，或者在末次给药的4周(对于恢复期动物)。所述数据呈现以平均值±SEM，n＝6猴子(两个性别)，脑切片6和9。两只猴子的数据没有包括在内；在尸检时所述导管被发现不通畅。图149B显示了在猴子肝脏中的HNS活性。所有组织样本的收集，在所述末次给药后的约24小时，或者在所述末次给药后的4周(对于恢复期动物)。DC，设备对照。Rec，恢复期。所述数据呈现形式为平均值±SEM，n＝4猴子(每个治疗组)；除了所述低剂量(4.5mg/剂)雌性组(n＝3)。
图150描述了示例性结果，其说明了在青少年食蟹猴中的HNS定位：3-个月中间时期队列。图150A描述了示例性结果，其说明了媒介物对照动物(0mg/剂)的小脑对于HNS免疫染色为阴性；20x放大倍数。图150B描述了示例性结果，其说明了低剂量(1.5mg/剂)的小脑，其显示了：最小阳性染色限制于所述分子层；20x放大倍数。图150C描述了示例性结果，其说明了中等剂量(4.5mg/剂)动物的小脑，其显示了在所述外部颗粒层中的最小染色；20x放大倍数。图150D描述了示例性结果，其说明了高剂量(8.3mg/剂)动物的小脑中的中度染色，包括分子层、外部颗粒层、以及浦肯野细胞；20x放大倍数。
图151描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述头部区域中的HNS浓度随时间(在所述第一个20分钟中)进行标绘。
图152描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述脑中的HNS浓度随时间进行标绘。
图153描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述脑区域中的HNS浓度随时间进行标绘。
图154描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述头部区域中的HNS浓度随时间进行标绘。
图155描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述近端脊柱中的HNS浓度随时间进行标绘。
图156描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述中段脊柱中的HNS浓度随时间进行标绘。
图157描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述远端脊柱中的HNS浓度随时间进行标绘。
图158描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述肝脏中的HNS浓度随时间进行标绘。
图159描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将在所述脑中的HNS浓度随时间进行标绘，单个(顶部)以及平均值±SD(底部)。
图160描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将所述肝HNS浓度随时间进行标绘，单个(顶部)以及平均值±SD(底部)。
图161描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将所述肾脏HNS浓度随时间进行标绘，单个(顶部)以及平均值±SD(底部)。
图162描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将所述心脏HNS浓度随时间进行标绘，单个(顶部)以及平均值±SD(底部)。
图163描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将所述皮肤HNS浓度随时间进行标绘，单个(顶部)以及平均值±SD(底部)。
图164描述了示例性的研究，在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将所述脑HNS浓度随时间进行标绘(顶部)；以及在所述脑中非-房室PK参数的比较(底部)。
图165描述了示例性的研究在IT给药124I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)之后，将所述肝脏HNS浓度随时间进行标绘(顶部)；以及在所述肝脏中非-房室PK参数的比较(底部)。
图166图解示例性的来自正常人类初级纤维细胞，其被用于rhNaglu和Naglu-IGFII的细胞内在化研究。rhNaglu的细胞吸收是最小的，而Naglu-IGFII的细胞吸收更明显。Naglu-IGFII内在化的饱和曲线表明了受体介导的吸收。这种吸收被IGFII抑制，但不被甘露糖-6-磷酸抑制。
图167描述示例性的共聚焦显微镜研究的结果，其使用Sanfilippo B受试者的成纤维细胞(GM01426)。观察到：Naglu-IGFII的广泛内在化，以及Naglu-IGFII与Lamp-1的共定位。
图168为示例性的图解，其显示了在野生类型(WT)、Naglu-/-(KO)和杂合体Naglu+/-(Het)小鼠中的Naglu活性。Naglu的总缺陷在SanfilippoB小鼠的脑、肝脏、肾脏和脾脏中观察到。
图169描述了小鼠小脑的顶面观和侧视图，表明了组织学分析脑池内(IC)注射位点和剖切平面。中间的显微照片，小鼠脑的横向切片视图以1x级数。方框的区域表明在所述底部的显微照片中，所述范围为4x显微图像。底部的显微照片，4x图像的组织学切片。方框A和B表明了所述范围为40x显微图像，在图170和图171中。
图170描述了在脑池内注射(IC)后的7天，在Sanfilippo B小鼠中示例性的免疫组织化学，40x。rhNaglu和Naglu-IGFII(在神经元中以及在胶质细胞中)都表现广泛的细胞吸收，并且所述分布和细胞吸收模式在所述两个蛋白质之间非常相似。(抗-人类Naglu单克隆抗体)。
图171描述了大脑皮层的示例性LAMP-1免疫染色，在40x放大倍数。与所述野生类型小鼠的脑相比，观察到在所述媒介物处理的Sanfilippo B小鼠中观察到溶酶体贮积增加，如所述增加的LAMP-1免疫染色阳性斑点所演示的。rhNalgu和Naglu-IGFII处理的Sanfilippo B小鼠的脑都表现溶酶体贮积的减少，这与wt小鼠非常相似。
图172A图解了在IT-施用Naglu的Naglu-缺陷型小鼠的白质组织中，细胞液泡化普遍地减少(相对于被施用媒介物的所述相同Naglu-缺陷型小鼠)。图172B图解了在鞘内施用Naglu的Naglu-缺陷型小鼠的白质组织中，溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)免疫染色显著减少(相对于被施用媒介物的所述相同Naglu-缺陷型小鼠)。
图173从数量上图解并比较了在被施用Naglu的Naglu-缺陷型小鼠(相对于被施用媒介物的所述野生类型、以及Naglu-缺陷型小鼠)的大脑皮层、尾状核和豆状核(CP)、丘脑(TH)、小脑(CBL)和白质(WM)中测量的LAMP浓度。在鞘内施用所述三剂量的Naglu后，在7天的过程中，在被分析的每个脑组织区域的所述LAMP-阳性区域进一步地减少(图173A)(相对于2剂量的Naglu，在2周的过程中(图173B))。
图174图解了示例性正中矢状位解剖图，其中人类CNS在该图中作为参考使用，以表明在wt插管的大鼠中的注射位点。箭头表面IT注射在所述脊髓和所述大脑皮层区域中的大约解剖学定位，其中组织从免疫组织化学采集。
图175图解了在IT注射后，在所述脑中示例性的Naglu活性。在Naglu-TAT和Naglu-IGFII注射的wt大鼠的脑中，Naglu活性显著较高。
图176描述了在IT注射后24小时，(rhNaglu、Naglu-TAT、Naglu-IGFII、Naglu-kif和PerT-Naglu处理的wt插管的大鼠)的大脑皮层的示例性Naglu免疫染色，20x。Naglu-IGFII是表现出良好地广泛分布至所述脑实质中的唯一蛋白质。被细胞吸收进入神经元和胶质细胞中，这在Naglu-IGFII处理大鼠中也是显著的。另一方面，在rhNaglu、Naglu-TAT、Naglu kif和PerT-Naglu处理组中，所述蛋白质保留在所述脑膜(M)中。
图177描述了来自图176的选定切片的示例性高能量放大。上面的面板，在所述rhNaglu处理的wt插管的大鼠中，rhNaglu保持在所述脑膜(M)，在所述脑的软组织中没有发现阳性染色。下面的面板，在Naglu-IGFII处理的wt插管的大鼠中，观察到良好地广泛分布进入所述脑实质，并且在神经元和胶质细胞中观察到细胞吸收。
图178图解了，在IT注射后的24小时，在所述脑和肝脏中的示例性Naglu活性。在所述三个组之间，在所述脑中的Naglu活性没有表现出显著的差异，在所述肝脏中对于Naglu活性，所述相同是真实的。这个结果表明在所述脑和肝脏中，Naglu活性被大程度地检测到，由于末次注射法发生在牺牲前的24小时。
图179图解了在IT注射Naglu-IGFII后，在所述脑和肝脏中的示例性总GAG水平。在媒介物处理的Sanfilippo B鼠中的总GAG表现出进行性增加，这反映了由于随Sanfilippo B小鼠年龄增长的累积效应。GAG在所述脑中统计学显著性降低，这在3x注射组中观察到(p＜0.05)。在2x和3x注射组中，也观察到GAG在肝脏中统计学显著性地降低(p＜0.05)。GAG水平在肝脏中(相对于在脑中)更快和更剧烈的变化，是在(对于亨特综合症)IT递送I2S中国已经被观察到的现象。
图180描述了在IT注射后，在Sanfilippo B小鼠的脑中，Naglu的示例性生物分布。Naglu免疫荧光染色显示了在所述脑的脑膜(M)和软组织上的Naglu-IGFII蛋白质。在所述2x和3x注射组中，观察到细胞吸收。G：胶质细胞。
图181为示例性的图解，其显示了所述小鼠脑的冠状面。方框表示LAMP-1免疫染色的照片拍摄的部位。为了演示蛋白质分布和功效的程度，选择大脑皮层和皮层下组织(例如尾状核、丘脑和白质)进行LAMP-1免疫染色。
图182为示例性的图解，其显示了大脑皮层的LAMP-1免疫染色，在40x放大倍数。与野生类型小鼠的脑相比，在所述媒介物处理的SanfilippoB小鼠的脑中，观察到溶酶体贮积增加，正如观察到LAMP-1免疫染色阳性斑点的增加。在Naglu-IGFII IT注射后，溶酶体贮积的减少是显著的：2x注射处理的Sanfilippo B小鼠脑的阳性斑点的大小减少，并且3x注射处理的Sanfilippo B小鼠脑的阳性斑点的大小和数量减少。
图183为示例性的图解，其显示了尾状核、皮层下核的LAMP-1免疫染色(40x)。与在所述大脑皮层中看到的相似，在所述媒介物处理的Sanfilippo B小鼠的脑中，观察到溶酶体贮积增加，正如观察到的LAMP-1免疫染色阳性斑点的增加。在Naglu-IGFII IT注射后，溶酶体贮积减少是显著的：2x注射处理的Sanfilippo B小鼠脑的阳性斑点的大小减少，并且3x注射处理的Sanfilippo B小鼠脑的阳性斑点的大小和数量减少。
图184为示例性的图解，其显示了所述丘脑、间脑核的LAMP-1免疫染色(40x)。在Naglu-IGFII IT注射后，溶酶体贮积的减少是显著的：2x注射处理的Sanfilippo B小鼠脑的阳性斑点的大小减少，并且3x注射处理的Sanfilippo B小鼠脑的阳性斑点的大小和数量减少。
图185为示例性的图解，其显示了白质的LAMP-1免疫染色(40x)。神经元轴纤维的径向磁迹将白质从存在于图181-184的灰质区分开。尽管如此，可以在媒介物处理的Sanfilippo B小鼠脑中观察到，溶酶体贮积增加的模式与所述野生小鼠相同。在Naglu-IGFII IT注射后，溶酶体贮积减少是显著的：在所述2x和3x注射处理的Sanfilippo B小鼠脑中，阳性斑点的大小减少，数量减少。
图186为示例性的图解，其显示了小脑皮层的LAMP-1免疫染色。所述小脑皮层的形态是明显的：密集定位的颗粒神经元、细胞减少的分子层、以及(在所述颗粒神经元和所述分子层之间的)单层的Purkinje神经元。Purkinje神经元通过大细胞质、以及突出进入所述分子层的临时性树突识别。
图187为示例性的图解，其显示在所述脑、脊髓和肝脏中的Naglu染色。在所述脑和脊髓中，注射的Naglu在脑膜(M)中检测到(仅通过IHC)，并且在其它区域没有检测到Naglu阳性染色。在所述肝脏中，窦状腺细胞(S)是Naglu阳性，并且在肝脏中没有发现Naglu吸收(H)。
图188为示例性的图解，其显示了所述肝脏和脊髓的LAMP免疫染色和H&E染色。与所述媒介物动物相比，在Naglu处理的整个肝脏和脊髓中，LAMP染色都减少。H&E染色显示，在肝脏中，在处理组中的细胞液泡化减少(与媒介物处理动物相比)。
图189A和图189B为示例性的图解，其显示了所述脑的H&E染色、以及所述脑的形态改善，在为期3个月的6次每隔一周(EOW)的IT注射Naglu后。在所述处理的脑中，在所有被检测区域中的所述细胞液泡化(箭头)比媒介物组减少。
图190A和图190B是示例性的图解，其显示了在多个脑区域中的LAMP免疫染色，在为期3个月6次IT Naglu注射后。与所述媒介物处理组相比，Naglu IT施用至Sanfilippo B小鼠，导致溶酶体活性在所有被检测区域中减少，通过LAMP免疫染色显示。这种减少的特征为：LAMP阳性细胞数目减少，较小的细胞体积，以及较轻的染色。在所述小脑和脑干(其定位在靠近所述脊髓的脑尾状核部分)中，(与其他脑区域相比)发现显著的减少。在所述深部脑区域(包括所述白质、海马和丘脑)中，发现明显的减少。
图191A和图190B是示例性的图解，其显示了在为期3个月的6次IT Naglu注射后，在多个脑区域中的Iba IHC，其揭示了小胶质细胞的活化。与媒介物处理相比，在所述Naglu处理组中，阳性细胞数目和染色强度没有观察到减少。尽管如此，阳性小胶质细胞的细胞形态随着在所有被检测脑区域中细胞大小的减少而改变(与在所述媒介物组中大的和液泡化相比)(插入)。
图192A和图192B是示例性的图解，其显示了在为期3个月的6次IT Naglu注射后，在多个脑区域中的GFAP IHC，其揭示了星形胶质细胞的活化。与媒介物处理相比，在所述小脑和脑干中，GFAP阳性染色减少，并且在其它被检测区域中轻微地减少。
定义
为了使本发明更容易被理解，某些术语在下文首先被定义。下面的术语和其它术语的其它定义在整个说明书提出。
约或者大约：如本文使用的，所述术语“约”或者“大约，”如应用于一个或多个感兴趣的值，其是指与规定的参考值相似的值。在某些实施方案中，所述术语“约”或者“大约”是指某范围的值，其落入所述规定的参考值在任意方向上(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、或更小以内，除非另有说明或以其他方式明显从上下文得出(除非其中该数字将超过100％的可能值)。
转佳：如本文使用的，所述术语“转佳”意思是状态的预防、减轻或者缓减，或者受试者状态的改善。转佳包括，但是不要求病情的痊愈或彻底的预防。在一些实施方案中，转佳包括相关蛋白质的水平或其活性的增加，所述相关蛋白质在相关疾病组织中缺乏。
生物活性：：如本文使用的，所述短语“生物活性”是指在生物系统中具有活性的任何实际的特性，并且特别地在生物体中。例如，当将试剂施用到生物体中，所述试剂对生物体具有生物效应，这被认为是生物活性。在特别的实施方案中，当蛋白质或多肽是生物活性的，该部分的蛋白或多肽将享有至少所述蛋白或多肽的一种生物活性，这通常被称为“生物活性”部分。
填充剂：如本文使用的，所述术语“填充剂”是指复合物，其为冻干混合物添加质量，并且有助于所述冻干块状物的物理结构(例如促进基本均匀的冻干块状物的生产，使其保持了开放的孔隙结构)。示例性的填充剂包括甘露醇、甘氨酸、氯化钠、羟乙基淀粉、乳糖、蔗糖、海藻糖、聚乙二醇和葡萄聚糖。
阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)：如本文使用的，所述术语“阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)”是指细胞受体，所述细胞受体在高尔基体中，在酸水解酶前体上结合甘露糖-6-磷酸(M6P)标签，并被注定运输到所述溶酶体。除了甘露糖-6-磷酸，所述CI-MPR也结合其他蛋白质，包括IGF-II。所述CI-MPR也被称为“M6P/IGF-II受体”、“CI-MPR/IGF-II受体”、“IGF-II受体”或者“IGF2受体”。这些术语和其省略语在本文中互换使用。
并发免疫抑制疗法：如本文使用的，所述术语“并发免疫抑制疗法”包括作为预处理、预调节或者与治疗方法平行的任意免疫抑制疗法。
稀释剂：如本文使用的，所述术语“稀释剂”是指药学上可接受的(例如对施用到人类是安全的和非毒性的)稀释物质，其对于重组制剂的制备是有效的。示例性的稀释剂包括无菌水、注射用制菌水(BWFI)、pH缓冲溶液(例如磷酸盐-缓冲盐水)、无菌生理盐水、林格式溶液或者右旋糖溶液。
剂型：如本文使用的，所述术语“剂型”和“单位剂型”是指待治疗患者的治疗蛋白质的物理上分离的单位。每个单位含有预定量的经计算产生预期治疗效果的活性材料。可以理解，尽管如此，所述组合物的总剂量可以被由主治医生根据合理的医学判断决定。
酶替代治疗(ERT)：如本文使用的，所述术语“酶替代治疗(ERT)”是指任意的治疗策略，其可以通过所述丢失的酶以纠正酶缺乏。在一些实施方案中，所述丢失的酶通过鞘内施用提供。在一些实施方案中，所述丢失的酶通过注入到血流中提供。一旦施用，酶被细胞吸收，并运输到所述溶酶体，在所述溶酶体中所述酶发挥清除由于酶缺乏而累积在所述溶酶体中的材料。通常，为了使溶酶体酶替代治疗有效，所述治疗酶被递送到在靶组织合适的细胞中的溶酶体(在所述组织中所述贮积缺陷是明显的)。
改善、增加、或者减少：如本文使用的，所述术语“改善”、“增加”或者“减少”或语法等价表达，包括相对于基线测量的值，例如在开始本文所描述的处理之前在相同个体中的测量，或者在缺乏本文所描述的处理的对照个体(或者多个对照个体)中的测量。“对照个体”是这样的个体：其受到与所述正被治疗的个体相同形式的溶酶体贮积症的折磨，并且其与所述治疗个体年龄相同(以确保在所述正被治疗的个体和所述对照个体之间所述疾病所处的阶段是可比性的)。
个体、受试者、患者：如本文使用的，所述术语“受试者”、“个体”或者“患者”是指人类或者非人类的哺乳动物受试者。所述正被治疗的个体(也称为“患者”或者“受试者”)是患有疾病的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年、成人)。
鞘内施用：如本文使用的，所述术语“鞘内施用”或者“鞘内注射”是指注射进入所述脊椎管(在所述脊髓周围的鞘内空间)。多种技术可以使用，包括但不限于，侧脑室注射(通过钻孔或小脑延髓池或腰椎穿刺或诸如此类)。在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或“鞘内递送”是指IT施用或者递送(通过腰部或腰区)，即腰椎IT施用或者递送。如本文使用的，所述术语“腰区”或“腰部”是指在所述第三和第四腰椎(下背部)骨之间的区域，更包含所述脊椎的L2-S1区域。
连接体：如本文使用的，所述术语“连接体”是指，在融合蛋白中，不同于在天然蛋白质中在特定位点出现的氨基酸序列，并且通常设计成柔性的或插入到在两个蛋白质部分之间的结构中(例如α-螺旋)。连接体也被称为间隔区。
冻干保护剂：如本文使用的，所述术语“冻干保护剂”是指这样的分子：其防止或减少蛋白质或其它物质在经过冷冻干燥和后续储存中的化学和/或物理的不稳定性。示例性的冻干保护剂包括糖(例如蔗糖或海藻糖)；氨基酸(例如氨基酸(例如谷氨酸一钠或组氨酸)；甲胺(例如甜菜碱)；感胶离子盐(硫酸镁)：多元醇(例如三价或更高的糖醇，例如甘油、赤藻糖醇、甘油、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇和甘露醇)；丙二醇；聚乙二醇；普流罗尼类；及其组合。在一些实施方案中，冻干保护剂是非还原糖，例如海藻糖或蔗糖。
溶酶体酶：如本文使用的，所述术语“溶酶体酶”是指任意的酶，其能够在哺乳动物溶酶体中累积的材料，或者能使一种或多种溶酶体贮积症症状得到拯救或转佳。适合于本发明的溶酶体酶包括野生类型的或者修饰的溶酶体酶，并能使用重组和合成的方法制备，或者从天然来源中纯化。示例性的溶酶体在表1中列出。
溶酶体酶缺乏：如本文使用的，“溶酶体酶缺乏”是指一组遗传性疾病，其由于至少一种酶的缺乏所导致，所述酶是在溶酶体中将大分子(例如酶底物)裂解成肽、氨基酸、单糖、核酸和脂肪酸所需要的。结果，患有溶酶体酶缺乏症的个体在多种组织(例如CNS、肝脏、脾脏、肠、血管壁和其它器官)中具有累积的材料。
溶酶体贮积症：如本文使用的，所述术语“溶酶体贮积症”是指导致一种或多种溶酶体酶缺乏的任意疾病，所述溶酶体酶是代谢天然大分子所需要的。这些疾病通常导致在溶酶体中未降解分子的累积，导致贮藏粒(术语也称为储存囊泡)数量的增加。这些疾病和多种实施例在下文详细地被描述。
多肽：如本文使用的，“多肽”，一般而言，是指由至少两个氨基酸彼此通过肽键连接成的一串。在一些实施方案中，多肽包括至少3-5个氨基酸，其中每个通过至少一个肽键的方式与其余的连接。那些在本领域的普通技术人员会意识到有时多肽包括“非天然”氨基酸或者任选的、其它仍然能合并到多肽链中的其它实体。
替代酶：如本文使用的，所述术语“替代酶”是指任意的酶，其能发挥作用以替代至少部分的所述(在待治疗的疾病中)缺乏或丢失的酶。在一些实施方案中，所述术语“替代酶”是指任意的酶，其能发挥作用以替代至少部分的所述(在待治疗的溶酶体贮积症中)缺乏或丢失的溶酶体酶。在一些实施方案中，替代酶能减少在哺乳动物溶酶体中累积的材料，或者其能拯救或改善一种或多种溶酶体贮积症症状。适合于本发明的替代酶包括野生类型或者修饰的溶酶体酶，并且能使用重组和合成的方法制备或者从天然来源中纯化。替代酶可以是重组的、合成的、基因活化的或者天然的酶。
可溶性：如本文使用的，所述术语“可溶性”是指治疗试剂形成均匀的溶液的能力。在一些实施方案中，所述治疗试剂在所述溶液中的可溶性(其在所述溶液中被施用，并且通过它运输到作用的靶向位点(例如所述脑的所述细胞和组织))是足够的，以允许递送治疗有效量的治疗世界至作用的靶向位点。几种因素可以影响所述治疗试剂的可溶性。例如，可能影响蛋白质可溶性的相关因素包括离子强度、氨基酸序列和存在其它共溶试剂或者盐(例如钙盐)。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制，使得所述钙盐从这种组合物中排除。在一些实施方案中，依照本发明的所述试剂是在对应的组合物中可溶性的。可以理解，当等渗溶液通常对于肠胃外施用药物是优选的，使用等渗溶液可能限制一些治疗世界充分的溶解性，特别是某些蛋白质和/或酶。已经表明，轻微高渗溶液(例如高达175mM氯化钠，在5mM磷酸钠中，pH7.0)和含糖溶液(例如高达2％蔗糖，在5mM磷酸钠中，pH7.0)在猴中具有良好的耐受性。例如，最常见的批准的CNS推注制剂组合物是生理盐水(在水中150mM NaCl)。
稳定性：如本文使用的，所述术语“稳定的”是指所述治疗试剂在较长期间保持其治疗效果(例如所有的或者大部分的其预期生物活性和/或理化完整性)的能力。所述治疗试剂的稳定性，以及所述药物组合物保持这种治疗试剂的稳定性的能力，可以在延长的时间周期内进行评估(例如至少1、3、6、12、18、24、30、36月或更久)。通常，本文描述的药物组合物已经被配制，可以使得其能稳定、或者作为选择减慢或阻止与之相配制的一种或多种治疗试剂(例如重组蛋白质)的所述降解。在配制的情况下，稳定的制剂是一种，在这种制剂中所述治疗试剂在储存和在加工过程中(例如冷冻/融化，机械混合和冻干)，基本保持其物理的和/或化学完整性和生物活性。对于蛋白质稳定性，其可以通过形成高分子量(HMW)聚集物酶活性损失、肽片段形成和电荷转移性能进行测量。
受试者：如本文使用的，所述术语“受试者”意思是任意的哺乳动物，包括人类。在本发明的某些实施方案中，所述受试者是成年人、青少年或者婴儿。本发明也考虑了所述药物组合物的施用、和/或子宫内治疗方法的性能。
基本的同源性：本文使用的所述短语“基本的同源性”是指，在氨基酸或核酸序列之间的比较。如本领域的普通技术人员的理解，两条序列通常会被认为“基本同源”，如果它们在对应的位点含有同源的残基。同源的残基可以是相同的残基。可选择的，同源的残基也可以是不相同的残基，其具有合适的相似结构和/或功能特性。例如，如本领域的普通技术人员所已知的，某些氨基酸通常被分类为“疏水的”或者“亲水的”氨基酸，和/或具有“极性”或“非极性|”侧链。一个氨基酸取代另一个相同类型的氨基酸，通常被认为是“|同源”取代。
众所周知在本领域技术中，氨基酸或者核酸序列可以使用多种算法比较，包括商业计算机程序，例如核酸序列的BLASTN，氨基酸序列的BLASTP、间隙BLAST(gapped BLAST)和PSI-BLAST。示例性的这种程序在这些文献中进行了描述：Altschul，等，Basic local alignment searchtool，J. Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；Altschul，等，Methods inEnzymology；Altschul，等，″Gapped BLAST and PSI-BLAST：a newgeneration of protein database search programs″，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Baxevanis，et al.，Bioinformatics：A Practical Guide tothe Analysis of Genes and Proteins，Wiley，1998；and Misener，等，(eds.)，Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，Vol.132)，Humana Press，1999.除了识别同源序列，上述提及的所述程序通常提供同源性程度的指示。在一些实施方案中，两个序列被认为基本同源，如果他们相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关延伸的残基之间是同源的。在一些实施方案中，所述相关延伸是完全的序列。在一些实施方案中，所述相关延伸是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多残基。
基本一致性：本文使用的所述短语“基本一致性”是指在氨基酸或者核酸序列之间的比较。如本领域的普通技术人员所理解的，两条序列通常会被认为是“基本一致的”，如果它们在相应的位点含有一致的残基。众所周知在本领域技术中，氨基酸或者核酸序列可以使用多种算法中的任意一个进行比较，包括在商业计算机中的程序，例如核酸序列的BLASTN，以及氨基酸序列的BLASTP、间隙BLAST(gapped BLAST)和PSI-BLAST。示例性的这种程序在下述的文献中进行了描述：Altschul，等，Basic localalignment search tool，J. Mol.Biol.，215(3)：403-410，1990；Altschul，等，Methods in Enzymology；Altschul等，Nucleic Acids Res.25：3389-3402，1997；Baxevanis et al.，Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genesand Proteins，Wiley，1998；and Misener，等，(eds.)，Bioinformatics Methodsand Protocols(Methods in Molecular Biology，Vol.132)，Humana Press，1999.除了识别这些一致的序列，上文所提及的所述程序通常提供了一致性程度的指示。在一些实施方案中，所述序列被认为是基本一致的，如果他们相应残基的至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更多在相关延伸的残基之间是一致的。在一些实施方案中，所述相关延伸是完全的序列。在一些实施方案中，所述相关延伸是至少10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500或更多残基。
合成的CSF：如本文使用的，所述术语“合成的CSF”是指具有与脑脊髓液一致的pH、电解质组成、葡萄糖含量和渗透压的溶液。合成的CSF也被称为人工CSF。在一些实施方案中，合成的CSF是Elliott’s B溶液。
适合于CNS递送：如本文使用的，所述短语“适合于CNS递送”或者“适合于鞘内递送”是指本发明的所述药物组合物，通常是指这些组合物的稳定性、耐受性和可溶性性能，以及这些组合物递送有效量的含于其中的治疗试剂至递送靶向位点(例如所述CSF或者所述脑)的能力。
靶组织：如本文使用的，所述术语“靶组织”是指受到待治疗的所述溶酶体贮积症影响的任意组织，或者在其中所述缺乏的溶酶体酶正常表达。在一些实施方案中，靶组织包括这些组织，在其中具有可检测的或者异常高量的酶底物(例如储存在所述组织的所述细胞溶酶体中)，在患有或者易患有溶酶体贮积症的患者中。在一些实施方案中，靶组织包括这些组织：其表现疾病相关病理、症状或特征。在一些实施方案中，靶组织包括这些组织：在其中所述缺乏的溶酶体酶以升高的水平正常表达。如本文使用的，靶组织可以是脑部靶组织、脊髓靶组织和/或周边靶组织。示例性的靶组织在下文详细描述。
治疗部分：如本文使用的，所述术语“治疗部分”是指部分的分子，其为所述分子提供治疗效果。在一些实施方案中，治疗部分是具有治疗活性的多肽。
治疗有效量：如本文使用的，所述术语“治疗有效量”是指治疗性蛋白质(例如替代酶)的量，其给予所述治疗的受试者治疗效果，以合理的效益/风险比率(适合于任意的医疗)。所述治疗效果可以是客观的(例如通过某种测试或者标记物测量)或主观的(例如受试者给出的效果的指示或感觉)。特别地，所述“治疗有效量”是指某种量的治疗蛋白质或者组合物有效治疗、改善或者阻止预期的病或者病情，或者表现可检测的治疗或者预防效果(例如通过改善疾病相关症状、阻止或者延缓所述疾病的发生、和/或减少所述疾病的严重程度或频率)。在给药方案上的治疗有效量通常施用，可以包括多种单位剂量。对任何特定治疗蛋白质，治疗有效量(和/或在有效给药方案内的合适的单位剂量)会有所不同，例如，根据施用途径、以及其它药物试剂。而且，任何特定患者的所述特定的治疗有效量(和/或单位剂量)可以根据多种因素改变，包括被治疗的疾病和所述疾病的严重程度；所采用的特定药物试剂的活性；所采用的特定组合物；所述患者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用时间；施用途径；和/或所采用的特定融合蛋白的排泄和代谢；所述治疗持续的时间；以及在医药领域已知的类似因素。
可容忍的：如本文使用的，所述术语“可容忍的”和“耐受性”是指本发明的药物组合物在所述受试者(所述的这些受试者是指被施用组合物的受试者)中不引发有害反应的能力，或者可选择地在所述受试者(所述的这些受试者是指被施用组合物的受试者)中不引发严重的有害反应的能力。在一些实施方案中，本发明所述药物组合物可以被所述受试者(所述受试者是指被施用组合物的受试者)良好地容忍。
治疗：如本文使用的，所述术语“治疗”(也称为“处理”或“治疗”)是指任意施用的治疗性蛋白质(例如溶酶体酶)，其部分地或者完全地缓解、改善、减轻、已知或者延缓发生，减少严重程度和/或减少(特定疾病、紊乱和/或病情(例如Hunters综合症、Sanfilippo综合症类型B的)一种或多种症状或特征的发生率。这种治疗可以是这样的受试者(其不表现相关的疾病、紊乱和/或病情的体征)，和/或这样的受试者(其仅仅表现相关的疾病、紊乱和/或病情的早期体征)。可选择地或者额外地这种治疗可以是这样的受试者，其表现所述相关的疾病、紊乱和/或病情的一种或多种已建立的体征。
发明详述
本发明提供了，此外，改善的方法用于有效直接递送治疗试剂至所述中枢神经系统(CNS)。如上文所讨论的，本发明基于意外的发现：溶酶体贮积症的替代酶可以以高浓度直接引入到有需要治疗的受试者的所述脑脊髓液(CSF)中，而在受试者中不诱发实质性副作用。更加出乎意料的是，本发明人发现：所述替代酶可以在简单的生理盐水或者缓冲液基础制剂中递送，而不使用合成的CSF。甚至更出乎意料的是，根据本发明的鞘内递送在所述受试者中不导致实质性副作用，例如严重的免疫应答。因此，在一些实施方案中，根据本发明的鞘内递送可以在缺乏并发免疫抑制疗法时使用(例如通过预处理或者预调节不诱发免疫耐受性)。
在一些实施方案中，根据本发明的鞘内递送允许在多种脑组织间的有效扩散，导致所述替代酶在在表面、浅部和/或深部的脑区域中多种靶脑组织中的有效递送。在一些实施方案中，根据本发明的鞘内递送产生充分量的替代酶进入所述外周循环。结果，在某些情况下，根据本发明的鞘内递送导致所述替代酶在外周组织中的递送，例如肝脏、心脏和肾脏。该发现是预料之外的，并且可以是对具有CNS和外周组件的所述溶酶体贮积症的治疗特别有用，其通常需要常规鞘内施用和静脉施用。这也是想到的：根据本发明的鞘内递送可以允许减少给药和/或iv注射的频率，而不损害周边症状治疗的治疗效果。
本发明提供了多种意外的和有益的特征，其允许替代酶有效和便捷地递送至多种脑靶组织，导致具有CNS指示的溶酶体贮积症的有效治疗。
本发明的多个方面在下面章节进行详细描述。所述章节的使用不是打算限制本发明。每章节可以应用于本发明的任意方面。在这份申请中，使用“或者”意思是“和/或”，除非另有声明。
溶酶体贮积症和替代酶
可以使用本发明的发明方法来治疗任何的溶酶体贮积症，特别是具有CNS病因和/或症状的溶酶体贮积症，包括但不限于：天冬氨酰葡萄糖胺尿症、胆固醇脂沉积病、沃尔曼病、胱氨酸病、Danon病、法布里病、Farber脂肪肉芽肿病、Farber病、墨角藻糖苷酶缺乏病、半乳糖唾液酸沉积症I/II型、戈谢病类型I/II/III、球细胞脑白质营养不良、克拉伯病、糖原贮积症II、庞贝氏症、GM1-神经节苷脂沉积症类型I/II/III、GM2-神经节苷脂沉积症类型I、泰-萨克斯病、GM2-神经节苷脂沉积症类型II、桑德霍夫病、GM2-神经节苷脂沉积症、α-甘露糖苷过多症类型I/II、β-甘露糖苷过多症、异染性脑白质营养不良、粘脂糖症类型I、唾液酸沉积症类型I/II、粘脂糖症类型II/III、I-细胞病、粘脂糖症类型IIIC假胡尔勒氏多种营养不良、黏多糖贮积症类型I、黏多糖贮积症类型II、亨特综合症、黏多糖贮积症类型IIIA、Sanfilippo综合症(类型A、B、C或者D)、黏多糖贮积症类型IIIB、黏多糖贮积症类型IIIC、黏多糖贮积症类型IIID、黏多糖贮积症类型IVA、莫基奥综合症、黏多糖贮积症类型IVB、黏多糖贮积症类型VI、黏多糖贮积症类型VII、Sly综合症、黏多糖贮积症类型IX、多种硫酸酯酶缺乏症、神经元蜡样脂褐质沉积症、CLN1Batten病、CLN2Batten病、尼曼匹克病类型A/B、尼曼匹克病类型C1、尼曼匹克病类型C2、致密性成骨不全症、Schindler病类型I/II、戈谢病和唾液酸贮积病。
在一些实施方案中，使用本发明的发明方法溶酶体贮积症包括：Hunters综合症、异染性脑白质营养不良(MLD)病、Sanfilippo综合症类型A、Sanfilippo综合症类型B、和细胞脑白质营养不良(GLD)病。
所述溶酶体贮积症的遗传病因、临床表现和分子生物学的详细评论可以详参于Scriver et al.，eds.，The Metabolic and Molecular Basis of InheritedDisease，7.sup.th Ed.，Vol.II，McGraw Hill，(1995).因此，在上文的疾病中的酶缺乏对本领域的普通技术人员是已知的，其中一些在下表中示出。
表1
替代酶
根据本发明发明的方法可以用于递送任何替代酶。如本文使用的，适合于本发明的替代酶可以包括任何替代酶，其能发挥作用替代在待治疗的溶酶体贮积症中缺乏或者丢失的溶酶体酶的至少部分活性。在一些实施方案中，替代酶能够减少在溶酶体中累积的物质，或者能拯救或改善一种或多种溶酶体贮积症症状。
在一些实施方案中，合适的替代酶可以是已知的与待治疗的所述溶酶体贮积症相关的任何替代酶。在一些实施方案中，合适的替代酶是选自在表1中列出的所述酶中的酶。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶是艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)、芳基硫酸酯酶A(ASA)、乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Naglu)或者β-半乳糖苷酶(GLC)。
在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶可以具有野生-类型或者天然发生的序列。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶可以具有修饰的序列，所述修饰的序列与所述野生-类型或者天然发生的序列具有基本的同源性或者一致性(例如与所述野生-类型或者天然发生的序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％序列一致性)。
适合于本发明的替代酶可以通过任何可用的方法制备。例如，替代酶可以利用设计表达替代酶编码核酸的宿主细胞系统重组制备。可选择地或者附加地，替代酶可以通过激活内源基因制备。可选择地或者附加地，替代酶通过化学合成部分地或者完全地制备。可选择地或者附加地，替代酶可以从天然来源纯化得到。
可以使用任意的表达系统，来重组制备酶。为了给出一些例子，已知的表达系统包括，例如卵、杆状病毒、植物、酵母、或者哺乳动物细胞。
在一些实施方案中，适合于本发明的酶在哺乳动物细胞中制备。可以根据本发明使用的哺乳动物细胞的非限定实施例包括：BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l，ECACC No：85110503)、人类成视网膜细胞(PER.C6，CruCell，Leiden，荷兰)、SV40转化的猴肾脏CV1系(COS-7，ATCC CRL1651)、人类胚胎肾脏系(在悬浮培养生长的293或293细胞亚克隆，Graham等，J.Gen Virol.，36：59，1977)、人类纤维肉瘤细胞系(例如HT1080)、幼地鼠肾脏细胞(BHK，ATCC CCL10)、中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub andChasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216，1980)、小鼠睾丸支持细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.，23：243-251，1980)、猴肾脏细胞(CV1 ATCC CCL70)、非洲绿猴肾脏细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)、人类宫颈癌细胞(HeLa，ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)、布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)、人类肺细胞(W138，ATCC CCL75)、人类肝细胞(HepG2，HB8065)、小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)、TRI细胞(Mather et al.，Annals N.Y.Acad.Sci.，383：44-68，1982)、MRC5细胞、FS4细胞、和人类肝癌细胞系(Hep G2)。
在一些实施方案中，根据本发明发明的方法被用来递送从人类细胞制备的替代酶。在一些实施方案中，使用根据本发明发明的方法递送从CHO细胞制备的替代酶。
在一些实施方案中，使用本发明的方法递送的替代酶含有与在脑细胞表面上的受体结合的部分，以促进细胞吸收和/或靶向溶酶体。例如，这种受体可以是阳离子依赖型甘露糖-6-磷酸受体(CI-MPR)，其与所述甘露糖-6-磷酸(M6P)残基结合。另外，所述CI-MPR也结合其它蛋白，包括IGF-II。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶在所述蛋白的表面含有M6P残基。在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶可以含有双磷酸化的寡糖，其与所述CI-MPR具有更高的结合亲和力。在一些实施方案中，合适的酶含有至多大约平均每酶大约至少20％双磷酸化的寡糖。在其它实施方案中，合适的酶可以含有每酶大约10％、15％、18％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％双磷酸化的寡糖。而这种双磷酸化的寡糖可以是天然存在在所述酶上的，应该注意，所述酶可以通过某些酶修饰而拥有这种寡糖。例如，合适的替代酶可以被某些酶(其能够催化溶酶体酶上的N-乙酰氨基葡萄糖-L-磷酸盐从UDP-GlcNAc至α-1，2-连接的甘露糖的6′位点)修饰。制备和使用这种酶的方法和组合物被详细描述，例如参见Canfield等(在美国专利号6,537,785中)和美国专利号6,534,300，每个都通过参考的方式并入本文。
在一些实施方案中，在本发明中使用的替代酶可以缀合或融合至能够结合到脑细胞表面上受体的溶酶体靶向部分。合适的溶酶体靶向部分可以是：IGF-I、IGF-II、RAP、p97、和变异型、及其同源物或者片段(例如包括与野生类型成熟人类IGF-I、IGF-II、RAP、p97肽序列具有至少70％、75％、80％、85％、90％或者95％一致性的序列的肽)。
在一些实施方案中，适合于本发明的替代酶未曾被修饰，以增强递送或者转运这种试剂穿过BBB而进入所述CNS。
鞘内递送
根据本发明，替代酶被递送到所述CNS。在一些实施方案中，替代酶通过施用到有需要治疗的受试者的所述脑脊髓液(CSF)，被递送到所述CNS。在一些实施方案中，使用鞘内施用递送期望的替代酶进入所述CSF。如本文使用的，鞘内施用(也被称为鞘内注射)是指注射进入所述脊椎管(在所述脊髓周围的鞘内空间)。可以使用多种技术，包括但不限于侧脑室注射(通过钻孔或者小脑延髓池或腰椎穿刺等)示例性的方法在Lazortheset al.Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery，143-192和Omaya et al.，Cancer Drug Delivery，1：169-179，中描述，这些内容通过参考的方式并入本文。
根据本发明，酶可以在所述脊椎管周围的任意区域注射。在一些实施方案中，酶被注射入所述腰部或者小脑延髓池或者脑室注射进入脑室空间。如本文使用的，所述术语“腰区”或者“腰部”是指在所述第三和第四腰椎(下背部)之间的区域，更加包含所述脊椎的所述L2-S1区域。通常，通过所述腰区或者腰椎区域的鞘内注射被认为是“腰部IT递送”或者“腰部IT施用”。所述术语“小脑延髓池”是指在所述小脑周围和下方的空间(经由在所述头骨和所述脊椎顶部之间的开口)。通常地，经由小脑延髓池的注射也被称为“小脑延髓池递送”。所述术语“脑室”是指在所述脑中的空腔，其与所述脊髓的中央管是连续的。通常地，经由所述脑室空腔的注射是指脑室内的(intravetricular Cerebral，ICV)递送。
在一些实施方案中，根据本发明的“鞘内施用”或者“鞘内递送”是指腰部IT施用或者递送，例如，在所述第三和第四腰椎(下背部)之间递送，更加包含所述脊椎的L2-S1区域。这也是考虑到的：腰部IT施用或者递送区别于在所述小脑延髓池递送，因为根据本发明的腰部IT施用或者递送提供了更好和更有效的递送至远端脊椎管，而小脑延髓池递送(此外)通常不能良好地递送至远端脊椎管。
递送的稳定制剂
在一些实施方案中，预期的酶在鞘内递送的稳定制剂中进行递送。本发明的某些实施方案是基于，至少部分地，是基于该发现：本文公开的多种制剂一种或多种治疗试剂(例如酶)有效递送或分布至所述CNS的靶组织、细胞和/或细胞器官。此外，本文公开的制剂能增溶高浓度的治疗试剂(例如蛋白质或者酶)，并适合于这种治疗试剂递送至受试者的所述CNS(为了治疗具有CNS组件和/或病因的疾病)。本文描述的所述组合物进一步的特征是：当施用到有需要其的受试者的所述CNS(鞘内施用)时，改善其稳定性和改善其耐受性。
在本发明之前，传统的无缓冲等渗盐水和Elliott’s B溶液(其是人工CSF)通常地用于鞘内递送。所述CSF组合物相对于Elliott’s B溶液的比较描述包含在下面的表2中。如表2所示，Elliott’s B溶液的所述浓度密切地与所述CSF相似。Elliott’s B溶液，尽管如此，含有非常低的缓冲液浓度，并且因此可能不能为稳定治疗试剂(例如蛋白质)的需要提供充分的缓冲能力，特别是在一段较长的时间(例如在储存条件下)。而且，Elliott’s B溶液含有某些盐，这些盐可能与所述制剂(所述制剂打算用于递送某些治疗试剂，特别是蛋白质或者酶)不相容。例如，存在于Elliott’s B溶液中的钙盐能够调节蛋白沉淀，并且因此减少了所述制剂的稳定性。
表2
因此，在一些实施方案中，适合于根据本发明的鞘内递送的制剂不是合成的或者人工的CSF。
在一些实施方案中，鞘内递送的制剂已经配制，使得它们能够稳定化，或者可选择地减缓或者阻止配制在其中的一种或多种治疗试剂(例如重组蛋白质)的降解。如本文使用的，所述术语“稳定的”是指所述治疗试剂(例如重组酶)在一段较长的时间内维持其治疗效果(例如它的预期的生物活性和/或理化完整性的全部或者大部分)的能力。治疗试剂的所述稳定性，和所述药物组合物维持这种治疗世界稳定性的能力，可以在一段较长的时间内(例如优选至少1、3、6、12、18、24、30、36月或者更多)进行评估。就制剂而言，稳定的制剂是这样的：其中的所述治疗试剂在储存和加工(例如冷冻/解冻、机械混合和冷冻干燥)过程中基本上保持其物理和/或化学完整性和生物活性。对于蛋白质稳定性，它可以通过形成高分子重量(HMW)聚集体，酶活性损失、肽片段的形成和电荷性能的变化进行量度。
治疗试剂的稳定性是特别重要的。所述治疗试剂的稳定性可以进一步评估，相对于所述治疗试剂在较长一段时间内的生物活性或理化完整性。例如，在给定时间点的稳定性可以与较早时间点(例如在配制的第0天)进行比较，或者与未配制的治疗试剂进行比较，并且这种比较结果以百分数表示。优选的，本发明的药物组合物使所述治疗试剂的生物活性或者理化完整性在一端较长的时间(例如在至少大约6-12个月、在室温或者加速储存条件下)内维持至少100％、至少99％、至少98％、至少97％至少95％、至少90％、至少85％、至少80％、至少75％、至少70％、至少65％、至少60％、至少55％或至少50％。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如预期的酶)在本发明的制剂中是可溶的。所述术语“可溶性”(如其所提及的本发明的治疗试剂)是指这种治疗试剂形成均匀的溶液的能力。优选地，所述治疗试剂在所述溶液(在其中所述治疗试剂被施用，并且通过所述溶液所述治疗试剂被运送到作用的靶位点)中的可溶性是足够地以允许递送治疗有效量的所述治疗试剂至作用的靶位点。几种因素可以影响所述治疗试剂的可溶性。例如，可能影响蛋白质可溶性的相关因素，包括离子强度、氨基酸序列和存在其它共溶试剂或离子(例如钙盐)。在一些实施方案中，所述药物组合物被配制成使得所述钙盐从所述组合物排除。
因此，适合于鞘内施用的制剂可以含有多种浓度的感兴趣的治疗试剂(例如酶)。在一些实施方案中，合适的制剂可以含有感兴趣的蛋白质，其浓度高达大约300mg/ml(例如高达大约250mg/ml、高达200mg/ml、高达150mg/ml、高达100mg/ml、高达90mg/ml、高达80mg/ml、高达70mg/ml、高达60mg/ml、高达50mg/ml、高达40mg/ml、高达30mg/ml、高达25mg/ml、高达20mg/ml、高达10mg/ml)。在一些实施方案中，合适的制剂可以含有感兴趣的蛋白质或酶，其浓度范围在大约0-300mg/ml之间(例如大约1-250mg/ml、大约1-200mg/ml、大约1-150mg/ml、大约1-100mg/ml、大约10-100mg/ml、大约10-80mg/ml、大约10-70mg/ml、大约1-60mg/ml、大约1-50mg/ml、大约10-150mg/ml、大约1-30mg/ml)。在一些实施方案中，适合于鞘内递送的制剂可以含有感兴趣的蛋白质，其浓度为约1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、15mg/ml、20mg/ml、25mg/ml、50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml、150mg/ml、200mg/ml、250mg/ml或者300mg/ml。
在一些实施方案中，使用等渗溶液。在一些实施方案中，已经表明：轻度高渗溶液(例如高达300mM(例如高达250mM、200mM、175mM、150mM、125mM)氯化钠，在5mM磷酸钠中，pH7.0)和含糖溶液(例如高达3％(例如高达2.4％、2.0％、1.5％、1.0％)蔗糖，在5mM磷酸钠中，pH7.0)在猴中可以被良好地容忍。在一些实施方案中，合适的CNS推注制剂组合物是生理盐水(例如在水中的150mM NaCl)。
许多治疗试剂，特别是本发明的蛋白质和酶，要求可控制的pH和特定的赋形剂，以维持他们在本发明的药物组合物中的的可溶性和稳定性。下面的表3区别了被认为对维持本发明所述蛋白质治疗试剂的可溶性和稳定性重要的某些示例性方面。
表3
所述药物组合物的pH是能够改变治疗试剂(例如酶或者蛋白质)在水性药物组合物中的可溶性的额外因素。在一些实施方案中，本发明的药物组合物含有一种或多种缓冲。在一些实施方案中，根据本发明的组合物含有缓冲剂的量，足够以维持所述组合物的最适pH在大约4.0-8.0之间、在大约5.0-7.5之间、在大约5.5-7.0之间、在大约6.0-7.0之间和在大约6.0-7.5之间。在其它实施方案中，所述缓冲剂包括高达大约50mM(例如，高达大约45mM、40mM、35mM、30mM、25mM、20mM、15mM、10mM、5mM)的磷酸钠。合适的缓冲剂包括，例如醋酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐、其它有机酸和三(羟甲基)氨基甲烷(“Tris”)。合适的缓冲剂浓度可以是从大约1mM至大约100mM、或者从大约3mM至大约20mM，根据例如所述缓冲剂和所述制剂的期望等渗性。在一些实施方案中，合适的缓冲剂存在的浓度约1mM、5mM、10mM、15mM、20mM、25mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、65mM、70mM、75mM、80mM、85mM、90mM、95mM、或者100mM。
在一些实施方案中，制剂含有保持所述制剂等渗的等渗剂。如与IT递送相关使用的，“等渗的”意思是所述感兴趣制剂与人类CSF具有基本相同的渗透压。等渗的制剂通常具有的渗透压，从大约240mOsm/kg至大约350mOsm/kg。等渗性可以被测量，例如，使用蒸汽压力或者凝固点类型渗透计。示例性的等渗剂包括，但不限于包括，但不限于甘氨酸、山梨糖、甘露醇、氯化钠和精氨酸。在一些实施方案中，合适的等渗剂可以存在于制剂中，以浓度从大约0.01-5％(例如0.05、0.1、0.15、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75、1.0、1.25、1.5、2.0、2.5、3.0、4.0或5.0％)，按重量计。
在一些实施方案中，制剂可以含有保护所述蛋白的稳定剂。通常地，合适的稳定剂是非还原糖(例如蔗糖、棉子塘、海藻糖)，或者氨基酸(例如甘氨酸、精氨酸和蛋氨酸)。稳定剂在制剂中的量通常是使得所述制剂等渗。尽管如此，高渗的制剂也可以是合适的。另外，所述稳定剂的量必须不能太低，使得所述治疗试剂发生降解/聚集的量不可接受。在所述制剂中示例性的稳定剂浓度范围从大约1mM至大约400mM(例如从大约30mM至大约300mM，以及从大约50mM至大约100mM)，或者，从0.1％至15％(例如从1％至10％，从5％至15％，从5％至10％)，以重量计。在一些实施方案中，所述稳定剂和所述治疗试剂的质量的比率是大约1∶1。在其它实施方案中，所述稳定剂和所述治疗试剂的质量的比率可以是大约0.1∶1、0.2∶1、0.25∶1、0.4∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、2.6∶1、3∶1、4∶1、5∶1、10；1、或者20∶1。在一些实施方案中，适合冷冻干燥的稳定剂也是冻干保护剂。
本发明的所述药物组合物、制剂和相关的方法对于递送(例如鞘内的、脑室内的、脑池内的)多种治疗试剂至受试者的所述CNS、以及所述相关疾病的治疗有用。本发明的药物组合物特别地对于递送蛋白质和酶至患有溶酶体贮积症的受试者有用。
在一些实施方案中，理想的是，添加表面活性剂至制剂。示例性的表面活性剂包括非离子表面活性剂，例如聚山梨醇酯(例如聚山梨醇酯20或者80)；泊洛沙姆(例如洛沙姆188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂基硫酸钠；sodium octyl glycoside；十二烷基-，十四烷基-，linoleyl-，或者硬脂基-磺基甜菜碱；十二烷基-，十四烷基-，linoleyl-或者硬脂基-肌氨酸；linoleyl-，十四烷基-，或者鲸蜡基-甜菜碱；lauroamidopropyl-，cocamidopropyl-，linoleamidopropyl-，myristamidopropyl-，palmidopropyl-，或者异硬脂酰丙基-甜菜碱(例如lauroamidopropyl)；myristarnidopropyl-，palmidopropyl-，或者异硬脂酰丙基-二甲胺；甲基椰油酰基钠-，或者disodiummethyl ofeyl-taurate；以及MONAQUATTM系列(Mona Industries，Inc.，Paterson，N.J.)，聚乙二醇，聚丙二醇，以及乙烯和丙二醇的共聚物(例如Pluronics，PF68等)。通常地，所述添加的表面活性剂的量是使得所述蛋白质聚集减少，并且使颗粒或冒泡最小化。例如，存在于制剂中的表面活性剂可以是从大约0.001-0.5％(例如大约0.005-0.05％，或者0.005-0.01％)。特别的，存在于制剂中的表面活性剂浓度可以是约0.005％、0.01％、0.02％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、或者0.5％等。
在一些实施方案中，合适的制剂可以进一步地包括一种或多种填充剂，特别地，用于冻干制剂的。“填充剂”是这样的复合物，其为所述冻干混合物增加质量，并且有助于所述冻干块状物的物理结构。例如，填充剂可以改善冻干块状物的外貌(例如基本均匀的冻干块状物)。合适的填充剂包括，但不限于，氯化钠、乳糖、甘露醇、甘氨酸、蔗糖、海藻糖、羟乙基淀粉。填充剂示例性的浓度是从大约1％至大约10％(例如1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.0％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、和10.0％)。
根据本发明的制剂可以基于这些进行评估：产品质量分析、再生时间(如果冻干)、再生质量(如果冻干)、高分子量、湿度、和玻璃转化温度。通常地，蛋白质质量和产品分析包括产品降解率分析，使用的方法包括但不限于，体积排阻HPLC(SE-HPLC)、阳离子交换-HPLC(CEX-HPLC)、X-射线衍射(XRD)、调制式差示扫描量热法(mDSC)、反相HPLC(RP-HPLC)、多角度激光光散射(MALS)、荧光、紫外吸收、浊度测定法、毛细管电泳(CE)、SDS-PAGE、以及其组合。在一些实施方案中，根据本发明的产品的评估可以包括评估外貌的步骤(无论液体或者块状物的外貌)。
通常，制剂(冻干的或者水性的)可以用于在室温下在长时间的储存。储存温度通常的范围可以从0℃至45℃(例如4℃、20℃、25℃、45℃等)。制剂可以在数月至数年的时间段储存。储存时间通常是24月、12月、6月、4.5月、3月、2月或者1月。制剂可以直接在用于施用、消除转移步骤的所述容器中储存。
制剂可以直接在冻干容器中储存(如果冻干)，所述冻干容器可以起重组器皿、消除转移步骤的作用。可选择的，冻干产品制剂可以估量成更小的储存增量。储存应该通常避免导致所述蛋白质降解的事件，包括但不限于暴露在阳光、紫外辐射、其它电磁辐射形式、过热或过冷、快速热冲击和机械冲击。
在一些实施方案中，根据本发明的制剂是以液体或者水性的形式。在一些实施方案中，根据本发明的制剂是冻干的。这种冻干的制剂可以在施用到受试者之前，通过添加以一种或多种稀释剂至其中进行再生。合适的稀释剂包括但不限于无菌水、注射用制菌水和无菌生理盐水。优选的，在再生过程中，所述治疗试剂(含在其中的)是稳定的、可溶的，并且表面光在施用到受试者过程中是具有耐受性的。
本发明的药物组合物的特征在于具有耐受性。如本文使用的，所述术语“可容忍的”和“耐受性”是指本发明的药物组合物在所述受试者(这种组合物施用至所述受试者)中不引起有害反应的能力，或者可选择地在所述受试者(这种组合物施用至所述受试者)中不引起严重有害反应的能力。在一些实施方案中，被这种组合物施用至的所述受试者可以良好地容忍本发明的药物组合物。
鞘内递送的设备
根据本发明鞘内递送可以使用多种设备。在一些实施方案中，鞘内施用的设备含有：流体进入端口(例如可注射的端口)；空心体(例如导管)，所述空心体具有与所述流体进入端口液体连通的第一流体孔口以及配置插入到脊髓中的第二流体孔口；和固定机构，所述固定机构用于固定在所述脊髓中的空心体的插入。如在图1中示出的非限定性实施例，合适的固定机构含有固定在所述空心体表面的一个或多个球形门柄、以及可调节覆盖所述一个或多个球形门柄的缝合环，所述缝合环用于阻止所述空心体(例如导管)从所述脊髓滑出。在多个实施方案中，所述流体进入端口包括贮液囊。在一些实施方案中，所述流体进入端口包括机械泵(例如灌流泵)。在一些实施方案中，植入的导管连接到贮液囊(例如用于推注递送)，或者灌流泵。所述流体进入端口可以是植入的或者外置的。
在一些实施方案中，鞘内施用可以通过腰椎穿刺(缓慢推注)或通过端口-导管递送系统(例如注射或者推注)进行。在一些实施方案中，所述导管插入到所述腰椎之间的薄层，所述前端被拧到预期水平的鞘空间(通常L3-L4)(图2)。
相对于静脉施用，适合鞘内施用的单剂量体积通常地小的。通常地，根据本发明的鞘内递送维持了所述CSF的组合物与所述受试者颅内压力之间的平衡。在一些实施方案中，对于相应的去除了CSF的受试者，鞘内递送没有进行。在一些实施方案中，合适的单剂量体积可以例如小于大约10ml、8ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1.5ml、1ml、或者0.5ml。在一些实施方案中，合适的单剂量体积可以是大约0.5-5ml、0.5-4ml、0.5-3ml、0.5-2ml、0.5-1ml、1-3ml、1-5ml、1.5-3ml、1-4ml、或者0.5-1.5ml。在一些实施方案中，根据本发明的鞘内递送涉及首先去除预期量的CSF的步骤。在一些实施方案中，在IT施用之前，小于大约10ml(例如小于大约9ml、8ml、7ml、6ml、5ml、4ml、3ml、2ml、1ml)的CSF首先被去除。在这些情况下，合适的单剂量体积可以是例如多于大约3ml、4ml、5ml、6ml、7ml、8ml、9ml、10ml、15ml、或者20ml。
可以使用多种其它设备影响治疗组合物的鞘内施用。例如，含有预期酶的制剂的给予可以使用Ommaya贮液囊，所述Ommaya贮液囊通常用于脑膜癌扩散药物的鞘内施用(Lancet2：983-84，1963)。更具体地说，在这种方法中，脑室管通过在所述前角形成的孔中插入，并且连接到安装在所述头皮下的Ommaya贮液囊；并且所述Ommaya贮液囊是皮下穿刺，使其鞘内递送所述特定被替代的酶(所述酶被注射到所述贮液囊中)。治疗组合物或者制剂鞘内施用到个体的其它设备的描述可以参见：美国专利号6,217,552，其通过参考的方式并入本文。可选择地，所述药物可以鞘内施用，例如，可以单一注射，或者持续注射。应该理解，所述剂量治疗可以以单一剂量施用或者多种剂量的形式。
对于注射，本发明的制剂可以以液体溶液配制。另外，所述酶可以以固体形式配制，并且在使用之前重溶或者立即悬浮。冻干形式也包括在内。所述注射，例如以所述酶的推注注射或者持续注射(例如使用灌流泵)的形式。
在本发明的一个实施方案中，所述酶通过侧脑室注射至所述受试者的脑中。所述注射，可以例如通过在所述受试者的头骨中钻孔。在另一实施方案中，所述酶和/或其它药物制剂通过外科插入分流至所述受试者的脑室中。例如，所述注射可以在侧脑室(其更大)进行。在一些实施方案中，也可以注射进入所述第三和第四较小脑室。
在又一个实施方案中，在本发明中使用的所述药物组合物通过注射施用至受试者所述小脑延髓池、或腰部。
在本发明的又一实施方案中，所述药学可接受的制剂提供了持久的递送至受试者(例如：在本发明中使用的所述酶或者其它药物组合物的“缓慢释放”)，在所述药学可接受的制剂被施用到所述受试者后，维持至少一周、两周、三周、四周或更长时间段。
如本文使用的，所述术语“持久的递送”是指本发明的药物制剂在施用以后，在体内，在一段时间内持续递送，优选至少几天、一周或数周。所述组合物的持久递送可以被证明，例如所述酶在一段时间内的持久治疗效果(例如所述酶的持久递送可以通过在所述受试者中贮藏粒量的持续减少所证明)。可选择地，所述酶的持久递送可以被证明：通过检测在一定时间内，在体内存在的所述酶。
递送至靶组织
如上文所讨论的，本发明的一种令人惊讶的和重要的特征是：所述治疗试剂，特别的，使用本发明施用的替代酶能有效地、广泛地分散在所述脑表面，并渗透多层脑区域(包括深部脑区域)。另外，本发明的方法和组合有效地递送治疗试剂(例如替代酶)至脊髓的多种组织、神经元或细胞，包括腰区，所述腰区难以通过存在的CNS递送方法(例如ICV注射)靶向定位。而且，本发明的发明方法和组合物递送充分的量的治疗试剂(例如酶)至血流、多种外周器官和组织中。
因此，在一些实施方案中，治疗性蛋白质(例如替代酶)被递送至受试者的中枢神经系统。在一些实施方案中，治疗性蛋白质(例如替代酶)被递送至脑、脊髓、和/或外周器官的靶组织。如本文使用的，所述术语“靶组织”是指受到待治疗的溶酶体贮积症的影响的任意组织，或者所述缺乏的溶酶体酶正常表达的任意组织。在一些实施方案中，靶组织包括这些组织：在所述组织中具有可检测的或者异常高的量的酶底物，例如储存在所述组织的细胞溶酶体中(在患有或已患有溶酶体贮积症的患者中)。在一些实施方案中，靶组织包括表现具有疾病相关病理、症状或特征的这些组织。在一些实施方案中，靶组织包括这些组织：在所述组织中所述缺乏的溶酶体酶以升高的水平正常表达。如本文使用的，靶组织可以是脑靶组织、脊髓靶组织和/或外周靶组织。示例性的靶组织在下文详细描述。
脑靶组织
一般而言，所述脑可以被分成不同的区域、层和组织。例如，脑膜组织是覆盖所述中枢神经系统(包括所述脑)的膜系统。所述脑膜含有三层，包括硬脑膜、蛛网膜和软脑膜。一般而言，所述脑膜和脑脊髓液的主要功能是保护所述中枢神经系统。在一些实施方案中，根据本发明的治疗性蛋白质被递送至一层或多层所述脑膜。
所述脑具有三个主要的细分区，包括大脑、小脑和脑干。所述大脑半球位于大部分其它脑结构上方，并且被皮层覆盖。在所述大脑下面是脑干，所述脑干看起来像连接在所述大脑上的柄。在所述脑的后部，所述大脑以下和所述脑干后面，是小脑。
间脑(其位于所述脑中线附近，并且在所述中脑上方)含有丘脑、后丘脑、下丘脑、上丘脑、腹侧丘脑和前顶盖。中脑(也称为中脑)含有顶盖、大脑脚盖、脑室中脑水管、大脑脚、红核、和颅神经III核。中脑与视觉、听觉、运动控制、睡眠/唤醒、警觉和温度调节相关。
中枢神经系统组织的区域(包括脑)的特征，可以基于所述组织的深度划分。例如，CNS(例如脑)组织的特征可以描述成表面或者浅部组织、中层深度组织和/或深部组织。
根据本发明，治疗性蛋白质(例如替代酶)可以递送到与在受试者中待治疗的特定疾病相关的任意合适的脑靶组织。在一些实施方案中，根据本发明的治疗性蛋白质(例如替代酶)被递送至表面或浅部的脑靶组织。在一些实施方案中，根据本发明的治疗性蛋白质被递送至中层深度脑靶组织。在一些实施方案中，根据本发明的治疗性蛋白质被递送至深部脑靶组织。在一些实施方案中，根据本发明的治疗性蛋白质被递送至表面或浅部脑靶组织、中层深度脑靶组织、和/或深部脑靶组织的组合。在一些实施方案中，根据本发明的治疗性蛋白质被递送至深部脑组织，其在脑的外部表面以下(或内部)至少4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm或更多。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至大脑的一个或多个表面或者浅部组织。在一些实施方案中，所述靶向的大脑表面或者浅部组织位于距所述大脑表面4mm以内。在一些实施方案中，所述靶向的大脑表面或浅部组织选自：软脑膜组织、大脑皮质带状组织、海马、Virchow Robin空间、VR空间内的血管、海马、在脑下表面上的部分下丘脑、视神经和神经束、嗅球和突起物、以及其组合。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至大脑的一个或多个深部组织。在一些实施方案中，所述靶向的大脑表面或浅部组织位于在所述脑表面以下(或内部)4mm(例如5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、或者10mm)。在一些实施方案中，大脑的靶向深部组织包括大脑皮质丝带。在一些实施方案中，大脑的靶向深部组织包括间脑(例如下丘脑、丘脑、腹侧丘脑、底丘脑等)、后脑、豆状核、基底神经节、尾状核、豆状核、杏仁核、苍白球及其组合的一种或多种组织。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至一种或多种的小脑组织。在某些实施方案中，所述靶向的一种多种小脑组织选自：分子层组织、浦肯野氏细胞层组织、颗粒细胞层组织、小脑脚、及其组合。在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至一种或多种小脑组织，包括但不限于浦肯野氏细胞层组织、颗粒细胞层组织、小脑深部白质组织(例如相对于颗粒细胞层的深部)、和小脑深部核组织。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至一种或多种脑干组织。在一些实施方案中，所述靶向的一种或多种脑干组织包括脑干白质组织和/或脑干核组织。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至多种脑组织，包括但不限于灰质、白质、脑室周围区域、软膜蛛网膜、脑膜、新皮质、小脑、大脑皮层中的深部组织、分子层、尾状核/豆状核区域、中脑、脑桥或者延髓的深部区域及其组合。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至在脑中的多种细胞，包括但不限于神经元、胶质细胞、血管周细胞和/或脑膜细胞。在一些实施方案中，治疗性蛋白质被递送至深部白质的少突胶质细胞。
脊髓
一般而言，脊髓的区域或者组织可以根据组织深度的特点区分。例如，脊髓组织可以区分为表面或者浅部组织、中层深度组织、和/或深部组织。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至脊髓的一种多种表面或者浅部组织。在一些实施方案中，靶向的脊髓的表面或浅部组织位于距离所述脊髓表面4mm以内。在一些实施方案中，靶向的脊髓的表面或浅部组织含有软脑膜和/或束状的白质。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至所述脊髓的一种或多种组织。在一些实施方案中，脊髓的靶向深部组织位于距所述脊髓表面内部4mm。在一些实施方案中，脊髓的靶向深部组织含有脊髓灰质和/或室管膜细胞。
在一些实施方案中，治疗试剂(例如酶)被递送至脊髓的神经元。
外周靶组织
如本文使用的，外周器官或组织是指那些不是所述中枢神经系统(CNS)组成部分的任意器官或组织。外周靶组织可以包括，但不限于血液系统、肝脏、肾脏、心脏、内皮、骨髓和骨髓来源的细胞、脾脏、肺脏、淋巴结、骨、软骨、卵巢和睾丸。在一些实施方案中，根据本发明的治疗性蛋白质(例如替代酶)被递送至一种或多种外周靶组织。
生物分布和生物药效率
在多种实施方案中，一旦递送至所述靶组织，治疗试剂(例如替代酶)被定位到细胞内。例如，治疗试剂(例如酶)可以定位至靶细胞(例如神经元，例如浦肯野细胞)的外显子、轴突、溶酶体、线粒体或者液泡。例如，在一些实施方案中，鞘内施用的酶展示易位动态，使得所述酶在所述血管周空间以内移动(例如通过脉动辅助对流机制)。此外，与将所述施用蛋白质或者酶与神经丝结合有关的活性轴突运输机制可能有助于或者促进鞘内施用蛋白质或者酶分布进入所述中枢神经系统的深部组织。
在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)可在多种本文描述的靶组织中，实现治疗(或临床)的效果水平(或活性)。如本文使用的，治疗(或临床)的效果水平(或活性)是这样的水平，其能在靶组织中提供足够的治疗效果。所述治疗效果可以是客观的(即通过某种测试或标记物进行可以测量的)或者主观的(即受试者给出的指示或者感觉的效果)。例如，治疗(或临床)的效果水平(或活性)可以是这样的酶水平或者活性：其可以足够地减缓与在所述靶组织中的疾病相关的症状(例如GAG储存)。
在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)可以实现的酶水平或者活性是：相对于在靶组织中的溶酶体酶的正常水平或者活性的至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％。在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)可以实现的酶水平或者活性是：相对于对照(例如没有进行所述治疗时的内源水平或者活性)，以至少1-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍或者10-倍地增加。在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)可以达到增加的酶水平或者活性是：在靶组织中，至少约10nmol/hr/mg、20nmol/hr/mg、40nmol/hr/mg、50nmol/hr/mg、60nmol/hr/mg、70nmol/hr/mg、80nmol/hr/mg、90nmol/hr/mg、100nmol/hr/mg、150nmol/hr/mg、200nmol/hr/mg、250nmol/hr/mg、300nmol/hr/mg、350nmol/hr/mg、400nmol/hr/mg、450nmol/hr/mg、500nmol/hr/mg、550nmol/hr/mg或者600nmol/hr/mg。
在一些实施方案中，根据本发明发明的方法对于靶向腰区特别有用。在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)可以达到的增加的酶水平或者活性是：在所述腰区中，至少约500nmol/hr/mg、600nmol/hr/mg、700nmol/hr/mg、800nmol/hr/mg、900nmol/hr/mg、1000nmol/hr/mg、1500nmol/hr/mg、2000nmol/hr/mg、3000nmol/hr/mg、4000nmol/hr/mg、5000nmol/hr/mg、6000nmol/hr/mg、7000nmol/hr/mg、8000nmol/hr/mg、9000nmol/hr/mg、或者10,000nmol/hr/mg。
一般而言，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)在CSF以及脑、脊髓和外周器官的靶组织中具有充分长的半衰期。在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)可以具有的半衰期：至少约30分钟、45分钟、60分钟、90分钟、2小时、3小时、4小时、5小时、6小时、7小时、8小时、9小时、10小时、12小时、16小时、18小时、20小时、25小时、30小时、35小时、40小时、多达3天、多达7天、多达14天、多达21天或者多达一月。在一些实施方案中，在一些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)可以在CSF或者血流中持有可检测的水平或者活性，在施用的12小时、24小时、30小时、36小时、42小时、48小时、54小时、60小时、66小时、72小时、78小时、84小时、90小时、96小时、102小时、或一周后。可检测的水平或者活性可以使用本领域已知的方法测定。
在某些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)达到的浓度是：在施用后(在鞘内施用所述药物组合物至所述受试者后的例如1周、3天、48小时、36小时、24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少)的所述受试者的所述CNS组织和细胞中，至少30μg/ml。在某些实施方案中，根据本发明递送的治疗试剂(例如替代酶)在施用至受试者(例如在鞘内施用这种组合物至所述受试者1周、3天、48小时、36小时、24小时、18小时、12小时、8小时、6小时、4小时、3小时、2小时、1小时、30分钟或更少时间之后)后，在所述受试者的靶组织或细胞中(例如脑组织或神经元)，达到的浓度为：至少20μg/ml、至少15μg/ml、至少10μg/ml、至少7.5μg/ml、至少5μg/ml、至少2.5μg/ml、至少1.0μg/ml或者至少0.5μg/ml。
通过鞘内施用治疗溶酶体贮积症
所述溶酶体贮积症表示导致溶酶体功能缺陷的一组相对稀少的遗传代谢疾病。所述溶酶体疾病的特征在于在溶酶体内部(参见表1)未消化大分子的累积，包括这些酶底物，这导致这种溶酶体体积和数量的增加，并最终导致细胞机能障碍和临床异常。
本文描述的发明方法能有利地促进一种或多种治疗试剂(一种或多种替代酶)递送至靶细胞器。例如，因为溶酶体贮积症(例如亨特综合症)的特征在于粘多糖(GAG)在受影响细胞的溶酶体中的累积，所述溶酶体表示所述治疗的溶酶体贮积症的预期靶细胞。
本发明的发明方法和组合物对于具有CNS病因或组件的这些疾病的治疗特别有用。具有CNS病因或组件的溶酶体贮积症，包括例如不限于：Sanfilippo综合症类型A、Sanfilippo综合症类型B、亨特综合症、异染性脑白质营养不良和球细胞脑白质营养不良。在本发明之前，传统治疗限于：将其静脉施用至受试者，并且通常仅对治疗潜在的酶缺乏的躯体症状有效。本发明的这些组合物和方法可以有利地直接施用至患有具有CNS病因的疾病的受试者的CNS，从而在所述CNS的受影响细胞和组织(例如脑)中达到治疗浓度，从而克服与传统全身施用这种治疗试剂相关的限制。
在一些实施方案中，本发明的发明方法和组合物对于治疗溶酶体贮积症的(神经病学的和身体的)后遗症或症状有用。例如，本发明的一些实施方案，关于递送(例如鞘内地、脑室内地或者脑池内地)一种或多种治疗试剂至受试者的CNS的组合物和方法，为了治疗所述CNS或者溶酶体贮积症的或者神经病学后遗症和表现，同时也治疗所述溶酶体贮积症的系统的或身体的表现。例如，本发明的一些组合物可以鞘内施用至受试者，从而递送一种或多种治疗试剂至所述受试者的所述CNS，并且治疗所述神经病学后遗症；联合静脉施用一种或多种治疗试剂以递送这种治疗试剂至体循环(例如心脏、肺脏、肝脏、肾脏或者淋巴结的细胞和组织)的细胞和组织(两者都包括)，从而治疗所述身体的后遗症。例如，具有或者其它受到溶酶体贮积症(例如亨特综合症)影响的受试者，可以被鞘内施用药物组合物，所述药物组合物包括一种或多种治疗试剂(例如艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶)，至少每周、两周，每月、两月或更多时间一次，以治疗所述神经病学的后遗症；同时不同的治疗试剂被静脉施用至所述受试者，更频繁地(例如，每天一次，隔日一次，一周或每周三次)，以治疗所述疾病系统的或者身体的表现。
例如，患有亨特综合症的患者在脑中表现组织学变化，包括萎缩症、皮层神经元增大、脑白质减少、扩张的血管周围间隙和浦肯野细胞树突增大。磁共振图像/光谱研究已经表明：严重的弥漫性病变(包括白质、脑萎缩症和脑水肿)在具有认知障碍的患者中更加常见，与没有损伤的患者相比(Vedolin，L.，等，AJNR Am J Neuroradiol(2007)28，1029-1033)。即使没有极端神经病学后遗症(例如智力迟钝或者发育迟缓)的患者，也表现具有脑异常，包括萎缩症、脑室扩大和扩大的血管周围间隙(Matheus，MG，等，Neuroradiology(2004)46，666-672.)。
作为非限定性实施例，黏多糖贮积症类型IIIA(MPS IIIA；Sanfilippo综合症类型A)是Sanfilippo综合症类型A最严重的形式，并且影响全球每100,000人中的约1个。Sanfilippo综合症类型A(Sanfilippo A)的特征在于乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)的缺乏，一种参与粘多糖(GAG)硫酸乙酰肝素在溶酶体中的分解代谢的exosulfatase(Neufeld EF，等The Metabolicand Molecular Bases ofInherited Disease(2001)pp.3421-3452)。在缺乏这种酶的情况下，GAG硫酸乙酰肝素在神经元和胶质细胞的溶酶体中累积，伴随在脑外累积的减少。
作为非限定性实施例，黏多糖贮积症类型IIIB(MPS IIIB；Sanfilippo综合症类型B病)是一种常染色体隐形遗传疾病，其特征在于α-N-鲸蜡基-氨基葡糖苷酶(Naglu)的缺乏。在缺乏这种酶时，GAG硫酸乙酰肝素在神经元和胶质细胞的溶酶体中累积，伴随在脑外累积的减少。
作为非限定性实施例，球细胞脑白质营养不良(GLD)是一种由于半乳糖脑苷脂酶(GALC)功能缺乏导致的稀有常染色体隐形遗传溶酶体贮积症。GALC是一种可溶性溶酶体酸性水解酶：其将半乳糖基神经酰胺(髓磷脂的正常组件)降解成为半乳糖和神经酰胺；并将鞘氨醇半乳糖苷(半乳糖基神经鞘氨醇)(半乳糖基神经酰胺合成的有毒副产物)降解成为半乳糖和神经鞘氨醇。GALC缺乏以两种相关的但是不同的途径。导致中枢和外周神经系统(分别称为CNS和PNS)的损失。所述第一途径导致过量鞘氨醇半乳糖苷累积，伴随成髓鞘细胞的最终细胞凋亡。在所述第二途径中，半乳糖基神经酰胺累积，并且在激活的小胶质细胞中被吞噬，产生了特征性的球细胞(所述疾病因此而命名)。与其他累积未降解底物的其他溶酶体贮积症对比，在神经组织中总的半乳糖基神经酰胺通常没有增加。
所述疾病定义的临床特征使中枢神经系统(CNS)衰退，其导致主要发育标志事件的损失或者未能实现。所述进行性的认知能力下降在痴呆和过早死亡中到达高潮。所述疾病通常表现在幼童中(早发性GLD)，或者在任意年龄段(晚发性GLD)。受早发性GLD影响的个体的寿命通常不超过两年的年龄。晚发性GLD可以在个体的任何年龄段出现，并且所述疾病的进展可以变化很大。
异染性脑白质营养不良并病(MLD)是常染色体隐形遗传疾病，其导致Arylsulfatease A(ASA)酶的缺乏。ASA，其是由人类ARSA基因编码的，是降解脑苷脂3-硫酸盐或者鞘脂类3-O-磺基半乳糖基神经酰胺(硫脑苷酯)成脑苷脂和硫酸盐的酶。在缺乏这种酶时，硫脑苷酯在神经系统(例如髓鞘、神经元和胶质细胞)中累积，并且在内脏器官中以较小的程度累积。这些分子和细胞事件的后果是进行性的脱髓鞘和轴突损失(在所述CNS和PNS中)，其伴随着临床上严重的运动和认知障碍。
这种疾病的定义的临床特征是中枢神经系统(CNS)衰退，其导致认知障碍(例如智力迟钝、神经紊乱和失明等等)。
作为非限定性实施例，MLD能够表现在幼童(晚期婴儿形式)中，其影响儿童，通常正好在其生命的第一年(例如在大约15-24月)开始表现症状，然后通常不会存活超过5岁。MLD可以在儿童中表现(幼态形式)，其影响儿童，通常表现在大约3-10岁之间的认知障碍，并且寿命可以变化(例如在发生症状后的10-15年的范围)。MLD可以在成人中表现(成人发病形式)，并且能够在个体的任何年龄出现(例如通常地在16岁或者更晚)，并且所述疾病的进展可以变化很大。
因此，在一些实施方案中，发明的方法和组合物递送一种或多种治疗试剂(一种或多种替代酶)至所述脑、脊髓和/或外周器官的靶组织和细胞的一种或多种细胞器(例如溶酶体)中，以影响治疗多种溶酶体贮积症。如本文使用的，所述术语“处理”或“治疗”，如本文使用的，是指：与所述疾病并发的一种或多种症状的转佳，阻止或者延缓所述疾病的一种或多种症状的发生，和/或减轻所述疾病的一种或多种症状的严重程度或频率。
在一些实施方案中，治疗是指：在患有或者易患有溶酶体疾病的患者中，使神经学损伤的严重程度和/或发生率部分地或者完全地缓解、转佳、减轻、抑制、延缓发生、降低。如本文使用的，所述术语“神经学损伤”包括：与中枢神经系统(例如脑和脊髓)损伤并发的多种症状。神经学损伤的症状包括：例如发育迟缓、进行性的认知障碍、听力损失、言语发展障碍、运动技能缺陷、活动过度、攻击性和/或睡眠障碍等等。
在一些实施方案中，治疗是指在多种组织中，溶酶体贮积(例如储存的巨大分子，例如GAG)的减少。在一些实施方案中，治疗是指在脑靶组织、脊髓神经元、和/或外周靶组织中，溶酶体贮积的减少。在某些实施方案中，溶酶体贮积相对于对照，以大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多地减少。在一些实施方案中，溶酶体贮积相对于对照，以至少1-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍或10-倍地减少。在一些实施方案中，溶酶体贮积以溶酶体贮藏粒(例如斑马-条纹形态)的存在进行量度。
在一些实施方案中，治疗是在神经元(例如含有浦肯野细胞的神经元)中液泡化的减少。在某些实施方案中，在神经元中的液泡化相对于对照，以大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或更多地减少。在一些实施方案中，液泡化相对于对照，以至少1-倍、2-倍、3-倍、4-倍、5-倍、6-倍、7-倍、8-倍、9-倍或者10-倍地减少。
在某些实施方案中，根据本发明的治疗导致与所述溶酶体贮积症并发的一种或多种病理学或生物学标记物的存在(或者可选择地，累积)的降低(例如大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、90％、95％、97.5％、99％或更多降低)或者完全消除。这种降低或者消除可以特别地明显，在所述CNS的细胞和组织(例如神经元和少突胶质细胞)中。例如，在一些实施方案中，在施用本发明的药物组合物至受试者后，在所述受试者的所述CNS细胞和组织中(例如，在所述大脑皮层、小脑、尾状核和豆状核、白质和/或丘脑中)，表现或实现了生物标记物溶酶体相关膜蛋白1(LAMP1)累积的降低。LAMP1是在溶酶体膜中高度表达的糖蛋白，并且它在许多患有溶酶体贮积症的患者中升高(Meikle，等Clin Chem.(1997)43：1325-1335.)。在患有溶酶体贮积症的患者中，LAMP1的存在或者缺乏(例如由LAMP染色测定的)，从而为溶酶体贮积症的诊断或者监测提供了有用的溶酶体活性指示和标记物。
因此，本发明的一些实施方案，关于以下的方法：降低或者消除与疾病(例如溶酶体贮积症)并发的一种或多种病理学或生物学标记物的存在(或累积)。相似地，本发明的一些实施方案，关于以下的方法：增加与溶酶体贮积症并发的一种或多种病理学或生物学标记物(例如，LAMP1)的降解(或降解率)。
在一些实施方案中，治疗是指认知能力丧失的进展减少。在某些实施方案中，认知能力丧失的进展相对于对照，以大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或者更多地减少。在一些实施方案中，治疗是指发展迟缓的减少。在某些实施方案中，发育迟缓相对于对照，以大约5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或者更多地减少。
在一些实施方案中，治疗涉及增加的存活率(例如存活时间)。例如，治疗能导致患者预期寿命的增加。在一些实施方案中，根据本发明的治疗导致患者预期寿命增加，相对于患有类似疾病而没有治疗的一个或多个个体对照的平均预期寿命，以多于大约5％、大约10％、大约15％、大约20％、大约25％、大约30％、大约35％、大约40％、大约45％、大约50％、大约55％、大约60％、大约65％、大约70％、大约75％、大约80％、大约85％、大约90％、大约95％、大约100％、大约105％、大约110％、大约115％、大约120％、大约125％、大约130％、大约135％、大约140％、大约145％、大约150％、大约155％、大约160％、大约165％、大约170％、大约175％、大约180％、大约185％、大约190％、大约195％、大约200％或更多地增加。在一些实施方案中，根据本发明的治疗导致患者预期寿命增加，相对于患有类似疾病而没有治疗的一个或多个个体对照的平均预期寿命，以多于大约6月、大约7月、大约8月、大约9月、大约10月、大约11月、大约12月、大约2月、大约3月、大约4月、大约5月、大约6月、大约7月、大约8月、大约9月、大约10年或者更多地增加。在一些实施方案中，根据本发明的治疗导致患者的长期存活。如本文使用的，所述术语“长期存活”是指存活时间或者预期寿命长于大约40年、45年、50年、55年、60年、或更长时间。
所述术语“改善”、“增加”或“减少”如本文使用的，表示指示相对于对照的值。在一些实施方案中，合适的对照是基线测量，例如在启动本文描述的治疗之前的相同个体内的测量，或者在缺乏本文描述的治疗的对照个体(或多个对照个体)内的测量。“对照个体”是受所述相同疾病折磨的个体，并且其处于与正被治疗的个体相同的年龄和/或者性别(以确保被治疗的所述疾病的阶段和所述对照个体具有可比性)。
正被治疗的所述个体(也称为“患者”或“受试者”)是这样的个体(胎儿、婴儿、儿童、青少年或成年人类)：其患有所述疾病或者具有发展为所述疾病的潜力。所述个体具有残留的内源性溶酶体酶表达和/或活性、或者不可测量的活性。例如，患有Sanfilippo综合症类型A的所述个体可以具有的HNS表达水平，比正常HNS表达水平，低大约30-50％、低大约25-30％、低大约20-25％、低大约15-20％、低大约10-15％、低大约5-10％、低大约0.1-5％。
免疫耐受性
通常，鞘内施用根据本发明的治疗试剂(例如替代酶)在所述受试者中不导致严重的不良反应。如本文使用的，严重的不良反应包括但不限于，基本免疫应答、毒性或者死亡。如本文使用的，所述术语“基本免疫应答”是指严重的免疫应答，例如适应性T-细胞免疫应答。
因此，在许多实施方案中，根据本发明发明的方法不涉及并发免疫抑制疗法(例如在与所述方法平行进行的作为预处理/预调节使用的许多免疫抑制剂治疗)。在一些实施方案中，根据本发明发明的方法不包括在所述被治疗的受试者中的免疫耐受诱导。在一些实施方案中，根据本发明发明的方法不涉及使用T-细胞免疫抑制剂进行的预处理或预调节。
在一些实施方案中，治疗试剂的鞘内施用可以发动针对这些试剂的免疫应答。因此，在一些实施方案中，它对于使得接受所述替代酶的所述受试者容忍所述酶替代疗法有用。免疫耐受性可以使用多种现有技术的方法诱导。例如，可以使用的方法：最初30-60天方案的T-细胞免疫抑制剂，例如环孢霉素A(CsA)和抗增殖剂(例如硫唑嘌呤(Aza))，并结合每周鞘内注射低剂量的预期替代酶。
对本领域技术人员已知的任何免疫抑制剂疗法，可以与本发明的组合疗法一起采用。这种免疫抑制剂包括但不限于：环孢霉素、FK506、纳巴霉素、CTLA4-Ig、和抗TNF试剂(例如依那西普)(参见例如Moder，2000，Ann.Allergy Asthma Immunol.84，280-284；Nevins，2000，Curr.Opin.Pediatr.12，146-150；Kurlberg et al.，2000，Scand.J.Immunol.51，224-230；Ideguchi etal.，2000，Neuroscience95，217-226；Potteret al.，1999，Ann.N.Y.Acad.Sci.875，159-174；Slavik et al.，1999，Immunol.Res.19，1-24；Gaziev et al.，1999，Bone Marrow Transplant.25，689-696；Henry，1999，Clin.Transplant.13，209-220；Gummert et al.，1999，J.Am.Soc.Nephrol.10，1366-1380；Qi et al.，2000，Transplantation69，1275-1283)。所述抗IL2受体(.α.-亚单位)抗体赛尼哌(例如Zenapax.TM.)，其被表明在移植患者中有效，也能作为免疫抑制剂使用(参见例如Wiseman et al.，1999，Drugs58，1029-1042；Beniaminovitz et al.，2000，N.Engl J.Med.342，613-619；Ponticelli et al.，1999，Drugs R.D.1，55-60；Berard et al.，1999，Pharmacotherapy19，1127-1137；Eckhoff et al.，2000，Transplantation69，1867-1872；Ekberg et al.，2000，Transpl.Int.13，151-159)。其它免疫抑制剂包括但不限于：抗-CD2(Branco et al.，1999，Transplantation68，1588-1596；Przepiorka et al.，1998，Blood92，4066-4071)，抗-CD4(Marinova-Mutafchieva et al.，2000，ArthritisRheum.43，638-644；Fishwild et al.，1999，Clin.Immunol.92，138-152)，和抗-CD40配体(Hong et al.，2000，Semin.Nephrol.20，108-125；Chirmule et al.，2000，J.Virol.74，3345-3352；Ito et al.，2000，J.Immunol.164，1230-1235)。
施用
本发明的方法考虑到：单一以及多个治疗有效量的本文所描述的所述治疗试剂(例如替代酶)的施用。治疗试剂(例如替代酶)可以根据所述受试者的病情(例如溶酶体贮积症)的特性、严重程度和范围，以有规律的间隔施用。在一些实施方案中，治疗有效量的本发明治疗试剂(例如替代酶)可以周期性地鞘内施用，以有规律的间隔(例如一年一次、6个月一次、每五个月一次、每三个月一次、两月一次(每两个月一次)、每月一次(每月一次)、两周一次(每两周一次)、每周一次)。
在一些实施方案中，鞘内施用可以连同其它施用途径使用(例如静脉内的、皮下地、肌肉内的、肠胃外地、经皮肤地、或者经黏膜地(或者口服地或经鼻地))。在一些实施方案中，这些施用途径(例如静脉施用)执行的频率不多于两周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次、每年一次施用。
如本文使用的，所述术语“治疗有效量”很大程度上，是基于在所述本发明药物组合物中的治疗试剂的总量决定的。通常的，治疗有效量对于所述受试者足够能实现有意义的好处(例如治疗、调整、治愈、阻止和/或改善所述潜在的疾病或病情)。例如，治疗有效量可以是足够实现预期治疗和/或预防性效果的量，并且这种量足够调节溶酶体受体或者他们的活性，从而治疗这种溶酶体贮积症或者其症状(例如在施用本发明组合物至受试者后，使“斑马小体”或者细胞液泡化的存在或者发生率减少或者消除。通常，治疗试剂(例如溶酶体酶)的量(施用至需要其的受试者)将根据所述受试者的特性变化。这种特性包括：所述受试者的病情、疾病严重程度、健康状况、年龄、性别和体重。一个本领域技术人员将根据这些和其它相关因素，容易地决定合适的剂量。另外，客观的和主观的分析都可以任选地采用，以识别最优剂量范围。
治疗有效量通常施用的剂量方案，包括多个单位剂量。对特定的治疗性蛋白质，治疗有效量(和/或在有效给药方案内的合适的单位剂量)可能会变化，例如根据结合其它药物试剂的施用途径。而且，对于特定患者的特定治疗有效量(和/或单位剂量)可以根据多种因素改变，包括正被治疗的疾病和所述疾病的严重程度、所采用的特定药物试剂的活性；所采用的特定组合物；所述受试者的年龄、体重、健康状况、性别和饮食；所采用的特定融合蛋白的施用时间、施用途径和/或排泄率或代谢率；所述治疗的持续时间；以及在医药领域已知的类似因素。
在一些实施方案中，所述治疗有效剂量的范围：从大约0.005mg/kg脑重量至500mg/kg脑重量，例如，从大约0.005mg/kg脑重量至400mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至300mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至200mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至100mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至90mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至80mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至70mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至60mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至50mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至40mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至30mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至25mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至20mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至15mg/kg脑重量，从大约0.005mg/kg脑重量至10mg/kg脑重量。
在一些实施方案中，所述治疗有效剂量是：大于约0.1mg/kg脑重量，大于约0.5mg/kg脑重量，大于约1.0mg/kg脑重量，大于约3mg/kg脑重量，大于约5mg/kg脑重量，大于约10mg/kg脑重量，大于约15mg/kg脑重量，大于约20mg/kg脑重量，大于约30mg/kg脑重量，大于约40mg/kg脑重量，大于约50mg/kg脑重量，大于约60mg/kg脑重量，大于约70mg/kg脑重量，大于约80mg/kg脑重量，大于约90mg/kg脑重量，大于约100mg/kg脑重量，大于约150mg/kg脑重量，大于约200mg/kg脑重量，大于约250mg/kg脑重量，大于约300mg/kg脑重量，大于约350mg/kg脑重量，大于约400mg/kg脑重量，大于约450mg/kg脑重量，大于约500mg/kg脑重量。
在一些实施方案中，所述治疗有效剂量也可以通过mg/kg体重定义。作为本领域技术人员，将理解：所述脑重量和体重是相关的。DekabanAS.“Changes in brain weights during the span of human life：relation of brainweights to body heights and body weights，”Ann Neurol1978；4：345-56。因此，在一些实施方案中，所述剂量可以根据在表4中所示的进行转化。
表4剂量转化
在雄性的脑重量、体重和年龄之间的相关性
年龄(年)      脑重量(kg)      体重(kg)
3(31-43个月)  1.27            15.55
4-5           1.30            19.46
在一些实施方案中，所述治疗有效剂量可以通过mg/15cc的CSF定义。作为本领域技术人员，将理解：根据脑重量和体重，将治疗有效量转化成mg/15cc的CSF。例如，在成年人类中的CSF的体积为约150mL(Johanson CE，et al.“Multiplicity of cerebrospinal fluid functions：Newchallenges in health and disease，”cerebrospinal fluid Res.2008May14；5：10).。因此，单剂量注射0.1mg至50mg蛋白质至成年人，在成年人中将会是约0.01mg/15cc的CSF(0.1mg)至5.0mg/15cc的CSF(50mg)剂量。
进一步可以理解，对于任意特定的受试者，随着时间的过去，根据所述个体需要和施用并监督(所述酶替代治疗的施用)的人员的专业判断，应该调整特定剂量方案，并且本文提出的给药范围仅仅是示例性的，并不打算限制本发明要求的范围或实践。
试剂盒
本发明进一步提供了试剂盒或者含有本发明所述制剂的其它制品，并提供了其再生(如果冻干)和/或使用的指导。试剂盒或其它制造业制品可以包括容器、IDDD、导管和其它对于鞘内施用和相关手术有用的制品、设备或装置。合适的容器包括，例如瓶子、小药瓶、注射器(例如载药注射器)、安瓿、药筒、贮液囊、或(装有冻干粉和稀释剂的)二室注射器给药系统(lyo-ject)。所述容器可以用多种材料(例如玻璃或者塑料)形成。在一些实施方案中，容器是载药注射器。合适的载药注射器包括，但不限于，具有烘干的硅树脂涂层的硼硅酸盐玻璃注射器、喷涂硅树脂的硼硅酸盐、或者无硅树脂的塑料树脂注射器。
通常地，所述容器可以容纳制剂，并在其上具有标签，或者与之相关地，所述容器可以指示再生和/或施用的指导。例如，所述标签可以指示：再生所述制剂至上文所描述的蛋白质浓度。所述标签可以进一步指示：所述制剂是有用的，或者打算用于(例如)IT施用。在一些实施方案中，容器可以含有单剂量的稳定制剂，所述制剂含有治疗试剂(例如替代酶)。在多种实施方案中，单剂量的所述稳定的制剂以小于大约15ml、10ml、5.0ml、4.0ml、3.5ml、3.0ml、2.5ml、2.0ml、1.5ml、1.0ml、或者0.5ml的体积存在。可选择地，持有所述制剂的容器可以是多用途的小药瓶，其允许重复施用(例如2-6次施用)所述制剂。试剂盒或者制品可以进一步包括第二容器，所述第二容器包括合适的稀释剂(例如BWFI、生理盐水、缓冲的生理盐水)。在将所述稀释剂和所述制剂混合后，在所述再生的制剂中的所述最终蛋白质浓度通常可以是：至少1mg/ml(例如至少5mg/ml、至少10mg/ml、至少25mg/ml、至少50mg/ml、至少75mg/ml、至少100mg/ml)。试剂盒或者制品可以进一步包括其它(从商业和用户的角度看)理想的材料，其包括其它缓冲剂、稀释剂、过滤器、针头、IDDD、导管、注射器和具有使用指南的包装说明书。
通过参考以下的实施例，本发明将更充分地被理解。但是这些用于解释的实施例不限制本发明的范围。所有文献引用通过参考的方式并入本文。
实施例
IT递送GalC蛋白的实施例
实施例1：用于鞘内递送的Galc制剂的理化特征
本实施例中描述GalC的理化特性用于了解在鞘内(IT)递送的蛋白质的过程中的不同溶液环境下，其行为和稳定性。
除其它事项外，本实施例描述了GalC制剂，其对于IT成功递送GalC而言这是非常重要的。在一些实施方案中，该制剂包括5mM磷酸钠+150mM NaCl，pH6.0+0.005％聚山梨醇酯20。在一些实施方案中，该制剂包括＜5mM，＜10mM，＜15mM和＜20mM的磷酸钠。在一些实施方案中，该制剂包括pH值≥5.5和pH值≤7.0的150mM NaCl。
PBS递送不同的磷酸摩尔浓度和pH值的媒介物，在成年食蟹猴(图3)中进行了测试。在5.5-7.0pH范围内的5mM磷酸盐显示没有不利的影响，而pH为7.0-7.5的20mM磷酸盐和pH值7.5-8.0的10-20之间的mM磷酸盐显示在所述猴子中产生不利影响(图3)。研究了hGalC(1mg/ml)在3mM的柠檬酸盐，磷酸盐和50mM NaCl硼酸盐缓冲液中的热稳定性，作为pH5.0-8.0范围内(图4)的pH函数。在基线(20-25℃)测定hGalC比活性，并在2周40℃下，在pH为6.0-6.5(图4)之间保持的最高比活度。另外，在3个月5℃下测量hGalC比活度，为pH为6.0-6.5(图5)之间保持的最高比活度。测量hGalc熔解温度作为pH值(表5)函数，并在不同的制剂(表6)中独立测量。
表5：hGalC(1mg/mL)的熔解温度作为pH值(表5)的函数
*[GalC]＜1mg/mL(由于沉析)
表6：在不同的制剂中hGalC(1mg/mL)的熔解温度
hGalC的热稳定性，由在～3周5℃下和2周40℃下保持hGalC比活度来测定，亦进行评估作为盐浓度函数(图6)。结果表明：在3周5℃下的各种盐(浓度范围从5mM磷酸盐+50mM NaCl(本文缩写为5+50)到50mM磷酸盐+150mM氯化钠(本文缩写为50+150)中，pH为6.5(图6)时，hGalC保持高比活度。
hGalC的沉降分析
沉降速度为分析超速离心法(AUC)方法，其测量分子响应于在离心机中产生的离心力的移动速率，是一种用于测定溶液中蛋白质的缔合状态的有用技术。所述第一沉降速度运行为人类GalC在5mM的磷酸钠，pH为6.0的150mM NaCl(图7)中的稀释系列，以评估样品的自缔合作用和/或非理想状态。所述稀释系列被绘制为在各浓度下归一g(*)曲线(g(s*))vs s*)。在稀释时，曲线向下限s值的一般移位指示解离，其为快速可逆自缔合系统。与不同离子强度(图7A，B&C)相比较，很明显，在升高的离子强度时，曲线组转移到下限s值，指示离子相互作用也参与了关联过程，而且较高盐浓度下，所述自缔合作用下降。
与hGalC相比较，在相同的时间150mM NaCl下，也运行小鼠GalC。比较相应的离子强度(150mM NaCl)，很明显，mGalC自缔合作用的自由能小于hGalC。在约20S切断图7中的曲线，以更清楚地显示解离；然而，使用的广泛分布分析(WDA)来分析这些运行，而且在对数标度上绘制结果时，可见清楚的高聚集体(*＞20S)。所述聚合高低聚物，在50mM NaCl(图8)下是特别可见的，在10mM NaCl中有所下降，而目前，在500mMNaCl，pH6.0下显著降低。从最高浓度，每个离子强度的所述WDA曲线绘制在图8中。
在pH6.0的通用缓冲液中的自缔合
在通用缓冲液的这些条件下，在约相同量级的磷酸盐缓冲液中，pH6.0，出现自缔合作用，如图9中所见。在通用缓冲中，也就pH值对hGalC自缔合作用能量的影响进行了研究。在pH值4.5，5.0，6.0，6.5，7.0和7.5进行系列稀释。在pH4.5和5.0，所述样品不溶，基本上100％hGalC沉淀析出，在上清液中不留下任何析可测量的物质。
PH的所述影响在图10中清楚地示出，其中在pH7.5时观察到最少量的自缔合作用，以及在pH6.0时观察到相当的自缔合作用。目前的趋势是，在具有较高的pH值下离子强度的变化中所看到的相似。同时增大离子强度和pH转移平衡，有利于最高浓度(约1.0mg/mL)下小的低聚物。通过三分之一系列稀释(见图7)减少浓度向最小样品转移平衡，会出现约5.2S的沉降系数。发生在约10-13S的峰可能表示5S样品的四聚体。适合这些数据的自缔合作用模型的努力，迄今未获成功，可能是由于不同程度的糖基化所产生的固有微异质性。
在pH 6.0的通用缓冲液中的自缔合
在稀释系列的实验(红→蓝→绿→黑)中，对在5mM磷酸钠，pH值为6.0，150mM NaCl中GalC的应激和基线样品进行了比较。最低浓度(黑色)～0.03mg/mL的结果为已平滑的，这就是为什么曲线似乎具有更少的干扰。在应激样品中有围绕ln(s*)＝3.0(～20S)的集合体，其比基线样品中的浓度高得多。其代表所述样品几乎恒定的部分，如其归一化的图(图11，图12，图13)中稀释的持久性所证明。因此其为不可逆的聚集体，摩尔质量至少为500kg/mol。
在溶液中的具有牛磺胆酸钠的hGalC
在牛磺胆酸钠(NaTC)(1％)中，所述自缔合作用显著降低。所述主边界移动到较低的s值，而较高的低聚反应被抑制(图14)。
具有5％右旋糖的hGalC
在5mM磷酸钠中，加入5％右旋糖到GalC，pH值为6.0，导致形成大的聚集体(图15)。18S处的峰对应的最小的摩尔质量约440kDa，而在56S处的峰对应的最小摩尔质量为2.4MDA，其具有延伸超出150S的尾部对应的摩尔质量大于10.0MDA。在此模式中从1.0到0.3mg/mL表示有非常小的变化，在沉淀实验中的时间刻度上，5-6个小时的期间时，这些低聚物大多是不可逆的。
hGalC固有荧光
进行hGalC(使用23Trp)的固有荧光研究，以评估pH值和盐浓度在分子间相互作用(图16和图17)中的角色。在500mM NaCl或1％NaTC(图16)中，分子间的相互作用最少(最高相对荧光在330nm-350nm之间)。在二级结构中观察到的小变化可作为pH的函数。在pH4.5和5.0(图17)下可观察到沉淀物。
总结
为了评估hGalC和mGalC的相对溶解度，使用聚乙二醇(PEG)-诱导的固相方法(Middaugh et al.，J.Biol.Chem.1979，254，367-370)。该方法允许以量化的方式测量蛋白质的相对溶解度。通过将每个GalC引入缓冲溶液(150mM NaCl的5mM磷酸钠，pH为6.0)到不同浓度的PEG(10kDa)中，进行了溶解度测量。蛋白质溶解度对数图vs.PEG浓度产生线性的趋势。制作表观溶解度到零PEG浓度的外推法，以得到各蛋白质的相对溶解度。mGalC vs.hGalC的相对溶解度没有任何区别。在hGalC溶解度实验中，在2-8℃(不同的盐浓度的5mM磷酸钠中，pH值6.0-6.5)，3周后，观察到无沉淀或失去活性。实现制剂5mM磷酸钠+150mM NaCl的溶解度(～30mg/mL)，pH为6.0，在2-8℃，50天后，没有观察到沉淀。
所述AUC数据表明，GalC的“天然”状态为浓度依赖性可逆的，与高阶低聚物相关。生物物理数据表明，有可能对高阶低聚物具功能和结构的重要性。在较高的pH值下，有较少的保留的活性，较低的Tm值和更均匀的系统，如AUC所确定的。在150mM NaCl的5mM磷酸钠中，pH为6.0，有可能为单体，四聚体和其它高阶物种之间的平衡。此外，在6.5-7.5的pH范围内，pH值不显著影响的AUC属性。总的来说，在测试缓冲液中，GalC系统是快速可逆的，高度的自缔合作用系统。
实施例2：单一鞘内给药或单一静脉弹丸注射125I-HGALC后，在Sprague-Dawley大鼠中的放射性药代动力学及组织分布
本实施例描述了示例性结果说明在单一的鞘内给药或静脉注射后，注射后在雄性Sprague-Dawley大鼠中125I-hGALC的药代动力学和组织分布。对全血、血清、红血细胞、脑脊髓液(CSF)和组织中的浓度和放射性活度含量进行测定，并对所得到的数据进行非房室的药代动力学分析。选择鞘内及静脉途径，因为其为人类中预期的施用途径。基于潜在的人体接触，现有的毒性和药代动力学数据及测试制品的任何限制施加来选择给药水平。选择大鼠进行研究，因为其为公认的用于药代动力学和组织分布研究的物种。本研究中所用的动物的数量为充分评估每个时间点预期变化及满足实验目标的最低需要。
材料和方法
试验系统
2009年4月15日，从Charles River Canada Inc.(St.Constant，Quebec，Canada)获得82只雄性SD大鼠(褐家鼠)。在治疗初期，动物约10-11周龄。2009年4月28日，从Charles River Canada获得另外的9只雄性大鼠；抵达时这些动物约9周龄，并要求确保有足够的插管的动物以完成研究的给药。
在治疗启动时，所述雄性大鼠的体重范围从342到453g。除了一个以外，所有雄性大鼠的体重均高于协议规定的范围(250-350g)，然而不考虑这个微小的偏差影响研究或获得数据，因为动物是健康的而且实际体重用于给药施用。
动物管理
到达PCS-MTL后，由合格的兽医人员对所有的动物进行常规体检。在获得的动物中无显著异常检测到。将动物单独安置在具有铁丝网底层和自动洒水阀的不锈钢笼内。对环境丰富化方案与SOP相应。每个笼子清楚地标有颜色编码的笼卡指示研究、组、动物数量和性别。使用纹身系统对每只动物标以唯一标识。在进行研究的过程中，环境条件被控制在目标温度和相对湿度分别为19到25℃和30～70％。除了由于安排活动中断外，光照时间为12小时光照和12小时黑暗。
饮食
除了在指定的程序过程中，所有的动物都可以自由采食标准认证的颗粒的商业实验室饮食(PMI Certified Rodent Diet5002：PMI NutritionInternational Inc.)。控制饮食中的污染物(例如：重金属、黄曲霉毒素、有机磷酸酯、氯代烃类、多氯联苯)允许的最大浓度并由制造商常规分析。适于人类消费(通过0.5μm抑菌聚碳酸酯过滤器过滤)的市政自来水随意提供给动物，除了指定程序外。有人认为，在膳食材料中没有已知的污染物可能会干扰研究目标。
驯化和随机化
至少为6天(2009年4月15日获得动物)或3天(2009年4月28日获得9个附加的动物)之间允许接收动物并手术放置鞘内插管，让动物变得适应于物理和环境条件。在驯化期间，对所有的动物称重，并随机使用以计算机为基础的随机化程序。使用体重作为参数分层后，进行随机化。在极端体重范围内的动物不被分配到组。
如下分配动物作为所述研究组：
表7
a：在鞘内给药后5分钟内，施用IV给药。
组1和组2中的每只大鼠接受约3μCi/动物的微量放射化学给药。组3的每只大鼠接受约6μGi/动物的微量放射化学给药。
鞘内给药制剂
在第一次施用鞘内给药的当天准备所述鞘内给药制剂。测量足够的125I-hGALC溶液，并添加到足够测量的未标记hGALC溶液中。加入测定体积的媒介物并轻轻混合整体。制备目标放射性水平约为150μCi/mL的浓度为3mg/mL的溶液。通过低蛋白质结合的过滤器(0.22μm GV PVDF过滤器单位)将所得制剂过滤到无菌的容器中，并保存在冰箱中(2-8℃)，避光，作为给药待用。
静脉给药制剂
在第一次施用静脉给药的当天准备所述静脉给药制剂。测量足够的125I-hGALC溶液，并添加到足够测量的未标记hGALC溶液中。加入测定体积的媒介物并轻轻混合整体。制备目标放射性水平约为3μCi/mL的浓度为0.3mg/mL的溶液。通过低蛋白质结合的过滤器(0.22μm GV PVDF过滤器单位)将所得制剂过滤到无菌的容器中，并保存在冰箱中(2-8℃)，避光，作为给药待用。
分析所述给药制剂
给药的每一天，在PCS-MTL上对每个放射性标记给药制剂进行分析，通过液体闪烁光谱法来测定治疗前和治疗后的放射性浓度。通过在媒介物中制备适当的给药制剂稀释液来测定放射性浓度并重复每个分析的稀释液等分。分析完成后(包括重复分析)丢弃其它的给药制剂。
计算测试制品的比活度
从放射性比活度的平均(给药前和后)测量水平和给药制剂测试制品(基于所提供的浓度)的总质量来计算给药制剂中的测试制品的比活度。
临床观察
除了动物到来和结束研究的日子只检查一次外，在整个驯化和研究期间，每天两次检查所有动物的死亡率和健康状况不佳的体征及对治疗的反应。每周进行详细检查。
体重
在驯化过程中、在手术前和给药施用的前一天，测量个体体重一次。在报道给药施用的前一天，只记录体重。
手术
在收到动物并动手术之间，允许的最低时间为6天(或9只附加的动物为3天)，让动物变得习惯实验室环境条件。所有的动物，包括备件，在手术当天和手术后又2天，接受单次肌内注射苄星青霉素G+普鲁卡因青霉素G抗生素。一般来说，在手术前和在第一次施用后约8小时，并认为其后必要，皮下施用丁丙诺啡0.05mg/kg。对有些动物，在第一次施用后约6小时施用丁丙诺啡，而不是8-12个小时。认为大鼠中半衰期的丁丙诺啡，此与协议中的偏差并不会影响这些动物的健康，因此，不会影响有效性或在研究中获得的数据。
准备动物(脖子的头盖骨到躯-胸区剃毛)进行手术。手术前用异氟醚/氧气将动物麻醉，并在整个手术过程中，在异氟烷气下保持麻醉。手术前、和手术过程结束时，同时在麻醉下，将平淡的润滑眼科剂施用给每只眼睛。在手术前、和第一次施用后的约24小时的时间间隔上的2个其它场合，每个动物通过皮下注射接受抗-炎性(卡洛芬在5mg/kg)药。
动物被放置在立体工作台内。从头盖骨的尾边缘到脖子分离制作约2厘米的皮肤切口。分离背颈部肌肉以暴露寰枕膜。用牵引器以方便接近所述膜。切开寰枕膜，而鞘内导管慢慢地插在尾部，直到导管置于腰部。用棉拭子去除多余的液体并干燥寰枕膜。紧随其后，使用粘合剂将导管泡锚定在膜上。一旦胶水干燥而且导管牢固固定，则移除牵引器。在头盖骨上制作具导管的小环及使用非吸收材料缝合连接泡。一旦导管被固定，其通过背胸部，在其中制作切口以放置接入端口。这是使用非吸收材料缝合的地方。
在颈部肌肉闭合之前，制作2mL的温生理盐水冲洗(即：约37.5℃)伤口上。使用可吸收材料简单间断缝合闭合肌肉。用2mL的温热生理盐水冲洗接入端口位点，并使用可吸收缝合线材料连续皮下缝合闭合皮肤。手术后，将外用抗生素软膏施用于手术部位后，并且此后每天一次，直到认为不必要。
在手术时间测定导管和接入端口的死体积。在手术当天和治疗日之间的预处理期间进行通畅检查。
治疗
在外科手术植入导管/接入端口之间允许的时间至少为7天，并开始治疗以便充分地恢复。鞘内给药前，如果必要的话，接入端口区域被剃光。使用葡萄糖酸氯己定和水清洗刺穿部位，用无菌水浸湿纱布擦拭所述站点，随后为聚维酮碘10％(第3代)。用针刺穿接入端口，连接到给药注射器而且缓慢施用测试制品。给药后，用碘酒擦拭所述位点，以限制污染。
该研究的第1天，组1动物通过缓慢弹丸鞘内注射施用制剂125I-hGALC到皮下腰椎接入端口，随后以0.04mL盐水冲洗，递送60μg/动物水平的目标给药以及约3μCi/动物的放射性给药。
该研究的第2天，组3动物通过缓慢弹丸鞘内注射施用制剂125I-hGALC到皮下腰椎接入端口，随后以0.04mL盐水冲洗，递送60μg/动物的目标给药水平以及约3μCi/动物的放射性给药。在缓慢弹丸鞘内注射的5分钟内，组3的动物也通过静脉导管接受静脉注射到尾静脉(3.33mL/kg)，随后以0.6mL盐水冲洗，以递送1mg/kg的目标给药水平，具有约3μCi/动物的放射性水平。
该研究的第2天，组2的动物也通过静脉导管到尾静脉(3.33mL/kg)，由静脉注射施用制剂125I-hGALC，随后以0.6mL盐水冲洗，以递送1mg/kg的目标给药水平，具有约3μCi/动物的放射性水平。
施用的体积基于最近的每只动物的实际体重。对充满制剂125I-hGALC以及排空的注射器的重量，在递送到动物后进行记录。在剂量制剂净重的基础上计算递送给每只动物的剂量，除去注射器中及配制给药中测量的放射性浓度。
在给药过程中，纱布可吸收任何给药制剂的少量回流，并根据计划的具体程序，通过液体闪烁计数来计数测试制品损失。注射器和静脉导管用于施用保留下来的制剂测试制品。根据计划的具体程序，对静脉导管及选定的鞘内接入端口/导管的放射性水平进行了分析。
样品收集
血/血清和组织
在给药后10分钟、30分钟和1、3、6、24，48和96小时后，从组1至组3的3只动物/时间点收集终端血液样品(最大可能的体积)。静脉内给药之前，在组3中鞘内施用，而且用于所述术语脊髓血液样品的定时基于静脉内给药的时间。在异氟醚麻醉下通过腹部大动脉放血，从安乐死的大鼠(组1，2和3，以及3备件动物)腹主动脉收集终端血液样品。约3mL血液(组1，2和3)被转移到合适的试管中(含有K3-EDTA)，提供的全血样品，并保持在湿冰上以待处理。对于组2和组3，以及备用的动物，额外的1.5mL血液被转移到含有柠檬酸钠的试管中，以分析凝血酶原时间(PTT)，活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白原。血液样品被存储在湿冰之上，在2700RPM和4℃下进行15分钟的离心分离。血浆样品在约80℃下冷冻贮存，在装运和由申请人指定的实验室中分析之前。来自备用动物的血浆作为空白样品，用于分析PTT，APTT和纤维蛋白原。其中获得不足的血容量以进行所有分析(组1，2和3)，然后用于放射性分析的血液具有优先权。
其余的血液(组1、2和3，以及3备用动物)被转移到含有凝血活化剂的试管中用于血清生产，在离心前的约30分钟的时间段后，让其在室温下凝结。从备用动物中收集的样品被用于评估来自非治疗动物的血液样品的凝结。
放血后，从组1至组3的3动物/时间点收集随后的组织，如：脂肪组织(肾脂肪)、肾上腺、骨(股骨)、脑、眼、心、肾、大肠、大肠内容物、肝、肺、肌肉(骨骼肌)、坐骨神经、小肠、小肠内容物、脊髓(腰椎、胸椎、颈椎)、脾、胃、胃内容物、甲状腺/甲状旁腺腺、膀胱内容物。
一旦收集，称重组织，然后处理及总放射性分析。上面提到的所有组织，以及终端的血液和血清，也从备用的动物中收集并被用于测定放射性的背景水平。其余的(动物)尸体被冷冻保存(-10℃至20℃)在指定的冰柜中，以便在被处置为生物废料之前允许放射性衰变。从组1和组3中在各时间点，从冷冻库中取回第一个动物尸体，解冻并除去接入端口和导管，以水冲洗，并验证剩余放射性。
脑脊液
在安乐死之前，尸检时，从所有动物收集脑脊液(CSF)样品。在给药10分钟、30分钟、1、3、6、24、48和96h后，处死从1到3组的三只动物/时间点。通过小脑延髓池移除CSF样品(最大的可行量)，使用立体表是必要的，以保持头部对齐。CSF被转移到光滑的试管中，并放置在湿冰上。进行处理一部分(约20μL)并分析总的放射性含量。也从备用动物中收集CSF并被用于测定放射性的背景水平。
测定背景放射性水平
从备用动物收集血液、血清和组织，用于测定组1，2和3中动物血液，血清和组织的背景放射性水平。从备用动物中收集CSF，用于测定CSF的背景放射性水平。
用于放射性测量的样品处理
除了血液、血浆、血清和CSF外，所有的样品收集后称重。对于所有的组，重复100μL称重等分的全血收集的K3-EDTA，用于分析放射性。用三氯乙酸(TCA)对全血蛋白质沉淀，按如下进行：将等体积的15％的TCA水溶液加入到到100μL称量的全血等分。通过涡旋混合样品(100μL全血+100μLTCA)，然后在4℃，10000rpm下进行约15分钟的离心分离，将上清液移到单独试管。进行分析上清液和沉淀放射性含量。
在2700rpm(1250rcf)，4℃下离心约10分钟分离血清之前，用于收集血清的血液在室温下保持约30分钟，允许凝结。然后保持血清样品在湿冰上，有待等分用于放射性分析(2×100μL称量等分)。堆积的红血细胞(从血清分离后得到)被保持在湿冰上，有待处理用于放射性分析。剩余的血清冷冻保存(--10℃到-20℃)。重复100μL称量等分全血和红血细胞(血清分离后获得，用等体积的去离子水(w/v)混合，并用Polytron乳化剂匀浆)，溶解在Soluene-350中，用过氧化氢脱色(30％w/v)，并用液体闪烁液混合，用于分析放射性。
所述TCA血液沉淀沉淀物溶解在35％的氢氧化四乙基铵(TEAH)中，用过氧化氢(30％w/v)脱色，用液体闪烁液混合用于放射性测量。膀胱内容物、TCA血上清液，重复称重的等分剂量制剂(稀释)、以及血清被直接与液体闪烁液混合用于放射性测量。在与液体闪烁液混合用于放射性测量之前，CSF(约10μL/等份)的重复称量等分溶解在35％TEAH中。
组织样品中完全溶解在35％TEAH中。然后在放射性测量之前，重复等分与用液体闪烁液混合。大肠内容物在已知体积的水中均一化。大肠内容物(LINC)匀浆，胃内容物(STC)和小肠内容物(SINC)的重复称量等分溶解在35％TEAH中并用液体闪烁液混合用于放射性测量。
放射性测量
根据标准作业程序(SOP)，由液体闪烁光谱进行放射性测量。每个样品计数为5分钟或2σ误差为0.1％，无论哪个先来。基于外部标准的频谱转移，由自熄校正将所有计数被转换为绝对放射活性(DPM)。从所有样品DPM值中消减适当的背景DPM值。背景消减之后，样品表现出的放射性小于或等于背景值，被视为零，用于所有后续的操作。
数据分析
放射性浓度
所有放射性测量进入到标准的计算机数据库程序(Debra版本5.2)用于计算样品中的放射性浓度(dpm/g和质量eq/g)和百分比-施用放射性。在给药溶液中的放射性测试制品的所测得的比活度(dpm/mg或适当的质量单位)的基础上，计算血液、血清、组织和CSF浓度为dpm/g和质量eq/g。在大鼠血液密度的基础上，将血液样品中的放射性浓度转换为质量eq/mL。计算总的组织内容物作为总器官重量。
药代动力学
血液、血清、CSF和组织中的总放射性的药代动力学(PK)特征，其特征在于：使用经过验证的计算机软件(WinNonlin，version3.2，PharsightCorp.，Mountain View，California，USA)，由非房室分析的浓度相对时间数据。在静脉和血管外给药途径的基础上选择模型。报告浓度值为不可检测或不可量化的；被视为缺席样品。在每个时间点，从不同动物得到浓度数据，而平均用来产生复合的药代动力学特征。10分钟采样(动物号：1001、1002、1003)组1和组2(动物号，2001、2002、2003)，而48小时组1(动物编号1019、1020)偏离超过10％或标称时间点6分钟。来自协议的这种偏差不影响研究或所得到数据的有效性，此后计算平均时间并用于药代动力学分析。
采用线性梯形法(线性插值)计算放射性浓度下的面积vs.时间曲线(AUC)。当可行时，基于最合适(R2)的行，使用至少最终3个观察到的浓度值来确定PK特征的所述终端消除阶段。使用对数-线性回归使用未称重的浓度数据计算终端消除阶段的斜率。如果测定系数(R2)为小于0.8时，或如果外推AUC到无穷大代表超过总面积的20％，不报道依靠测定kel的参数。
结果
给药制剂分析(表8)
给药期间的每一天，对所有组给药施用之前和之后，通过液体闪烁光谱法分析各等分的制剂，并从这些分析中计算测试制品的比活度。鞘内施用制剂中的整体平均放射性浓度(±SD)：组1为345.4×106±4.92×106dpm/g(155.60μCi/g)而组3为334.4×106±5.87×106dpm/g(150.62μCi/g)。在制剂中，用于静脉施用的整体平均放射性浓度：组2为4.4×106±4.22×105dpm/g(1.97μCi/g)，而组3为4.7×106±2.31×105dpm/g(2.11μCi/g)。鞘内制剂的测试制品的比活度：组1计算为51.16μCi/mg，而组3为49.53μCi/mg。静脉注射制剂中的测试制品比活度：组2计算为6.53μCi/mg，组3为6.99μCi/mg。
表8：通过液体闪烁光谱得到的在给药制剂中的放射性浓度总结结果
动物体重和施用剂量(表9)
在给药之前，组1、2和3中大鼠的平均体重分别为405克(范围从373克到452克)、410克(范围从367克到453克)、和395克(范围从342克到444克)。计算出鞘内施用125I-hGALC到组1动物的平均剂量为41±0.014μg/动物，这相当于放射化学剂量为2.12±0.72μCi/动物。静脉内途径施用125I-hGALC到组2动物的平均剂量为1.00±0.02mg/kg(2.69±0.14μCi/动物)。对于组3，计算出的鞘内施用和静脉内施用125I-hGALC的平均剂量为1.08±0.04mg/kg(5.72±0.31μCi/动物)。
表9：组平均体重和施用至雄性SD大鼠的125I-hGALC剂量规格
在组1中，施用于大鼠的平均化学给药和放射化学给药低于(分别约32％和29％)目标给药水平，而这构成了与协议的偏差。然而，由于施用于动物的实际给药用于整个计算，这些较低的值被认为是不影响研究或获得的数据的有效性。
临床观察
鞘内施用125I-hGALC60μg/动物和/或静脉施用1mg/kg，在任意的所述大鼠中没有观察到治疗相关的临床体征
凝血评估
在较早的时间点(给药后10分钟到6小时)，有人指出，从治疗过的动物中收集的血液在30分钟允许时间内没有完全凝血。然而，容易从3只未治疗的备用大鼠中收集血液凝块，指出一些干扰测试制品的的凝血过程。小于或大于30分钟的凝血时间构成与协议的偏差。然而，较长的凝血时间需要一些样品，以提供某些血清的分析。审查得到的结果，在获得的血清浓度值和血液凝结成块的时间长度之间没有发现相关性。因此，此延长或缩短的凝血时间没有影响研究或获得的数据的有效性。
在血液、血清、红血细胞、CSF和组织中总放射性的药代动力学
在血液、血清和红细胞(表10，表11，表12，图18-21)中的总放射性浓度
鞘内和/或静脉给药125I-hGALC后，雄性大鼠血清中的放射性标记物质的平均浓度见表10中给出。全血和红血细胞中的放射性材料标记的平均浓度列于表11中。平均数据见图18中显示。TCA沉淀后，在回收的上清和血液中沉淀的放射性活度的平均百分比列于表12中。
组1(41μg/动物的鞘内平均剂量)
鞘内给药，给药后在3小时观察到血清和血中的放射性标记材料(分别为0.108±0.026μg eq/g和0.093±0.023μg eq/g)最高的平均浓度(Cmax)。给药后3至6小时，血液中的放射性水平保持相对稳定，而血清中的放射性水平略有下降。此后，给药后48小时，血清和血液中的放射性浓度下降，并且低于定量限(LOQ)。对于红血细胞，在给药后6小时观察到Cmax，为0.089±0.024μg eq/g。此后，给药后48小时，红血细胞的放射性浓度下降，并低于LOQ。鞘内给药后，在整个研究期间(范围从0.7至0.9)平均血液与血清比率均小于1，表明放射性标记的材料与血细胞没有特别的关联。红血细胞与血清的比率(范围从0.8至0.9)值还支持放射性基本上与血细胞不相关联。使用标准的血液量/体重(即64.0mL/kg)，评估在血液中发现的给药的百分比。在tmax(最高放射性浓度发生时的时间)上，约施用给药的6％与血液相关联。
组2(1.00mg/kg的静脉平均剂量)
静脉施用后，给药后(即第一个时间点分析)10分钟，在血清(14.864±0.853μg eq/g)和血液(10.228±0.447μg eq/g)中观察到放射性标记材料最高的平均浓度(Cmax)。此后，血清和血液中的放射性浓度缓慢下降，但在给药后96小时(血清：0.088±0.006μg eq/g，Cmax的0.59％：0.051±0.002μg eq/g，Cmax的0.50％)仍可检测到，估计在血液中剂量的百分数从68.4％下降到0.3％。对于红血细胞，在给药后10分钟观察到Cmax为5.136±1.529μg eq/g。此后，红血细胞的放射性浓度下降，而给药后96小时低于LOQ。静脉给药后，在整个研究期间(范围从0.6至0.8)血液与血清的平均比率小于1，表明放射性标记材料与血细胞没有特别的关联。红血细胞与血清比率(范围从0.4到0.6)的值还支持放射性基本上与血细胞不相关联。
组3(鞘内随后静脉给药：1.08mg/kg(联合给药))
鞘内给药(目标60μg/动物)和静脉给药(1mg/kg)后，给药后(即在第一时间点分析)10分钟，在血清(14.675±0.810μg eq/g)和血液中(9.974±0.558μg eq/g)观察到的放射性标记材料的最高平均浓度(Cmax)。然后，血清和血液中的放射性浓度缓慢下降，但在给药后96小时(血清：0.077±0.010μg eq/g，Cmax的0.52％；血液：0.037±0.033μg eq/g，Cmax的0.37％)，仍可检测到，在血液中推算的剂量百分比从32.6％下降到0.1％。对于红血细胞，给药后10分钟观察到Cmax为6.113±1.748μg eq/g。此后，给药后96小时，红血细胞的放射性浓度下降，在定量的下限以下。放射性标记的材料与血细胞没有特别的关联，如平均血液与血清以及红血细胞与血清比率小于1(范围分别从0.7到0.8和0.4～0.7)所示。
表10a-在单一鞘内给药125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠血清中的放射性浓度的组平均值
组1：在41μg/动物的平均剂量
表10b-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠血清中的放射性浓度的组平均值
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
表10c-在单一鞘内和静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠血清中的放射性浓度的组平均值
组2：在1.08mg/kg的平均剂量
表11a-在单一鞘内给药125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠血液中的放射性组平均值浓度和含量、以及血液与血清的比率
组1：在41μg/动物的平均剂量
表11b-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠血液中的放射性组平均值浓度和含量、以及血液与血清的比率
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
表11c-在单一鞘内给药和静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠血液中的放射性组平均值浓度和含量、以及血液与血清的比率
组3：在1.08mg/kg的平均剂量
表11d-在单一鞘内给药125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠红血球细胞中的放射性组平均值浓度和含量、以及红血球细胞与血清的比率
组1：在41μg/动物的平均剂量
表11e-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠红血球细胞中的放射性组平均值浓度和含量、以及红血球细胞与血清的比率
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
表11f-在单一鞘内给药和静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠红血球细胞中的放射性组平均值浓度和含量、以及红血球细胞与血清的比率
组3：在1.08mg/kg的平均剂量
表12a-在单一鞘内给药125I-hGALC后，来自雄性Sprague-Dawley大鼠血液的上清液和沉淀中恢复的放射性平均百分比
组1：在0.10mg/kg的平均剂量
表12b-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，来自雄性Sprague-Dawley大鼠血液的上清液和沉淀中恢复的放射性平均百分比
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
表12c-在单一鞘内给药和静脉弹丸注射125I-hGALC后，来自雄性Sprague-Dawley大鼠血液的上清液和沉淀中恢复的放射性平均百分比
组3：在1.08mg/kg的平均剂量
125I-在全血中可沉淀的
(表12)
对组1、2和3，由三氯乙酸(TCA)在全血中沉淀后，沉淀和上清放射性活度的回收平均值总结在表12中。当使用15％的三氯乙酸水溶液沉淀全血中的蛋白质，主要是在血液(在组1中取值范围从100％到67％；在组2中100％至91％；在组3中100％至88％)的颗粒中回收放射性，这表明大部分循环放射性与蛋白质相关联，并因此不反映没有125碘。
在组织和脑脊液(CSF)中的放射性浓度
(表13、表14、表15、图19-30)
在表13中给出了：在单一鞘内和/或静脉给药125I-hGALC后，在大鼠组织和CSF中的放射性平均浓度。在图19-30中以图表形式呈现了平均值数据。组织与血清的比率平均值在表14中给出；并且在所述组织、CSF和胃肠的和膀胱内容物中，以及恢复期的施用剂量在表15中给出。
表13a-在单一鞘内给药125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液中的放射性组平均浓度
组1：在41μg/动物的平均剂量
表13b-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液中的放射性组平均浓度
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
表13c-在单一鞘内给药和静脉弹丸注射125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液中的放射性组平均浓度
组3：在1.08mg/kg的平均剂量
表14a-在单一鞘内给药125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液与血清的放射性比率平均值
组1：在41μg/动物的平均剂量
表14b-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液与血清的放射性比率平均值
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
表14c-在单一鞘内和静脉弹丸注射125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液与血清的放射性比率平均值
组3：在1.08mg/kg的平均剂量
表15a-在单一鞘内给药125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液、胃肠道和膀胱内容物的组平均放射性含量
组1：在41μg/动物的平均剂量
表15b-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液、胃肠道和膀胱内容物的组平均放射性含量
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
表15c-在单一鞘内给药和静脉弹丸注射125I-hGALC后，雄性Sprague-Dawley大鼠组织、脑脊液、胃肠道和膀胱内容物的组平均放射性含量
组3：在1.08mg/kg的平均剂量
组1(41μg/动物的鞘内平均剂量)
在所述鞘内给药后，125I-标记的物质一般分布进入所有被检测物质，尽管如此，在所述CSF中的放射性水平低于所述LOQ。在雄性组织大鼠中125I-标记的物质的最高平均浓度：在给药后48小时观察到，在甲状腺/甲状旁腺中(4.127±1.635μg eq/g)；以及在给药后3小时，在胃中(0.203±0.101μg eq/g)，肾脏(0.096±0.014μg eq/g)；以及肺脏(0.058±0.014μgeq/g)。在其它组织中的水平较低，以及tmax值通常在给药后3和6小时之间观察到。所述最低的Cmax值被观察到：在脑中(0.005±0.001μg eq/g)，以及脂肪组织(0.006±0.000μg eq/g)。在给药后48和96小时之前，在大多数组织中的放射性水平低于所述检测限，例外的是甲状腺/甲状旁腺、肾脏和胃。在给药后的96小时，所述最高平均浓度在甲状腺/甲状旁腺(1.927±1.585μg eq/g，46.7％的Cmax)观察到，然后肾脏(0.005±0.001μg eq/g，5.2％的Cmax)以及胃(0.002±0.001μg eq/g，1％的Cmax)。
对于在鞘内给药后多达24小时的组织，组织与血清的比率通常小于1。所述例外是甲状腺/甲状旁腺、肾脏和胃。所述最高比率，到目前为止，观察到的是甲状腺/甲状旁腺。在给药后48和96小时前，组织与血清比率不能计算，因为血清浓度低于LOQ。
在所有组织中，恢复的放射性水平小于1％的所述施用的剂量，并且在肝脏中在给药后3小时观察到所述最高比率。在给药后1小时，比率大于1％的施用的剂量，在胃内容物中发现(1.8％)。在给药后3小时，大于1％的施用的剂量被观察到：在小肠内容物(2.6％)、胃内容物(5.0％)和膀胱内容物(1.2％)中。在给药后6小时，大于1％的施用的剂量被发现到：在小肠内容物(1.7％)和胃内容物(4.0％)中。在给药后96小时，小量125I-hGALC递送的放射性(小于0.1％)在肾脏、甲状腺/甲状旁腺、胃和膀胱内容物中仍然恢复；并且最高恢复在所述甲状腺/甲状旁腺(0.09％)观察到。
组2(1.00mg/kg的静脉平均剂量)
在静脉施用后，在组2大鼠组织中，放射性标记物质的最高平均浓度(Cmax)被观察到：在甲状腺/甲状旁腺(294.521±52.953μg eq/g；在给药后48小时)中，然后肺脏(20.629±2.125μg eq/g；在给药后30分钟)、肝脏(11.335±1.436μg eq/g；在给药后10分钟)、肾上腺(8.827±2.435μg eq/g；在给药后10分钟)、脾脏(6.595±0.625μg eq/g；在给药后10分钟)和肾脏(3.027±0.330μg eq/g；10分钟)。所述组织的tmax值的发生在给药的10分钟和3小时之间，除了所述甲状腺/甲状旁腺(给药后48小时)。所述最低平均放射性Cmax值被观察到：在肾脏脂肪(0.158±0.019μg eq/g)中、CSF(0.210±0.363μg eq/g)、脑(0.252±0.041μg eq/g)、骨骼肌(0.275±0.025μg eq/g)和脊髓(0.293±0.028μg eq/g)。在给药后的96小时前，放射性仍然检测到，在18种被分析组织的7种中，具有被检测到的最高平均浓度是：在所述甲状腺/甲状旁腺(218.917±45.098μg eq/g，74.3％的Cmax)中，接着肝脏(0.126±0.014μg eq/g，1.1％的Cmax)，脾脏(0.111±0.009μgeq/g，1.7％的Cmax)和肾脏(0.099±0.010μg eq/g，3.3％的Cmax)。
在给药后10分钟，对于所有被分析组织，平均组织-血清比率小于1。在给药后30分钟和1小时之前，对于肺脏和甲状腺/甲状旁腺，平均组织-血清比率大于1。在给药后3小时和6小时，对于肝脏、肺脏和甲状腺/甲状旁腺，平均组织-血清比率大于1。在给药后24和48小时，肝脏、肺脏、脾脏和甲状腺/甲状旁腺具有的平均组织-血清比率高于1。在给药后96小时，对于肾脏、肝脏、脾脏和甲状腺/甲状旁腺，平均组织-血清比率大于1。所述最高组织-血清比率被观察到：在甲状腺/甲状旁腺(2485，在96小时)、肺脏(6.5，在24小时)和肝脏(2.2，在24小时)。
根据施用的放射性比率，在组织中所述最高平均值被观察到：在所述肝脏中(41.7％，在给药后10分钟)，肺脏(7.0％，在30分钟)，肾脏(2.2％，在10分钟)，小肠(1.5％，在1小时)和甲状腺/甲状旁腺(1.4％，在48小时)。在胃肠道内容物中，所述最高平均值为：在胃内容物中10.3％的所述剂量(在给药后3小时)，在肠内容物中5.4％(在给药后3小时)，以及在大肠内容物中1.1％(6小时)。在给药后96小时之前，所述施用的剂量的最高比率被检测到：在甲状腺/甲状旁腺(1.0％)中、肝脏(0.5％)和肾脏(0.1％)。在给药后的这个时间点，小于0.01％的所述施用的剂量滞留在所述胃和膀胱内容物中。
组3(鞘内、然后静脉给药：1.08mg/kg(联合给药))
在所述鞘内和所述静脉给药后，在组3大鼠的组织中，放射性标记的物质的所述最高平均浓度(Cmax)被观察到：在甲状腺/甲状旁腺(296.957±57.793μg eq/g；在给药后的24小时)，然后肝脏(10.181±0.600μg eq/g；在给药后10分钟)，肾上腺(9.567±1.678μg eq/g；在给药后10分钟)，肺脏(5.305±0.194μg eq/g；给药后1小时)，脾脏(5.042±0.902μg eq/g；在给药后10分钟)，胃(4.454±1.455μg eq/g；给药后3小时)，肾脏(3.390±0.183μg eq/g；1小时)以及CSF(2.087±2.912μg eq/g；10分钟)。所述组织的tmax至发生在给药后的10分钟和3小时之间，除了所述大肠(给药后6小时)以及甲状腺/甲状旁腺(给药后24小时)。最低平均放射性Cmax被观察到：在肾脏脂肪中(0.188±0.020μg eq/g)，脑(0.283±0.062μgeq/g)，脊髓(0.327±0.062μg eq/g)和骨骼肌(0.411±0.009μg eq/g)。在给药后96小时之前，仍然检测到放射性，在18种被分析组织的8种中，所述最高平均浓度被检测到：在甲状腺/甲状旁腺中(43.962±23.164μg eq/g，14.8％的Cmax)，然后肝脏(0.137±0.018μg eq/g，1.3％的Cmax)，肾脏(0.124±0.005μg eq/g，3.7％的Cmax)，脾脏(0.083±0.009μg eq/g，1.6％的Cmax)以及肾上腺(0.069±0.016μg eq/g，0.7％的Cmax)。
在给药后10分钟，所有被分析组织的平均组织-血清比率小于1。在给药后30分钟和1小时之前，对于甲状腺/甲状旁腺，平均组织-血清比率大于1。在给药后3小时和6小时，对于胃和甲状腺/甲状旁腺，平均组织-血清比率大于1。在给药后的24小时，肝脏和甲状腺/甲状旁腺具有的平均组织-血清比率高于1。在给药后的48和96小时，平均组织-血清比率大于1(对于肾脏、肝脏和甲状腺/甲状旁腺)；以及对于脾脏(96小时)。所述最高组织-血清比率：在甲状腺/甲状旁腺中(854，在48小时)，肝脏(1.8，在48小时)以及肾脏(1.6，在96小时)。
根据施用的放射性比率，在组织中所述最高平均值被观察到：在所述肝脏中(19.0％，在给药后10分钟)，肾脏(1.2％，在1小时)以及小肠(1.2，在3小时)。在胃肠道内容物中，所述最高平均值为：在胃内容物中8.8％的所述剂量(在给药后3小时)，在肠内容物中4.3％(在给药后3小时)以及在大肠内容物中1.0％(6小时)。在给药后96小时之前，所述施用的剂量的最高比率被检测到：肝脏(0.3％)，在甲状腺/甲状旁腺(0.1％)中，以及肾脏(0.05％)。在给药后的这个时间点，小于0.01％的所述施用的剂量滞留在所述肾上腺、心脏、肺脏、脾脏、胃和膀胱内容物中。
在血液、血清、红血球细胞、CSF和组织中放射性的药代动力学
(表16和表17)
在单一鞘内和/或静脉给药125I-hGALC后，在大鼠的血液、血清、红血球细胞、CSF和组织中放射性的药代动力学参数平均值，在表16和表17中给出。
表16：在单一鞘内给药125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、血液、红血球细胞、CSF和组织中总放射性的处置动力学。
血清
组1：在41μg/动物的平均剂量
血液
红血球细胞
表16b-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、血液、红血球细胞中总放射性的处置动力学。
血清
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
血液
红血球细胞
表16c-在单一鞘内给药和静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的血清、血液、红血球细胞中总放射性的处置动力学。
血清
组3：在1.08mg/kg的平均剂量
血液
红血球细胞
表17a-在单一鞘内给药125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的组织和脑脊液中总放射性的处置动力学。
组1：在41μg/动物的平均剂量
a没有可报告的结果，因为不能识别末期阶段
b不能估计PK参数.因为样品＜LLOQ
c值不能被报告，因为AUC0-tlast被推论大于20％或者R2＜0.8
表17b-在单一静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的组织和脑脊液中总放射性的处置动力学。
组2：在1.00mg/kg的平均剂量
a值不能被报告，因为AUC0-last被外推大于20％或者R2＜0.8
b没有可报告的结果，因为不能识别末期阶段
表17c-在单一鞘内给药和静脉弹丸注射125I-hGALC后，在雄性Sprague-Dawley大鼠的组织和脑脊液中总放射性的处置动力学。
组3：在1.08mg/kg的平均剂量
a值不能被报告，因为AUC0-tlast被外推大于20％或者R2＜0.8
血液、血清和红血球细胞
在所述鞘内给药后(组1：41μg/动物)，对于血清、全血和红血球细胞，在放射性vs.时间(从0至最后可测量时间点)曲线下的所述平均计算区域(AUC0-tlast)分别为1.48μg eq·h/g、1.33μg eq·h/g和1.24μg eq·h/g。所述表观末端t1/2值，在血清、全血和红血球细胞中分别被报道为：5.34、5.02和4.08小时。所述消除速率常数k，在血清、全血和红血球细胞中被计算分别为0.130h-1，0.138h-1和0.170h-1。AUC0-inf在血清、全血和红血球细胞中被计算分别为1.54μg eq·h/g、1.37μg eq·h/g和1.25μg eq·h/g。对于来自血清、全血和红血球细胞的放射性消除阶段是定义明确的，其通过所述非常低的外推值百分数(AUC0-inf计算所需要)所演示(分别为4.0、3.2和1.4％)。
在所述静脉给药后(组2：1.00mg/kg)，对于血清、全血和红血球细胞，所述AUC0-tlast值平均值分别为71.1μg eq·h/g，51.2μg eq·h/g和33.9μgeq·h/g，并且所述表观末端t1/2值分别为30.7、27.1和0.9小时。所述k值，在血清、全血和红血球细胞中分别计算为0.0226h-1、0.0256h-1和0.0635h-1。对于来自血清、全血和红血球细胞的放射性消除阶段定义明确，并且AUC0-inf在血清、全血和红血球细胞中分别计算为75.0μg eq·h/g(外推5.21％)、53.2μg eq·h/g(外推3.75％)和35.7μg eq·h/g(外推4.94％)。所述表观分布容积(Vz)在全血中(735mL/kg)最大，然后使血清(591mL/kg)和红血球细胞(441mL/kg)。测试制品的清除率估计：血清13.3mL/h/kg，以及全血18.8mL/h/kg。
在所述鞘内给药和静脉给药(联合的1.08mg/kg)至组3动物后，对于血清、全血和红血球细胞，所述AUC0-tlast值平均值分别为89.8μg eq·h/g，66.9μg eq·h/g和49.2μg eq·h/g。在血清、全血和红血球细胞中，所述表观末端t1/2值分别被报道为25.5，20.9和9.61小时，并且k分别为0.0272h-1，0.0332h-1和0.0721h-1。此外，来自所有三种基质的消除阶段定义明确；并且在血清、全血和红血球细胞中，AUC0-inf分别计算为92.6μg eq·h/g，68.0μg eq·h/g和51.0μg eq·h/g(外推的3.06％、1.64％和3.69％)。所述Vz在全血中较大(478mL/kg)，然后使血清(429mL/kg)和红血球细胞(293mL/kg)。清除率为：全血15.9mL/h/kg，以及血清11.7mL/h/kg。
组织
在鞘内给药125I-hGALC(组1：41μg/动物)后，在来自大鼠的组织中，观察到最高AUC0-tlast值在甲状腺/甲状旁腺(313μg eq·h/g)中，接着是胃(2.60μg eq·h/g)和肾脏(1.84μg eq·h/g)。对于几种组织，估计k值或者其他来自k的参数(即t1/2和AUC0-inf)是不可能的，因为所述AUC至无穷的％外推大于20％，或者在所述末端阶段中缺乏数据。对于这些可以估计的组织(眼睛、心脏、肾脏、大肠、肺脏、小肠和胃)、k范围从0.01至0.17h-1，并且所述t1/2通常范围从4至6h；例外的是，肾脏为58.6h，以及胃为39.1h。
在所述静脉给药(组2；1.00mg/kg)后，AUC0-tlast的最高值在甲状腺/甲状旁腺(24989μg eq·h/g)中观察到，接着是肺脏(165μg eq·h/g)、肝脏(100μg eq·h/g)、脾脏(56.1μg eq·h/g)、肾上腺(43.1μg eq·h/g)和肾脏(40.7μg eq·h/g)。AUC0-tlast最低值在肾脏脂肪(0.617μg eq·h/g)和脑(0.735μgeq·h/g)中观察到。来源与k的参数没有被报道，这些组织的消除阶段定义明确(甲状腺/甲状旁腺和CSF)，或者这些组织至AUC0-inf的外推大于20％(肾脏脂肪和脑)。只有对于肝脏和肺脏的AUC0-inf值大于血清(75μgeq·h/g)。报道的最高AUC0-inf值为肺脏(167μg eq·h/g；外推0.832％)，接着肝脏(105μg eq·h/g；外推4.15％)，脾脏(61.2μg eq·h/g；外推8.33％)，肾上腺(46.8μg eq·h/g；外推7.89％)和肾脏(46.7μg eq·h/g；外推12.7％)。
AUC0-inf报道的最低值，从脊髓(2.51μg eq·h/g；外推4.87％)计算得到，接着肌肉(2.69μg eq·h/g；外推1.93％)和眼睛(5.64μg eq·h/g；外推5.19％)。在组织中，最长可计算的t1/2为：对于肾脏41.6小时，接着对于肾上腺34.6小时，以及对于脾脏31.8小时。被报道最短的t1/2是对于坐骨神经4.18小时。
对于组3，在鞘内和静脉给药(1.08mg/kg，联合的剂量)后AUC0-tlast的最高值在甲状腺/甲状旁腺(16776μg eq·h/g)中观察到，接着是肝脏(96.5μg eq·h/g)，胃(72.1μgeq·h/g)，肾脏(57.9μg eq·h/g)，脾脏(46.9μgeq·h/g)，肺脏(44.1μg eq·h/g)和肾上腺(43.9μg eq·h/g)。AUC0-tlast最低值在肾脏脂肪(0.954μgeq·h/g)和脑(1.03μg eq·h/g)中观察到。来源于k的参数没有被报道，这些组织至AUC0-inf的外推大于20％(肾脏脂肪和脑)，或者R2低于0.8(CSF)。只有对于甲状腺/甲状旁腺和肝脏的AUC0-inf值大于血清(92.6μg eq·h/g)。报道的最高AUC0-inf值为甲状腺/甲状旁腺(18390μg eq·h/g；外推8.78％)，接着肝脏(102μg eq·h/g；外推5.0％)，胃(72.6μgeq·h/g；外推0.766％)，肾脏(64.4μg eq·h/g；外推10.1％)，脾脏(49.3μgeq·h/g；外推4.85％)，肾上腺(45.8μg eq·h/g；外推4.25％)以及肺脏(45.4μg eq·h/g；外推2.88％)。报道的AUC0-inf最低值从脊髓(3.77μgeq·h/g；外推6.55％)计算，接着肌肉(4.66μg eq·h/g；外推6.25％)。在组织中，最长的可计算的t1/2，为对于肝脏的36.4小时，接着对于肺脏27.5小时，对于肝脏的25.7小时，以及对于甲状腺/甲状旁腺的25.4小时。被报道的最短可计算的t1/2为对于坐骨神经的4.71小时。
讨论
在鞘内施用后，在血清和全血中的放射性最高平均浓度，在给药后3小时观察到，这意味着剂量-相关物质相对快速分布至体循环。在静脉施用后，在血清和全血中的放射性最高平均浓度，在所述测量的第一个时间点观察到。在血清中的浓度总是高于在全血中，其通过小于1的血液-血清比率反应。这表明：剂量相关物质与在给药后任意时间点的血液细胞没有特定地相关。在血液蛋白质的TCA沉淀后，在所述沉淀中的所述放射性大体上恢复，这意味着所述大多数循环放射性是蛋白质相关的，表明了观察的放射性分布没有大程度地反映所述自由125碘的处置。
当将组2(静脉剂量1.00mg/kg)与组3(鞘内和静脉联合1.08mg/kg)比较，在组3血清和全血中的浓度似乎与在组2中的相似。放射性在这两者基质中的下降也非常相似，这通过血液-血清比率评估。将组2与组3血清和血液的AUC0-tlast和AUC0-inf进行比较，表明了组3动物至剂量相关物质的暴露轻微较高。
在组1中，在CSF中的放射性水平非常低(这个发现似乎与直接施用至鞘内空间的测试制品不一致)，尽管如此在脑中观察到非常低的水平。尽管如此，放射性在给药后不久，在体循环中、在全身组织中观察到，这意味着剂量相关物质在施用后相当迅速地从鞘内空间分布。在胃和肠内容物中的较高水平意味着，剂量相关物质通过粪便排泄，尽管在这个研究中没有直接在排泄物中进行测量。另外，在所述膀胱内容物中的高水平也意味着通过尿液的排泄。不同于在甲状腺/甲状旁腺中的高水平，考虑到反应碘标记的损失、以及所述标记在该组织中的持续，而不是所述测试制品自身的分布/持续；放射性的高水平在肝脏、肺脏、肾上腺、脾脏和肾脏、以及可能参与代谢和/或所述测试制品排泄的组织中观察到。
在组2和组3中，在给药后的所述第一个时间点前，放射性的分布是普遍和广泛的。所述最高浓度通常与所述肝脏、肺脏、肾脏、脾脏、肾上腺、以及(特别地)所述甲状腺/甲状旁相关。因此，在所有三组的组织中，放射性的分布模式大程度地相似。此外，高水平的放射性在所有动物的甲状腺/甲状旁腺中观察到，特别地考虑浓度随着给药后的时间而显著增加，这可能表明了所述碘标记在所该组织中的损失以及所述标记的持续，而不是所述测试制品自身的分布/持续。CSF水平在这些组织中较高，与组1相比(在给药后的早期时间点)，这意味着：放射性标记物质能穿过血-脑屏障。在组3中，该基质观察到轻微较高的水平，与组2相比(此外在给药后的早期时间点)，这意味着：该浓度被测试制品相关物质(来自静脉给药和直接注入鞘内空间的物质的分布)所占有。下面观察的来自组1的LOQ值，因此可能是(非常小的样本容积中)非常低浓度的结果，下面可以通过这种分析方法定量。
在给药后96小时前，在所有组大多数组织中，组织-血清比率通常小于1，这表明：剂量相关物质分布进入所述组织，并且通常其更加容易从所述组织清除(与所述血清相比)。对于所有组，大多数组织至剂量相关物质(通过AUC0-tlast评估)的暴露，小于血清。
结论
在单一鞘内(名义上60ug/动物)施用后和/或静脉弹丸注射剂量125I-hGALC至雄性大鼠(名义上1mg/kg的浓度)之后，在血液、血清、红血球细胞、CSF和组织中的放射性浓度被测定。
在血清和全血中，在鞘内施用的剂量后3小时后，或者在静脉给药后第一个时间点(10分钟)，都观察到放射性的最高浓度(这表明其相对快速地分布至体循环)。在血清中的浓度高于血液，表明测试制品相关物质与所述血液细胞没有特定地相关。放射性分布至组织是广泛和普遍的，在给药后的早期时间点，并且，总之，分布至组织的模式在所有三组之间是非常相似的。对于所有组，大多数组织至剂量相关物质的暴露(通过AUC0-tlast评估)小于血清。在所有组的甲状腺/甲状旁腺中的高浓度，被认为表明了碘标记的损失，而不是在该组织中剂量相关物的分布和持续。在静脉给药后的96小时前，反射性在一些被检测组织中仍然能检测到。
实施例3：在Twitcher小鼠中，ICV和ICV/IP RMGALC注射及延长存活时间的预临床研究
本实施例演示了一个临床前研究的实施方案，示出在twitcher小鼠中提供每周IP注射rmGALC后的延长生存。在本实施方案中，在坐骨神经中观察到改进的髓鞘，与减少的鞘氨醇半乳糖苷水平和粗大运动功能(即，步态)改善。在一些实施方案中，用单一的ICV或ICV/IP rmGALC注射治疗的twitcher小鼠表现出增加生存率而且大脑鞘氨醇半乳糖苷的水平减少了63％。单一的ICV施用rmGALC后重要端点(即，存活，脑鞘氨醇半乳糖苷水平)的阳性结果，与另外全身施用(ICV/IP)后这些端点的很小的改善表明：CNS仅有方案是可行的治疗GLD的临床选项。
介绍
球细胞脑白质营养不良(GLD)是一种常染色体隐性遗传的溶酶体贮积症，发病率约1∶100,000出生(在Scandinavian国为1.9∶100,000出生)的发生率。作为逐步的外围(PNS)和中枢(CNS)神经系统疾病，GLD是基因突变结果导致半乳糖脑苷酶的活性(GALC)缺陷，降低基板血脂[即：将半乳糖基神经酰胺降解成为半乳糖和神经酰胺；并将鞘氨醇半乳糖苷降解成为半乳糖和神经鞘氨醇]。此疾病的特征在于完全损失了少突胶质细胞和髓磷脂，以及存在半乳糖神经酰胺-充盈的巨噬细胞(“球体”细胞)。
本病的临床特点存在两种形式：婴儿(期)和晚发(期)。婴儿型GLD(也称为Krabbe病)发生在90％的所有诊断为GALC不足的患者中，通常在婴儿出生后3-6个月内观察到此症状；有早在2-3周龄表现症状的报道(Wenger，D.A.et al.，2001，Galactosylceramide Lipidosis：Globoid CellLeukodystrophy(Krabbe Disease)，in The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease，C.R.Scriver，Beaudet，A.L.，Sly，W.S.，and Valle，D，Editor.2001，McGraw-Hill.p.3669-3687；纳入本文作为参考)。这种疾病的迟发性变体的临床表现为10岁，然而，也有确诊患者年龄在40岁以上的报告(Wenger，D.A.et al.，2001，Galactosylceramide Lipidosis：Globoid CellLeukodystrophy(Krabbe Disease)，in The Metabolic and Molecular Bases ofInherited Disease，C.R.Scriver，Beaudet，A.L.，Sly，W.S.，and Valle，D，Editor.2001，McGraw-Hill.p.3669-3687；并入本文作为参考)。迟发性患者中功能下降逐步进行几年的时间。
全身酶替代疗法(ERT)为遭受溶酶体贮积症(LSDs)，如Gaucher病，Fabry病，和亨特综合症的患者提供了福音(温格，DA等人，2001年，半乳糖脂沉积球细胞脑白质营养不良(Wenger，D.A.et al.，2001，Galactosylceramide Lipidosis：Globoid Cell Leukodystrophy(KrabbeDisease)，in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease，C.R.Scriver，Beaudet，A.L.，Sly，W.S.，and Valle，D，Editor.2001，McGraw-Hill.p.3669-3687；Neufeld，E.F.，2004，Enzyme Replacement therapy.Lysosomaldisorders of the Brain，ed.F.M.a.W.Platt，S.V.2004：Oxford University Press.327-338；Desnick，R.J.，2004.J.Inherit.Metab.Dis.，27(3)：p.385-410；所有这些都纳入本文作为参考)。ERT用于GLD不追求严谨，也许是因为这种疾病影响PNS和CNS。目前治疗GLD的患者包括造血干细胞移植(HCT)，但这一程序由于显著不良事件(即30％的治疗相关死亡率，终身免疫抑制治疗)以及只在症状前患者的疗效，也有其局限性。
所述twitcher小鼠是最常用的实验动物模型，用于研究GLD，并构成了对本病的大量的实验工作(Wenger，D.A.，2000，Mol.Med. Today，6(11)：p.449-451；纳入本文作为参考)，但其他天然出现的GLD动物模型存在具有可变程度的表征。West Highland White/Cairn Terriers中存在自发突变(Kobayashi T.，et al.，1980，Brain Res.，202：479-83；纳入本文作为参考)，polled Dorset Sheep(Pritchard D.，et al.，1980，Vet.Pathol.，17：399-405)，家猫(Johnson K.，1970，J. Am.Vet.Med. Assoc.，157：2057-64；纳入本文作为参考)和非人类灵长类动物Rhesus macaque(Baskin G.，et al.，1998，Lab Anim.Sci.，48：476-82；纳入本文作为参考)。
最初的异体神经移植研究表明：改善twitcher小鼠Schwann细胞末梢神经功能的能力可由酶在原地替代异体移植twitcher细胞来调节，而长期恢复受伤的twitcher外周髓鞘细胞是可行的。然而，这种技术，不能一概而论作为twitcher小鼠(Baskin G.，et al.，1998，Lab Anim.Sci.，48：476-82；纳入本文作为参考)的整体治疗。在受影响的老鼠中，HCT表明显著改善寿命和受影响动物的增重，但观察到可变的疗效，可行性记录在44天到超过100天之间(小鼠接受myeloreductive训练)(Lin，D.，et al.，2007，Mol.Ther.，15(1)：p.44-52；Hoogerbrugge，P.M.，et al.，1998，J. Clin.Invest.，81(6)：p.1790-4；二者纳入本文作为参考)。在这些调查中，未经治疗的小鼠典型寿命约为40天。
在这些和其他研究中，与未治疗的对照组相比，治疗组小鼠中，髓鞘再生速率和现有大脑病理率都没有得到改善(Yeager A.，et al.，1984，Science，225：1052-4；Toyoshima，E.，etal.，1986，J. Neurol.Sci.，74(2-3)，p.307-18；两者都纳入本文作为参考)。使用L-环丝氨酸进行底物抑制靶向神经鞘氨醇的合成，无论单独使用或组合HCT，增加twitcher小鼠寿命(LeVine S.，et al.，2000，J. Neurosci.Res.，60：231-6；Biswas S.，et al.，2003，Neurosci.Lett.，p347：33-6；两者都纳入本文作为参考)。L-环丝氨酸供人类使用太毒了，不像其对映体D-环丝氨酸那样被用于治疗焦虑症。基因治疗的实验已经显示在转染细胞中生成酶的能力，并提高twitcher小鼠寿命，无论是在单一疗法还是组合HCT(Lin，D.，et al.，2007，Mol.Ther.，15(1)：p.44-52；纳入本文作为参考)。当用于预症状的动物时，基质减少、HCT，和基因治疗都提供了最显著的疗效，没有或只有有限的对疾病症状动物的影响。因此，在治疗GLD上，ERT可能提供可行的选择，特别是当考虑到预-症状的患者。
结果
系统施用酶替代疗法使用HEK293衍生的鼠GALC(rmGALC；5mg/kg)，外围多个腹腔(IP)注射，(当与媒介物处理的动物相比)，提高twitcher小鼠的寿命，减少鞘氨醇半乳糖苷积累的15％(表18，图31)。
表18：IP施用rmGALC提高twitcher小鼠的存活期
以rmGALC治疗的小鼠IP表现出更好的步态测试，而且与未治疗的或媒介物治疗的动物相比，坐骨神经组织病理学得到了促进。外周(IP)施用rmGALC最低限度地递送到大脑，导致大脑中的鞘氨醇半乳糖苷略有下降。然而，脑组织病理学似乎没有任何改变。因此，在twitcher小鼠中观察到的每周重复全身施用(IP)rmGALC(5毫克/公斤)治疗的结果导致小鼠的存活获益，脑鞘氨醇半乳糖苷水平略有下降，并改善粗大运动功能。
在twitcher小鼠中，单一ICV和联合ICV/IP rmGALC
结果表明，高剂量ICV/IP治疗的组平均存活50天(120μg/5mpk)，而媒介物治疗的动物仅存活36天(图32)。仅用ICV rmGALC治疗的小鼠显示剂量反应的平均存活时间为42天(40μg)和48天(120μg)。单一的120μg ICV注射减少脑水平的鞘氨醇半乳糖苷(63％)，其中单一的ICV注射40μg rmGALC导致鞘氨醇半乳糖苷(图33)下降39％。虽然，与单独注射ICV相比，在减少鞘氨醇半乳糖苷上，ICV/IP施用不提供任何额外的益处。观察到，联合用药可鞘氨醇半乳糖苷的水平减少48％，显著低于观察到的每周单独IP施用(15％)。此外，ICV在40μg水平(图34)下治疗时，在注射部位的远侧位点观察到脑组织学的改善。这些结果证实了直接ICV注射后，rmGALC的活性及在脑中的分布。然而，只以ICVrmGALC治疗的小鼠没有表现出恢复坐骨神经纤维形态或髓鞘形成，只轻微的改善了粗大运动功能(例如，步态分析)。单一的ICV施用rmGALC后显著改善端点(即存活，脑鞘氨醇半乳糖苷水平)表明：在全身循环中缺乏足够的酶浓度。
临床剂量参数：在twitcher小鼠中，鞘氨醇半乳糖苷重新积累率
在twitcher小鼠模型中进行以下的研究，努力限定适当的临床剂量范围：
-单一的ICV注射于PND19，twitcher小鼠脑鞘氨醇半乳糖苷的重新积累率。
-使用rmGALC联合腹腔内(IP)+脑室内(ICV)注射于twitcher小鼠中的剂量探索研究，
为了评估鞘氨醇半乳糖苷在中枢神经系统中的重新积累率，在PND19用单一的ICV注射12μg或40μg rmGALC治疗twitcher小鼠。注射(PND20)后24小时处死小鼠组(n＝3)，然后其后每三天进行。取出脑组织，并提交用于鞘氨醇半乳糖苷分析，组织病理学和酶活性分析。监测动物的子集存活(n＝8)，并在PND40分析运动功能(步态分析)。
通过质谱(LCMS Ltd.，North Carolina)随ICV注射后分析在脑组织匀浆中的鞘氨醇半乳糖苷水平。并表明鞘氨醇半乳糖苷在rmGALC施用(图35)的24小时之内急剧下降。在施用酶后，鞘氨醇半乳糖苷减少的趋势维持24天时间。此外，在此期间内与媒介物治疗的动物(媒介物治疗为：(平均4.5ng/ml鞘氨醇半乳糖苷)vs.12μgrmGALC(平均为2.5mg/ml鞘氨醇半乳糖苷)vs.40μg/ml rmGALC(平均：1.6ng/ml鞘氨醇半乳糖苷))相比，鞘氨醇半乳糖苷浓度的减少呈剂量依赖。有趣的是，在研究结束时(天28-32后处理)，这两个剂量组鞘氨醇半乳糖苷水平的增加表明，如果按月施用ERT可能不会成功。可能需要更为频繁的给药方案。由于在每个采样时间点的动物数量小，结果的变化是显而易见的。然而，基于这些结果，很明显，鞘氨醇半乳糖苷的重新积累发生在约4周(28天)的日程安排上。
当分析了生存时间，结果表明，12μg/mL和40μg/mL rmGALC治疗组具有的存活期中值为48天(12μg/mL)和50.5天(40μg/mL)，媒介物治疗的动物存活为40天(图36)。出乎意料的是，与媒介物治疗的动物存活40天相比，用40μg人类GALC(rhGALC)治疗的小鼠表现出的存活获益仅为42天。还不知道rhGALC降低药效的原因(s)，但会在后面的章节中讨论。然而，从本研究的结果，很明显，即使较低剂量的rmGALC也在twitcher小鼠模型中显示有效的生存获益。
临床剂量的参数：在twitcher小鼠中，rmGALC和rhGALC的剂量范围研究
以前的研究结果表明，用ICV/IP rmGALC(120μg和5MPK)治疗的twitcher小鼠比媒介物治疗的动物多存活了14天的时间。然而，仅直接CNS注射治疗的twitcher小鼠显示，在平均存活的12天(120μg ICV)和6天(40μg ICV)内，显示出剂量-响应的改善。在小鼠大脑的120μg的剂量在患者大脑中转换的剂量为300mg/kg；因此，对于调查低剂量rmGALC的功效而言它是重要的。此外，检查早期特定rhGALC，用于twitcher小鼠中的疗效。每周IP注射(5mg/kg)rmGALC治疗的小鼠组，在PND10开始加单一的ICV注射12μg(30mg/kg脑重量)或26μg(60mg/kg脑重量)的rmGALC起始rmGALC或rhGALC在PND19。在PND39，处死小鼠(N＝3/group)的子集收获组织(脑、坐骨神经、神经，肝脏，血清)。提交脑组织用于鞘氨醇半乳糖苷分析，组织病理学和酶的活性量化。监测其余动物的存活(n＝8)分析存活和步态。
讨论
此剂量调查研究的结果显示：rmGALC施用的存活获益具有剂量依赖的趋势(图37)。与媒介物治疗动物的40.5天相比，12μg/5mpk和26μg/5mpk组合剂量的rmGALC延长twitcher小鼠的平均寿命分别为44.5和45.5天。12μg/5mpk(38天)和26μg/5mpk(39.5天)剂量的rhGALC没有存活获益。26μg/5mpk rhGALC剂量延长受影响的twitcher小鼠的寿命1.5天，但是二者rhGALC的剂量都达不到媒介物治疗的动物(图37)的存活天数。以前观察的动物系统治疗(IP)以rmGALC，在所有接收组合ICV/IP施用rmGALC的动物中观察到步态分析的改善，而以单一ICV注射治疗的动物表现出了较少的运动功能(图38)的获益。以rhGALC治疗的小鼠，观察到寿命的获益，没有观察到任何步态分析的获益。然而，发现rhGALC的比活度为约rmGALC体外活性的33％(表19)的。因此，这些目前的结果表明，即使较低剂量的rmGALC，也可在生存和运动功能中获益，并强化了ERT用于治疗GLD的机会。鞘氨醇半乳糖苷重新积累约发生在4周(28天)日程，是显而易见的。
表19：rmGALC和rhGALC活性
预期作为twitcher小鼠rmGALC和rhGALC的抗原性为空模型[即，它们是交叉反应的免疫学材料(CRIM)阴性]。总体而言，在rhGALC治疗的小鼠(ICV/IP方案)中，最大血清抗体滴度显著高于具有可比性的ICV/IP rmGALC方案(图39)治疗的小鼠。虽然抗体也存在于直接CNS注射治疗的小鼠中，但最大的滴度低于动物ICV/IP治疗的几倍。可能生成中和抗体的可能性是存在的。
研究GALC-缺陷犬引发表征的rhGALC抗原性。在这项研究中，以2mg/kg每周IV和/或2.25mg(30mg/kg脑重量)IT施用人类GALC或媒介物单独治疗受影响的动物(出生后6周)。在第8周时施用额外的治疗，并每月进行剩余的研究(直至出生后～16周)。在安乐死之前，除去CSF，并分析抗体的形成和鞘氨醇半乳糖苷水平(图40)。
先前在Huntaway犬的MPSIIIA模型中研究重组人肝素N-硫酸酯酶，表现出了显著的抗体对外源性酶的反应，导致在研究中需要动物的耐受。然而，从天然和rhGALC治疗的狗中检查CSF的初步结果，与未经处理的对照组(图40)相比，鞘氨醇半乳糖苷水平表现出明显的减少。
实施例4：在小鼠中，IT-注射GALC的脑和肝组织学/标记
本实施例描述了在小鼠中IT注射hGalC和mGalC的一个实施方案以及在各种组织中相应GALC抗体的检测和定位。
试验设计
实验设计：
组织收集和组织学染色
仅有三只动物适合于组织学分析，分别从B和C组。来自大脑和肝脏的样品固定在10％的中性缓冲福尔马林中，后续以石蜡包埋。制备5μm的石蜡切片用于I2S的免疫组化(IHC)以检测注入的蛋白质。3个抗-GALC抗体被用于IHC染色GalCA。
1.小鼠单克隆抗体(由Dr.Eckman’s产生)
2.兔子多克隆抗体(由组1产生)
3.兔子多克隆抗体(由组2产生)
高度敏感的ABC+酪胺荧光扩增方法用于标记靶蛋白。所述染色结果表明GalC阳性细胞为绿色，细胞核为DAPI蓝染液，而背景为黑色。
结果
在小鼠的大脑中，组1的多克隆抗体与内源性蛋白具有强烈的交叉反应。即使在媒介物对照的大脑中，CNS细胞染色呈强阳性。注射的蛋白不确定有如此强烈的背景(图41)。在小鼠大脑中，组2的多克隆抗体与内源性蛋白的交叉反应较弱，但在媒介物对照的大脑中，CNS细胞仍然为阳性。在上述背景(图42)中未检测到所注射的蛋白质。小鼠单克隆抗体具有可接受的特异性，在媒介物对照的大脑中(数据未示出)具有低得多的信号。IT注射后，在大大脑表面上的大脑膜内，所有蛋白质是可检测的。在CNS细胞(神经元和神经胶质细胞)中的大脑膜以下区域，组1和组2的这两种hGalC是可检测的，在组1接受治疗的动物的hGalC中，具有相对较强的信号。在mGalC治疗的大脑(图43)中没有检测到阳性神经元和神经胶质细胞。在小脑中，hGalC在大脑膜中和颗粒区的表面上产生染色，而mGalC不产生(图44)。鼠单克隆抗体在小鼠大脑组织中工作，但与在肝脏中的正弦细胞表现出较强的交叉反应性，而且不能被用来评估细胞摄取的IT在肝脏中注入的蛋白质(图45)。组2的多克隆抗体在肝组织中显示出特异性，比媒介物对照的大脑中的信号要低得多。在治疗后的肝脏中，所有IT注射的蛋白在sinusoidal细胞和肝细胞中是可检测，在组1治疗的动物(图46)的hGalC中，具有较少阳性细胞和较弱的信号。虽然在任何治疗组中没有发现更高GalC活性，但在大脑膜和周围区域的CNS细胞中发现阳性染色，指示IHC检测注射的蛋白上是敏感的，已在细胞水平上(图47)被采用。在肝脏中，mGalC表现出较高的活性，但在mGalC和hGalCIHC之间，IHC通过组2Ab之间检测的差异非常小(图48)。在hGalC中，组1Ab的低检测活性与观察到的IHC水平低是一致的。
总结
IT注射后，在大脑的脑膜中，所有通过IHC注射的蛋白质是可检测。在CNS的细胞(神经元和神经胶质细胞)中，组1和组2中，细胞更新注入的hGalC的是可检测，在组1治疗的大脑的hGalC中具有相对较强的信号。在mGalC治疗的大脑中，没有检测到阳性神经元和神经胶质细胞。在小脑中，除了在脑膜中的阳性信号，在颗粒区表面上的细胞层内发现组1和组2注射的hGalC。在所有治疗组的肝脏中，在sinusoidal细胞和肝细胞内，注射的蛋白质是可检测的，暗示最终摄取鞘内I2S进入循环系统。相对于组1的hGalC而言，组2的mGalC和hGalC也有类似的强染色信号。
实施例5：在犬中，IT-注射GALC的脑组织学/标记
本实施例描述了在犬中IT-注射GalC的一个实施方案，和GalC抗体在大脑中相应的检测及定位。在本实施方案中，在脑膜和脑膜下面的表面皮质区域中，IT注射的蛋白是可检测到的。在periventricle区域(图49)发现ICV注射的蛋白。IT注射后，在皮质中GalC IHC显示出扩散的细胞外染色模式，在神经元(圆圈内)(图50)中具有负信号。在ICV注射的periventricle区域和IT注射皮质(图51)中，观察到以阳性Iba染色的小胶质细胞的活性有限下降。在媒介物组中，发现具有LFB/PAS的皮质无形态变化(球形细胞)而且在各组之间无差异。经ICV治疗后，在4个有限的periventricle区(图52)区域内，由IBA染色标记的球形细胞(箭头)下降。
IT递送I2S蛋白的实施例
实施例6：IT递送I2S的生物学分布
本研究的主要目的是测定是否可以通过鞘内腰椎路线将重组人类的I2S递送到成年MPS II小鼠的大脑
表20：6组8-12周龄的雄性小鼠按如下治疗：
注射时间表：通过鞘内腰椎的路线，动物接受3次艾杜硫酶(10μL)注射：
○组A&D：在1，8，和15天，施用3剂量的I2S
○组B：在1，和8天，施用2剂量的I2S
○组C&E：未治疗的对照(IKO)小鼠
○组F：未治疗的野生型对照小鼠
材料和方法
动物：
每笼4组将小鼠圈养在集群屋中，12-小时的光暗周期。提供鼠类的饮食(LabDiet-5001，St Louis，MO)和水(Lexington，反渗透纯化的MA城市用水)，用于实验持续期间的自由采食。按照实验动物护理(美国国家学术出版社，华盛顿特区，1996年)“指南”中描述的爱护和使用准则进行爱护动物。目前从4个载体雌性小鼠杂合IKO突变(获自Dr.JosephMuenzer(北卡罗莱纳大学))建立了IKO繁殖群。饲养载体雌性与C57BL/6背景株(C57BL/6NTac，Taconic，Hudson，NY)的雄性小鼠，生产杂合的雌性和半合子的雄性基因敲除小鼠，以及野生型雄性和雌性同窝小鼠。由PCR分析所有后代基因型的组织DNA。本实验中使用的所有小鼠确定为8和12周龄之间的雄性半合子IKO(-/0)或野生型(WT)的同窝小鼠(+/0)。
艾杜硫酶：
对2L的磷酸盐缓冲盐水(PBS)的4个转变，透析22mL I2S[重组人艾杜硫酶]。然后用Vivaspin色谱柱浓缩I2S，而且再悬浮的最终体积为1mL的PBS中，然后通过使用0.2μm的过滤器过滤灭菌。最终浓度为5151mg/mL。
鞘内-腰椎注射：
通过腹膜内注射，使用1.25％2，2，2三溴乙醇(Avertin)(200-300μL/10克体重(250-350mg/kg))，麻醉成年小鼠。除去尾基和肩胛之间的背毛，而且在用异丙醇擦洗之后，用povidine/聚乙烯吡咯酮碘擦洗剃除区域。在腰骶部和背中线的交叉点以及确定的回肠(奇异回肠)翼部的颅方面制作小正中皮肤切口(1-2cm)。在髂窝内的肌肉(臀中肌)为心形的肌肉，而且“心”顶部两侧接近回肠翼部的位置。32号计量注射针连接到气密10-20μL玻璃Hamilton注射器并插入，直到从底层的骨感觉到阻力。在近似速率为2μL/20秒(10μL/2分钟)下进行注射10μL的测试制品。使用适当的创伤夹关闭皮肤切口，而且在返回到相应的笼中之前，动物允许在恢复室恢复。
组织学程序：
在最后一次注射后的1小时处死动物。
收集脑和肝组织并固定在10％中性缓冲福尔马林中，然后处理并在石蜡中包埋。准备5μm的切片用于苏木素/伊红(H&E)和免疫组织化学(IHC)染色。
苏木精和曙红染色：
用H&E染色脑和肝组织切片。染色结果显示细胞核为紫色而细胞质为粉红色到红色。H&E染色切片用于病理组织学形态评价。
免疫组织化学：
为了I2S生物分布评价，将脱蜡和再水化的脑和肝切片与小鼠单克隆抗体2C4-2B2(Maine Biotechnology Services，Portland，ME)抗重组人的I2S孵育过夜，以检测注射的I2S(或不相关的小鼠IgG作为阴性对照抗体；Vector Laboratories，Burlingame，CA)。在2-8℃下过夜孵育后，加入与辣根过氧化物酶共轭的二次山羊抗小鼠IgG。在37℃下，经过额外的30分钟孵育，加入酪胺-Alexa Fluor488标记溶液(Invitrogen Corp.，Carlsbad，CA)溶液中进行额外的10分钟。使用含有1.5μg/ml4′-6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)抗褪色安装的介质(VectaShield；Vector Laboratories)封片切片作为核染液，并用多通道Nikon荧光显微镜观察。染色结果显示I2S阳性细胞为绿色，细胞核为蓝色，及背景为黑色。
为了疗效分析，用鼠抗LAMP-1(溶酶体相关的膜蛋白作为溶酶体标记)IgG(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，California)染色脑，肝切片作为初级抗体。IgG作为不相关的抗体用作为阴性对照。ABC(亲和素生物素复合物试剂盒来自Vector Labs，Burlingame，California)方法用于扩增目标标记。
简而言之，再水化脱石蜡切片，并用初级抗体孵育。在2-8℃下过夜孵育之后，加入次级生物素化的兔抗鼠IgG(Vector Labs，Burlingame，California)，并在37℃下孵育30分钟，然后洗涤样品并用抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物(Vector Laboratories)处理30分钟。为了彩色显影，使用了3，3′-二氨基联苯胺四盐酸盐(DAB)作为发色团。然后用苏木精和封片复染切片。染色结果表明，LAMP-1阳性细胞为棕色而细胞核为蓝色。
拍摄所述代表照片以及用Image-Pro Plus软件(Media Cybemetics，Inc.，Bethesda，MD)分析LAMP-1阳性细胞面积的并使用检定t-检验进行比较性统计分析。
电子显微镜法：
来自3个剂量I2S治疗动物的脑组织被固定在2.5％PFA/2.5％戊二醛(在0.1M二甲胂酸钠缓冲液pH7.4)中，在4度下过夜。然后在二甲砷酸缓冲液(0.1M，pH7.4)中清洗样品，然后固定在四氧化锇中，在酒精和环氧丙烷中脱水，并嵌入在EPON树脂中。在100nm下切成超薄切片，用柠檬酸铅染色，在TECNAITMG2Spirit BioTWIN透射电子显微镜下检查。
结果
在由免疫组化法(IHC)所测定的大脑中，在媒介物对照动物中没有发现I2S。与此相反，在I2S注射的动物中，大脑和小脑的脑膜细胞，神经元对I2S为阳性染色。在动物施用的3剂量(图53)中，染色信号强烈。
与野生型动物相比，在媒介物-治疗的IKO小鼠的脑组织中，在整个大脑中发现细胞空泡化，溶酶体贮积症的组织病理学特点。与未经处理的(图54)小鼠相比，在I2S治疗的IKO小鼠中，从大脑皮层表面，尾状核，丘脑，小脑，到白质的细胞空泡化普遍降低。与野生型动物(图55)相比，在媒介物治疗的IKO小鼠中，由溶酶体相关膜蛋白1(LAMP-1)染色，在小胶质细胞，脑膜和血管周围的细胞中，发现异常高的溶酶体活性，溶酶体活性和疾病状态的指标。I2S intralthecal-治疗的小鼠的LAMP-1免疫组化显著减少。此减少的特征在于：LAMP-1阳性细胞数目降低而且染色更轻。在2和3剂量I2S治疗的动物中，从大脑皮质，尾状核，丘脑，小脑白质(图56)，在整个全脑表面发现减少。不同脑区的LAMP-1免疫组化形态计量学分析证实，在评估的大脑的各个区域，LAMP-1阳性(图56)显著减少。
电子显微镜检查媒介物治疗的IKO小鼠的脑细胞发现：扩大后的空泡含有无定形颗粒存储材料和薄片形的夹杂物和斑马体状结构。在腰椎I2S鞘内注射的小鼠(图57)中，在超微结构水平下，这些典型溶酶体贮积的病理特征降低。
在肝脏中，在媒介物治疗的动物中，没有阳性染色I2S。在I2S鞘内注射的小鼠中，在正弦细胞(图58)中清楚地发现注射的大量I2S，这表明注射的I2S与CSF散布在鞘内空间，然后通过蛛网膜颗粒吸收进入循环系统。
与WT小鼠相比，在媒介物治疗的IKO小鼠的肝组织中，由H&E染色表明细胞空泡化严重和异常高的溶酶体活性，以及发现强的LAMP-1免疫组化。在鞘内以I2S治疗后，在肝中发现细胞空泡化和LAMP-1免疫组化显著减少。H&E染色显示的胞浆内空泡形成几乎完全消失，接近正常肝细胞结构(图59)。
在IKO小鼠中，通过鞘内腰椎路线，重组人I2S传递到大脑，而且在大脑中的不同区域，注射的I2S引起广泛的病理组织学改善。
●大脑的脑膜细胞和神经元中，注射的I2S是可检测的。
●在光学和电子显微镜水平下，整个大脑细胞的空泡化降低。
●在整个大脑中，LAMP-1溶酶体标记减少。
●鞘内注射的I2S进入外周循环，而且改善肝形态学和组织学标记。
实施例7：IT递送I2S的毒理学
本实施例说明了在食蟹猴内，通过每月弹丸鞘内腰椎给药的剂量临床体征相关联的艾杜硫酶。为了实现这一目标，将14例雄性食蟹猴随机分配成5个治疗组，如在下面表21所示。
表21：试验设计
动物标称剂量(mg)剂量体积(ml)的组号码
所有组中的动物，每隔一个月在腰椎水平上IT给药3次。从导管系统中用0.3ml的PBS冲洗1ml剂量体积。每个剂量的1到2天之前，在小脑延髓池水平，从IT脊椎抽液收集约2ml的CSF。在这个时候，还收集血液样品(2ml)。从组5的预给药动物中，第一次剂量给药后0.5、1、2、4、8，24和48小时后，收集血液(2ml)和CSF(0.1ml)。每天至少记录2次临床体征。第3次给药约24小时后进行尸检，收获并保存选择的组织。
第1天，所有3个组4(150mg)的动物给药后3-12分钟内，表现出倾向于背面的最小倾向，持续5-15分钟，此信号被认为是与测试制品相关联的。体重、食物消费和神经/体检参数没有变化，被认为与测试制品相关联。
分析血清和CSF样品并提供计量溶液分析。在食蟹猴的不同组织中观察各种内源性艾杜硫酶活性的变化；检查的大脑和脊髓比其他外周器官的内源性活性较大，包括肝脏，心脏和肾脏。艾杜硫酶施用与艾杜硫酶在不同脑区，以及在脑干和脊髓活性的剂量依赖性增加相关联。IT递送不会导致在左，右大脑半球之间可观察到的差异分布。艾杜硫酶活性在以下器官中有明确的剂量依赖性增加：大脑、肝脏，心脏和肾脏。大脑中艾杜硫酶的免疫染色，在染色强度表现出剂量依赖性增加。在3mg组中，在脑膜下方观察到脑膜细胞和神经胶质细胞染色；在3mg治疗组动物中，神经元染色并不明显。艾杜硫酶染色呈阳性，而且在脊髓内具有剂量依赖性，最高的染色强度在腰部，其中发生IT施用艾杜硫酶。艾杜硫酶染色强度在肝，肾和心脏呈剂量依赖性而且在这些器官中与增加的艾杜硫酶活性相一致。
总之，IT施用艾杜硫酶，每隔一个月递送剂量至150mg均无不良影响。因此，没有观察到不利影响水平(NOAEL)被解释为150mg，为本研究中测试的最高剂量。在CNS的艾杜硫酶活性中，艾杜硫酶施用与剂量依赖性增加相关联，并导致在肝，肾，心脏中的系统水平。
在154mM NaCl，0.005％聚山梨酯20，pH值5.3-6.1中，提供测试制品，艾杜硫酶作为剂量溶液。提供的剂量溶液的标称浓度分别为0、3，30或150mg/ml。测试制品保存在-82°至-79℃的冰箱中。磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH为7.2，用作为剂量施用和系列脑脊液收集后的冲洗剂。PBS获自Gibco，Invitrogen公司。
测试制品剂量制备
给药第一天的每个时间间隔，从-80℃冷柜取出各浓度的药瓶，在台面上使其解冻至室温。一旦解冻，分别标记为组1，2，和3中的药瓶，称重并通过0.22μm的过滤器取回1ml用于每个预定的动物进行给药。施用完所有的剂量剂量后，再次称重药瓶并放置在冰箱中。
接下来的一天(用于动物003，组4和组5给药的天)，从冰箱中取出用于组1和组4的剂量溶液，并在台面上放置至室温。一旦到了室温下，称重用于组1和4的药瓶，标记组4药瓶，并通过过滤器取回用于每只动物预定的1ml，用于给药组1和组4。然后通过在无菌聚丙烯药瓶中注入适量的组4剂量溶液和组1(媒介物)来制备组5剂量溶液。记录来自组1和组4中的添加量。轻轻翻转药瓶混合该溶液而且通过过滤器取回2-1ml剂量用于组5中的动物。给药完成后再次称重组1和组4的药瓶，而且所有的药瓶(组1-5)被放置在冰柜中。
14只动物随机分配到表21中所描述的治疗组。
选择IT施用途径因为这是倾向于对人施用的路线。本研究中(3，30，100，和150mg/ml)被选择的艾杜硫酶剂量，被选择以评估在每月3次连续丸IT腰椎注射后，在非人类灵长类动物的中枢神经系统(CNS)中的不同剂量水平的酶的生物分布。
临床观察
临床体征的总发病率是最小的。在组1(对照)，组2(3mg)，组3(30mg)，或组5(100mg)中的动物，没有临床体征，被认为在研究过程中的任何时间上与测试制品相关联。
第1天，所有3个组4(150毫克)的动物(012-014)在给药后3-12分钟内，表现出倾向于背面的最小倾向，持续5-15分钟。本信号被认为是与测试制品相关联的，而且任何的较低剂量组中没有观察到。在紧随第1剂后或在紧随测试制品施用后的期间内，没有其他的临床体征。组4动物中，只观察到其他信号为第35天动物013的单一呕吐事件。
考虑到植入的药物递送装置的固有的变化，单一的每月鞘内丸施用测试制品与任何不利的肉眼变化或微观变化不相关联。所有的组，包括对照组，在脑膜中有微观的变化，表明药物递送系统的炎症反应。在动物接受30mg及以上的测试制品剂量时，在脑膜中有炎症反应的倾向，有较明显的嗜酸性粒细胞成分，但这种差异不认为具有生物意义。
由于对照和测试制品处理的动物之间的差异是非常轻微的，在本研究中没有观察到不利影响水平(NOAEL)的最高测试剂量被解释为150mg。
在所有组(包括对照)脑膜中的整体炎症反应比在猴子中进行的此鞘内研究一般遇到的稍加明显。然而，这被认为可能与媒介物的一些特性或尸检前24小时的给药行为相关联。
除了3mg组中的一只动物之外，在所有治疗的动物中，脑艾杜硫酶染色呈阳性，在150mg组(图60，61，62和63)中发现最高的染色强度。在3mg组中，只有脑膜下方的脑膜细胞和少量的神经胶质细胞为阳性；在神经元中检测到不注射的艾杜硫酶。在高剂量组(30，100和150毫克)中，大量的脑神经元对艾杜硫酶染色呈强阳性，还有脑膜细胞、神经胶质细胞和血管周围细胞。艾杜硫酶免疫组化结果显示：在脑神经元中，注射艾杜硫酶从脑膜表面的神经元内层I，到与白质(图64，图65和66)相邻的更深层VI广泛分布。在150毫克剂量组(图67)中，也观察到标记染色的神经元。在所有动物中(从30-150mg的剂量组)，在神经元的艾杜硫酶染色中，大脑的额叶，中部和后部部分之间没有发现显著性差异。
在所有动物的脊髓中，艾杜硫酶染色呈阳性，在腰部(图68和图69)具有最高的染色强度。艾杜硫酶免疫染色也呈剂量依赖性。在150mg组(图70和图71)中，神经元、meningial细胞、神经胶质细胞、血管周围细胞和外延/周边/神经内膜(结缔细胞)周围的神经纤维，艾杜硫酶染色呈强阳性。
在肝脏中，在所有动物的正弦细胞(枯否细胞和内皮细胞)中发现艾杜硫酶的阳性染色。然而，3mg治疗组(图72)的肝细胞中未检测到艾杜硫酶，而在更高剂量的肝细胞中发现阳性艾杜硫酶染色，在150mg治疗组(图73中，74和75)中，具最大的染色强度。
在3mg治疗组(图76)的动物中，没有艾杜硫酶的阳性染色。相反，在30，100和150mg组中，间质细胞的艾杜硫酶为阳性染色，在150mg组中观察到标记染色-以阳性细胞数和染色强度(图77，图78和79)而言。
肾
在从3mg剂量组(图80)的动物中检测到很少或没有注射的艾杜硫酶。然而，在30和100mg组(图81和图82)的肾小球细胞和间质细胞中，发现阳性艾杜硫酶染色。在所述150mg组中，艾杜硫酶免疫组化染色另外揭示近端肾小管上皮细胞艾杜硫酶染色，与显著的肾小球及间质细胞染色(图83)。
讨论
体重，食物消费，体格检查和神经系统检查结果发现：没有测试制品相关的临床体征或影响。在第1天，组4(150mg)的动物，给药后3-12分钟内表现出倾向于背面的最小倾向，持续5到15分钟；此信号被认为是测试制品相关联的。
艾杜硫酶施用与在不同脑区，以及脑干和脊髓中的艾杜硫酶活性的剂量依赖性增加相关联。在脊髓内，最高水平的染色强度是在腰部，其中发生IT施用艾杜硫酶。在肝，肾，心脏中，IT施用艾杜硫酶也导致全身暴露剂量依赖的染色强度。动物接受的测试制品剂量，在30mg和更大时，在脑膜中，具有炎症反应的倾向，具有较明显的嗜酸性粒细胞成分。
IT施用艾杜硫酶的剂量至150mg，每隔一个月递送均无不良影响。因此，在本例中，没有观察到的不良作用水平(NOAEL)被解释为是150mg，为最高剂量测试。在CNS的艾杜硫酶活性中，艾杜硫酶施用与剂量依赖性增加相关联，并导致在在肝，肾，心脏中的系统性水平。
实施例8：IT递送I2S的PK(血清和CSF)
本实施例提供了血清和脑脊液(CSF)分析，通过在食蟹猴中每月Bolus鞘内腰椎注射和每周Bolus静脉注射与施用艾杜硫酶的6个月的毒性研究相关联，用于测试制品(TA)浓度
试验设计
从超过6个月时间的毒理学和安全药理学的角度来看，t的目的是评估重复给药鞘内(IT)施用的艾杜硫酶(12s)。该研究的设计见表22。
表22：研究设计
DC＝设备对照：在组1中的动物没有给药媒介物成测试制品
测试制品
鉴定：ldursulfase IV给药-Lot No.FDC06-001(2.0mglmL)
IT给药-艾杜硫酶(0mgImL)
艾杜硫酶(3mg1mL)
艾杜硫酶(30mg/ml)
艾杜硫酶(100mg/ml)
检测方法：
用ELLSA法(酶接免疫吸收剂检测)进行分析，以测定艾杜硫酶浓度。在用稀释因子增加之前，检测限度(LOD)＝1.25毫微克/毫升。以1∶50稀释进行样品筛选，因此，检测的灵敏度为62.5ng/mL。进一步稀释超出校准曲线高端的样品，并在一个适当的稀释下重新测试，导致在值在曲线的范围内。另外使用的酶活性检测分析选定的样品。在最小的样品稀释液1∶150上，用于此检测的LOD为0.18mU/mL。
组1和组2的动物分别给药以生理盐水或媒介物，在整个IV和IT给药期间内，所有具有的血清艾杜硫酶水平介于138ng/mL和62.5ng/mL(或LOD)之间。从组1和组2动物的200个CSF样品测试，62个表现出的水平I2S在检测LOD以上。这些，7个值较高(＞1,000ng/mL)。另外一个CSF样品收集预IT给药3测试超过I2S的1000ng/mL。然后这些测试的样品用于艾杜硫酶活性。在每一种情况下，活性的结果表明，存在I2S以及基于活性水平计算I2S的近似浓度时，结果为通过抗原ELISA法获得的20％的范围内。(见表23)，利用酶活性检测，也对其他与随机选择的具有抗原ELISA结果＜LOD的CSF样品进行了测试，以排除任何非比活度。
表23：CSF样品的调查结果
在本研究中，分析血清和CSF样品用于艾杜硫酶浓度。根据如下进度安排血清样品收集：
IV给药：预给药和给药1至10后2小时，预给药和给药11至23后4小时，以及在尸检时。
IT给药：预给药和给药1至2后2小时，预给药和给药3至6后4小时，以及在尸检时。根据如下进度安排CSF样品收集：
IV给药：预给药和给药1后2小时，和药3至6给4小时后。
IT给药：预给药和给药1至2后2小时，预给药和给药3至6后4小时，并在尸检。
一般情况下，似乎血清艾杜硫酶的清除速度比CSF艾杜硫酶快。在所有时间点的测试中，分别组对1和组2动物给药以生理盐水或媒介物时，血清艾杜硫酶水平小于或等于138ng/mL。有些动物有水平低于检测的检测限(LOD)。
组1和组2中较少的CSF样品在检测LOD以上，有7个显著的例外，其导致高(＞1000ng/mL)的水平。选自预IT给药3的动物的一个CSF样品，也超过1000ng/mL艾杜硫酶。
对给出了这些趋势结果的样品进行重测，并确认。此外，进行测试这些样品的艾杜硫酶酶活性。这些活性的结果也证实了高的艾杜硫酶水平，在由艾杜硫酶质量检测(表23)获得的20％之内。
通过随机测试低于LOD的艾杜硫酶质量单位的CSF样品证实这些样品队列中活性检测的特异性，并确证在这些样品中艾杜硫酶水平确实为LOD(数据未示出)。
实施例9.递送的I2S的生物分布
已成功地证实，鞘内施用为有效的递送I2S到CNS组织的方式，进行了更多的研究以确定是否IT-施用的I2S能分布到大脑深部组织以及IT-施用的I2S是否有细胞定位。已经制备重组的人类己醛糖酸盐-2-硫酸酯酶(I2S)制剂并配制在154mM氯化钠，0.005％聚山梨酯20(pH为6.0)媒介物中。
按植入鞘内端口的方式给非人类的灵长类动物按月给予3mg，30mg或100mg的I2S，连续6个月。该研究的设计总结在以下的表24中。
表24
a艾杜硫酶除非另有规定。DC(设备对照)；IT(鞘内)；IV(静脉注射)；NS(生理盐水)；PBS(磷酸盐缓冲盐水，pH值7.2)。
每月重复施用I2S到非人类灵长类动物进行6个月，在最高剂量检测的耐受性良好，不与任何重大不利的毒理学事件相关联。施用第6和最后给药I2S的24小时后，处死受试者非人类灵长类动物，检查此非人类灵长类动物的CNS组织。
如由免疫组化法(IHC)测定的，在整个CNS组织和细胞中，有有广泛的I2S细胞沉积。通过IHC，在所有的脑组织中检测到I2S蛋白，从大脑皮质的心白质具有沉积梯度。在剂量依赖式的所有组中的大脑，小脑，脑干和脊髓的神经元的灰质中，可检测到I2S。在高剂量组的灰质表面中，在表面皮层(图84A)内，大量的脑神经元对I2S染色为阳性。在丘脑(图84B)、海马(图84C)、尾状核(图84D)和脊髓(图84E)的神经元中也检测到I2S。脑膜和血管周围细胞也I2S染色(图84F)呈阳性。
如图85和图86所述，IT-施用的I2S进入CNS组织分布并尤其在受试者非人类灵长类动物的灰质，丘脑和大脑皮质中的沉积是显而易见的。此外，图86和图87示出，IT-施用的I2S受试者非人类灵长类动物CNS组织中的的积聚为剂量依赖的方式。共定位染色也显示，IT施用的I2S与神经元和少突胶质细胞相关联。IT施用的I2S也在受试者非人类灵长类动物的整个大脑分布和定位，如图88证实。特别地，如图89A-D示出，神经元摄取和轴突关联的IT对非人类灵长类动物施用I2S后，如由纤维丝染色表明。而且特别感兴趣的是，目前的研究表明，I2S对神经细胞是有选择性的，而且这些神经细胞协助鞘内-施用I2S在大脑深部组织的分布，而且似乎是与轴突结构相关联，表示顺轴突运输I2S。
下表25示出单独动物研究的剂量和各种施用途径的药代动力学数据。
表25
124I标记的I2S施用于试验动物，如下表26所示，以及PET扫描结果见图106中所示。
表26
本研究还显示了IT-施用后，受试者非人类灵长类动物脑室附近，白质脑组织中的IT施用I2S的细胞识别。虽然白质中的I2S染色密度比灰质中的普遍更低，在少突胶质细胞(图90)内可检测到I2S。特别是，图90示出在白质脑组织中I2S的细胞识别，并进一步说明I2S与髓鞘不表现出相关性。
除了展示IT施用的I2S的分布深入到脑组织中，目前的研究也证实了I2S在目标细胞器内的定位，而且重要的是I2S在溶酶体内部的定位，其影响溶酶体存储失调症中的细胞器，如Hunter’s综合症。特别地，位于溶酶体内的I2S，而且在轴突也可检测到。图90示出在非人类灵长类动物少突胶质细胞溶酶体内，IT-施用的I2S定位，从而确认IT-施用I2S能够分布到大脑深部组织并能够细胞定位。
为了辨别是否递送的I2S保留生物活性，利用比活度测定I2S在大脑中的水平。最后给药后24小时，3mg IT组在大脑中的活性明显不同于设备对照及媒介物对照动物的基础水平。在尸检(给药后24小时)中，30mg和100mg IT给药动物的大脑中，酶活性高于基线。
在图104和下表27中，进一步示出了动物试验，以辨别I2S递送到大脑的位置。
表27：样品位置
实施例10.在BEAGLE犬内，IT递送的生物分布
在上述例子中观察到的I2S的分布模式也通过在健康Beagle犬中给予单一的IT或ICV给药来概括。使用计算机生成的数字，雄性Beagle犬随机分为两组(组1(ICV)，N＝3，组2(IT)；N＝4)。所有犬具有在腰椎或左侧脑室(用于给药)和在小脑延髓池(采样)内的蛛网膜下腔植入导管。在皮下钛接入端口终止所有的导管。额外的犬用作为不给药的手术对照。
I2S单一的弹丸1ml注射(在20mM磷酸钠中30mg/ml，pH值为6.0；137mM氯化钠；0.02％聚山梨酯-20)，施用IT或ICV，然后由0.3ml磷酸缓冲盐水(PBS，pH7.2)冲洗。临床体征进行监测，并且牺牲发生在给药后24小时。收集脑和脊髓组织样品用于定量I2S分析，如由ELISA所测定的I2S的酶活性和IHC，并在研究组之间进行比较。
I2S广泛分布在IT和ICV组的整个灰质，如由IHC所测定。在大脑皮质的所有6个神经元层中，神经元对I2S呈阳性，从IT和ICV组的表面分子层到深部层，如由图91所示(图像a和c)。在IT和ICV组的小脑皮质中，神经元中检测到I2S，包括Purkinje细胞，如由图91(图片c和d)所示。在IT和ICV组的海马体中，众多数量的神经元对I2S为阳性，如图91(图片e和f)表明的。在两个组中，也在丘脑和尾状核中发现I2S阳性神经元，如图91(图像g和h)中表明的。
因此，本研究证实了IT-施用酶分配到深部细胞和大脑组织的能力，并支持IT-施用的酶的效用，如I2S用于治疗与溶酶体贮积症相关联的CNS的表现，如亨特氏综合症。
实施例11.IT递送I2S的体内疗效
己醛糖酸盐-2-硫酸酯酶缺失小鼠模型
进一步研究表明，IT-施用的I2S能够分布到脑深部组织和I2S细胞定位，进行进一步的研究用于测定IT-施用I2S的治疗效果。开发Hunter综合症的基因工程己醛糖酸盐-2-硫酸酯酶基因敲除(IKO)小鼠模型用于研究IT-施用I2S以改变疾病级数的能力。使用目标性的破坏I2S所在地，其导致在组织和器官中积累聚糖(GAG)，开发所述I2S基因敲除小鼠模型。IKO小鼠模型显示出许多在人类见到的Hunter综合症的物理特性，包括特征性的粗功能和骨骼缺陷。此外，所述IKO小鼠模型在尿和整个身体组织中演示升高的糖胺聚糖(GAG)水平，以及广泛的细胞空泡化，其为观察的病理组织学。
在本研究中，市售的I2S为浓缩的，并再悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中。6组雄性IKO小鼠，8-12周龄，用I2S(10μL，26mg/ml)治疗。组A和B(N＝3)分别施用3个260μg剂量(1，8，和15天)和260μg剂量(1和8天)的I2S，通过在1天，8，和15鞘内施用260μg剂量，进行组D治疗。组C和E(N＝3)为未经治疗的对照，而组F(N＝3)为未经治疗的野生型对照。对照小鼠施用的媒介物没有I2S。最后一次注射1小时后处死小鼠，其次为组织制备用于进行免疫组化(IHC)和病理组织学分析。
3次注射后，与媒介物治疗过的小鼠相比，在I2S治疗的小鼠中，大脑皮层表面、尾状核，丘脑和小脑的细胞空泡化普遍减少。也在IT处理后的白质中发现细胞空泡化减少。IT-施用后，IKO小鼠脑组织中I2S的分布是明显的。
在IKO小鼠中，3周的IT施用I2S也表明在光，电的微观水平，CNS中的细胞空泡化的显著下降。随着IT施用I2S，相对于未经处理的IKO小鼠，细胞空泡化明显减少，这表明IT-施用I2S能够改变疾病的发展。如图92所示，IT-施用I2S后，IKO小鼠的corpous胼胝体和穹窿的细胞空泡明显减少。
此外，电子显微镜检查表明：存在贮积的减少，包括在灰质中的神经元、和在白质中少突胶质细胞的液泡中。特别是，IKO小鼠IT-施用I2S也表现出栅栏层状体(“斑马小体”)的减少，其特性在于：某些溶酶体贮积症。特别是，图57表示电子显微镜扫描，示出了相对于未治疗的IKO鼠，在施用I2S的IKO小鼠的神经元中，斑马小体的减少。类似地，图57示出了胼胝体中少突胶质细胞的电子显微镜扫描。
此外，IT施用I2S到IKO小鼠，在溶酶体病病理的生物标志物的溶酶体相关的膜蛋白1(LAMP1)免疫染色中，一种溶酶体活性和疾病状态指标，在大脑皮质的表面、尾状核、丘脑，小脑和白质，也表现出显著减少。正如在图93A所示，相对于未处理的IKO对照小鼠大脑皮层组织表面，在治疗的IKO小鼠大脑皮层组织表面，LAMP1免疫染色明显减少，见图93B中所示，反映疾病病理的改进。
图56定量地表明和比较脑组织中μm2区域测量的LAMP1浓度。不同脑区的LAMP-1免疫染色的形态计量学分析证实，在评估的脑的各个领域内，LAMP-1阳性染色显著减少。正如图56所示，在脑组织评估(皮层，尾状核和豆状核(CP)、丘脑(TH)，小脑(CBL)和白质(WM))的每个区域中，相对未治疗的IKO对照小鼠，在治疗的IKO小鼠中，LAMP-阳性区域减少，并接近的野生型小鼠的LAMP-阳性区域。特别值得注意的是：在持续治疗持续时间中，在每个脑组织区域中的分析的LAMP-阳性区域为进一步降低。
在所述脑的所有区域中，异常高溶酶体活性的减少，与剧烈形态改善相关。这些结果证实了：IT-施用I2S能改变溶酶体贮积症的进展，在基因工程的IKO小鼠模型，进一步证实了：IT-施用酶(例如I2S)，以治疗与溶酶体贮积症(例如Hunter’s综合症状)并发的CNS表现的能力。
实施例I2-疾病患者的治疗
通过例如IT递送的直接CNS施用可以用于有效治疗MLD患者。这个实施例解释了多剂量递增研究，其被设计以评估每隔一周(EOW)高达3剂量水平，持续总共40周，通过鞘内药物递送设备(IDDD)施用rhASA至患有婴儿型MLD患者的安全性。适合于人类治疗的多种示例性的鞘内药物递送设备，在图89-图92中描述。
参加的患者高达20个：
队列1∶5患者(最低剂量)
队列2∶5患者(中等剂量)
队列3∶5患者(最高剂量)
随机分配5例患者，不进行治疗。
选择患者进行研究，基于以下包含的标准：(1)在30个月的年龄之前出现第一个症状；(2)在筛选时是能走动的(定义为独立站立和用一只手举着向前走10步的能力)；(3)在筛选时存在神经学体征。通常地，具有造血干细胞移植历史的患者被排除。
通过IT注射，持续40周，测定在儿童和晚期婴儿Hunter’s症中施用I2S的递增剂量的安全性。此外，评估了I2S在粗大运动功能方面的临床活性、以及在血清中单一和重复剂量的药代动力学、和在脑脊髓液(CSF)中的浓度。
IT递送rhASA蛋白
实施例13：IT-递送重组ASA的毒理学研究
为了评估其他鞘内-施用重组酶分布到的细胞和CNS组织的能力，进行GLP研究以从毒理学和安全药理学的角度评估，超过1个月期的青少年(年龄小于12个月)食蟹猴的重复给药鞘内(IT)施用重组-制备的人芳基硫酸酯酶A(rhASA)。制备rhASA制剂，并在154mM氯化钠、0.005％聚山梨酯20(pH为6.0)媒介物中配制。
为了实现这一目标，按体重随机分配9只雄性和9名雌性少年食蟹猴至3个治疗组之一，见下表28中所示。动物(剂量1的1只雄性动物例外)接受0.6mL短期IT输注0，3或31mg/mL的rhASA(总剂量为0，1.8或18.6mg)，每隔1周，每只动物进行总的3次给药。监测体重，临床观察发现，精神和身体检查，临床病理，眼科检查和毒物采样。第29，30或31(最后IT给药后～24小时)天，解剖所有的动物。收集选定的组织，保存和显微镜检查。
表28
使用ELISA分析食蟹猴CNS组织中检测到的rhASA浓度，并与正常人类rhASA浓度10％的治疗目标相比，对应组织的约2.5ng/mg。分别提取食蟹猴大脑不同区域的组织样品或钻孔活组织，并进一步分析存在的rhASA。图133-图138示出了从该钻孔中提取的组织。钻孔活组织的组织样品反映了rhASA浓度的增加，反映在图139A-G中，从大脑皮质到深部白质和深部灰质具沉积梯度。
使用相同钻孔活组织，从IT和ICV施用途径检测rhASA的浓度，对6只猴子施用18.6mg剂量的rhASA，见图140A-B所示。成年和青少年食蟹猴鞘内-(IT)或脑室内-(ICV)施用rhASA，深部白质(图140A)和在深灰质(图140B)的脑组织中检测到的rhASA浓度具有可比性。
然后进行分析从成年和青少年食蟹猴的大脑的钻孔提取的组织样品，以确定沉积在所提取的组织样品中的rhASA的浓度，并比较此的浓度与治疗的2.5ng rhASA每mg蛋白的目标浓度(对应于在健康受试者中正常浓度rhASA的10％)。如图141A所示，在每个组织样品中，钻孔分析IT-施用18.6mg剂量的rhASA，导致rhASA浓度超过目标治疗蛋白质2.5ng/mg的浓度。同样，当IT-施用1.8mg剂量的rhASA于青少年食蟹猴，每个组织样品钻孔分析表明：rhASA浓度在2.5ng/mg的蛋白质治疗浓度之内或超过，而且对所有组织钻孔测试(如图141B)而言，中位rhASA浓度在治疗目标之上。
要确定是否IT-施用的rhASA分布至有关的细胞，分析食蟹猴中深部白质的组织，IT-施用1.8mg rhASA，从图142A中示出的区域。深部白质组织的免疫染色揭示了rhASA在食蟹猴少突胶质细胞的分布，如图142B所示。同样，图142C表明，IT-施用的rhASA在食蟹猴深部白质组织中表现出共定位。特别是，在目标细胞器，如溶酶体中，染色共定位是明显的(图142C)，支持结论：IT-施用的rhASA能够分配到CNS相关的细胞，组织和细胞器，包括少突胶质细胞中的溶酶体。
实施例14.ICV-VS.IT-施用
制备标记有正电子发射体124I的rhASA，并在154mM氯化钠，0.005％聚山梨酯20，pH为6.0的媒介物中配制。等价于3mg rhASA(对应约为脑的38mg/kg)的制剂体积通过脑室内地(ICV)和鞘内施用途径(IT)施用于成年食蟹猴。对食蟹猴进行高分辨率的PET扫描成像研究(微PETP4)，以测定施用的124I标记的rhASA的分布。
PET成像数据(图143)示出了ICV和IT-施用的124I-标记的rhASA二者在CNS组织中的有效分布，尤其是124I-标记的rhASA立即通过IT腰椎导管施用以及在脊柱长度上的脑脊髓液(CSF)中的均匀散布。特别是，如在图143中示出，ICV-和IT施用后，在食蟹猴受试者的CNS组织(包括脑，脊髓和脑脊液)中检测124I-标记的rhASA的治疗浓度。在CNS等组织中浓度检到的rhASA，特别是在大脑组织中，超出了治疗目标蛋白质2.5ng/mg的浓度。
虽然IT和ICV施用途径的rhASA蛋白质分布是可比的，ICV导致在脊柱中沉积显著减少，如图143证实。
施用制剂24小时后，ICV和-IT-施用的124I-标记的rhASA有效地分布在CNS组织。特别是，与ICV-施用剂量的16.7％相比，在颅区，IT-施用后24小时为施用剂量的12.4％。因此，在此CNS组织检测到的rhASA浓度，特别是在大脑组织中，IT施用的rhASA接近这些检测的浓度(当ICV-施用相同剂量后)。
ICV注射124I-标记rhASA导致ICV注射导致立即传输注入的量到小脑延髓池，池脑桥，〔脑〕脚间池和近侧脊柱，如在图144中所示。也如图144所示，在2-5小时内，IT施用递送124I-标记rhASA的相同的初始房室(池与近端脊柱)如ICV施用所示。24小时后的ICV-和IT施用124I-标记的rhASA分布，在脊柱区池和近端是可比的，如在图145中示出。
这些结果证实，可以使用微创的IT给药途径将rhASA递送给受试者，从而在靶细胞和组织中达到治疗的浓度。
所述溶酶体贮积症，代表酶丢失或损坏所造成的遗传性疾病家族，其导致异常的物质积累。而与这些疾病相关的几个周边症状，可以通过过静脉施用重组酶有效地减轻，静脉施用此重组酶预计不会显著影响与多数溶酶体贮积症相关的CNS表现。例如，重组人己醛糖酸盐-2-硫酸酯酶(艾杜硫酶，Shire人类基因疗法，Inc.Lexington，MA)被批准用于治疗Hunter综合症的躯体症状，但有没有药物疗法用于治疗Hunter综合症的神经系统表现，其中可包括迟缓发育和精神障碍加剧。这部分是由于I2S的天性，其为大的、高度糖基化的酶，其分子量约76kD而且静脉内施用后不穿过血脑屏障。
因此，本发明人已经进行了计划，以研究鞘内(IT)递送重组人酶的鞘内制剂，诸如，例如，艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)，芳基硫酸酯酶A(rhASA)和α-N-乙酰氨基(Naglu)。本文所示的结果第一次证明，施用IT-腰椎施用重组溶酶体蛋白导致施用的蛋白质显著部分递送到脑，特别是导致在在食蟹猴和狗的脑和脊髓的神经元中广泛沉积这种蛋白质。CNS组织的免疫组织化学分析表明，该蛋白针对溶酶体在溶酶体贮积症中，病理粘多糖积累的位点。此外，在Hunter综合症的IKO小鼠模型、Sanfilippo综合症B型的Naglu-缺陷小鼠模型、和异染性脑白质病变(MLD)的ASA基因敲除小鼠模型中，所述形态改善表现出加强观察IT-施用的酶分布到适当的组织和转运到适当的细胞室和细胞器。
IT腰椎和ICV施用I2S后，在脑分布格局中检测到的相似的观察暗示CSF的总体流动和活性再混合。因此，在临床设置中，IT和ICV二者的施用途径是潜在可行的，然而，IT施用后所观察到的I2S在脊髓中沉积中提供了在处理脊髓后遗症和溶酶体贮积症组分(如Hunter综合症)中的明显的优势。此外，脊髓内注射端口是微创的，并预期更适合长期使用，尤其是儿童受试者中。
血管周细胞染色和通过上述PET成像研究观察的蛋白质转运动态证据表明：在血管周围空间内酶的移动，可能是通过脉动辅助对流机制。由观察的关联I2S的神经丝蛋白，指示积极轴突运输，暗示额外的运输机制。后者假定蛋白质与神经元甘露糖-6-磷酸(M6P)受体的相互作用开始，这可能导致在脊髓和脑细胞上的广泛表达，其直接施用至脑实质可引发靶细胞细胞很容易地吸收I2S酶。(Begley，et al.，Curr Pharm Des(2008)14：1566-1580)。
虽然先前已通过在体内间接的方法和体外成像暗示轴突运输溶酶体酶，目前的研究提供了轴突运输非病毒的或通过CSF递送表达酶的第一个直接证据。因此，从CSF到脑表面和深入脑组织的蛋白递送似乎取决于活性转移过程，其中没有先前已经描述或阐明蛋白质或酶递送到大脑的细胞、组织和细胞器。
与流行的观点相反，实质间质和CSF的流体动力可防止IT-腰椎施用的蛋白质到脑白质的分布，即时研究清楚地表明：IT递送溶酶体酶导致蛋白在所有脑组织中的分布和积累以及沉积在靶细胞溶酶体房室中的积累，其为粘多糖积累的病理位点。(见，Fenstermacher et al.，Ann N Y Acad Sci(1988)531：29-39和DiChiro et al.，Neurology(1976)26：1-8.)。再加上微创性天然的IT-腰椎递送，这条路线提供了递送生物疗法到大脑的临床相关方法，特别是在儿童中。
实施例15-毒理学
这个例子说明了从毒理学和安全药理学的角度来重复剂量鞘内(IT)施用rhASA，超过6个月的时间。这项研究的IT测试制品为rhASA。36只雄性和雌性食蟹猴被随机分配成5个治疗组。组1的动物为未治疗的植入装置对照(端口与导管)和未给药以媒介物或测试制品；然而，在时间表上这些动物被给药以0.6mL的PBS以匹配测试制品给药的时间表。组2-5的动物接受0，3，10或31mg/mL rhASA(总剂量为0，1.8，6.0，或18.6mg)的0.6mL IT注射的，每隔一周(即总共12个剂量)。6个月(最后IT剂量后24小时)时尸检动物，而其余4只动物/性别/组在4周恢复期结束时尸检。收集选定的组织，保存并显微镜检查。
在一般情况下，所述测试制品相关的变化可以分为两大类，并在所有剂量水平(1.8，6.0和18.6mg/剂量)存在。(白血细胞，通常有显著的嗜酸性粒细胞成分)在脑膜、脑实质、脊髓实质、三叉神经节，以及偶尔为脊神经根/节(或围绕这些结构的外膜)的浸润增加。此增加被解释为是由于在鞘内空间和在神经系统组织中存在测试制品(蛋白质)。在偶尔的动物(在任何高剂量的动物中没有观察到小胶质细胞积累)的脊髓和脑中小胶质细胞轻微地、灶状增加。两种类别的形态学变化被解释为响应测试制品的存在。没有任何动物神经元坏死的证据。在脑、脊髓，脊神经根或神经节中，没有测试制品相关变化有关的任何生物的不良反应。具体来说，没有证据证明神经元坏死或生物学重要的胶质响应。在非神经系统组织中，没有测试制品相关的病变。
经过为期一个月的恢复时期(给药自由期)后，变化相关的测试制品或完全消退或仅限于之前炎症反应(与测试制品存在相关)增加的残余。在恢复的动物中无不良的形态影响。如基于双盲显微检查分配半定量染色评分，对于芳基硫酸酯酶A(rhASA；测试制品)的免疫组织化学染色，在脑和脊髓的各种细胞类型中增加，除了神经元，对于所有测试制品治疗的组在终末期处死。此增长在肝脏的Kupffer细胞中也很明显。1个月的恢复期后，在测试制品治疗的动物(所有剂量组)rhASA染色已返回到对照(设备和/或媒介物对照)的水平。在低剂量恢复的雄性中，有多个星形胶质细胞和神经元的损失的病灶，表示多个区域缺血之前，在大脑皮质中。虽然在这种动物中的这些病变确切发病机制并不明显，在任何其他测试制品治疗的动物中，缺乏类似的病变，包括获得10倍剂量的高剂量的动物，表明这些病变与测试制品是不相关的。
这项研究的IT测试制品为rhASA。36只雄性和雌性食蟹猴被随机分配成5个治疗组。组1的动物为未治疗的植入装置对照(端口与导管)和未给药以媒介物或测试制品；然而，在时间表上这些动物被给药以0.6mL的PBS以匹配测试制品给药的时间表。组2-5的动物接受0，3，10或31mg/mL rhASA(总剂量为0，1.8，6.0，或18.6mg)的0.6mL IT注射的，每隔一周(即总共12个剂量)。6个月(最后IT剂量后24小时)时尸检动物，而其余4只动物/性别/组在4周恢复期结束时尸检。收集选定的组织，保存并显微镜检查。下表中反映的研究的设计，因为其涉及本研究的病理方面。
在处死的时候，大脑削减成约3mm冠状切片厚度的大脑基质。第一片和此后每一秒片被固定在福尔马林中用于组织病理学评估及免疫组化分析。大脑被处理为全冠部分。这些部分包括至少以下的大脑区域。
·新皮层(包括额叶，顶叶，颞叶和枕叶皮质)：脑切片1至8(及切片9，如果存在的话)。
·原脑皮(质)(嗅球和/或梨状叶)：脑切片1至3。
·基底神经节(包括尾状核和壳核)：脑切片3和4。
·(大脑)边缘系统(包括海马和扣带回)：脑切片4和5。
·丘脑/下丘脑和中脑区域，包括黑质脑切片4和5。
·小脑，脑桥和延髓：脑切片6至8条(及切片9，如果存在的话)。
脑切片列于数据表中，作为1至8/9(一些动物，通过测试设施所提供切片9的)。动物之间切片略有不同。上述提供的脑切片(1至8/9)大概位于各种解剖区域。列于的数据表的脑切片作为单独切片，与该切片相关的诊断以方便潜在的，未来的其他切片审查(如果有的话)。在数据的解释中，对单独的脑解剖部位(如上所列)进行了比较，以确定任何独特的测试制品的影响(即独特的特定的大脑区域)。在TPS，来自所有动物的脑切片被包埋在石蜡中，切片为5微米，用苏木精和伊红(H&E)染色，并进行显微镜检查。此外，用Fluoro-Jade B(染色增加大脑的神经元变性评估的敏感性)和Bielschowsky银染色(允许直接可视化轴突，树突和神经丝的过程)对对照和高剂量组的动物脑进行染色并检验。
将脊髓(颈，胸和腰)切成1厘米切片。第一切片和其后的其他切片固定在福尔马林中，用于组织病理学观察及免疫组化分析。来自所有动物的脊髓切片(颈，胸(包括导管尖端)和腰椎)切片成约5微米，用H&E染色，并在每个水平检查横向和倾斜部分。另外，用Bielschowsky银染和抗-GFAP(免疫组化染色，允许直接可视化星形胶质细胞及其过程)对照和高剂量组的系列脊髓切片染色。
脊神经根和神经节(在中颈，中胸，中腰椎)包埋在石蜡中，用H&E染色连续切片，此外，用Bielschowsky银染染色来自对照和高剂量组的连续切片。
对于来自所有的动物坐骨神经，胫骨和腓肠神经节：每个神经的纵向切片在石蜡中包埋，切片约5微米，并用H&E染色。每个神经的横截面后固定在锇中，嵌入到Spurr树脂中，约1至2微米的切片，并用甲苯胺蓝染色。锇后固定及树脂包埋提供了髓鞘在周围神经中优越的保存，从而更细致地检查神经。
收集的所有组织和从所有的动物尸检中收获肉眼病变也用石蜡包埋，用H&E染色，并进行显微镜检查。通过TPS进行病理组织学处理和评估及免疫组化分析。
方法：芳基磺胺酶A(rhASA)染色
由研究赞助者提供的阳性对照切片。切片为注射rhASA的小鼠的肝切片。在肝脏的Kupffer细胞(正弦巨噬细胞)中，阳性对照切片都表现出充分的rhASA样本证据。阳性对照切片与本研究的其他切片存储。所有rhASA染色切片的评估最初进行盲法治疗动物组。其通过病理学家最初读取的rhASA染色切片与标签上的遮蔽(由具有实际动物评估知识的助手)动物数量来得到，在评估过程中口述的得分(严重程度等级)，相同的助手立即记录的染色得分(严重程度等级)到数据表中。然后通过研究神经病理学家和助手验证动物ID，以保证准确的数据输入。进行此程序，因此不会把任何偏差引入到判定染色(为检测细胞内rhASA的免疫组织化学染色)的整体强度。对所有的脑和脊髓节切片的神经元，脑膜巨噬细胞，血管周围巨噬细胞和神经胶质细胞(星形胶质细胞和小神经胶质细胞，但可能主要为小胶质细胞)的染色的相对程度进行分级。合计(通过组)各组每个大脑和脊髓水平的平均严重度评分并作为整体记录，在所述组织下(标题：大脑，一般，rhASA染色和脊髓，一般，rhASA染色)。
在一般情况下，在大脑神经元的rhASA染色为在大脑中大脑皮层和其他核区域的神经元的度量。脑膜中巨噬细胞的rhASA染色为脑膜巨噬细胞和/或脑膜巨噬细胞中内源性rhASA摄取测试制品的证据。rhASA染色血管周围的巨噬细胞为巨噬细胞中的脑/脊髓(或内源性rhASA的)摄取rhASA的测量，尽管应该指出：在脑和脊髓(Virchow-Robins空间)中的血管周围空间为连续的脑膜。在一般情况下，神经胶质细胞中rhASA染色的分级为主要测量摄取测试制品/渗透测试制品进入灰和/或白质，尤其是在大脑皮质(电晕辐射为大脑皮层下方的白质)。白质中的rhASA染色出现在星形胶质细胞和小胶质细胞。
下列分级方案用于在各种细胞类型(神经元，神经胶质细胞，巨噬细胞)中，rhASA染色程度的得分。
等级说明(可能细胞染色的％)
1小于10％
2大于10to25％
3大于25to50％
4大于50to75％
5大于75％
注意：此方案为不严格的定量。其被用于作为高效，半定量的方法来评估用rhASA染色脑和脊髓的程度。据神经病理学家研究指出：并非所有的神经元区域具有相等的rhASA染色。也有人指出：在一些对照动物中和脉络丛和背根神经节神经元的细胞的内源性神经元染色，往往rhASA染色强烈，即使在对照动物中。脉络丛和背根神经节染色是不分级的，但通过神经病理学家研究指出，即使在控制动物中较为突出。
注意：所有剂量组：低剂量＝1.8mg/剂量；中剂量＝6.0mg/剂量，高剂量＝18.6mg/剂量。在非神经系统组织中没有测试制品相关病变，除了各剂量组(男，女，见下文)的肝脏中的增加rhASA染色。
末期牺牲动物(每周给药为期6个月)：rhASA染色切片
在随后的组织/细胞类型中具有增加的rhASA染色。当考虑在特定的剂量组的特定细胞类型中，测试制品影响rhASA染色的程度，在并发的媒介物对照和设备对照(牺牲的恢复期牺牲动物)中的染色水平被认为是用于比较。
脑，脑膜，巨噬细胞(所有剂量组，雄性和雌性)
·脑、血管周围，巨噬细胞(所有剂量组、雄性和雌性)
·脑、胶质细胞(所有剂量组、雄性和雌性)
·脊髓、脑膜、巨噬细胞((所有剂量组、雄性和雌性)
·脊髓、血管周围，巨噬细胞(所有剂量组、雄性和雌性)
·脊髓、胶质细胞(中和高剂量组雄性和雌性)
·肝、Kupffer细胞(所有剂量组、雄性和雌性)
由于内源性染色，大脑和脊髓中的神经元的ARSA的染色水平的是最困难来具体的定义的。rhASA染色表现出在脑膜和脑/脊髓血管周的巨噬细胞已经神经胶质细胞内不断增加的rhASA水平。在对照和测试制品处理的动物之间的神经元中，没有可检测的rhASA染色差异。
恢复期牺牲的动物(每隔一周给药为期6个月，随后进行为期一个月时间不给药)
在一般情况下，这些动物中测试制品相关的变化完全溶解或显著减少，允许尸检之前1个月内没有给药。下面的微观变化存在于发病率和/或严重程度，其表明与测试制品可能的关系。
测试制品相关的微观变化(恢复期动物)
·脑，脑膜，浸润(中和高剂量组，两性)(图111和图112)
·脑，脑膜，浸润，％嗜酸粒细胞(中剂量雄性；高剂量雌性)
·脑，血管周围，浸润(中剂量雄性；高剂量雌性)(图113)
·脑，血管周围，浸润，％嗜酸粒细胞(中剂量雄性；高剂量雌性)
·脑，灰质，浸润(所有剂量组，两性)
·脑，灰质浸润，％嗜酸粒细胞(低剂量雄性)
·脑，灰质，嗜酸粒细胞，坏疽(低剂量雄性)
·脊髓，脑膜，浸润(中和高剂量雄性；低和高剂量雌性)
·脊髓，脑膜，浸润，％嗜酸粒细胞(中剂量雄性；低剂量雌性)
·脊髓，灰质，浸润(低剂量雌性)
·脊髓，灰质，浸润，％嗜酸粒细胞(低剂量雌性)
·背根节和根，神经外膜，浸润(中剂量雌性)
·脊髓神经根和神经节，浸润，嗜酸性粒细胞(中和高剂量雄性；所有剂量，雌性)
·三叉神经节，浸润，嗜酸性粒细胞(中等剂量的雄性和雌性)
所有这些变化被解释指出在末期牺牲的动物中增加的炎症变化为代表的残余。至于在末期牺牲的动物中，没有证据表明增加的炎症性细胞浸润仍然存在于一些恢复期动物中，代表造成任何不利的影响的形态学改变。在非神经系统组织中没有测试制品相关的病变。
恢复期牺牲的动物(每隔一周给药为期6个月，随后是为期一个月时间的不给药)：ARSA染色。
与设备和/或媒介物对照相比，没有任何迹象表明恢复期雄性或雌性rhASA染色增加。在低，中，高剂量恢复期的雄性大脑中，与设备和/或媒介物对照相比，在某些类型的细胞(这各不相同，治疗组)中实际上rhASA染色有下降迹象。此原因，包括其为实际的效果并不明显。可能的解释是，施用外源性rhASA可能会导致一些内源性rhASA生产的减少。类似的发现不存在于雄性脊髓中。在恢复期雄性和雌性中，在肝脏中染色，类似于对照中指出的。
在一般情况下，测试制品相关的变化可以分为两大类，并在所有剂量水平(1.8，6.0和18.6mg/剂)存在。
在脑膜、脑实质、脊髓实质、三叉神经节，和偶尔的脊神经根/节(或围绕这些结构的外膜)增加浸润(白血细胞，通常有显着的嗜酸性粒细胞成分)。此增加被解释为是由于在鞘内空间和在神经系统组织中存在测试制品(一种蛋白质)。
在偶尔动物(任何高剂量的动物中没有观察到microgliosis)的脊髓和大脑的小胶质细胞中，轻微，病灶增加。两种类别的形态学变化被解释为是的响应测试制品的存在。没有证据表明任何动物的神经元坏死。评估rhASA染色切片，待作为本中期报告的书写。在脑，脊髓，脊神经根或神经节中，无任何生物的不良反应与测试制品相关的变化有关。具体来说，没有证据证明神经元坏死或生物重要的胶质响应。没有测试制品相关的在非神经系统组织病变。经过为期一个月的恢复时期(给药期)，测试制品相关的变化已完全解决，或仅限于炎症反应存在相关的之前增加的残余测试制品。恢复动物形态无不良影响。
基于双盲镜检分配半定量的染色评分，在所有测试制品治疗组中，各种细胞类型的脑和脊髓中，免疫组织化学染色用于芳基硫酸酯酶(rhASA；所述测试制品)增加，除了神经元。在肝脏的Kupffer细胞中，此增长也很明显。经过1个月的恢复期，测试制品治疗的动物(所有剂量组)的rhASA染色已回归到对照(设备和/或媒介物对照)的水平。在低剂量恢复的雄性中，有多个星形胶质细胞和神经元的损失的病灶，表示大脑皮质中之前缺血的多个领域。虽然在这种动物中的这些病变的确切发病机制并不明显，任何其他测试制品治疗的动物缺乏类似的病变，包括高剂量的动物接受10X的剂量，这些病变与测试制品是不相关的。在最初发布这一初步报告的时间，并根据这项研究中严格的肉眼和显微镜的结果(石蜡包埋，苏木精和曙红染色切片)，没有观察到不良的效应水平(NOAEL)为18.6mg。
实施例16-药代动力学数据
6个月动物数据
本实施例提供了血清和rhASA的CSF浓度以及来自NorthernBiomedical Research，Inc.的抗rhASA血清抗体的解释性分析。
本实施例的目的是评估在青少年(年龄＜12个月)食蟹猴中，从毒理学和安全药理学的角度来评估重复剂量鞘内(IT)施用rhASA。在6个月内，共12剂。最后1次给药后24小时或1个月解剖动物。该研究的设计示于表29。
表29：047-021的研究设计(rhASA1-09-015)
DC＝设备对照；组1中的动物不给药以媒介物或测试制品。
a媒介物对照动物编号044在第50天处死，由于导管泄漏
测定方法-抗体测定
使用经过验证的方法，对食蟹猴CSF和血清中的抗-rhASA抗体进行定量。简言之，通过阻断MSD的链霉抗生物素蛋白涂板开始测定，然后与生物素标记的rhASA孵育。经过洗涤步骤后，向板中加入稀释的样本，校准器，和QC。经过额外的洗涤步骤后，添加SULFO TAG-标记的药物并孵育。进行最后的清洗步骤并加入MSD读出缓冲器。立即读板。使用SoftMax Pro模板分析相对发光单位(RLU)中的信号数据。
血清和CSF浓度
使用经过验证的方法，对食蟹猴CSF和血清中的rhASA进行定量。该方法是基于酶联免疫吸附试验(ELISA)技术。简要地说，微量滴定板涂覆以兔多克隆抗体(SH040)引起的抗抗重组人类芳基硫酸酯酶A(rhASA)。参考标准和试验样品，用rhASA孵育后，通过辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的抗-ASA单克隆抗体(克隆19-16-3)可检测到束缚rhASA蛋白。然后将所述板与HRP，TMB过氧化物酶的底物孵育。通过加入2N硫酸(H2SO4)停止此酶-底物反应，而且用参考波长655nm的吸光度波长450nm来测量各孔的吸光度。在相同的板中使用rhASA校准曲线，计算样品中的rhASA浓度。
rhASA的血清浓度总结见表30。
rhASA的CSF浓度总结见表31。
抗-rhASA血清抗体浓度总结见表32。
抗-rhASA CSF抗体浓度总结见表33。
组别及性别抗体的发病率见表36。
表30：食蟹猴中rhASA的血清浓度总结
表30(补充)：食蟹猴中rhASA的血清浓度总结
表30(补充)：食蟹猴中rhASA的血清浓度总结
表31：食蟹猴中CSF浓度总结
表31(补充)：食蟹猴中CSF浓度总结
表31(补充)：食蟹猴中CSF浓度总结
表32：血清中抗-rhASA抗体浓度总结
表32(补充)：血清中抗-rhASA抗体浓度总结
表33：CSF中抗-rhASA抗体浓度总结
表33(补充)：CSF中抗-rhASA抗体浓度总结
表34：血清和CSF中rhASA浓度，雄性和雌性联合的(ng/mL)
表34(补充)：血清和CSF的rhASA浓度，雄性和雌性联合的(ng/mL)
表34(补充)：血清和CSF的rhASA浓度，雄性和雌性联合的(ng/mL)
表35：血清和CSF抗-rhASA抗体，雄性和雌性联合的(ng/mL)
                                                                          
表35(补充)：血清和CSF抗-rhASA抗体，雄性和雌性联合的(ng/mL)
                                                                           
表35(补充)：血清和CSF抗-rhASA抗体，雄性和雌性联合的(ng/mL)
表36：抗-rhASA抗体在尸检时的发生率
食蟹猴血清rhASA的定量限为39.1ng/mL，而且来自组1和组2的所有血清样本均低于定量限(BQL)，见表30。在给药2，4，6，8，10，12(6个月尸检)之前和24小时之后，测试rhASA的血清水平，中途经过复苏期，并在恢复期尸检之前。组3(1.8mg/剂)，组4(6.0mg/剂)，和组5(18.6mg/剂)中，在给药2，4，6，8，10和12之前检测不到rhASA水平。给药12后，中途通过恢复期间，而且在恢复期尸检之前。给药2之后，血清中的rhASA水平与剂量有关。给药4(组3)，6(组3和组4)，和给药8和10(组3和组4和组5雄性)后，检测不到rhASA水平。组4(6.0mg/剂)给药4和组5(18.6mg/剂)雄性给药4和6后以及雌性给药4，6，8，和10之后，血清rhASA下降。血清中rhASA水平的明显下降可能与抗-rhASA抗体浓度的增加有关。目前在本研究中，给定的样本变异性和小组数量中，血清rhASA水平还没有明显的性别差异。
食蟹猴CSF的rhASA的定量限为19.5ng/mL，来自组1和组2的所有CSF样本为BQL，见表31。所有给药组中，在所有给药组中给药2，4，6，8，10，和12(6个月尸检)之前和之后，可检测到CSF中rhASA。水平高于给药后(约给药后24小时)并与剂量相关。CSF中的水平比血清中的更大。在本研究中，当给定样本的变异性和小组数量时，CSF的rhASA水平目前还没有明显的性别差异。在所有剂量组的恢复时期和恢复期尸检之前，中途的rhASA是不可检测的。rhASA治疗组在剂量12(尸检)收集的CSF水平低于给药后8和11的水平。尸检时，低rhASA水平的潜在原因包括在尸检时采取的较大体积(～2.25mL总细胞数，化学，rhASA和抗-RHASA抗体)vs.在生活给药间隔(高达0.5mL前或预给药的rhASA浓度)采取的体积。此外，尸检时，某些动物没有通畅的导管，因此通过CM抽头而不是经导管来采取样品。与通过导管取样相比，这条路线一直得到较低的rhASA浓度。这可能是由于CSF集流有限的rostrocaudal方向，被公认的发生在垂直方向的动物，例如猴子和人(例如，其为众所周知，CSF成分在整个个体一生中表现出明显的rostrocaudal梯度)。
在一些时间点，每个用RHASA治疗的动物血清中，抗-rhASA是可检测的，见表32。如果抗-rhASA抗体水平在定量限(78.1ng/mL)以上，则动物被定义对抗-rhASA抗体为阳性。一旦其血清阳转，动物对抗-rhASA抗体保持阳性。在预给药2时间点，无任何动物对抗-rhASA抗体呈阳性。在预给药4的时间点，除了雄性026号(第4组，6.0mg/剂)，所有rhASA动物对血清抗-rhASA抗体为阳性。在预给药6时间点，雄性026号对血清抗体为阳性。在第5组(18.6mg/kg)，尸检抗体样本具有较低的抗体水平。此明显的减少可能是由于存在rhASA干扰检测。中，高-剂量组(6.0和18.6mg/剂)的滴度普遍高于低剂量组的动物(1.8mg/剂)。用重组人蛋白质治疗食蟹猴，存在抗-rhASA抗体是的预期结果。由于变异的结果，并没有明显的性别差异。
所有在CSF中具有可检测抗-rhASA抗体的动物，在血清也有可检测的rhASA抗体，除雌性049(组3，1.8mg/剂量)和057(组4，6.0mg/剂量)号。抗体浓度和发病率的变异性排除剂量响应的测定。如果抗rhASA抗体水平在定量限(78.1ng/mL)以上，则动物被定义为对抗-RHASA抗体为阳性。
雄性和持续血清和CSF RHASA水平以及抗-RHASA抗体的组合值示于表34和表35。上述讨论，雄性和持续的合并结果与个体性别是相似的。
实施例17-功效
在这个例子中，11只野生型对照(mASA+/+hASA-/-)小鼠被分配到A组而且未接受治疗。34只(34)hASAC69S/ASA-/-小鼠分配给每个5剂量组并在1，9，15/16，和22天，接受剂量为20mg/kg(静脉注射[IV]；组C)或0.04，0.12，和0.21mg(组D，E，和F，分别)的媒介物(B组)或rhASA。所有IV剂量经尾静脉施用。在近似范围2μL/20秒(表37)12μL内的体积，作为输液对所有鞘内(IT)的剂量施用。
表37：研究设计
NA＝不适用；IT＝鞘内；IV＝静脉。
a小鼠的脑重量大约为0.0004kg。
b第15天给药组C、D，和E；第15天给药组B和E。
ASA基因敲除小鼠hASAC69S/ASA(-/-)为MLD公认的模型，并用于测试对此疾病潜在的治疗。鞘内途径为人类预期的施用途径。此化合物以及在MLD小鼠中类似化合物的静脉施用途径已经过测试。已加入静脉注射对照组作为预期的外周器官组织学改变的阳性对照。动物接受100，300，或520mg/kg脑重量(0.04，0.12，0.21毫克，分别)的rhASA。选自本研究的剂量水平归一化到脑重量对应于计划用于人体中或已经用于毒理学研究或在以前疗效模型溶酶体贮积症的剂量。这些剂量预期不会有任何毒性。
收条
物种      小鼠(小家鼠)
株        hASAC69S/ASA-/-)小鼠和野生型对照
年龄      抵达时大约14-17个月
组数量    6
动物数量  34ASA敲除小鼠+11野生型对照
抵达后，检查每只动物以评估健康状态。
圈养
在高温聚碳酸酯过滤器顶部的笼子里圈养动物组，具有CareFresh垫纸和水瓶。每个笼子里清楚地标有笼子卡显示项目，组和动物数目，和性别。耳朵打孔系统唯一标识每只动物。
动物房环境和光照的定向条件如下：
温度    22℃±3℃
湿度    50％±20％
光循环  12小时光照和12小时暗
所有可用的野生动物(11)被分配到组A，编号为35至45。ASA(-/-)hASA(+/-)动物被分配为连续的数字(1至34)，作为他们从笼中取出，称重，并在驯化中对耳朵钻孔。然后，2011年1月3日，使用研究随机数发生器(www.randomizer.org)将动物分配到治疗组。前9个数被分配到B组，接下来的5个分配到C组，接下来的5个分配到D组，接下来的5个分配到E组，最后的10个分配到F组。动物被分配如下：
表38：动物分配
组 N 动物编号
A 11 35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45
B 9 7，13，17，22，23，24，28，29，30
C 5 6，16，19a，21，32
D 5 5，9，14，18，27
E 5 1，2，4，8，11
F 10 3b，10，12，15，20，25，26，31，33，34
a动物编号19在给药时间不能定位。
b动物编号3在给药之前死去。
测试制品和媒介物
测试制品
特性    rhASA
描述        人类重组芳基磺胺酶A(ARSA)
储藏条件    约4℃
媒介物
特性        rhASA媒介物(154mM NaCl，0.005％聚山梨酯20，pH～6.0)
储藏条件    约4℃
制备媒介物
使用提供的媒介物。在工作台(环境)上加热媒介物。一旦媒介物加热，通过轻轻涡旋和反转混合该物质。不振荡或摇动瓶。进入材料之前干燥瓶。任何剩余的媒介物放回到冰箱(1℃-8℃)。
剂量制剂制备
用媒介物稀释rhASA以达到所需的浓度。在工作台(环境)上加热测试制品。一旦所述测试制品加热，通过轻轻涡旋和反转混合该物质。不振荡或摇动瓶。
染料跟踪注射：
红外染料(如LI-COR Biosciences，Lincoln，NE)用于跟踪注射。像这样的染料已被用于鞘内注射作为鞘内施用后的存活程序。施用前，染料与测试制品混合；1μL的1nmole染料被添加到测试制品中。除了红外染料，1μL的FD&C蓝色#1(0.25％)用于跟踪注射。此蓝色染料为常见的食品添加剂，并且通常被认为是安全和无毒的。
腰骶部IT注射rhASA或媒介物
在第1、9、15或16、和22天，组B，D，E，和F的动物接受鞘内注射。
通过腹膜内注射，使用1.25％2，2，2三溴乙醇(Avertin)(200-300μL/10克体重(250-350mg/kg))，麻醉成年小鼠。除去尾基和肩胛之间的背毛，用povidine/聚乙烯吡咯酮碘擦洗剃除区域，随后用用异丙醇擦洗。在腰骶部和背中线的交叉点以及确定的回肠(奇异回肠)翼部的颅方面制作小正中皮肤切口(1-2cm)。在髂窝内的肌肉(臀中肌)为心形的肌肉，而且“心”顶部两侧接近回肠翼部的位置。32号计量注射针连接到气密10-20μL玻璃Hamilton注射器并插入，直到从底层的骨感觉到阻力。在近似速率为2μL/20秒(10μL/2分钟)下进行注射10μL的测试制品，1μL的红外染料，1μL的FD&C蓝色#1(总注射量12μL)。使用适当的创伤夹关闭皮肤切口。通过成像测定红外染料是否已分布于整个CNS，以及可见的蓝色染料，来判断注射的成功。成像后，动物允许在恢复室恢复。
静脉注射rhASA
在1，9，15，和22天，组C的动物接受静脉注射。
对于静脉注射，如果需要的话用异氟醚将动物麻醉，并置于限制器内。用手指轻轻弹的尾部加热以扩张尾静脉。然后用70％乙醇擦拭注射部位。可替换地，将动物放置在暖腔室(40℃)内进行1-1.5分钟。28-30号针用于注射试验材料。注射量为5-10mL/kg。
第4剂量约24小时之后，处死组B-F动物。进行动物不同组织的收集程序，详细说明如下。组A动物未接受治疗；然而，于2011年1月27日或28日，进行动物的安乐死和组织收集程序，详细说明如下。
血清(所有动物)
在异氟醚麻醉下，通过眶后穿刺，收集所有动物(组AF)的A端血液样品(约0.5mL)。玻璃管放置在眼眶上，轻轻地穿透眼睛后面的区域，这样就打乱了位于眼睛后方的静脉引流。通过毛细作用和/或重力流采集血液。采血后，在眼眶施加压力，达到止血。
全血样品进行处理血清并在＜-80℃下冷冻，这些血清保存在-80℃下，并分析抗体。
组织进行光镜检查(组A-F；每组5只小鼠)
采血后，通过CO2窒息处死动物。灌注之前收集尾巴剪切，并冻结用于可能的基因分型。心包腔暴露出来。每组3(3)只小鼠穿心地灌注以肝素化生理盐水溶液(1U/mL的肝素钠在0.9％的NaCl中，无菌过滤)冷藏冰冻冷却，然后在约4℃下以4％多聚甲醛。除去脑，而且剪切腹部以进一步暴露出内部器官。大脑和胎体被放置在多聚甲醛中，除了被冻结的尾部剪切。
组织用于脂质分析(组A、B，和F；6、4，和5动物，分别地)
采血后，通过CO2窒息处死动物。灌注之前收集尾巴剪切，并冻结用于可能的基因分型。心包腔暴露出来。对于血脂分析，每组4-6只小鼠穿心地灌注以肝素生理盐水溶液(1U/mL的肝素钠在0.9％NaCl中，无菌过滤)冷藏冰冻冷却。
表39：收集组织用于脂质分析
经过收集，称重组织然后在干冰上或通过在-80℃冰箱中冷冻。脑部被分为左，右半球。右半球将通过MS用于脂质分析。分析左半球用于可能的N-乙酰基-L-天门冬氨酸(NAA)分析。组织保存在-80℃直至分析。
表40：组织储藏条件
样本类型 储藏温度
血清 大约-80℃冷冻
组织用于血渍分析 大约-80℃冷冻
尾部剪切 大约-80℃冷冻
组织用于光学显微检测 约4℃
rhASA减少硫脑苷酯在MLD小鼠脊髓的存储，特别是在白质中，图114。脊髓的形态分析表明，rhASA给药后alcian蓝染色的光密度的统计学显著减少，图115。rhASA治疗的MLD小鼠在大脑中也表现出溶酶体活性的减少，如图116。与媒介物治疗的动物相比，在高剂量组(0.21mg-520mg/kg脑重量)中，此减少有显著的统计学意义，图117。
1岁年龄以上的免疫耐受MLD小鼠(hASAC69S/ASA-/-))，每周一次鞘内腰椎施用rhASA，连续4周(共4个剂量)。剂量为媒介物(154mM氯化钠，0.005％聚山梨酯20，pH值～6.0)，0.04，0.12，0.21mg/剂(归一化的剂量分别为100，300和520mg/kg的脑重量)。采用免疫组化评估在大脑和脊髓中的硫脑苷酯清除和溶酶体活性来评估终端时间点的疗效。使用alcian蓝染色组织中的目标硫脑苷酯来进行脊髓和脑组织切片染色。也染色脑切片表示溶酶体相关膜蛋白(LAMP)的存在，为溶酶体过程指示器。此外，alcian和LAMP(颈椎，胸椎和腰椎)染色脊髓和大脑切片以进行形态分析。
这些初步的研究结果表明鞘内腰椎rhASA施用的疗效。与媒介物对照组相比，rhASA治疗的MLD小鼠的疾病组织学标志物表现出改善的证据，如降低硫苷存储(由alcian染色指出的)和在大脑中的溶酶体活性。在前端脊髓，以及在大脑的前端部的施用部位附近(脊髓的腰椎区域)，观察到这些病理组织学变化。
实施例18-生物分布2
综述
在这项研究中，36只雄性和36只雌性青少年食蟹猴(＜12个月在起始)被分配到每个5剂量组中，并接受剂量为0(设备对照；动物给药以0.6mL PBS)、0(媒介物对照)、1.8、6.0，或18.6mg(分别为组1，2，3，4和5)的rhASA，每隔一周，进行6个月，总共12剂量。所有剂量为给药体积为0.6mL的输液，然后由0.5mL PBS冲洗，经过大约10分钟(表41)。
表41：研究设计
DC＝设备对照；组1中的动物不给药以媒介物或测试制品.
a由于漏水导管，媒介物对照动物编号044在50天牺牲
材料和方法
组织收集
脑被切成3mm厚的冠状切片厚度的大脑基质。每个脑分为完整的冠状切片，包括：新皮层(包括额叶、顶叶、颞叶和枕叶皮质)，旧皮质(嗅球和/或梨状叶)，基底节区(包括尾状核和壳核)，边缘系统(包括海马和扣带脑回)，丘脑/下丘脑，中脑区(包括黑质)，小脑，桥脑，和延髓。从单个组织样本获得(通过4毫米活检钻孔)的位置见图133-138所示。图133-138中的图像来自Wisconsin大学和威斯康星州和Michigan State比较哺乳动物脑收集(也是国家卫生与医学博物馆)。没有收集打孔22号，在尸检中这种结构是不存在的。所有脑样本冷冻并贮存于-60℃或更低，在使用酶联免疫吸附试验分析rhASA的温度之前。
第一脑切片其后的每一第二切片被固定在福尔马林中，用于组织病理学评估及免疫组化。第二脑切片其后的每一第二切片被冷冻用于测试制品浓度分析。冷冻前，脑样本取自偶数右侧部分，测试制品分析脑切片用于生物分布分析。尸检时拍摄脑样本的位置并记录脑切片号。使用4毫米的圆钻孔或用解剖刀切割获得所述样本，以优化收集的白质数量。所有的钻孔被冷冻和储存在-60C或以下，用于测试制品分析。剩余部分的脑切片被冻结，保存在-60C或以下，用于可能的测试制品分析。
所述脊髓(颈、胸、腰椎)被切成1厘米长的段。第一切片和此后每一第二切片被固定在福尔马林中，用于病理组织学和免疫组化分析。脊髓的第二切片和此后的每一第二切片被冷冻，并储存在-60℃或更低温度下用于测试制品分析。调节切片的分布，使所述切片的前端的鞘内导管(切片0)固定在福尔马林中，并用于组织病理学分析。
脑，肝，脊髓提取物的制备和rhASA浓度的测定
使用经过验证的方法，符合美国食品和药物管理(FDA)良好实验室规范(GLP)法规21CFR，第58部分并适用于中西部生物学研究的标准作业程序，对大脑钻孔、脊髓，和肝脏样本进行了分析。在裂解缓冲液中匀浆组织样本，离心除去任何组织碎片，并储存于-80℃，直至测定。使用多克隆兔抗体SH040作为捕获抗体和HRP(辣根过氧化物酶)标记的抗-ASA单克隆抗体19-16-3作为检测抗体，通过ELISA测定组织匀浆中可溶性组分的rhASA浓度。经过洗涤步骤除去未结合的材料，在HRP偶联抗体的存在下，四甲基联苯胺(TMB)底物溶液与过氧化物反应中以产生色度信号，其在最初步骤中的抗ASA抗体约束的rhASA的量是成比例的。由此产生的在每个组织匀浆中的rhASA量为来自标准曲线的插值。
也由二辛可宁酸(BCA)蛋白质测定实验分析样本，以获得样本中蛋白质的浓度。通过插入白蛋白的标准曲线，对每个样本的蛋白质浓度进行测定。然后归一化rhASA浓度的结果到组织提取物中的总蛋白，如由二辛可宁酸检测法测定的。
媒介物(1.8mg/剂，6.0mg/剂，和18.6mg/剂组)的所有钻孔的rhASA水平，分别见图118、图119，图120和图121所示。恢复期动物设备对照，媒介物(1.8mg/剂，6.0mg/剂，和18.6mg/剂组)的所有钻孔的rhASA水平，分别见图122，图123，图124，图125所示，并图126所示。
脑表面附近(脑膜)采取的，选择的钻孔的rhASA水平，如图127所示。选择的钻孔的rhASA水平被认为是包含多个深部脑白质物质，如图128所示。白质由髓神经细胞的突起(或轴突)束组成。选择的束主要包含深部脑灰质，如图129所示。与白质相比，灰质包含神经细胞体。每个记录组从表面上，深白质和深灰质选定的rhASA值，如图130所示。
脊髓浓度数据见图131所示。
肝浓度数据见图132所示。
设备和媒介物给药的对照组中，肝脏、脊髓和大脑的rhASA浓度在某些情况下是可测量的。在肝脏和脊髓水平分别为比任何rhASA治疗的组低。在设备对照和媒介物给药的动物中，测量的rhASA水平代表ELISA中使用的天然食蟹猴蛋白与抗-rhASA抗体的交叉性反应。在设备对照和媒介物组织的报告值并不代表组织中用于食蟹猴rhASA的量化值，因为抗体和食蟹猴ASA之间的交叉反应性的程度是不知道的，而事实上，该检测标准使用rhASA。然而，设备对照和媒介物给药的组织之间检测的rhASA水平的变化可以解释为表明在食蟹在不同组织和解剖区中的域rhASA相对量的变化。
分别对1.8，6.0，和18.6mg/剂组，雄性脊髓片中的rhASA水平范围为160-2352，1081-6607，1893-9252ng/mg蛋白，而在雌性中为0-3151，669-6637，和1404-16424ng/mg蛋白(图127)。脊椎中腰椎区域的rhASA水平比宫颈区域较高。在rhASA治疗的组中，肝脏中检测到的rhASA蛋白质水平为剂量反应型，而且在媒介物组中是非常低的。在1.8，6.0和18.6mg/剂组，雄性和雌性的平均rhASA水平分别为88，674，2424和140，462，和1996ng/mg蛋白质(图128)。
总体而言，在rhASA给药组的脊髓切片和肝制备样品中的rhASA水平表出现剂量相关性。许多测试的脑区域，rhASA水平和rhASA施用之间表现出明显的剂量关系，而其它更模棱两可。在一般情况下，在脑中的rhASA水平随rhASA剂量增加。
实施例19：IT VS.IV施用rhASA的药代动力学(PK)和生物分布
本研究的目的是评估鞘内(IT)和静脉(IV)施用于食蟹猴后，各种治疗替代酶的药代动力学(PK)和生物分布。
在本研究中，阶段1a(I2S施用)和阶段1B(rhASA施用)中，共有12只雄性和12只雌性食蟹猴(具有鞘内腰椎(IT-L)导管)按体重被随机分配分为4治疗组。
两个阶段给药后，在指定的时间间隔收集血液和CSF(从IT-CM导管)。从阶段1a收集最后的样品后，动物被允许阶段1B开始前进行7天的清除期。
从阶段1b选择最后的样本后，在开始阶段2之间，这些动物将被允许为期7天的清除期。来自阶段1b的共有12只雄性和雌性的食蟹猴按体重被随机分配分成I2S(组1a-6a)和rhASA(组1b-6b)的12个治疗组。
随着IT-L施用，血清中的rhASA绝对生物利用度为～30至40％。相比之下，在CSF中，只有0.5％的IV剂量为生物利用。
随着IT-L施用，暴露到血清中的rhASA按大于比例的方式增加。
随着IT-L施用，暴露到CSF中的rhASA小于剂量增加比例的方式。
表42-食蟹猴血清中的rhASAPK参数总结
表43-食蟹猴CSF中的rhASA PK参数总结
表44-血清和CSF中rhASA的生物利用度
在IT-L施用后，血清中的rhASA生物利用度为～30％至40％。相比之下，由IV途径剂量施用后，在CSF中只有0.5％的生物利用度。
表45-CSF：血清分区
实施例20-MLD患者的治疗
通过例如IT递送的直接CNS施用可以用于有效治疗MLD患者。这个实施例解释了多剂量递增研究，其被设计以评估每隔一周(EOW)高达3剂量水平，持续总共40周，通过鞘内药物递送设备(IDDD)施用rhASA至患有婴儿型MLD患者的安全性。适合于人类治疗的多种示例性的鞘内药物递送设备在图94、图95、图96和图97中描述。
将招募多达20例患者：
队列1∶5例患者(最低剂量)
队列2∶5例患者(中剂量)
队列3∶5例患者(最高剂量)
5例患者被随机分配至没有治疗组。
为本研究选取的患者是根据一下标准的内容：(1)在30个月的年龄之前出现第一症状；(2)在筛选的时候是能走动的(定义为独立站立和用一只手举着向前走10步的能力)；(3)在筛选时存在神经学体征。通常地，具有造血干细胞移植历史的患者被排除。
通过IT注射，持续40周，测定在儿童和晚期婴儿MLD中施用rhASA的递增剂量的安全性。此外，评估了rhASA在粗大运动功能方面的临床活性、以及在血清中单一和重复剂量的药代动力学、以及在脑脊髓液(CSF)中的浓度。
IT递送HNS的实施例
实施例21：乙酰肝素N-硫酸酯酶的慢性鞘内施用
这个实施例表明：可以使用鞘内施用以有效地递送溶酶体酶，例如重组人类乙酰肝素N-硫酸酯酶(rhHNS)，至脑组织中，以治疗黏多糖贮积症IIIA(MPS IIIA；Sanfilippo综合症类型A)的神经病学症状(这种疾病定义的临床特征)。在这个实施例描述的实验表明：慢性施用rhHNS与在所述脑、脊髓和肝脏中检测的剂量相关酶活性耐受性良好。
总之，已经开发了重组人类乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)的鞘内制剂，用于治疗黏多糖贮积症IIIA(MPS IIIA；Sanfilippo综合症类型A)的神经病学症状(这种疾病定义的临床特征)。由于MPS IIIA患者的平均年龄是4.5年，HNS的关键毒理学研究在青少年食蟹猴中进行，以评估对发育中的大脑的影响进行评估。猴子被植入鞘内(IT)-腰椎药物递送设备，并每隔一周给药，通过短期注射(1.5、4.5、或者8.3mg/剂HNS，持续6个月；12剂)，以及分别接受磷酸盐-缓冲生理盐水或者媒介物的设备和媒介物对照。每组8只动物(4/性别)在3个月和6个月尸检(设备对照组在3个月尸检)，并且来自媒介物组的8只动物和HNS给药组的3只动物在所述最终IT给药后的1个月尸检。没有观察到HNS相关的临床体征或者严重的中枢神经系统损害。与对照相比，在所述脑/脊髓周围的脑膜/神经束膜中具有轻微至最小平均严重程度的细胞浸润，其与在脑脊髓液(CSF)白血球的增加相关，主要是嗜酸性细胞(其大程度地消退，在最终给药1个月后)。这些变化不与在脑或者脊髓中的任何不良形态学变化相关。似乎有剂量相关的趋势，所述趋势倾向于更高的平均CSF中HNS水平和组织HNS活性水平(在脑、脊髓、以及肝脏中)。未观察到不良效应水平是每隔一周给予8.3mg/剂(所述最高施用剂量)，表明：HNS可以以不同的浓度(包括高于8.3mg/剂的浓度)，被安全地鞘内施用。
Sanfilippo综合症类型A
黏多糖贮积症类型IIIA(MPS IIIA；Sanfilippo综合症类型A)，一种稀有的溶酶体贮积症(其影响世界范围内约每100,000个人中的一个)，其是由于乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)的缺乏或者缺陷所导致(Neufeld EF，etal.The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease(2001)pp.3421-3452)，乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)是一种exosulfatase，其参与粘多糖(GAG)硫酸乙酰肝素的溶酶体分解代谢。.在缺乏这种酶时，GAG硫酸乙酰肝素在神经元和胶质细胞的溶酶体中累积，伴随在脑外累积的减少.。这种疾病定义的临床特征是中枢神经系统(CNS)退化，其导致丧失，或者不能实现主要发育标志事件。所述进行性的认知衰退在痴呆和过早死亡中达到顶点。
rhHNS的IT递送
由于MPS IIIA患者的平均年龄是4.5年，所述HNS的关键毒理学研究在青少年食蟹猴中(所述物种的选择是根据其与人类的遗传学和解剖学相似性)进行，以评估对脑发育的影响。在文献中引用的猴子与人类的等价年龄范围从7.6个月至12.1个月，而对应于30-40个月年龄的儿童。(HoodRD，Developmental and Reproductive Toxicology：A practical approach(2006)p.276)。作为这种努力的一部分呢，6个月的毒理学研究在青少年食蟹猴中进行，以评估HNS的IT腰椎施用。从1个月前的青少年食蟹猴毒性研究中获得的数据，指导了所述剂量水平的选择、以及所述6个月重复给药的青少年猴研究的设计。据我们所知，这是在青少年非人类灵长类中涉及慢性IT施用ERT的第一次研究。
在本研究中，使用56个雄性和56个雌性青少年食蟹猴(约6至9个月的年龄)，并且称重0.82至1.81kg。猴子被每天饲喂15个饼干的PMI-Certified灵长类饲料5048(Richmond，IN)。水通过过滤的自动水系统随意提供，并且在尿液收集期间保留。猴子在达到后被分组容纳(每笼2只)(对于2至4周)在不锈钢笼子中，除了所述3个月龄的猴子，这些被单个地容纳在不锈钢笼子中。在所述研究期间，所有的猴子被容纳在单个不锈钢笼子中，其空间中控制温度和湿度，并具有12小时光照和12小时黑暗的循环。
在研究启动之前，所有的猴子被手术植入SC端口和IT导管。在手术前施用氢化波尼松琥珀酸钠(IV，30mg/kg)和氟胺烟酸葡胺(肌肉内[IM]，2mg/kg)。所述猴子用SC硫酸阿托品(0.04mg/kg)预处理，用IM氯胺酮盐酸使其镇静；8mg/kg)，插管的，并维持约1L/min的氧气和2.0％异氟醚。在所述腰椎(L4、L5、或者L6)的背侧上制作一切口，并且进行偏侧椎板切除术，以在L3、L4、或者L5处插入锥形聚氨酯导管(长度25cm，0.9mm外直径x0.5mm内直径，并具有6个0.33mm直径的测孔)。所述导管通过小的硬脑膜切口插入，并且顺行所述胸腰部连接区域推进约10cm。将钛SC端口与所述IT导管连接，并且在所述SC组织中植入。合适的导管放置通过脊髓造影确认，使用Isovue-300(0.8ml；Bracco Diagnostics，有限公司，普林斯顿，NJ)。在从手术恢复后，使猴子接受酒石酸布托啡诺(IM，0.05mg/kg)和头孢噻夫钠(IM，5.0mg/kg，每天两次，持续两天)。
在这个实施例中，HNS在IT制剂媒介物中提供，包括5mM磷酸钠、145mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯20(pH7.0)。EOW给药的HNS按照短期注射施用的(超过约11分钟)：0.6mL(4分钟)，然后用一阵0.5mL磷酸盐-缓冲的生理盐水(PBS)(7分钟)。在所述媒介物对照组中的猴子仅接受IT制剂；DC猴子接收PBS(pH7.2)IT。
发病率和死亡率
没有HNS相关的死亡或者更早的牺牲。在给药或者在日常观察期间没有HNS相关的临床体征指示。在给药期间或之后观察到的错放、瘙痒、震颤和运动失调，在施用的数分钟至约4小时以内消退，并且这些被认为是体积相关应答，而不是对HNS或者媒介物的反应。在给药期间或者刚给药之后观察到的临床体征，可看到其在对照组中以可比的发生率(DC和/或媒介物-给药组)；没有剂量应答的证据。一般而言，在给药时临床体征的发生率随着后续的给药而减少。没有与HNS-相关：在体重、采食量、物理身体和神经病学研究结果方面的变化，或者在ECG或者眼科学检查中的变化。
临床病理
在血液学、血清、化学、凝结或者尿分析参数中，以任意的时间间隔，没有变化被认为是HNS相关。
CSF细胞计数和化学
对所有组的平均CSF白血球计数具有剂量相关的增加，包括DC和0mg/剂组，在给药后24小时。随着每个剂量的施用，在白血球计数方面通常增加。在给药之前，从约一半的猴子中收集CSF，表明：因为先前的剂量导致的这些效应在两周内减弱。在给药5次后，除了白血球增加之外，相对于先前给药平均值(P≤0.05相对于，所述DC和所述0mg/剂组)观察到更高组的平均CSF总蛋白和白蛋白(对于所述HNS给药的雄性)，在所述4.5和8.3mg/剂组(多达4-至5-倍)中；显著的是：在雌性HNS-给药组中的较少的趋势。
HNS浓度和抗体分析
通常地，在血清中的所述平均HNS水平＜对于所述时间点的所有测试组的检测极限。在来自猴子的CSF中的所述HNS浓度(在所述DC-和媒介物-给药对照组中)通常在定量极限以下(LOQ)。尽管没有进行统计分析，但是似乎具有倾向于更高的平均HNS水平(在所述1.5、4.5和8.3mg/剂组的CSF中)的趋势。所述给药前CSF平均HNS水平显著低于所述给药后CSF水平。对于6个月队列(所有性别)的所述平均HNS浓度，在研究结束时(主要的和恢复的尸检)，在表46中总结。在给定的剂量水平，在CSF中的平均HNS浓度似乎维持在相同的范围(图146A)，尽管所述抗HNS抗体水平(在所述血清和CSF中)在整个研究中继续升高。
表46：在研究结束时(主要的和恢复的尸检)的CSF HNS浓度
CSF，脑脊髓液；HNS，人类乙酰肝素N-硫酸酯酶；n＝在LOQ以上的样
本数目；IT，鞘内；SD，标准差。
a＝在给药后约24小时收集的样本。
NA＝不能获得样本进行分析，或者在所述LOQ以下的样本。
在所述6-月/恢复队列，在设备对照组(仅PBS)中或者那些给药媒介物的组中，没有猴子在任意测试时间点的血清或者CSF中产生抗HNS抗体。在所述1.5、4.5、和8.3mg/剂组中的所有猴子被测试为对抗HNS抗体阴性(＜LOD)，在血清和CSF样本中，从研究前(对于CSF)以及在给药2之前收集。在所述研究结束前，所有猴子被测试对抗HNS抗体阳性(在血清中)。
在所述1.5mg/剂和8.3mg/剂组中的所有猴子，以及在所述4.5mg/剂组中的8只猴子中的6只，测试为对抗HNS抗体阳性(在一个或多个时间点的CSF中)。由于在所述4.5mg组中的两只猴子没有从任意时间点收集的样本(包括尸检)，这些结果似乎表明所有给药HNS的猴子产生抗体应答。
在所有三个剂量水平，在给药2之后检测在血清中的抗HNS抗体浓度，并且在给药4之后水平显著增加。尽管没有进行统计分析，似乎有倾向于更高更高血清抗体浓度的剂量相关趋势；在所述研究结束前，其水平可以与所述3个HNS剂量组相比(图146B)。在所述血清中的抗HNS抗体总是高于在所述CSF中的，在所述研究过程的整个时间中(从9至236-倍血清/CSF抗体浓度)；血清与CSF浓度的最高比率(98和236倍)，在更早的给药过程中(6和10周)中，在8.3mg剂量水平观察到。
在所述血清中的抗HNS抗体浓度在1.5mg、4.5mg、和8.3mg/剂水平，分别增加9-、16-、和16-倍，在给药的早期时间(从第6周至第14周)。在所述相同的时间段，CSF抗体浓度在1.5mg、4.5mg、和8.3mg/剂水平，分别增加30-、41-、和52-倍，(图146B)；在所述给药1月后自由恢复阶段，保持基本水平(表47)。
表47：在研究结束时，CSF抗HNS抗体浓度(主要的和恢复的尸检).
CSF，脑脊髓液；HNS，人类乙酰肝素N-硫酸酯酶；IT，鞘内；n＝在所述定量极限以上的样本数目；SD，标准差。
a在给药后约1周后收集的样本。
在所述CSF中抗HNS抗体出现的比在所述血清中较迟(图146C)。在所述血清或者CSF中的抗体浓度，没有观察到明显的剂量相关性的差异(由于样本容量小，没有进行统计分析)；在雄性和雌性之间，抗体应答没有观察到可观察的差异。
在所述CSF中，存在抗HNS抗体时，在所述CSF中的HNS平均浓度似乎被保持，这意味着：在所述血清和CSF中，抗HNS抗体的存在不改变所述IT给药的HNS的浓度水平。所述6-月重复剂量施用的所述6-月重复/恢复队列分析表明：所述3-月中间时期和6-月队列牺牲猴子的抗HNS抗体浓度是可比的(图146C)。
总体和组织病理学发现
在所有剂量水平(尽管不是在所有的牺牲间隔、性别-特异的，也不是剂量相关的方式)，嗜酸性细胞的浸润(图147A)存在于脑(主要是灰质)、脊髓(灰质和白质)、背部脊髓神经根/神经节和三叉神经神经节(仅仅中剂量雄性)的软组织(图147B-D)。所述浸润被解释为次级的所述脑膜/神经束膜浸润和/或在存在HNS在所述组织以内的(浸润)。尽管有大量的炎症类型变化，所述猴子似乎容忍HNS施用，并且所述浸润没有被认为与不良形态变化相关或者导致其产生(在所述神经系统软组织中)。特别地，没有神经元坏死/退化的证据，并且没有与HNS施用相关的胶质细胞应答。
在所述脑和脊髓的灰质中的Microgliosis，与细胞浸润相关，主要是嗜酸性细胞，在先前进行的1-个月青少年猴子毒性研究中相对地常见；这些变化在所述6-个月研究中(在所述3-个月中间时期牺牲之前)相对地不常见，但是这种应答的残留证据仍然能在所述6-个月队列中看到(图147F)。小胶质细胞反应倾向于相对早的时间，在与一些(通常基于蛋白质)集中施用(或者集中反应)测试制品相同的反应中。所述嗜酸性细胞的浸润没有与嗜酸性细胞(在HNS给药的猴子的CSF中)的增加相关，但是所述细胞不存在充分的数量以引起不良反应。
在所有剂量水平，对多数HNS-给药组，观察到在所述背部脊髓神经根/神经节中观察到嗜酸性细胞的浸润，而不管性别如何。在多种神经系统组织中的浸润被解释为次级的所述脑膜/神经束膜浸润和/或在存在HNS在所述组织以内的(浸润)。在所述恢复的牺牲猴子中，与对照水平相比，HNS相关影响通常缺乏或者减少。一些变化，例如在所述脊髓中的microgliosis，在所述恢复期后完全消退。所述HNS相关变化似乎没有与在脑或脊髓中任何的不良结构形态变化相关。在所述脑、脊髓或者神经节中没有神经元坏死。
HNS酶活性
在所述6-个月/恢复队列中，在媒介物-给药组(0.0-0.154nmol/hr/mg蛋白质)的所述脊髓和脑中的HNS酶活性，与在来自所述3-个月中间时期队列(0.0-0.0.154nmol/hr/mg蛋白质)组织显示的水平相似。在脊椎中的酶活性水平比在脑或肝脏中测量的水平更高(在所述腰椎中约更高一个数量级)，所述4.5mg和8.3mg/剂组具有相似的水平。在所述脊髓切片中的HNS酶活性范围：在雄性中从3.9-18.6、13.1-67.1、和3.6-69.2nmol/hr/mg蛋白质(图148A)；在雌性中1.8-16.2、4.5-61.2、以及21.1-66.0nmol/hr/mg蛋白质(图148B)；分别对应于所述1.5、4.5、和8.3mg/剂组。在脊髓组织中，在1-个月恢复期，酶活性水平回到与媒介物对照值一致的水平。
在所述脑切片中的所述HNS活性范围：在雄性中从0.03-16.0、0.30-55.7、和0.15-21.2nmol/hr/mg蛋白质(图148C)，在雌性中0.04-5.1、0.0-14.4和0.9-33.2nmol/hr/mg蛋白质(图148D)；分别对应于所述1.5、4.5、和8.3mg/剂组。在恢复后的脑组织中，酶活性水平回到与对照值一致的水平。
不同年龄脑的活性倍数-变化与内源性水平(DC组)的比较在图149A中示出。尽管倾向于增加分布的趋势在表面样本中没有指出，可以表明腰椎-IT施用HNS渗透入所述脑的脑室周围区域。
在所述6-个月队列/恢复队列中，在肝脏中的平均活性水平是：在雄性中0.50、2.41和6.65nmol/hr/mg蛋白质；在雌性中1.04、4.15和7.62nmol/hr/mg蛋白质，分别对应于1.5、4.5和8.3mg/剂组(图149B)。在媒介物对照猴子中的水平是：雄性0.089nmol/hr/mg蛋白质，雌性0.083nmol/hr/mg蛋白质。在所述恢复期后，在肝脏中HNS活性水平与基线对照水平(对于所有剂量组)是可比的。
免疫组织化学
通过推注IT注射将HNS递送至所述CNS，在所述3-个月中间时期和6-个月/恢复队列中，导致递送免疫反应性测试制品至所述脊髓和脑的软膜蛛网膜组织。在接受IT HNS的所述猴子中，所述免疫反应性材料是始终存在于脑膜和血管周巨噬细胞中(脑/脊髓)，并且可变地存在于邻近的神经胶质和神经元细胞群体中。在媒介物-给药对照猴子中缺乏染色(图150A)，表明了：针对人类HNS抗体的特异性。通常的，所述免疫反应性是剂量相关的(即，使用半定量分级标准，增加的免疫组织化学染色以通常的剂量依赖性方式指出)。通过IT推注递送HNS至所述CNS，导致在大脑皮层和小脑中的阳性免疫染色(图150B-D)；尽管如此，在所述尾状核/豆状核区域、中脑、或者脑桥(或延髓)深部区域的免疫反应性是始终明显的。施用HNS的所有猴子，在所述肝脏中(在窦状腺系细胞中，包括Kupffer细胞，但不是在肝细胞中)的免疫反应性是明显的。在一只牺牲初期的雌性(4.5mg/剂组)中，免疫反应性不明显，因为导管泄露而不能修补。
在所述1.5mg/剂组，基本恢复是明显的，例外的是：肝脏、所述脑的脑膜、以及一些残留的免疫反应性明显的脊髓。在更高剂量(4.5和8.3mg/剂)，免疫反应性的强度和发生率低于给药结束时。在所有剂量水品，在脊髓、脑和肝脏中的HNS水平接近于在媒介物给药对照中的水平(在所述1-个月恢复期之后)。
在这个研究中，EOW递送HNS，IT施用持续6个月，通常耐受性良好。在体重、临床状态、眼科学的/神经病学的/身体检查、ECG、脏器重量、或者总体器官外貌方面没有观察到显著的变化。研究结果限于在CSF中临床病理中的瞬时变化，伴随着轻微至中度的脑膜浸润和硬脑膜外炎症、以及接近于完全的逆转(在所有但是所述最高的剂量组，在所述恢复期之后)。观察到：HNS在整个所述脑和脊髓中的广泛分布。
IT施用HNS EOW，引起炎症反应，其特征为残余白血球浸润和白细胞的溢出，在给药24小时后以及在尸检时被指出。不希望被任何特定的理论所约束，这可能反映了：与所述(在导管尖端附进的)紧密连接中的变化相关，所述BBB瞬时的、局部的和不完全的开口，这导致白血球和血浆蛋白质进入所述CSF(Simard JM，et al.Lancet Neurol.(2007)6，258-268；Stamatovic SM，et al.Curr.Neuropharmacol.(2008)6，179-192)。这可能是两种组件的结果：一个与所述剂量施用程序或者体积相关，以及另一个与蛋白质的IT施用相关。
在BBB渗透性中的所述瞬时变化(在剂量组和对照之间没有显著的差异，在给药24小时后，在所述主要的尸检)，不伴有任何的临床体征。
似乎有倾向于更高平均CSF HNS水平的剂量相关趋势；在给定的剂量水平，在所述CSF中的平均HNS浓度似乎维持在相同的范围，尽管抗HNS抗体水品在所述血清和CSF中增加。
在HNS给药的青少年猴子的脑和脊髓中，观察到轻微至最小平均严重程度的脑膜细胞浸润。这种在媒介物给药的对照中指出的微观变化，表明某些应答与IT导管放置有关，以及对外源蛋白质的非特异炎症应答也一样。将生物学的/蛋白质引进到IT空间，特别是其渗透到所述CNS，几乎总是引起某些程度的炎症应答(Hovland DN，et al.Toxicol.Pathol.(2007)35，1013-1029；Butt MT， Toxicol.Pathol.(2011)39，213-219)，其中，如果存在的数量损坏连接组织，将代表不良影响。在目前的研究中，尽管如此，这些细胞(主要是嗜酸性粒细胞)似乎代表了组织反应/渗透的标记物，并且没有发现作为不良反应的足够数量。所述HNS相关变化似乎没有与在所述脑、脊髓或者神经节中的任何不良结构微观变化相关。在所述脑、脊髓或者神经节中没有神经元坏死。
抗-测试制品抗体的评估是所述毒性研究的重要方面，因为中和或结合抗体对所述测试制品的清除或生物分布有潜在影响(Ponce RP，et al.Regul.Toxicol.Pharmacol.(2009)54，164-182)。在这项研究中，由于剂量相关和定量相似的HNS酶活性水平在所述脑和脊髓中(在所述3-个月中间时期和6-个月队列)没有被指出，并且在所述CSF中的平均HNS浓度似乎维持在相同的范围，尽管如此，在所述血清和CSF中的抗HNS抗体水平增加，其意味着没有中和活性。
在脊髓、脑和肝脏中似乎有倾向于更高水平的HNS酶活性的趋势，这在所述腰区的脊髓中的注射位点附近最高，并且在所述脑中是均匀的，而且从吻端至尾端、以及在右半球和左半球之间没有显著的差异。在所述6-个月队列的所述脑和脊髓组织中，没有HNS累积的证据被指出，与所述3-个月中间时期队列相比。尽管倾向于增加分布的趋势在表面样本中被指出，腰椎-IT施用的HNS渗透入所述脑的深部、脑室周围。在所述肝脏中的所述HNS酶活性，意味着所述HNS在IT递送之后的系统性重新分布；(在所述关键毒性研究中，在评估临床和解剖学病理参数后)在所述肝脏中没有观察到HNS-相关的不良影响。
一般而言，免疫组织化学结果证实了与剂量相关免疫反应性的所述酶组织活性，所述剂量相关免疫反应性在所述脊髓、脑软膜蛛网膜脑膜、以及在所述脑膜直接邻近去的神经组织(神经元、胶质细胞)中观察到。在推注IT注射或者短期IT注射后，有良好的灰质渗透的大脑和小脑。尽管在更深部结构(例如所述基底神经节、或者丘脑/下丘脑的所述中央区域、中脑、或者脑桥/延髓)中，免疫反应性不明显；但是酶活性结果表明：腰椎-IT施用的HNS渗透到所述脑的深部、脑室周围区域。因此，免疫组织化学对于检测测试制品的生物分布，可能是较不敏感的技术。在Kupffer细胞和肝脏的内皮细胞(能够吞噬作用的细胞)中，免疫反应性是明显的，但是薄壁组织细胞(肝细胞)不明显。
在青少年猴子中，所述6-个月重复剂量IT毒性研究的6-个月重复/恢复队列分析表明：在所述3-个月中间使其和6-个月牺牲猴子中的HNS-相关变化是可比的，包括：生命参数，临床和解剖学病理，在CSF和血清中的HNS和抗HNS抗体的浓度，以及HNS在脊髓、脑和肝脏中的分布/亚细胞定位。在所述恢复牺牲的猴子中，HNS影响或者缺乏、或者显著减少。因此，未观察到不良效应水平是8.3mg/剂，所述最高施用剂量。
在CSF细胞结构和蛋白质浓度中监测的变化似乎与在组织病理学评估上指出的所述形态变化可靠地相关，并且可能在使用HNS进行IT处理后的患者中是有用的；这些变化被认为是与IT-施用蛋白质的预期反应，并且在所述恢复期后大程度地消退。来自动物模型的这些数据提供了执行IT疗法(作为溶酶体贮积症神经学表现的治疗策略)的置信度。这种青少年非人类灵长类毒理学研究表明：通过IT腰椎药物递送设备施用HNS施用至儿科患者的可行性和耐受性。所述非不良CNS病理和不良临床体征的缺乏支持了最近的研究医药产品档案，并且表明了：IT施用HNS可以安全地和有效地治疗Sanfillippo A综合症的CNS症状。
材料和方法9
下文提供了：在这个实施例中描述的(在多个实验中使用的)示例性方法和材料。
研究设计和HNS给药
所述猴子被随机成5个治疗组；组1未处理(植入设备对照[DC]，端口和导管)并且没有用媒介物或测试制品给药。组2-5接受0.6mL的0、2.5、7.5或13.8mg/mL HNS(即，总剂量0、1.5、4.5、或者8.3mg)，IT，EOW。4只猴子/性别/组在3个月(中间时期尸检；在所述第6次给药后24小时)被尸检，4只猴子/性别/组(除了所述DC组，其在3个月尸检)在给药的6个月尸检(主要的尸检；在所述第12次给药后的24小时)，并且所述剩余的4只猴子/性别/组在1-个月恢复期的结束时被尸检。在尸检时，选定的组织被收集、加工和显微镜观察。
HNS在IT制剂媒介物中提供，其含有5mM磷酸钠、145mM氯化钠和0.005％聚山梨醇酯20(pH7.0)。每隔一周给药的HNS按照短期注射施用(超过约11分钟)：0.6mL(4分钟)，然后用一阵0.5mL磷酸盐-缓冲的生理盐水(PBS)(7分钟)。在所述媒介物对照组中的猴子仅接受IT制剂；DC猴子接收PBS(pH7.2)IT。
临床评估
临床体征和发病率以及死亡率观察至少每天记录两次，从所述第一次给药开始。测量体重：在手术之前、在手术的那天、在所述研究期间的每周、以及在尸检的时候。每天监测采食量，从手术前开始。体格检查(心率、呼吸、体温、听诊、步态、性情、腹部触诊、淋巴结和总体外观)和神经病学的(意识水平、追踪)检测在所述研究启动前、在所述研究期间的每个月、以及在所述尸检之前进行。也评估了运动功能、脑反射(瞳孔、眨眼角膜反射)，以及脊髓反射(感官脚、膝反射、皮肤的、本体感受和尾部反射)。心(动)电图描记器(ECG；导联I、II和III)和眼科学检查在HNS的所述第一次给药之前、以及在所述中间时期(3-个月)或者所述主要的(6-个月)尸检之前的一周完成。眼科检查通过直接检眼镜进行，所述猴子用氯胺酮盐酸(IM，8mg/kg)使其镇静，并且所述眼睛用1％托品酰胺散瞳。
临床病理
在研究开始前，在IT给药1、3、5、7、9和11、中恢复之后，以及在尸检时，从禁食猴子收集血液样品(以进行血液学和血清化学)。尿液样本通过平移捕捉收集，在给药前、在给药期间和恢复期间一月一次、以及在尸检前。CSF样本通过腰椎导管收集(以进行总细胞计数和化学分析)：在手术时、以及在IT给药1、3、5、7、9和11、中恢复之后的24小时，以及在尸检时；有时，由于部分导管堵塞，样本不能收集。因为高于预期CSF白血球计数被指出，所述3-个月给药5CSF样本从每组中一半的猴子处收集(在给药前)，并且在给药后24小时从剩余的猴子处。所述给药前的样本收集发生在给药前至少一天，以免显著改变刚给药前所述CSF体积。对于所述6-个月和恢复期的猴子，用于总细胞计数和化学分析的CSF从每组中一半的猴子处收集(在给药前)，并且在给药后24小时从剩余的猴子处。如果猴子由于堵塞而没有抽样导管，在尸检时执行脊髓穿刺(小脑延髓池)。
HNS分析
用于HNS分析的血液样本从外周静脉收集：在IT给药2、4、6、8、10、12、之前和之后的24小时，中恢复时，以及在尸检时。CSF样本通过腰椎导管收集：在给药2、4、6、8、10、12、中恢复之前和之后的24小时，以及在尸检时。HNS浓度通过酶连接的免疫吸附测定法测定。所述捕捉抗体是多克隆兔抗-HNS IgG，并且所述检测抗体是所述相同兔抗-HNS IgG的辣根过氧化物酶共轭缀物。所述LOD为0.22ng/mL；因此，所述LOQ被计算为0.66ng/mL。血清和CSF样本血清被一式两份筛选，以1∶100和1∶5稀释；超过校准曲线高端的样品被进一步稀释和重新测试。抗-HNS抗体分析
抗体分析的血液从外周静脉收集：在IT给药2、4、6、8、10、12之前，中恢复时，以及在尸检时。用于抗体分析的CSF样本在手术时收集，并通过所述腰椎导管：在IT给药2、4、6、8、10、12之前约1周，中恢复时，以及在尸检时。使用Meso Scale Discovery技术电化学发光电桥测试法检测抗HNS抗体。所述分析对于从任意物种的抗HNS抗体以及免疫球蛋白同种异型来说，是一种通用的、但是敏感的筛选方法。所述LOD为5ng/mL，并且所述样本被一式两份地筛选(以1∶20稀释)，产生100ng/mL的有效检测灵敏度。超过校准曲线高端的样品被进一步稀释和重新测试。
尸检和组织制备
猴子经历完全尸检：在所述最终IT给药后的24小时(主要的尸检)，或者在所述1-个月恢复期结束时(恢复的尸检)。所用的猴子用氯胺酮盐酸(IM，8mg/kg)使其镇静，并且维持在异氟醚/氧气混合物中，并且接受IV推注的肝素钠(200IU/kg)。猴子通过左心室灌注，室温在生理盐水中的0.001％亚硝酸钠，以速率200ml/min，持续12min(～2400ml)。在收集后，组织样本用10％中性福尔马林缓冲液固定，以进行组织病理学检查/免疫组织化学分析，或者在干冰上冷冻，并且在-60℃或者更低温贮存，以进行HNS活性分析。
所述脑在脑模型(MBM-2000C，ASI Instruments，Inc.，Warren，MI)中切片，以3-mm灌装切片厚度。所述切片被编号，在最吻端的切片被指定为切片1。切片1、4、7、10、13和16被加工用于组织病理学分析，并且切片2、5、8、11、14和17(如果有的话)被加工用于免疫组织化学。切片3、6、9、12和15被冷冻以用于HNS活性分析。所述脊髓(颈椎、胸椎和腰椎部分)被切成1-cm的切片。所述第一切片和每个第三切片后被加工用于组织病理学评估，并且所述第二切片和每个第三切片后被加工用于免疫组织化学分析。所述第三切片和每个第三切片后被冷冻用于HNS分析。调整所述切片的分布，使得所述含有所述鞘内导管尖端(切片0)的切片在福尔马林中固定，并进行组织病理分析。～5g肝脏的重复样本(取自两个单独的叶)被冷冻，以进行HNS分析，并且～5g的另外样本被固定已进行免疫组织化学分析。
组织病理
脑、脊髓、背部脊髓神经根/神经节、坐骨神经、胫神经和腓肠神经，完整的组织清单(对于这个物种的临床前期药物安全性研究期间是典型的)，以及任意的肉眼损害在所有猴子尸检中收集。组织切片用石蜡包埋，并用苏木精和曙红染色(除了下文指出的任何特定染色/包埋程序之外)，以进行综合微观评估。
准备好的石蜡块的脑切片(来自所述设备和媒介物对照组、以及所述高剂量猴子)用Fluoro-Jade B(一种增加神经元退化评估的敏感性的染料)染色，并进行Bielschowsky’s银染(一种允许直接可视化轴突、树突和神经丝的程序)。所述Fluoro-Jade B染色的切片在荧光灯照明下检查，使用异硫氰酸荧光素filter cube。
脊髓被连续地切片，在所述颈部、胸部和腰部采用横向和斜向切片，(在每个水平一个检查切片)，包括在导管尖端的切片；额外的横向切片取自马尾区。背神经根和神经节(中颈的、中胸的和中腰的)被加工和检查。外周神经(坐骨神经、胫神经和腓肠神经)被纵向切片、石蜡包埋和用苏木精和曙红(H&E)染色。横截面在锇中二次固定(postfixed)，然后包埋在Spurr’s树脂中，切片(2μm)并用甲苯胺蓝染色。一系列脊髓切片、以及背部脊髓神经根和神经节(来自所述设备和媒介物对照组、以及所述高剂量猴子)用Bielschowsky’s银染色。来自这些组的脊髓切片也用抗-胶质纤维酸性蛋白染色(一种允许直接可视化星形胶质细胞和它们的加工的染料)。
制备用于定量分析的组织提取物
冷冻脑切片3、6、9、12和15通过分离所述左和右半球进行解剖。表面组织取自距所述表面测量4mm，在每个半球剩余的组织被认为是深部组织。如果存在(例如切片6和切片9)，额外的脑室周围样本被从所述冠状切片切断。因为只有一半的脑(所述右侧)被加工(所述左侧保持冷冻)，所述切片导致产生2至3个样本：右表面、右深部和如果存在的右脑室周围(即，脑室深部；Vdeep)。小脑和脑干组织，如果存在，在分离所述半球之前被分离，并被单个地加工。脊髓切片相似地被制备、称重和均质化。
组织切片在裂解缓冲液(1ml/0.25g组织)中均质化，用10mM Tris，5mM乙烯乙二胺四乙酸、0.1％Igepal、添加α完整蛋白酶抑制剂迷你平板(Alpha Complete protease inhibitor minitablet)(Roche Diagnostics，Indianapolis，IN)配制，使用TeenA Lysing Matrix A管或者圆锥形聚丙烯管。样品在Fastprep-24自动化均质器(MP Biomedicals，Solon，OH)或者PowerGen Model125动力均质器(Omni International，Kennesaw，GA)中加工40秒。一旦均质化，使样品进行5次冻融循环，使用乙醇/干冰浴，并37℃水浴，然后在4℃离心以衬垫组织残骸，上层清液在-80℃储存知道分析。HNS活性使用特定的底物(4-甲基伞形基-α-D-N-磺基氨基葡糖苷)和2-步骤荧光测定法测定。
免疫组织化学的组织加工和染色
6个福尔马林固定的3-mm厚度冠状脑切片(切片编号2、5、8、11、14和17)，来自每只猴子，从吻端至尾端被编号成1至6。通常，切片1-4含有基地核/丘脑/中脑和大脑，并且所述尾端的切片含有小脑和脑干(延髓)组织。脑、脊髓和肝脏(取自与H&E以及所述多种特定染色相同的石蜡块)进行HNS的免疫组织化学染色。特定的小鼠单克隆抗体(克隆2C7；MaineBiotech，Portland，ME)用于IT-施用的HNS细胞内吸收的检测；这种试剂被表明与内源性食蟹猴HNS没有交叉反应性。阴性对照施用不相关的小鼠IgG进行。去石蜡包埋的切片与初级小鼠抗HNS抗体一起过夜孵育，在2至8℃。添加次级山羊抗-小鼠生物素化的免疫球蛋白G，并在37℃孵育30分钟。添加抗生物素蛋白/生物素化的辣根过氧化物酶复合物，并在37℃孵育30分钟。切片在过氧化物酶底物二氨基联苯胺溶液中孵育，直至达到预期的染色强度。核用苏木精复染色。
统计分析
分析体重、体重变化、采食量、呼吸率、体温、心率、CSF细胞计数、CSF化学、临床病理数据、尿液数据、以及绝对和相对脏器重量，通过方差分析以及Dunnett’s检验(比较所述设备和媒介物对照组与每种HNS-给药组)。另外，所述数据分析将所述两个对照组彼此进行了比较。分析双尾检验的显著性水平为5％和1％。所有的数据以平均值±标准差的形式呈现。
实施例22：乙酰肝素N-硫酸酯酶生物分布和药代动力学研究
在这个实施例中的所述实验被设计为测定HNS在大鼠中的组织分布，在单一静脉内或鞘内给药后(1或者10mg/kg)的HNS。例如，此外，这些实验的目的是使用正电子放射断层造影术(PET)来表征HNS在大鼠中的生物分布(BD)性质；以比较当以不同途径(IV或者IT)和不同剂量(1或者10mg/kg)给药时的HNS分布模式；并测定在每种感兴趣器官中按这些给药方案的HNS药代动力学性能。
研究了124I-硫酸胺酶(HNS)的药代动力学(PK)和生物分布(BD)属性，通过组织PET成像，在大鼠中单一静脉内(IV)或鞘内(IT)施用1或者10mg/kg的124I-HNS。从动态图像(在第一个20分钟)和静态图像(在IV或者IT给药后的0.05(仅对于IT施用)、1、2、4、8、24、48、96和192小时)，获得在感兴趣器官的放射性实时数据。
在这项研究中，施用4组中的每个(1mg/kg IV，1mg/kg IT，10mg/kgIV和10mg/kg IT)。测量放射性实时数据：在IV施用以后的所述头部、脑(包括脑脊髓液，CSF)、脊椎和肝脏区；以及在IV施用以后的所述血液、脑(包括CSF)、肝脏、肾脏、心脏(包括肺脏)和皮肤。所述数据通过124-碘的衰变半衰期(100.2小时)校正，表示为：感兴趣区域注射剂量(％ID)的百分比或者％ID每克成像组织(％ID/g)，然后归一化为200克体重。在感兴趣区域给药蛋白质的总量(ug)或者浓度(ug/g)从相应的％ID或者％ID/g数据计算。
在IT给药后的第一个20分钟，在所述头部区域的HNS的总量，以0.002/min-0.011/min(λz)的恒定速率减少(在1和10mg/kg)。在这个报告中，对于在所述两个剂量和两个施用途径之间的药代动力学比较(更多信息参见结果部分)，没有使用清除率和分布统计。从所述脑中消除的恒定速率基本上相同，在两个测试剂量(λz：0.016/hr相对于0.014/hr，分布对应于1和10mg/kg)，和具有有大约2天的相似半衰期(通过IT给药后的多达192小时的静态图像测定)。所述Cmax和AUC(0-最终或者0-无限)的值与施用的剂量成正比。在1至10mg/kg的剂量范围(在这些IT单一给药方案中给出)中表明了线性PK行为。从所述脊椎的近端至远端切片(两个剂量水平都)观察到了浓度梯度。
在IT给药后，HNS蛋白质在所述肝脏中是可测量的：在1mg/kg多达96小时，以及在10mg/kg的HNS多达192小时。在所述肝脏中的浓度，1mg/kg的2小时达到顶峰，10mg/kg的7小时达到顶峰。所述消除(在1mg/kg)为0.030±0.011/hr(平均值λz)，其与在10mg/kg(λz0.017±0/hr)(p＝0.10)显著不同，以及相应的t1/2(28相对于42小时，分别对应于1和10mg/kg的剂量)。
在IV给药以后，在肝脏、肾脏、心脏和皮肤的所述消除半衰期为：对肝脏47±10和38±13小时，对于肾脏54±25和29±16小时，对于心脏36±15和42±19小时，以及对于皮肤40±21和31±13小时，分别对应于1和10mg/kg；而在所述脑中的半衰期为71±23和60±53小时。对于肝脏、皮肤、肾脏、心脏和脑的Cmax的平均值为：在1mg/kg为9.6、0.30、0.25、0.22和0.08ug/g；以及在10mg/kg为132、7.9、3.9、3.7和1.8ug/g。在从个体动物得到Cmax值以后，相对于剂量进行归一化，所述Cmax/剂量值(在10mg/kg)显著高于在这些器官中的1mg/kg(大多数p值＜0.05，对肝脏p＝0.06)。所述肝脏、皮肤、肾脏、心脏和大脑的所述AUClast值为：在1mg/kg为525、16、14、9和7hr.ug/g；以及在10mg/kg为6747、276、183、201和86hr.ug/g。在归一化以后，所述AUClast/剂量值在10mg/kg显著高于1mg/kg，在皮肤中(p＜0.01)，在心脏中略微不同(p＝0.06)，并且在肝脏、脑和肾脏中不显著(所有p值＞0.34)。
当所述剂量的HNS被注射，鞘内施用比静脉施用导致的脑暴露大3个数量级。所述消除半衰期在脑中：IT为2天，IV施用为3天。尽管如此，在IT给药后的肝暴露与在HNS的所述相同剂量IV给药后近似。对于肝脏的所述暴露(Cmax和AUClast)，通过IT/IV，在1mg/kg和10mg/kg，范围为0.4-1.2。
实验设计
在大多数溶酶体贮积症中，所述中枢神经系统(CNS)是脆弱的，并且在一些类型的这些疾病中是严重损坏的，例如Sanfilippo综合症类型A或者B(黏多糖贮积症III)、异染性脑白质营养不良(MLD)和亨特综合症。如本文描述的，这也是考虑到的：由于当外围施用时通过血-脑屏障的渗透较差，直接施用酶蛋白质进入所述CNS可能使它们在中枢神经组织中的浓度增加，并进一步增强它们的治疗效果。在这项研究中，研究鞘内(IT，或者小脑延髓池)施用，并将其与IV施用在不同剂量水品进行了比较。
PET是非侵入性的、重复的和定量的技术，提供了随时间推移、在所述感兴趣器官中动态变化的药物浓度。来自靶器官(活性位点，而不是血液循环中)的动态浓度-时间数据是有价值的，并且与所述给药药物的生物活性直接相关。进一步的，来自动物PET研究在组织暴露中的信息，可以用于指导在人类中首次剂量的选择。
材料和方法
测试制品
肝素N-硫酸酯酶(HNS)被配制成浓度20mg/mL的HNS，在5mM磷酸钠缓冲剂中，145mM氯化钠，pH7.0。所述材料通过RP-HPLC纯化，含有98.7％的肝素N-硫酸酯酶，具有99.9％的二聚体。HNS用124碘标记。
样品来源
放射性图像来自在IV和IT给药124I-H-N-硫酸酯酶之后的大鼠，在1和10mg/kg。
动物
16只雄性Sprague-Dawley大鼠从Charles River实验室购买(190±60g，n＝16)，并且被分配到4个组(n＝4)。单一IV或者IT注射，在两个不同剂量(1mg/kg和10mg/kg)，被给予至每个组的这些大鼠中(总共4组)。所述剂量和注射体积根据每个动物的体重个体化。在所述两个IV-处理组中，通过IV注射戊巴比妥钠(以35mg/kg的剂量)使其镇静。静脉内剂量的注射通过经尾静脉的推注。在两个IT-处理组中，动物通过腹膜内使用戊巴比妥钠(以50mg/kg的剂量)麻醉。鞘内剂量使用超过1分钟，在经过寰枕膜的小脑延髓池。所述实际施用的放射性通过PET测量，并且作为注射剂量。
实验和/或分析方法
获得动态图像(每2分钟)：在所述第一个20分钟，在所述心脏(包括所述肺脏)、肝脏和肾脏(在IV注射后)区域中；以及在所述头部区域在IT施用这两种剂量之后。静态图像的获得：在所述区域包括脑(包括脑脊髓液，CSF)、肝脏、肾脏、心脏(包括所述肺脏)，、肌肉、皮肤和骨骼，在IV-处理组中；以及在IT-处理动物的所述头部、脑(包括CSF)和肝脏区域，在给药后的0.05(仅适用于IT组)、1、2、4、8、24、48、96和192小时。重新构建所述图像，并将所述三个主体切片融合成一张图像。
数据分析
PET数据以毫微居里(nCi)，每mL(对液体)或者每克(对组织)表示。相对活性从在静态图像中的所述脑、肝脏、肾脏、骨骼肌、胃、心脏(带肺)和皮肤区域获得。在整个头部或者脑区域的绝对活性从接受IT注射的动物获得。每毫米脊柱的放射性在IT注射的动物中测定，在三个选定的切片：近端(颈部)，中间(对肝脏的上边缘)，和远端脊柱(距离含隔室蛋白质的远端1厘米)。
所有数据通过124I(100.2小时)的衰变半衰期校正，并且归一化为注册功效，基于124I来源的校准(具有外部测量活性)。所述数据然后被表达为整个区域(所述头和脑)的注射剂量(％ID)的百分比，或者％ID每克(％ID/g)的组织，然后归一化为200克体重[数据归一化：(％ID或者％ID/g)/体重的所述动物x200]。采用所述归一化，以减少所述数据的变异性，因为在每个组中仅使用4只动物。
在这个实施例中，HNS蛋白质浓度或者量使用所述注射到每个动物的蛋白质剂量，进行计算：蛋白质浓度(ug/g)＝(％ID/g)x(mg/kg的注射剂量x1000x0.2)；在感兴趣区域中的给药蛋白质总量(ug)＝％ID x(mg/kg的注射剂量x1000x0.2)，此处所述注射剂量为1mg/kg或者10mg/kg，并且0.2是体重的归一化因子。每个PK参数的组平均值和标准差的计算，基于所述4组中的每组中的单个非房室化数据(non-compartmental data)。进行学生t-检验，以比较λz、t1/2、Cmax和AUC的值，在所述两个测试剂量之间和所述两个施用途径之间。统计显著性被定义为p-值小于0.05(p＜0.05)。
结果
计算在下面的表、图和PK分析中的HNS的量(ug)或者浓度(ug/g)，通过将所述注射的蛋白质剂量(1mg/kg或者10mg/kg)乘以相应的％ID或者％ID/g值。
用 124 I-HNS(以1和10mg/kg的剂量)鞘内治疗
在所述头部区域中的所述给药蛋白质的量(ug)(来自动态图像)被绘制，作为时间的函数，在他151中。在所述脑区域中的所述浓度(ug/g)(来自静态图像)被绘制，作为时间的函数，在图152中。在所述脑和头部区域的注射蛋白质的量(ug)(来自静态图像)与时间被绘制，分别为图153和图154中。在近端、中间和远端的脊柱处的浓度-时间曲线(ug/mm)，在图155至图157中示出。图158示出了：在IT施用124I-HNS后(在1和10mg/kg)，在所述肝脏中HNS浓度(ug/g)随时间的变化。
通过非房室(WinNonlin5.2，Pharsight，Mountain View，CA)分析总量-时间(ug)或者浓度-时间(ug/g)数据。从每个单个动物的数据，评估所述PK参数，例如消除的恒定速率(λz)，顶峰浓度(Cmax)，终末衰变期(t1/2)，在曲线以下的面积(AUClast和AUC0-inf)以及其它。
评估清除率和分布容积，但是，在这个报告中，它们不用于在所述两个剂量之间和所述两个施用途经之间的PK比较，其原因有二：(1)这项研究关注在固体组织中HNS的生物分布，而不是血液PK；以及(2)在所述脑区域中的放射性是来自所述脑组织(固体)和CSF(液体)的总量，其在这项研究中不能彼此分离。评估所述λz，并且用于比较，因为它表明了每单位时间排除的所述注射剂量的百分比。
计算所述组平均值和标准差(SD)，并在所述测试剂量之间进行比较。所述PK参数在下文表48中列出。
表48
10
mg/kg
IT
10
mg/kg
IV
λz 0.102 0.180 0.021 0.012 0.035 0.024 0.020 0.010 0.026 0.012
t1/2 60.5 53.1 37.8 13.4 28.4 16.4 41.6 18.6 31.0 12.7
Tmax 13 12 2 1 12 11 16 9 3 1
Cmax 1.8 0.2 131.6 26.8 3.9 0.7 3.7 0.7 7.9 2.3
AUClast 86 66 6747 2837 183 123 201 89 276 40
AUCinf 118 98 7171 3029 198 131 230 110 292 43
MRTlast 43 32 40 14 33 21 41 18 33 13
在给药后的第一个20分钟能够，在所述头部区域的HNS的总量(ug)：在1mg/kg时，以0.002-0.011每分钟(λz，0.005±0.004/min)的恒定速率减少；在10mg/kg时，以0.003-0.010每min(0.007±0.003/min)的恒定速率减少。这些消除的恒定速率在这两个剂量水平没有显著差异(p＝0.57，图151)。
对脑的所述浓度-时间曲线(ug/g，从0.05至192小时)表明为双阶段属性(图152)。所述早期阶段持续约2小时。所述末期阶段遵循一级动力学。从所述脑中消除的恒定速率在两个测试剂量(0.0016±0.003和0.014±0.001每小时)是非常相似的，并具有非常相似大约2天的半衰期(45±7和49±4小时，分别在1和10mg/kg)。当所述剂量从1增加至10mg/kg，所述顶峰浓度的值(257±90和2628±265ug/g)以及AUClast(8393±2457和83962±10083hr.ug/g，分别在1和10mg/kg)增加约10倍。这些观察现象表明了：在(在这些IT单一剂量方案给与的)1至10mg/kg的剂量范围的线性PK行为。在IT给药后的3分钟(Tmax)，所述顶峰浓度在所述脑中出现。
在所述脑和头部中的总量-时间曲线(ug从0.05至192小时)遵循与在脑中观察到的浓度-时间曲线(ug/g)相同的二阶段模式(图153和图154)。在所述脑区域中的Cmax值显著低于在所述头部区域中的(69±8相对于200±0，在1mg/kg，p＜0.01；以及836±117相对于1844±314ug，p＜0.01，在10mg/kg)。所述消除的恒定速率为：对脑分别为0.017±0.002/hr和0.014±0.001/hr，对头部区域分别为0.016±0.002和0.010±0.001/hr，在相应的1和10mg/kg。所述平均值的残留时间值为：对脑为42±5相对于51±5小时(p＝0.048)，以及对于所述头部为45±7相对于70±9小时(p＜0.01)，分别对应于1和10mg/kg。这些观察现象表明了：所述给药蛋白质从两个区域中消除，较低剂量比较高剂量都更快。所述半衰期平均值42至70小时的范围，在IT给药1mg/kg和10mg/kg的HNS后。
在两个剂量水平，从所述脊柱的近端、至中间和远端切片，都可以观察到浓度梯度(未显示数据)。在IT给药后，观察到所述顶峰浓度(ug/mm的脊椎柱)：在所述近端大约30分钟(0至1小时)，在所述中间(1至4小时)(除了已知大鼠为24小时)，以及在所述远端切片(1至8小时)。在这些切片中的半衰期是可变的(平均值t1/2：对所述近端32±13和45±18小时，对所述中间39±16和大约50小时，以及对所述脊柱远端切片30±12和大约123小时，分别对应于1mg/kg和10mg/kg)。顶峰浓度的平均值与在这三个切片的每个的剂量大致成正比，在1和10mg/kg的124I-HNS(0.5相对于6.0、0.2相对于0.9、以及0.1相对于0.5ug/mm；分别对应于所述脊柱的近端、中间和远端切片)。AUClast的所述平均值遵循与观察到的顶峰浓度相同的比例模式(9.5相对于83、6.8相对于35、以及2相对于38hr.ug/mm，分别对应于近端的、中间的和远端的切片)。
尽管HNS在大多数外周器官中不是可检测的，但是它在肝脏中在IT给药后早至1小时(在给药后的所述第一个成像时间点)，在1mg/kg至96小时(四只动物中的三只)，在10mg/kg至192小时(所有四只大鼠)，是可测量的(图158)。在所述肝脏中的所述浓度达到所述顶峰，在IT给药1mg/kg后的2小时，以及IT给药10mg/kg后的7小时，这遵循具有一级动力学的消除阶段。消除的所述恒定速率：在1mg/kg(λz0.030±0.011/hr)快于10mg/kg(λz0.017±0/hr)(p＝0.10)；伴随相应较短的t1/2(28±16相对于42±1小时，分别对应于1和10mg/kg的剂量，p＝0.76)。AUClast值在1mg/kg，减少大约40倍(相比与在10mg/kg的值)(分别地，204±50相对于7987±3276ug/g).
124I-HNS在1和10mg/kg的剂量进行的静脉内治疗
在脑、肝脏、肾脏、心脏(包括肺组织)和皮肤中的浓度被标绘(作为时间的函数)，在IV给药1和10mg/kg的HNS后，分别显示在图159至图163。由于这些器官的第一静态成像时间点为在给药后的1小时，在这项研究中没有观察到这些浓度-时间曲线的起始阶段。对于所述肝脏、肾脏、心脏和皮肤的浓度-时间曲线，显示了平坦的阶段(在给药后从1至8小时)。该平坦阶段在给药后在脑中持续24小时，意味着：脑吸收所述IV给药蛋白质慢于外周器官。剩余的数据显示了接近一级动力学的末期消除阶段
在所述肝脏、肾脏、心脏和皮肤中的消除半衰期为：对肝脏47±10和38±13小时，对肾脏54±25和29±16小时，对心脏36±15和42±19小时，以及对皮肤40±21和31±13小时，分别对应于在1和10mg/kg；同时在所述脑中的半衰期为71±23和60±53小时(在10mg/kg组中的大鼠3被排除，因为没有充分的数据来测定t1/2)，分别对应于在1和10mg/kg。在这些器官中在1和10mg/kg之间没有显著性差异，例外的是对肾脏p值＜0.03。
对于所述肝脏、皮肤、肾脏、心脏和大脑的平均值和Cmax为：9.6、0.3、0.25、0.22、和0.08ug/g(在1mg/kg)，以及132、7.9、3.9、3.7和1.8ug/g(在10mg/kg)。对于这些器官，在10mg/kg的Cmax与在1mg/kg相应值的比率为14、26、16、17和23。在将来自个体动物的所述Cmax值相对于剂量归一化后，在所有这些器官中，所述Cmax/剂量值在10mg/kg显著高于在1mg/kg(大多数p值＜0.05，对于肝脏p＝0.06)。对于肝脏、皮肤、肾脏、心脏和大脑的AUClast值为：525、16、14、9.3和7hr.ug/g(在1mg/kg)；以及6747、276、183、201和86hr.ug/g(在10mg/kg)。对这些器官，AUClast在10mg/kg与AUClast在1mg/kg相应值的比率分别为13、17、13、22和12。在归一化后，所述AUClast/dose值在10mg/kg显著高于1mg/kg，在所述皮肤中(p＜0.01)；略微不同地，在所述心脏中(p＝0.06)；并且与在所述肝脏、脑和肾脏中(所有p值＞0.34)显著不同。
这些观察现象意味着：(1)在大多数器官中的半衰期为大约2天，例外的是所述脑(大约3天)；(2)在所述肝脏中每克暴露大于所述皮肤、心脏和肾脏(其大于所述脑)；(3)伴随10倍增加，在剂量(10/1mg/kg)，来自所有测试器官的Cmax值在10mg/kg增加超过10倍(比在1mg/kg)。
在所述脑中的顶峰浓度在IV给药后1-24小时(Tmax)达到。
IV相对于IT治疗的比较
在图164和图165中，分别比较了在IV和IT施用后(在1和10mg/kg)，在所述脑和肝脏中的浓度-时间曲线。在所述脑中，通过IT/IV，在1和10mg/kg，Cmax的比率分别为3212和1501。这些AUC0-192hr的比率为1136和978。这些观察现象表明：当相同剂量的HNS被注射时，鞘内施用导致所述脑比静脉施用约大3个数量级的暴露。在所述脑中的消除半衰期为：IT2天(45和49小时，在1和10mg/kg)，以及IV3天(71和60小时，在1和10mg/kg)，在两个施用剂量水平。
尽管如此，在IT给药后的肝暴露与IV给药后的相似，在相同剂量的HNS。在肝脏中Cmax的比率(通过IT/IV，在1mg/kg和10mg/kg)为0.5和0.8，并且AUClast的比率分别为0.4和1.2。.
结论
在大鼠中，在单一静脉内或者鞘内施用1或者10mg/kg的124I-硫酸胺酶后，通过组织PET成像，研究124I-硫酸胺酶(HNS)的药代动力学和生物分布属性。在感兴趣区域中，在给药后0.05、1、2、4、8、24、48、96和192小时，动态地(所述第一个20分钟)和静态地获得浓度-时间数据。通过在IT给药后的动态成像，在所述头部区域中的HNS总量，以0.005/min-0.007/min(平均值λz)近似的恒定速率减少(在所述第一个20分钟中)。通过静态成像，从所述脑的消除速率，在两个测试剂量(λz：0.016/hr相对于0.014/hr，分别对应于1和10mg/kg)，基本相同，并且伴随近似的半衰期(大约2天)。
Cmax和AUClast的值与所述施用剂量成正比，并且在所述1至10mg/kg的剂量范围(在这些IT单一给药方案中给予的)表现了线性的PK行为。
在两个剂量水平，从所述近端至远端，都观察到浓度梯度。
在IT给药后，所述顶峰浓度在大约20分钟观察到(在近端)，1至4小时(在中间)，以及1至8小时(在远端切片)。在脊椎柱的不同切片中表明了线性PK行为。
在IT给药后，HNS蛋白质在肝脏中是可测量的，从较早时间多达96小时(在1mg/kg)，以及192小时(在10mg/kg)。所述消除速率在1mg/kg(λz0.030/hr)较高于10mg/kg(λz0.017/hr)，伴随相应的较短t1/2(在较低剂量)(28±16相对于42±1小时，分别在1和10mg/kg的剂量)。
在IV给药后，在所述肝脏、肾脏、心脏和皮肤中的消除半衰期为：对于肝脏47±10和38±13小时，对于肾脏54±25和29±16小时，对于心脏36±15和42±19小时，以及对于皮肤40±21和31±13小时，分别在1和10mg/kg；同时在所述脑中的半衰期为71±23和60±53小时。对于所述肝脏、皮肤、肾脏、心脏和大脑的Cmax平均值为：9.6、0.30、0.25、0.22和0.08ug/g(在1mg/kg)，以及132、7.9、3.9、3.7和1.8ug/g(在10mg/kg)。在将来自个体动物的所述Cmax值相对于剂量归一化后，在所有这些器官中，所述Cmax/剂量值(在10mg/kg)显著高于在1mg/kg，(大多数p值＜0.05，对于肝脏p＝0.06)。对于所述肝脏、皮肤、肾脏、心脏和大脑的AUClast值为：525、16、14、9.3和7hr.ug/g(在1mg/kg)；以及6747、276、183、201和86hr.ug/g(在10mg/kg)。在归一化后，所述AUClast/剂量值(在10mg/kg)显著高于在1mg/kg(在皮肤中)(p＜0.01)，与在心脏中略微不同(p＝0.06)，并且与在肝脏、脑和肾脏中(所有p值＞0.34)显著不同。
实施例23：用HNS治疗Sanfilippo综合症类型A(Sanfilippo A)患者
可以使用通过例如IT递送直接施用CNS，以有效治疗Sanfilippo A患者。这个实施例解释了多剂量递增研究，其被设计以评估：多达3个剂量水平每隔一周(EOW)，持续40周的rhHNS施用(通过鞘内药物递送设备(IDDD))至Sanfilippo A患者的安全性。适合于人类治疗的多种示例性鞘内药物递送设备在图94-97中描述。
将招募多达20例患者：
队列1∶5例患者(最低剂量)
队列2∶5例患者(中剂量)
队列3∶5例患者(最高剂量)
5例患者被随机分配至没有治疗组。
为本研究选取的患者是根据一下标准的内容：
通过IT注射，持续40周，测定在Sanfilippo A患者中施用HNS的递增剂量的安全性。此外，评估了：HNS在认知功能方面的临床活性、以及在血清中单一和重复剂量的药代动力学、以及在脑脊髓液(CSF)中的浓度。
实施例Naglu-IGFII的IT递送
实施例24：rhNaglu和Naglu-IGFII的体外研究
使用两种的Sanfilippo B患者成纤维细胞，GM02391(P359L)和GM01426(E153K)，以及一种正常人类成纤维细胞系，研究了每种Naglu变异型的细胞吸收机制。由于在所述细胞系上M6P受体表达，传统上研究者使用成纤维细胞研究溶酶体酶的细胞吸收。
通过使成纤维细胞与rhNaglu或者Naglu-IGFII在37℃孵育4小时，进行细胞吸收研究。在孵育后，洗涤和裂解细胞，并测量Naglu在裂解液中的酶活性。rhNaglu与成纤维细胞的孵育导致在细胞内几乎没有可检测的酶量。相反，Naglu-IGFII与成纤维细胞的孵育导致酶在细胞内的显著水平(图166)。内在化的Naglu-IGFII的量达到饱和，同样用于孵育的酶的量增加。所述剂量依赖性的饱和吸收对于受体介导的细胞吸收，是典型的发现。而且，Naglu-IGFII的内在化不受外源M6P的抑制，但是被外源IGFII完全抑制(图166)。这个结果表明了：Naglu-IGFII内在化进入成纤维细胞，依赖于M6P/IGFII受体，以糖基化独立的方式。
进行实验，以研究rhNaglu和Naglu-IGFII至溶酶体的运输。使用Sanfilippo B患者成纤维细胞(GM01426)进行该研究。rhNaglu和Naglu-IGFII检测，通过在将使所述蛋白质与所述细胞初始孵育后，用抗-人Naglu多克隆抗体染色检查。使用LAMP-1(溶酶体相关膜蛋白1)的免疫荧光染色，以检测溶酶体。rhNaglu和Naglu-IGFII，与溶酶体的共定位，通过共聚焦显微镜可视化(图167)。
在所述蛋白质与所述细胞孵育4小时后，观察到Naglu-IGFII的广泛内在化，证明了Naglu-IGFII与溶酶体的共定位。相反地，rhNaglu未能在相同时间框架内的内在化，并且没有观察到与溶酶体的共定位。这个结果进一步为以下提供了证据：Naglu-IGFII被内在化进入细胞，并被运输到正确的细胞房室(溶酶体)。在Sanfilippo B患者成纤维细胞中，测定内在化的Naglu-IGFII的半衰期为1.5天(未显示数据)。
实施例25：在小鼠模型中的体内研究
野生类型(wt)插管的大鼠
除了Sanfilippo B小鼠模型，使用所述wt插管的大鼠(一种无缺陷的动物模型)，以进行在体内的分子筛选。所述wt插管的大鼠具有外科植入的插管(在所述脊髓的上腰部和下胸部区域)，并且通过所述插管，35ul的单剂量注射至所述CSF。使用该动物模型评估分子筛选的标准是Naglu活性检测、以及所述脑和脊髓的免疫组织化学。
Sanfilippo综合症类型B小鼠模型
Sanfilippo综合症类型B的小鼠模型(Naglu-/-小鼠，Sanfilippo B小鼠)由E.Neufeld和其同事形成(Li HH，et al.，PNAS96(25)：14505-14510；1999)。所述小鼠的Naglu基因的外显子6被插入的选择性标记物(新霉素抗性基因)打断。最终的同型结合子Naglu-/-小鼠是完全Naglu缺乏的(图168)，并且在肝脏和肾脏中具有总的GAG累积。尽管Naglu的总缺陷，但是这些小鼠通常健康并具有8-12个月的寿命。其它溶酶体酶的表达变化发生在约5个月龄，这些变化包括：β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶和β-氨基己糖苷酶在肝脏和脑中的补偿性增加，α-L-艾杜糖苷酸酶在肝脏但不在脑中的提高，以及唾液酸苷酶在肝脏和脑中的降低。死亡通常由于尿滞留和尿传染而发生。已经在文献中广泛研究了所述Sanfilippo B小鼠模型，以描述Sanfilippo B病理学变化。已经报道了Naglu-/-小鼠的CNS病理相关的表现型，在4.5月龄为低活性，但是已经观察到在其它年龄段为极度活跃。
在Naglu-/-小鼠中的神经病理变化被描述为在神经元、巨噬细胞和内皮细胞中的液泡和内含体，其通过EM(电子显微镜)观察。这些病理变化通常在33天龄开始，并且随动物变老而进行性地恶化。通过组织病理学分析，也证明了活化的星形胶质细胞细胞和小胶质细胞。B两种神经节苷酯的生物化学分析(GM2和GM3)表明：5倍和9倍增加所述脑。(由于GM2和GM3不是Naglu的直接底物，并且在ERT后短时间内证明其显著减少是挑战性的，所以他们没有用作POC的生物标记物)。
通过测量Naglu酶活性和GAG水平进行了生物化学分析，通过抗-人Naglu抗体、抗-LAMP-1抗体、抗-Iba-1抗体和抗-GFAP抗体免疫组织化学进行了组织学分析。本研究使用的抗-人Naglu抗体为小鼠单克隆抗体，其不与在wt小鼠中的内源性鼠科Naglu或者Sanfilippo B小鼠的变异Naglu结合。LAMP-1免疫染色使用抗体结合溶酶体膜蛋白质，溶酶体相关膜蛋白-1。Iba-1染色使用的抗体结合离子钙-结合接头蛋白质，其对于小胶质细胞和巨噬细胞是特异性的。GFAP染色使用的抗体与胶质纤维酸性蛋白结合，其对于星形胶质细胞是特异性的。
通过颅内的(IC)注射进入Sanfilippo B小鼠，进行体内生物活性筛选
这项研究的目的是评估Naglu酶在体内的生物活性。在这项研究中，通过IC注射施用蛋白质进入所述Sanfilippo B小鼠的脑中。本研究的Sanfilippo B小鼠的年龄接近匹配在8周龄。所述IC注射途径提供了最好的案例方案，以评估所述分子的功效。Naglu蛋白质的评估，通过其被吸收进入神经元细胞和减少溶酶体贮积的能力进行。施用免疫组织化学评估生物分布。并且溶酶体贮积被表征为使用LAMP-1免疫染色的阳性染色数量和体积。
通过经过所述Sanfilippo B小鼠的头骨直接注射进右大脑皮层，进行IC注射。将2微升或者35μg的Naglu蛋白质注射进入每只动物。所述动物的牺牲发生在注射后的7天。在初步研究中，牺牲的时间是预先确定的，其中动物牺牲发生在注射后的3、7和14天。从所述初步研究，已经确定：注射后7天对于免疫组织化学研究是最合适的时间。脑切片被横向切断(图169)，并进行Naglu和Lamp-1免疫染色。通过使用抗-人Naglu抗体的免疫组织化学，证明：细胞吸收进入所述神经元和胶质细胞(在rhNaglu和Naglu-IGFII处理的Sanfilippo B小鼠中)(图170以及图171)。在rhNaglu和Naglu-IGFII处理的Sanfilippo B小鼠之间，观察到关于所述细胞吸收没有显著差异。另外地，(rhNaglu和Naglu-IGFII处理的小鼠两者都)脑组织的LAMP-1免疫染色表明：溶酶体贮积的降低。溶酶体贮积降低的水平(在rhNaglu和Naglu-IGFII处理组中，两者都)与正常wt小鼠水平几乎相同。
也观察到在IC注射后溶酶体贮积的降低(在Naglu-TAT、Naglu-Kif和PerT-Naglu测试的Sanfilippo B小鼠中)(未显示数据)。这项研究表明：所有Naglu的所述变异性的体内生物活性。
在单独的研究中，Naglu-缺陷小鼠被IT施用媒介物，或者可选的一周、两周或者三周剂量的重组Naglu-IgF-II融合蛋白构建体(Naglu)(在PBS中)。未处理野生-类型组的小鼠作为未处理野生-类型对照，并且施用没有Naglu的媒介物。小鼠在最终注射后的24小时后牺牲，接着制备组织进行免疫组织化学(IHC)和组织病理学分析。
在IT-施用所述重组Naglu后，Naglu分布至所述Naglu-缺陷的小鼠是明显的。如在图172A中图解的，IT-施用所述重组Naglu至Naglu-缺陷的小鼠，导致细胞液泡在所述白质组织中的普遍减少，与被IT-使用媒介物的Naglu-缺陷的小鼠相比。相似地，并且如在图172B中所图解的，形态计量分析揭示了：在所述处理小鼠中所述白质组织中LAMP1免疫染色的显著减少(相对于所述未处理Naglu-缺陷小鼠)，从而反映了在疾病病理中的改善。
如在图173A-B中所示的，在被评估的每个区域的脑组织中(所述皮层，尾状核和豆状核(CP)、丘脑(TH)、小脑(CBL)和白质(WM))，在所述Naglu-处理小鼠中所述LAMP-阳性区域减少(相对于所述未处理Naglu-缺陷对照小鼠)，并且接近于野生-类型小鼠的所述LAMP-阳性区域。特别显著的是，在被分析脑组织的每个区域中，在所述IT-施用两个或3个剂量(图173B)后，LAMP-阳性区域进一步减少，相对于单一剂量的(图173A)Naglu。
这些结果确证了：IT-施用的Naglu能改变溶酶体贮积症(例如在Naglu-缺陷小鼠模型中的Sanfilippo综合症类型B)的进展，进一步确证了IT-施用酶(例如Naglu)治疗溶酶体贮积症(例如Sanfilippo综合症类型B)并发的CNS表现的能力。
通过鞘内(IT)注射进入wt插管的大鼠，进行分子筛选
这项研究直接模拟药物施用的端口-介导方法。通过IT注射进入wt插管的大鼠，施用Naglu蛋白质，以测定其进入所述脑实质的生物分布。
在这些动物中的所述插管放置在脊髓的上腰椎和下胸椎部分(图174)。通过所述插管(由于可溶性限制，Naglu Kif仅被注射38.5ug，其少于其余Naglu的10倍)，动物被注射5μl或者385μg的rhNaglu、Naglu-TAT、Naglu-IGFII和PerT-Naglu。牺牲发生在注射后的4小时或者2小时。
收集脑和脊髓组织，并通过Naglu活性分析测量。在所述处理动物的脑中，Naglu-TAT和Naglu-IGFII处理的动物表现更高的活性，与所述rhNaglu和其它Naglu变异型处理的动物(图175)相比。作为总趋势，对于所有处理的动物，在脊髓中所述Naglu活性显著高于在脑中(未显示数据)。这种现象可能表明：在接近所述IT注射位点，蛋白质被吸收更多。
免疫组织化学分析表明：在IT注射后的24小时，Naglu-IGFII处理组的生物分布在脑中比其它Naglu变异型处理组更加广泛(图176和图177)。在所述rhNaglu处理动物中，仅在所述脑的脑膜中观察到所述蛋白质。在所述脊髓切片中，IHC表明：一些细胞吸收rhNaglu(在灰质神经元中)，但是其与在脊髓神经元中的Naglu-IGFII吸收相比，程度较小(未显示数据)。.
在Naglu-TAT IT注射组中，即使最高的Naglu活性在脑组中观察到(通过生物化学分析)，但是IHC未能表明：任意的Naglu-TAT渗透进入所述脑的软组织，除了保留在所述脑膜上。除了Naglu-IGFII，所有的或其它的Naglu变异型未能显示越过脑膜的生物分布，这有力证明了Naglu细胞吸收依赖于M6P/IGFII受体(在脑中)，在IT注射后。这个研究指出：Naglu-IGFII是主要的分子，用于Sanfilippo B的药物开放。
实施例26：使用Naglu-Igfii的概念研究的验证
实验设计
设计概念研究的验证，以表明(在Sanfilippo B小鼠中)在IT注射Naglu-IGFII后的生物分布和溶酶体贮积症逆转。对于这项研究，三组的Sanfilippo B小鼠(在8周龄)，用IT注射Naglu-IGFII处理。每个IT注射剂含有10ul体积或者260ug的Naglu-IGFII。有三个处理组：1x注射，2x注射和3x注射组。对于所述1x注射组，单一剂量的蛋白在第0天施用。动物在注射后24小时牺牲。对于2x注射组，两次IT注射在第0天和第7天施用，并且动物在所述末次注射后的24小时牺牲。对于所述3x注射组，IT注射在第0天、第7天和第14天施用，并且动物在末次注射后的24小时牺牲。所述三组的媒介物处理小鼠也被包括在内。对于所述媒介物对照组，Sanfilippo B小鼠被注射媒介物(以与所述处理组相同的时间间隔)，并且以与所述处理组相同的方式牺牲。
生物化学和组织学两者都被应用，以评估本研究的结果。所述生物化学分析包括Naglu活性分析(以测量酶在所述组织中的量)，以及总GAG分析(以测量溶酶体贮积的减少)。对生物化学分析，肝脏和脑是所述受试的组织(图178和图179)。所述组织学分析包括H&E染色，以进行形态学评估(未显示数据)，以及用抗-人Naglu抗体、LAMP、Iba和GFAP(数据未显示Iba和GFAP染色)进行的免疫组织学染色。
本研究使用的抗-人Naglu抗体是小鼠单克隆抗体，其不结合在wt小鼠中内源的鼠科Naglu或者在Sanfilippo B小鼠中变异的Naglu。LAMP-1免疫染色使用抗体与溶酶体相关膜蛋白结合。Iba-1染色使用抗体与离子钙结合接头蛋白质结合，其对于小胶质细胞和巨噬细胞是特异性的。GFAP染色使用抗体与胶质纤维酸性蛋白结合，其对于星形胶质细胞是特异性的。
Naglu免疫荧光的代表性微观图片在图180中示出。图181显示了所述脑的代表性切片示意图。即使Naglu-IGFII被检测进入更接近脑膜的大脑皮层，但是其没有在皮层下区域(例如尾状核、丘脑和白质)发现(未显示数据)。由于所述相同皮层下区域LAMP-1、Iba-1和GFAP的免疫染色确实表明了溶酶体贮积的逆转，可认为，Naglu在所述深部脑区域的阴性免疫染色可能是由于Naglu免疫荧光的敏感性。
Lamp-1免疫染色的代表性微观图片在图182至图186中示出。为了证明蛋白质分布和功效的程度，选择大脑皮层和皮层下区域(尾状核、丘脑和白质，以及小脑皮层)，以进行免疫组织学分析。来自Iba-1和GFAP免疫染色(未显示数据)的结果表明：在LAMP-1免疫染色中所见到的是小胶质细胞和星形胶质细胞变化的组合影响，已报道这两种细胞类型在Sanfilippo B小鼠模型中受影响(Li2002，0hmi2002)，除了神经元以外。由于技术限制，LAMP-1免疫染色不能显示在神经元中的溶酶体贮积。为了更好地观察在神经元中的溶酶体累积，例如液泡和包涵体，通常利用电子显微镜(EM不包括在目前的研究中)。
将被理解的是，细胞类型的识别限制于神经元和胶质细胞。所述神经元通常地被识别，通过相对大和苍白的核(其中包含一个或多个致密染色的核仁)、以及经常可检测的细胞质。所述胶质细胞通常被识别，通过小而致密的核、以及不显眼的细胞质。在所述不同类型的胶质细胞之间的区分(例如星形胶质细胞、小胶质细胞、室管膜细胞和少突胶质细胞)通常的，通过用细胞类型特异性标记物染色进行。
在所述大脑皮层、尾状核、丘脑、白质和小脑中，在IT注射Naglu-IGFII后，除了溶酶体贮积的减少(通过所述LAMP-1免疫染色表现)，Iba-1免疫染色表明了在小胶质细胞(microgial cell)中细胞体积和突起数目的减少，并且GFAP免疫染色表明了在星形胶质细胞中细胞大小和突起的长度/数目的减少(未显示数据)。而且，通过来自与免疫组织化学检测相同区域的脑组织H&E染色(苏木精和曙红)，进行的组织病理学分析表明：在胶质细胞中的液泡在3x IT注射Naglu-IGFII后减少。所有上文提及的结果也意味着Naglu-IGFII注射的剂量相关影响。
Sanfilippo B小鼠在IT注射Naglu-IGFII后的生物化学分析，检测了在脑和肝脏中的Naglu活性。所述Naglu-IGFII的功效通过总GAG在脑和肝脏中的减少证明。免疫组织化学表明了Naglu-IGFII在脑实质中的生物分布。LAMP-1、Iba-1、GFAP的免疫染色和组织病理学分析(通过H&E染色)表现了溶酶体贮积的减少，所述体积和突起的减少(由小胶质细胞和星形胶质细胞)不仅仅在所述脑的大脑皮质区域，而且在所述脑的皮层下区域、白质和小脑皮层。
结论
此外，已经表明，所述融合蛋白，Naglu-IGFII，表现了在体外对底物的酶活性，所述底物具有与Naglu天然底物相似的结构。在体外的细胞吸收研究表明，所述分子被所述M6P/IGFII受体吸收(以独立于M6P糖基化的方式)。内在化的Naglu-IGFII被显示与溶酶体共定位。Naglu-IGFII被显示：在IC注射进入所述Sanfilippo B小鼠后，减少在体内的溶酶体贮积。与rhNaglu和其它Naglu融合体和修饰体相比，在IT注射后，在渗透进入所述wt插管的大鼠脑实质方面，Naglu-IGFII超过了它们。最终，IT注射的Naglu-IGFII入Sanfilippo B小鼠表明了越过所述脑膜良好地广泛分布，并且观察到溶酶体贮积在所述大脑皮层中以及所述皮层下区域中逆转。总之，这些数据表明Naglu-IGFII是治疗Sanfilippo B疾病的候选药物。
实施例27：递送NAGLU-IGFII的毒性、药代动力学(pk)和组织生物分布研究
在小鼠中的概念研究的验证
Naglu(-/-)小鼠的三组(n＝3)注射10uL含260ug Naglu-IGFII(作为单一推注IT腰椎注射)。所述260ug剂量解释为520mg/kg脑重量剂量(小鼠脑＝0.0005kg)。一个组在第0天注射，并在注射后24小时牺牲。一个第二组在第0天和第7天注射，并且在末次注射后24小时牺牲。所述第三组在第0、7和14天组合注射，并在末次注射后24小时牺牲。每个Naglu-IGFII-给药组搭配媒介物对照组，以控制年龄/疾病严重程度。
在所述脑和肝脏中的Naglu酶活性，对于所述三个Naglu-IGFII-给药组是相似的。将rhNaglu酶活性在所述肝脏中与脑进行比较，在所述肝脏中发现超过10-倍的rhNaglu酶活性。这也是被考虑到的：因为在脑和肝脏中rhHNS酶活性水平是可比的，在1-、3-以及6-个月的给药后，在鼠和青少年猴子的所述关键毒性研究中，其中给予Naglu(-/-)小鼠的所述一些部分的rhNaglu剂量可能不是IT递送至肝脏，而是全身地递送。虽然如此，在所述脑中的总GAG水平显示了在3IT注射后的统计-显著性减少(p＜0.05)。在所述肝脏中看到总GAG水平减少的剂量相关趋势，这在接受2或者3次剂量的所述组中是统计-显著性的(p＜0.05)。
在IT注射后Naglu-IGFII的生物分布，很好地观察到其越过脑膜进入所述脑的软组织，但是深部皮下层区域对于抗-Naglu抗体免疫染色阴性。仅在所述给予2或者3次剂量的所述组中，观察到溶酶体活性的减少(通过溶酶体相关膜蛋白(LAMP)免疫染色)。溶酶体活性减少的区域包括大脑皮层和(尾状核、丘脑和白质的)深部皮层下区域。因此，在Naglu-IGFII-给药的动物中，多种免疫染色参数的减少意味着：尽管缺乏抗-NAGLU免疫染色，NAGLU的治疗水平可能存在。减毒的炎症反应，由星形胶质细胞的胶质纤维酸性蛋白(GFAP)免疫染色的减少，以及小胶质细胞/巨噬细胞的离子钙结合接头分子(Iba)染色的减少所证明(仅在接受2或者3次剂量的所述组中)。分析区域包括大脑皮层和(尾状核、丘脑和白质的)深部皮层下区域。
在鼠中研究
选择所述S-D作为啮齿物种，以从毒物学上评估IT-施用Naglu-IGFII。作为结果，16只鼠(每个性别8只)被给药重组Naglu-IGFII，在最大可行剂量(MFD)、以及1/4和1/2的所述MFD(分别为低的-和中间的-剂量水平)，每4天共8剂量。
进行在鼠中的单剂量PK/生物分布研究，以分别测定CSF和血清浓度、或者组织分布(在IT施用至雄性和雌性动物中)。
设计毒理学研究，以评估Naglu-IGFII的IT-L施用的毒理学、以及安全药理学(神经病学的、呼吸系统的和心血管安全性的)的观点，包括在雄性和雌性动物中。在这些研究中的毒物学评估包括临床观察、体重、采食量、临床病理、合适的安全药理学评估(身体检查或者心电描记法)、总体组织和微观评估。收集有限数量的CSF和血清样本，并进行Naglu-IGFII分析，并作为所述测试制品的抗体。Naglu-IGFII组织分布和亚细胞定位的定量，分别通过酶活性分析和免疫组织化学。另外，选定的研究包括恢复期，以评估任何指出的显著毒物学发现的可逆性、或者潜在延迟外观。
在猴子中的研究
选择食蟹猴以作为非啮齿动物物种，以从毒物学角度评估IT施用Naglu-IGFII，由于它们与人类遗传学和解剖学的相似性，因此被认为是人类最相关的物种。假定Sanfilippo综合症类型B临床试验的所述预计患者人口为儿科的，在青少年食蟹猴中进行慢性6-个月毒理学研究，特征为进行鞘内药物递送设备(IDDD)施用Naglu-IGFII。青少年食蟹猴在研究起始通常小于1年的年龄(约7-9个月龄)，并且在研究起始称重在900至1,500之间。从1-个月重复剂量青少年食蟹猴研究获得的数据指导了所述剂量水平的选择、以及所述6-个月青少年食蟹猴研究的设计。所述重复剂量毒理学研究被设计，以模拟在1至6个月的时间段内，所述预期的临床途径(IT-L推注)和施用频率(每隔一周，EOW)。
如上文所描述的，设计毒理学研究，以评估IT-L施用Naglu-IGFII，从毒理学和安全药理学角度(神经学的、呼吸系统的和心血管安全性的)，包括在雄性和雌性动物中。在这些研究中的毒物学评估包括临床观察、体重、采食量、临床病理、合适的安全性药理学评估(通过身体检查或心电描记法)、总组织和微观评估。收集有限数量的CSF和血清样本，并进行Naglu-IGFII分析，以及作为对所述测试制品的抗体。Naglu-IGFII组织分布和亚细胞定位，分别通过酶活性分析和免疫组织化学定量。另外，选定的研究包括恢复期，以评估任何指出的显著毒物学发现的可逆性或者潜在延迟外观。
实施例28：NAGLU-IGFII的EOW鞘内施用
设计这个实施例，测定在所述Naglu-/-小鼠模型中，IT-腰部给药EOW，持续6次注射(3个月的研究)的可行性。这个给药方案与每周给药相比，更加地临床相关。
根据下述的实验设计，研究8周年老的Naglu-/-雄性和雌性小鼠：
表49：Naglu-IGFII的EOW IT递送的实验设计
生理学研究，包括进行：在肝脏、脑和血清中的Naglu活性分析，在血清中的抗-Naglu抗体分析，以及在肝脏和脑的BCA分析。组织学研究，包括进行：对脑、脊髓和肝脏的Naglu IHC，以及对脑和脊髓的Lamp染色。
收集脑、脊髓和肝脏，并固定在10％NBF中。制备5μm石蜡切片，以进行组织学染色。使用Naglu的免疫组织化学(IHC)染色，以检测所述注射蛋白质的细胞吸收。使用H&E染色，以观察形态学变化。LAMP(一种溶酶体活性和疾病状态的指示)，GFAP和Iba-1(激活星形胶质细胞和小胶质细胞的两种CNS病理学标记物)，被用于评估组织病理学的改善。
脑、脊髓和肝脏的媒介物和Naglu-IGFII处理小鼠的Naglu免疫染色表明，在所述脑和脊髓中，注射的Naglu在脑膜(M)中仅通过IHC检测到，并且在任何其它区域没有检测到Naglu阳性染色(图187)。在所述肝脏中窦状腺细胞为Naglu阳性，并且在肝细胞(H)中没有发现Naglu吸收。
媒介物和Naglu-IGFII处理小鼠的肝脏和脊髓的LAMP免疫染色和H&E染色表明，与所述媒介物动物相比，LAMP染色在Naglu处理的整个肝脏和脊髓中都减少。H&E染色显示，在肝脏中，在处理组中的细胞液泡形成显著减少(与媒介物处理动物相比)(图188和图189)。
媒介物和Naglu-IGFII处理小鼠的H&E染色表明，在6次每隔一周，IT注射Naglu-IGFII，持续3个月后，在所述脑中形态改善。在所述处理的脑中，在所有检验区域，所述细胞液泡形成(箭头)减少(与所述媒介物组相比)(图190)。
在6次IT Naglu注射，持续3个月后，在多个脑区域的LAMP IHC表明，与所述媒介物处理组相比，Naglu IT施用至SFB小鼠，导致溶酶体活性在所有检测区域减少(通过LAMP免疫染色显示)(图190)。这种减少的特征在于，LAMP阳性细胞数量减少，较小的细胞体积和较轻的染色。与其他脑区域相比，在所述脑和脑干中发现显著的较少，其定位于(靠近脊髓)脑的尾状核部分。在所述深部区域(包括白质、海马和丘脑)也发现明显的减少。
在6次IT Naglu注射，持续3个月后，多个脑区域的Iba IHC揭示了小胶质细胞的活化(图191)。与媒介物处理组相比，在Naglu处理组中观察到：阳性细胞的数量和染色强度没有减少。尽管如此，在所有检测的脑区域中，阳性小胶质细胞的细胞形态随细胞大小的减少而改变，与在所述媒介物组中大的和液泡化的相比(插入物)。
在6次IT Naglu注射，持续3个月后，在多个脑区域中的GFAP IHC揭示了星形胶质细胞的活化(图192)。与所述媒介物处理组相比，GFAP阳性染色在所述小脑和脑干中减少，并且在其它检验区域轻微减少。
关于细胞吸收，这些数据表明，在所述脑和脊髓中，仅在6次每隔一周Naglu IGFII IT注射持续3个月以后，在meningial细胞中检测到Naglu。在所述脑和脊髓的其它区域，Naglu通过IHC检测不到。在所述肝脏中，在窦状腺细胞中发现Naglu的阳性染色。
在所述脑和脊髓中，在6次每隔一周的Naglu-IGFII，持续3个月以后，在整个所述脑和脊髓中可见到组织病理学改善，尽管注射的Naglu通过IHC检测不到。H&E染色表明了在所有检测脑区域中细胞液泡化的减少。LAMP染色在整个处理脊髓和在所有被评估脑区域(包括白质、海马和作为深部脑区域的丘脑)中减少，并且(在Naglu-IGFII处理组中)在所述小脑和脑干中显著减少。星形胶质细胞GFAP染色减少的染色模式，与LAMP染色一致，但没有如LAMP一样剧烈地减少。Iba-1染色显示了，在所有检测脑区域中，小胶质细胞的细胞体积减小。在所述肝脏中，H&E染色表明了，细胞液泡化减少，并且LAMP染色显著减少(在所述Naglu处理组中)。
实施例29：Sanfilippo B患者的治疗
通过例如IT递送的直接CNS施用，可以被用来有效地治疗Sanfilippo综合症类型B(Sanfilippo B)患者。这个实施例解释了：设计了多剂量递增研究以评估多达3剂量水平，每隔一周(EOW)，持续40周的Naglu-IGFII和/或rhNaglu施用的安全性(通过鞘内药物递送设备(IDDD)至SanfilippoB综合症的患者)。适合于人类治疗的多种示例性鞘内药物递送设备在图94-97中进行了描述。
将招募多达20例患者：
队列1∶5例患者(最低剂量)
队列2∶5例患者(中剂量)
队列3∶5例患者(最高剂量)
5例患者被随机分配至没有治疗组。
为本研究选取的患者是根据一下标准的内容：
在Sanfilippo B患者中测定了：通过IT注射施用Naglu-IGFII(40周)的递增剂量的安全性。此外，评估了：Naglu-IGFII和/或rhNaglu对认知功能的临床活性、以及在血清中单一和重复剂量药代动力学、以及在脑脊髓液(CSF)中的浓度。
通常地，治疗有效量的Naglu-IGFII和/或rhNaglu以规则的间隔鞘内施用，根据所述疾病影响的性质和程度、以及进行性的基础。如本文使用的，以某“间隔”施用，表明了：所述治疗有效量是定期地施用(根据一次性剂量进行区别)。所述间隔根据标准临床技术决定。在一些实施方案中，Naglu-IGFII和/或rhNaglu鞘内施用的频率为：两月一次、每月一次、每月两次、三周一次、两周一次、每周一次、一周两次、每周三次或者每天一次。单个个体的所述施用间隔不需要被固定，而是可以根据所述个体的需要随时间改变。例如，在疾病或者压力的时候，如果抗-Naglu抗体已经存在或者增加，或者如果疾病症状恶化，在所述给药之间的间隔可以缩短。
虽然本文描述的某复合物、组合物和方法已经根据某实施方案进行特定的描述，但是所述实施例仅用于解释本发明的复合物，并且不用于限制必须与其相同。
所述冠词“a”和“an”，如本文在说明书中和权利要求书中使用的，除非清楚地表明与之相反，应该被理解为包括其复数形式。在某组的一个或多个成员之间包括“或者”的权利要求或者描述，被认为：如果一个、一个或多个、或所有组成员存在、被采用或者以其它方式与给定的产品或过程相关，那么就是符合的；除非从上下文中表示相反或者其它方式明显地指出。本发明包括这样的实施方案：其中所述组的只有一个成员存在、或者被采用、或者以其它方式与给定的产品或过程相关。本发明也包括这样的实施方案：其中多个、或者整个组成员存在、或者被采用、或者以其他方式与给定的产品或过程相关。而且，应该理解，本发明包括来自一条或多条所列出的权利要求所有的变型、组合、以及置换，其中一种或多种限制、元素、条款、描述性术语等，其根据所述相同权利基础(或者相关、任意其它权利要求)被引入到另一权利要求，除非其它方式指出或者除非其对于本领域技术人员将明显地出现矛盾或者不一致。当元素以列表形式呈现(例如在Markush基团中或者类似的形式)时，应该理解，所述元素的每个亚组也是包括在内地被公开，并且任何元素可以从所述组删除。应该理解，一般而言，当本发明、或者本发明的某些方面，被指出包括特定的元素、特征等，那么本发明或者本发明的方面的某些实施方案、或者基本含有这些元素、特征等。为了简化这些实施方案，本文没有在每个案例中具体提出这么多的单词。应该理解，本发明的任意实施方案或者方面可以被清楚地从所述权利要求排出，无论所述具体的排除是否在本说明书中叙述。本文所引用的所述公开文本、网址和其它参考材料，为了描述本发明的背景、以及提供关于其实践的其它细节；都通过参考的方式引入本文。

Claims (116)

1.包含溶酶体酶替代酶的组合物在药物制备中的用途，其中向正患有或者易患伴有溶酶体酶水平或者活性降低的溶酶体贮积症的受试者，鞘内施用所述药物，其中施用的所述药物中所述替代酶浓度大于5mg/ml，其中所述组合物包括不超过50mM磷酸盐。
2.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物包括不超过30mM磷酸盐。
3.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物包括不超过10mM磷酸盐。
4.如权利要求1所述的用途，其中所述替代酶的浓度大于10
mg/ml。
5.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物进一步包括下述的一种或多种：(i)缓冲剂、(ii)表面活性剂、或者(iii)渗透压调节剂。
6.如权利要求5所述的用途，其中所述组合物进一步包括表面活性剂。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述表面活性剂的浓度为0.001－0.5％。
8.如权利要求1的用途，其中所述组合物具有3.0-8.0的pH。
9.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物以小于5mL的单剂量体积施用。
10.如权利要求1所述的用途，其中所述组合物以小于3mL的单剂量体积施用。
11.如权利要求1所述的用途，其中所述鞘内施用的所述组合物在所述受试者中不产生严重的不良反应。
12.如权利要求1所述的用途，其中所述鞘内施用的所述组合物不产生适应性T-细胞介导的免疫应答。
13.如权利要求1所述的用途，其中所述施用不包括在被治疗的所述受试者中的免疫耐受诱导。
14.如权利要求13所述的用途，其中所述施用不包括使用T-细胞免疫抑制剂对所述受试者的预处理或者预调节。
15.如权利要求1所述的用途，其中所述鞘内施用使得在一种或多种脑、脊髓和外周器官组织中达到溶酶体酶正常水平或者活性的至少10％。
16.如权利要求15所述的用途，其中所述一种或多种脑组织包括menengal组织。
17.如权利要求16所述的用途，其中所述menengal组织选自：软脑膜、硬脑膜和蛛网膜组织。
18.如权利要求17所述的用途，其中所述一种或多种脑组织包括大脑组织。
19.如权利要求18所述的用途，其中所述大脑组织是大脑的表面或浅部组织。
20.如权利要求19所述的用途，其中所述大脑的表面或浅部组织选自：软脑膜组织、大脑皮质带状组织、在大脑表面距表面4mm以内的组织、及其组合。
21.如权利要求18所述的用途，其中所述大脑组织是所述大脑的深部组织。
22.如权利要求21所述的用途，其中所述大脑的深部组织选自：在大脑皮质丝带以下的组织、在所述大脑表面距所述表面以下4mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下6mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下10mm的组织、及其组合。
23.如权利要求15所述的用途，其中所述一种或多种脑组织包括小脑组织。
24.如权利要求23所述的用途，其中所述小脑组织选自：分子层组织、浦肯野氏细胞层组织、颗粒细胞层组织、及其组合。
25.如权利要求23所述的用途，其中所述小脑组织是所述小脑的深部组织。
26.如权利要求25所述的用途，所述小脑的深部组织选自：浦肯野氏细胞层组织、颗粒细胞层组织、小脑深部白质组织、和小脑深部核组织。
27.如权利要求15所述的用途，其中所述一种或多种脑组织包括脑干组织。
28.如权利要求27所述的用途，其中所述脑干组织选自：脑干白质组织和/或脑干核组织。
29.如权利要求15所述的用途，其中所述一种或多种脊髓组织是脊髓的表面或浅部组织。
30.如权利要求29所述的用途，其中所述脊髓的表面或浅部组织选自：软脑膜、束状的白质、和距所述脊髓表面4mm以内的组织。
31.如权利要求15所述的用途，其中所述脊髓的所述一种或多种组织是所述脊髓的深部组织。
32.如权利要求31所述的用途，其中所述脊髓的所述深部组织选自：脊髓灰质和包含室管膜细胞的深部组织，以及在所述脊髓表面距所述表面以下4mm的组织。
33.如权利要求15所述的用途，其中所述一种或多种脑组织包括表面或者浅部组织。
34.如权利要求33所述的用途，其中所述表面或者浅部组织选自：软脑膜、硬脑膜、和menengal的蛛网膜组织、软脑膜组织、大脑皮质带状组织、在所述大脑的表面距所述表面4mm以内的组织、及其组合。
35.如权利要求15所述的用途，其中所述组织包括深部组织。
36.如权利要求35所述的用途，其中所述深部脑组织选自：所述大脑的深部白质、所述脊髓的深部灰质、胼胝体、脑室周围组织、丘脑、海马伞、在大脑皮质丝带以下的组织、在大脑表面距所述表面以下4mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下6mm的组织、在所述大脑表面距所述表面以下10mm的组织、浦肯野氏细胞层、颗粒细胞层组织、小脑深部白质组织、以及小脑深部核组织、及其组合。
37.如权利要求15-36任意一项所述的用途，其中治疗有效剂量的范围从0.005mg/kg脑重量至100mg/kg脑重量。
38.如权利要求15-36任意一项所述的用途，其中治疗有效剂量大于1mg/kg脑重量。
39.如权利要求15-36任意一项所述的用途，其中治疗有效剂量大于10mg/kg脑重量。
40.如权利要求15-36任意一项所述的用途，其中治疗有效剂量大于30mg/kg脑重量。
41.如权利要求15-36任意一项所述的用途，其中施用间隔为每两周一次。
42.如权利要求15-36任意一项所述的用途，其中施用间隔为每月一次。
43.如权利要求15-36任意一项所述的用途，其中施用间隔为每两月一次。
44.如权利要求1所述的用途，其中所述溶酶体贮积症选自：天冬氨酰葡萄糖胺尿症，胆固醇脂沉积病，沃尔曼病，胱氨酸病，Danon病，法布里病，Farber脂肪肉芽肿病，Farber病，墨角藻糖苷酶缺乏病，半乳糖唾液酸沉积症类型I/II，戈谢病类型I/II/III，球细胞脑白质营养不良，克拉伯病，糖原贮积症II，庞贝氏症，GM1-神经节苷脂沉积症类型I/II/III，泰-萨克斯病，桑德霍夫病，GM2-神经节苷脂沉积症，α-甘露糖苷过多症类型I/II、β-甘露糖苷过多症，异染性脑白质营养不良，粘脂糖症类型I，唾液酸沉积症类型I/II，粘脂糖症类型II/III，I-细胞病，粘脂糖症类型IIIC，黏多糖贮积症类型I，黏多糖贮积症类型II，亨特综合症，黏多糖贮积症类型IIIA，Sanfilippo综合症类型A、B或C，黏多糖贮积症类型IIIB，黏多糖贮积症类型IIIC，黏多糖贮积症类型IIID，黏多糖贮积症类型IVA，莫基奥综合症，黏多糖贮积症类型IVB，黏多糖贮积症类型VI，黏多糖贮积症类型VII，Sly综合症，黏多糖贮积症类型IX，多种硫酸酯酶缺乏症，神经元蜡样脂褐质沉积症，CLN1Batten病，CLN2Batten病，尼曼匹克病类型A/B，尼曼匹克病类型C1，尼曼匹克病类型C2，致密性成骨不全症，Schindler病类型I/II，戈谢病和唾液酸贮积病。
45.如权利要求44所述的用途,其中所述GM2-神经节苷脂沉积症为GM2-神经节苷脂沉积症类型I或GM2-神经节苷脂沉积症类型II。
46.如权利要求44所述的用途，其中所述溶酶体贮积症选自：亨特综合症、异染性脑白质营养不良(MLD)病、Sanfilippo综合症类型A、Sanfilippo综合症类型B、和球细胞脑白质营养不良(GLD)。
47.如权利要求46所述的用途，其中所述替代酶选自重组艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶(I2S)、芳基硫酸酯酶A(ASA)、乙酰肝素N-硫酸酯酶(HNS)、α-N-乙酰葡糖胺糖苷酶(Naglu)和β-半乳糖苷酶(GLC)。
48.如权利要求47所述的用途，其中所述替代酶含有甘露糖-6-磷酸(M6P)残基。
49.如权利要求48所述的用途，其中所述替代酶是包含溶酶体靶向部分的融合蛋白。
50.如权利要求49所述的用途，其中所述替代酶被递送到神经元、胶质细胞、血管周细胞和/或脑膜细胞。
51.如权利要求50所述的用途，其中所述替代酶进一步被递送到脊髓中的神经元。
52.如权利要求51所述的用途，其中所述鞘内施用进一步导致在外周靶组织中的所述替代酶的全身递送。
53.如权利要求52所述的用途，其中所述外周靶组织选自：肝脏、肾脏、脾脏和/心脏。
54.如权利要求44-53任一项所述的用途,其中所述鞘内施用导致所述替代酶在脑靶组织、脊髓神经元和/或外周靶组织中的溶酶体定位。
55.如权利要求54所述的用途，其中所述鞘内施用导致在所述脑靶组织、脊髓神经元和/或外周靶组织中GAG贮存的减少。
56.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少20％。
57.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少40％。
58.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少50％。
59.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少60％。
60.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少80％。
61.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少90％。
62.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少1倍。
63.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少1.5倍。
64.如权利要求55所述的用途，其中所述GAG贮存与对照相比，至少减少2倍。
65.如权利要求55所述的用途，其中所述鞘内施用导致在神经元中液泡化的减少。
66.根据权利要求65所述的用途，其中所述神经元包括浦肯野细胞。
67.如权利要求55所述的用途，其中所述鞘内施用导致在所述脑靶组织、脊髓神经元和/或外周靶组织中所述替代酶活性的增加。
68.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加1-倍。
69.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加2-倍。
70.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加3-倍。
71.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加4-倍。
72.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加5-倍。
73.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加6-倍。
74.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加7-倍。
75.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加8-倍。
76.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加9-倍。
77.如权利要求67所述的用途，其中所述酶活性与对照相比，至少增加10-倍。
78.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少10nmol/hr/mg。
79.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少20nmol/hr/mg。
80.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少40nmol/hr/mg。
81.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少50nmol/hr/mg。
82.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少60nmol/hr/mg。
83.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少70nmol/hr/mg。
84.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少80nmol/hr/mg。
85.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少90nmol/hr/mg。
86.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少100nmol/hr/mg。
87.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少150nmol/hr/mg。
88.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少200nmol/hr/mg。
89.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少250nmol/hr/mg。
90.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少300nmol/hr/mg。
91.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少350nmol/hr/mg。
92.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少400nmol/hr/mg。
93.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少450nmol/hr/mg。
94.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少500nmol/hr/mg。
95.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少550nmol/hr/mg。
96.如权利要求67所述的用途，其中所述增加的酶活性为至少600nmol/hr/mg。
97.如权利要求78所述的用途，其中所述酶活性在腰区中增加。
98.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少500nmol/hr/mg。
99.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少600nmol/hr/mg。
100.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少700nmol/hr/mg。
101.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少800nmol/hr/mg。
102.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少900nmol/hr/mg。
103.如权利要求98所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少1000nmol/hr/mg。
104.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少1500nmol/hr/mg。
105.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少2000nmol/hr/mg。
106.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少3000nmol/hr/mg。
107.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少4000nmol/hr/mg。
108.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少5000nmol/hr/mg。
109.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少6000nmol/hr/mg。
110.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少7000nmol/hr/mg。
111.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少8000nmol/hr/mg。
112.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少9000nmol/hr/mg。
113.如权利要求97所述的用途，其中在所述腰区中所述增加的酶活性为至少10,000nmol/hr/mg。
114.如权利要求97所述的用途，其中所述溶酶体贮积症伴有周边症状，并且所述治疗包括进一步向所述受试者静脉施用所述替代酶。
115.如权利要求114所述的用途，其中所述静脉施用没有比每月施用更频繁。
116.如权利要求115所述的用途，其中所述溶酶体贮积症伴有周边症状，并且其中不向所述受试者静脉施用所述替代酶。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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EP2593131B1 (en) 2010-06-25 2019-08-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for cns delivery of iduronate-2-sulfatase
LT2588130T (lt) 2010-06-25 2016-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Terapinės priemonės pristatymas cns
KR102537084B1 (ko) 2010-06-25 2023-05-26 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 아릴설파타제 a의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
WO2012101671A1 (en) * 2011-01-25 2012-08-02 Jcr Pharmaceuticals Co., Ltd. Method for production of human recombinant iduronate 2-sulfatase
PT2717917T (pt) 2011-07-05 2016-07-27 Bioasis Technologies Inc Conjugados de anticorpos p97
US9579366B2 (en) * 2011-10-12 2017-02-28 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Recombinant human NaGlu protein and uses thereof
EP2793933B1 (en) * 2011-12-23 2019-04-17 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Treatment of cognitive impairment of hunter syndrome by intrathecal delivery of iduronate-2-sulfatase
EP2793922B1 (en) 2011-12-23 2019-10-30 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Stable formulations for cns delivery of arylsulfatase a
ES2647082T3 (es) * 2012-07-31 2017-12-19 Bioasis Technologies Inc Proteínas desfosforiladas de la enfermedad de depósito lisosómico y métodos de uso de las mismas
MX2015008875A (es) 2013-01-09 2015-10-22 Shire Human Genetic Therapies Metodos para la purificacion de arilsulfatasa a.
CA2901978A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Valerion Therapeutics, Llc Methods and compositions for treatment of pompe disease
CA2906003C (en) 2013-03-13 2021-07-06 Bioasis Technologies Inc. Fragments of p97 and uses thereof
CN105377039A (zh) * 2013-05-15 2016-03-02 明尼苏达大学董事会 腺相关病毒介导的基因向中枢神经系统转移
BR112016017933A2 (pt) 2014-02-03 2017-10-10 Bioasis Technologies Inc ?proteínas de fusão p97?
US10392605B2 (en) 2014-02-19 2019-08-27 Bioasis Technologies Inc. P97-IDS fusion proteins
CA2943890A1 (en) 2014-05-01 2015-11-05 Bioasis Technologies, Inc. P97-polynucleotide conjugates
EA201790178A1 (ru) * 2014-08-11 2017-07-31 Шир Хьюман Дженетик Терапис, Инк. Пептиды, несущие маннозо-6-фосфат, слитые с лизосомальным ферментом
EP3200816A1 (en) 2014-09-29 2017-08-09 Alexion Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating mucopolysaccharidosis iiib (mpsiiib)
US10945951B2 (en) * 2014-12-19 2021-03-16 Biogen Ma Inc. Apparatus for compound dispersion
AU2016256895B2 (en) 2015-05-07 2022-05-26 Takeda Pharmaceutical Company Limited Glucocerebrosidase gene therapy for parkinson's disease
GB201508025D0 (en) 2015-05-11 2015-06-24 Ucl Business Plc Fabry disease gene therapy
KR20170004814A (ko) * 2015-07-02 2017-01-11 주식회사 녹십자 헌터증후군 치료제
WO2017062666A2 (en) * 2015-10-06 2017-04-13 Patricia Dickson Enzyme replacement therapy for mucopolysaccharidosis iiid
US10123969B2 (en) 2015-10-15 2018-11-13 Wisconsin Alumni Research Foundation Osmotic enhancement of drug/therapeutic delivery to the brain following infusion or injection into the cerebrospinal fluid
AU2016372035B2 (en) * 2015-12-15 2023-03-30 Genzyme Corporation Adeno-associated viral vectors for treating mucolipidosis type ii
EP3397270B1 (en) * 2015-12-30 2024-04-17 Green Cross Corporation Compositions for use in the treatment of hunter syndrome
CA3014909A1 (en) * 2016-02-17 2017-08-24 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for cns delivery of arylsulfatase a
EP3452104A1 (en) 2016-04-15 2019-03-13 The Trustees of The University of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
US11957713B2 (en) 2016-10-14 2024-04-16 Children's Medical Center Corporation Compositions and methods for treating diseases and disorders of the central nervous system
EP3571310A4 (en) 2017-01-17 2020-12-16 Children's Medical Center Corporation COMPOSITIONS AND METHODS OF DIAGNOSIS AND TREATMENT OF PEROXISOMAL DISEASES
GB201709459D0 (en) 2017-06-14 2017-07-26 Intrabio Ltd Treatment for migraine
JP7188944B2 (ja) * 2017-09-07 2022-12-13 Ｊｃｒファーマ株式会社 水性医薬組成物
EP3684938A1 (en) 2017-09-22 2020-07-29 The Trustees of the University of Pennsylvania Gene therapy for treating mucopolysaccharidosis type ii
TW201925236A (zh) 2017-10-02 2019-07-01 美商戴納立製藥公司 包含酶替代療法酶之融合蛋白
RU2763425C2 (ru) 2017-10-18 2021-12-29 Интрабио Лимитед Терапевтические агенты для нейродегенеративных заболеваний
EP3697406A1 (en) 2017-10-18 2020-08-26 IntraBio Ltd Therapeutic agents for improved mobility and cognitive function and for treating neurodegenerative diseases and lysosomal storage disorders
BR112020012637A2 (pt) 2017-12-19 2020-12-01 Shire Human Genetic Therapies, Inc arilsulfatase a purificada e composições da mesma
RS65663B1 (sr) 2018-02-15 2024-07-31 Intrabio Ltd Acetil leucin za upotrebu u lečenju sindroma nemirnih nogu
JP2020002130A (ja) 2018-06-25 2020-01-09 Ｊｃｒファーマ株式会社 蛋白質含有水性液剤
BR112021017203A2 (pt) 2019-03-02 2021-12-14 Intrabio Ltd Leucina, acetil leucina e análogos relacionados para o tratamento de doenças
MA56386A (fr) 2019-06-28 2022-05-04 Intrabio Ltd Polythérapie comprenant de l'acétyl-leucine et du miglustat
US20230051742A1 (en) 2020-01-13 2023-02-16 Intrabio Ltd. Treatment of late-onset neurodegenerative diseases in heterozygous npc1 gene mutation carriers
EP4153161A1 (en) 2020-05-22 2023-03-29 IntraBio Ltd The combination of acetyl leucine and 4-aminopyridine or acetazolamide for treating ataxia
WO2024102808A2 (en) * 2022-11-09 2024-05-16 Gmp Biotechnology Limited Compositions and methods for cns diseases
WO2024176112A1 (en) 2023-02-21 2024-08-29 Takeda Pharmaceutical Company Limited Large scale production of recombinant arylsulfatase a and compositions thereof

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4743265A (en) * 1986-04-23 1988-05-10 Dij Catheter Corp Articulated catheter placement device
US5863782A (en) 1995-04-19 1999-01-26 Women's And Children's Hospital Synthetic mammalian sulphamidase and genetic sequences encoding same
US6118045A (en) 1995-08-02 2000-09-12 Pharming B.V. Lysosomal proteins produced in the milk of transgenic animals
DK0900569T3 (da) 1997-08-22 2003-01-27 Seikagaku Kogyo Co Ltd Terapeutisk middel til behandling af herniaramt intervertebral diskus
DK1137762T3 (da) 1998-12-07 2009-02-02 Genzyme Corp Behandling af Pompes sygdom
US6217552B1 (en) * 1999-03-01 2001-04-17 Coaxia, Inc. Medical device for selective intrathecal spinal cooling in aortic surgery and spinal trauma
US20020052311A1 (en) 1999-09-03 2002-05-02 Beka Solomon Methods and compostions for the treatment and/or diagnosis of neurological diseases and disorders
US6642038B1 (en) 1999-09-14 2003-11-04 Genzyme Glycobiology Research Institute, Inc. GlcNAc phosphotransferase of the lysosomal targeting pathway
US20020099025A1 (en) 1999-12-30 2002-07-25 Heywood James A. Treatment of neurological disorders
US7629309B2 (en) 2002-05-29 2009-12-08 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
CA2445577C (en) 2001-04-30 2012-07-03 Symbiontics, Inc. Subcellular targeting of therapeutic proteins
US20040005309A1 (en) 2002-05-29 2004-01-08 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US7560424B2 (en) 2001-04-30 2009-07-14 Zystor Therapeutics, Inc. Targeted therapeutic proteins
EP1446007A4 (en) 2001-10-16 2005-12-07 Zystor Therapeutics Inc TECHNIQUES AND COMPOSITIONS FOR TARGETING SUBGLYCOSYLATED PROTEINS THROUGH THE HEMATO-ENCEPHALIC BARRIER
US20030072761A1 (en) 2001-10-16 2003-04-17 Lebowitz Jonathan Methods and compositions for targeting proteins across the blood brain barrier
ES2367257T3 (es) * 2002-04-25 2011-10-31 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Tratamiento de deficit de alfa-galactosidasa a.
CA2487815A1 (en) 2002-05-29 2003-12-11 Symbiontics, Inc. Targeted therapeutic proteins
US20040248262A1 (en) 2003-01-22 2004-12-09 Koeberl Dwight D. Constructs for expressing lysomal polypeptides
US20050026823A1 (en) * 2003-06-20 2005-02-03 Biomarin Pharmaceutical Inc. Use of the chaperone receptor-associated protein (RAP) for the delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
WO2005002515A2 (en) 2003-06-20 2005-01-13 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
US7442372B2 (en) * 2003-08-29 2008-10-28 Biomarin Pharmaceutical Inc. Delivery of therapeutic compounds to the brain and other tissues
AU2005209360B2 (en) 2004-01-30 2009-06-25 Takeda Pharmaceutical Company Limited Production and purification of recombinant arylsulfatase A
WO2005074888A2 (en) 2004-02-03 2005-08-18 Biodelivery Sciences International, Inc. Replacement enzyme cochleates
JP2007523648A (ja) 2004-02-06 2007-08-23 バイオマリン ファーマシューティカル インコーポレイテッド 高リン酸化リソソーム酵素製剤及びそれらの使用
US20050244400A1 (en) 2004-02-10 2005-11-03 Zystor Therapeutics, Inc. Acid alpha-glucosidase and fragments thereof
US20050208090A1 (en) * 2004-03-18 2005-09-22 Medtronic, Inc. Methods and systems for treatment of neurological diseases of the central nervous system
EP1889628B1 (en) 2005-05-11 2013-12-11 JCR PHARMACEUTICALS Co., LTD. Lipid liposome composition
AU2006254796B2 (en) 2005-06-08 2012-08-16 Amicus Therapeutics, Inc. Treatment of CNS disorders associated with mutations in genes encoding lysosomal enzymes
AR059089A1 (es) 2006-01-20 2008-03-12 Genzyme Corp Administracion intraventricular de una enzima para enfermedades de almacenamiento lisosomal
SI2628746T1 (sl) 2006-04-04 2019-04-30 Chiesi Farmaceutici S.P.A. Proces za koncentriranje polipeptida
GB0611463D0 (en) 2006-06-09 2006-07-19 Novartis Ag Organic compounds
WO2008070769A1 (en) * 2006-12-06 2008-06-12 Medtronic, Inc. Intrathecal catheter
US20090041741A1 (en) 2007-03-06 2009-02-12 Saint Louis University Modified enzyme and treatment method
EP2174661B1 (en) * 2007-06-29 2012-12-19 National University Corporation Nagoya University Agent for improving neuropathic pain
WO2009017005A1 (ja) 2007-07-27 2009-02-05 Sharp Kabushiki Kaisha 移動局装置、基地局装置、通信システム及びプログラム
AU2008287340A1 (en) 2007-08-15 2009-02-19 Amunix, Inc. Compositions and methods for modifying properties of biologically active polypeptides
CA2707483A1 (en) 2007-11-30 2009-06-11 Wolfgang Fraunhofer Protein formulations and methods of making same
US7722865B2 (en) 2008-01-18 2010-05-25 Biomarin Pharmaceutical Inc. Manufacture of active highly phosphorylated human lysosomal sulfatase enzymes and uses thereof
EP2279210B1 (en) 2008-05-07 2017-04-12 BioMarin Pharmaceutical Inc. Lysosomal targeting peptides and uses thereof
US8436489B2 (en) 2009-06-29 2013-05-07 Lightsail Energy, Inc. Compressed air energy storage system utilizing two-phase flow to facilitate heat exchange
LT2588130T (lt) 2010-06-25 2016-12-12 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Terapinės priemonės pristatymas cns
WO2011163651A2 (en) 2010-06-25 2011-12-29 Shire Human Genetic Therapies, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS FOR CNS DELIVERY OF β-GALACTOCEREBROSIDASE
ES2895655T3 (es) 2010-06-25 2022-02-22 Shire Human Genetic Therapies Métodos y composiciones para la administración al SNC de iduronato-2-sulfatasa
KR20130043166A (ko) 2010-06-25 2013-04-29 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 산필리포 증후군 b형의 치료
EP2593131B1 (en) 2010-06-25 2019-08-21 Shire Human Genetic Therapies, Inc. Methods and compositions for cns delivery of iduronate-2-sulfatase
CN103260637B (zh) 2010-06-25 2016-04-06 夏尔人类遗传性治疗公司 乙酰肝素n-硫酸酯酶cns递送的方法和组合物
KR102537084B1 (ko) 2010-06-25 2023-05-26 샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크. 아릴설파타제 a의 cns 전달을 위한 방법들 및 조성물들
JP2012062312A (ja) 2010-08-19 2012-03-29 Yoshikatsu Eto ハンター症候群の治療剤

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
INTRATHECAL DELIVERY OF PROTEIN THERAPEUTICS TO TREAT GENETIC DISEASES INVOLVING THE CNS;Zahra Shahrokh 等;《Injectable Drug Delivery 2010: Formulations Focus》;20100531;16-20 *
Torayuki Okuyama 等."Japan Elaprase ？;Treatment (JET) study: Idursulfase enzyme replacement therapy in adult patients with attenuated Hunter syndrome (Mucopolysaccharidosis II, MPS II).《Molecular Genetics and Metabolism》.2009,第99卷第18-25页. *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2011163648A8 (en) 2013-01-03
KR20210095733A (ko) 2021-08-02
AU2017202349B2 (en) 2019-03-14
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KR102283671B1 (ko) 2021-07-30
AU2011270668B2 (en) 2017-01-12
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RU2012154831A (ru) 2014-07-27
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IL291554A (en) 2022-05-01
KR102007044B1 (ko) 2019-08-02
KR20190092592A (ko) 2019-08-07
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CY1124154T1 (el) 2022-05-27
EP3103469A1 (en) 2016-12-14
KR20210014221A (ko) 2021-02-08
JP2013534526A (ja) 2013-09-05
AU2019204056A1 (en) 2019-07-04
KR20220002738A (ko) 2022-01-06
KR102211960B1 (ko) 2021-02-05
AU2021254564A1 (en) 2021-11-18
EP3103469B1 (en) 2020-12-09
WO2011163648A1 (en) 2011-12-29
PL3103469T3 (pl) 2021-09-06
JP6045491B2 (ja) 2016-12-14
EP2588130A4 (en) 2014-01-15
RU2626514C2 (ru) 2017-07-28
CN103096918A (zh) 2013-05-08
ZA201300671B (en) 2018-01-31
CA2803166A1 (en) 2011-12-29
AU2019204056B2 (en) 2021-07-22
AU2011270668A1 (en) 2013-02-14
DK2588130T3 (en) 2016-10-24

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