KR102283671B1 - 치료제들의 cns 전달 - Google Patents

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로렌스 찰나스
토마스 맥카울리
테레사 레아 라이트
리차드 파이퍼
자흐라 샤로크
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샤이어 휴먼 지네틱 테라피즈 인크.
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Abstract

본 발명은 중추신경계 (CNS)로 치료제들의 직접적인 전달을 위한 효과적이고 덜 침습적인 접근법을 제공한다. 일정 구현예들에서, 본 발명은 리소좀 효소의 감소된 수준 또는 활성과 연관된 리소좀 축적병을 앓거나 이에 취약한 개체에게 리소좀 효소의 대체 효소를 포함하는 조성물을 경막내로 투여하는 단계를 포함하는 방법들을 제공한다.

Description

치료제들의 CNS 전달 {CNS delivery of therapeutic agents}
본 발명은 중추신경계 (CNS)로 치료제들의 직접적인 전달을 위한 효과적이고 덜 침습적인 접근법을 제공한다.
효소 대체 요법 (Enzyme replacement therapy, ERT)은 개체에게 천연 또는 재조합-유래 단백질들 및/또는 효소들의 전신적 투여가 관여한다. 승인된 요법들은 전형적으로 정맥내 투여되고 근간이 되는 효소 결핍의 신체적 증상들을 치료하는 데 일반적으로 효과적이다. 중추신경계 (CNS)의 세포들 및 조직들 내에 정맥내 투여된 단백질 및/또는 효소의 제한된 분배의 결과로서, CNS 병인학 (CNS etiology)을 가지는 질환들의 치료는 정맥내 투여된 단백질들 및/또는 효소들이 혈액-뇌 장벽 (blood-brain barrier, BBB)을 적당하게 통과하지 못하기 때문에 특히 문제가 되어왔다.
혈액-뇌 장벽 (BBB)은 박테리아, 거대분자들 (예로, 단백질들) 및 기타 친수성 분자들과 같은 혈류에서 해로운 물질들로부터 중추신경계 (CNS)를 보호하도록 BBB를 거쳐서 근간이 되는 뇌척수액 (CSF) 및 CNS 내로 이러한 물질들의 확산을 제한하는 기능을 하는 내피세포들을 포함하는 구조적 체계이다.
조직 분포를 변경하는 직접적인 두개내 (intra-cranial) 주사, BBB의 일시적 투과화 (transient permeabilization), 및 활성을 가진 제제의 변형을 포함하는, 치료제의 뇌 전달을 증진하도록 BBB를 기만하는 여러 가지의 방식들이 존재한다. 뇌 조직 내로 치료제의 직접 주사는 혈관 구조 (vasculature)를 완전하게 우회하지만, 두개내 주사들 및 투여 부위로부터 적게 확산되는 활성을 가진 제제로 인해 발생되는 합병증들 (감염, 조직 손상, 면역 반응)의 위험을 주로 겪는다. 지금까지, 뇌 물질 내로 단백질들의 직접 투여는 확산 장벽들 및 투여가능한 치료제의 제한된 부피로 인해 유의한 치료 효과를 달성하지 못하였다. 전도-조력 (convection-assisted) 확산은 저속의 장기간 주입 (long-term infusions)을 사용하는 뇌 실질 (parenchyma)에 설치된 카테터들에 의해 연구되어 왔지만 (Bobo, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 91, 2076-2080 (1994); Nguyen, et al. J. Neurosurg. 98, 584-590 (2003)), 현재 승인된 요법들은 본 장기 요법의 접근법을 전혀 사용하지 않고 있다. 또한, 뇌내 카테터들의 설치는 매우 침습적이고 임상적 대안으로서 별로 바람직하지 않다.
경막내 (IT) 주사, 또는 뇌척수액 (CSF)으로 단백질들의 투여도 역시 시도되어 왔지만, 치료적 성공은 아직 달성하지 못하였다. 본 치료의 대부분의 도전은 연속적인 확산을 방해하는 뇌실의 뇌실막 내층 (ependymal lining)과 매우 강하게 결합하는 활성을 가진 제제의 경향이 되어왔다. 현재로는, CSF로의 직접 투여에 의해 뇌의 유전적 질환을 치료하는 승인된 제품들이 전혀 없다.
사실상, 많은 사람들이 뇌의 표면에서는 확산에 대한 장벽, 뿐만 아니라 효과적이고 편리한 전달 방법들의 부족이 너무 큰 장애물이 되어 뇌 질환이라면 모두에서 적당한 치료적 효과를 달성할 수 없는 것으로 여겨왔다.
많은 리소좀 축적 장애들이 신경계에 영향을 주고 따라서 전통적인 요법들로 이들 질환들을 치료하는 데 독특한 문제점을 보여준다. 침범된 환자들의 뉴런들 및 뇌척수막에서 글리코아미노글리칸들 (glycosaminoglycans, GAGs)의 많은 생성이 종종 존재하고 다양한 형태들의 CNS 증상들의 유발시킨다. 지금까지, 리소좀 장애로부터 초래되는 CNS 증상들은 입수가능한 수단이라면 모두에 의해서 성공적으로 치료되지 못하였다.
따라서, 뇌에 치료제들을 효과적으로 전달해야 하는 강한 필요성이 있다. 보다 상세하게는, 리소좀 축적 장애들을 치료하기 위해 중추신경계로 활성을 가진 제제들의 더욱 효과적인 전달의 강한 필요성이 있다.
관련 출원들에 관한 상호 참조
본 출원은 미국 가특허출원들 2010년 6월 25일자로 제출된 일련번호 제 61/358,857호; 2010년 7월 1일자로 제출된 제61/360,786호; 2010년 9월 29일자로 제출된 제 61/387,862호; 2011년 1월 24일자로 제출된 제 61/435,710호; 2011년 2월 11일자로 제출된 제 61/442,115호; 2011년 4월 15일자로 제출된 제 61/476,210호; 및 2011년 6월 9일자로 제출된 제 61/495,268호에 대한 우선권을 주장하고 있고; 이들 각각은 전부 본 명세서에 의해 참조문헌으로 통합되어 있다. 본 출원은 동일한 날짜에 제출된 "헤파란 N-설파타제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of Heparan N-Sulfatase)" ; 동일한 날짜에 제출된 "이듀로네이트-2-설파타제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of Iduronate-2-Sulfatase)"; 동일한 날짜에 제출된 "β-갈락토세레브로시다제의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of β-Galactocerebrosidase)"; 동일한 날짜에 제출된 "아릴설파타제 A의 CNS 전달을 위한 방법들 및 조성물들 (Methods and compositions for CNS Delivery of Arylsulfatase A)"; 동일한 날짜에 제출된 "산필리포 증후군 B형의 치료 (Treatment of Sanfilippo Syndrome Type B)"라는 명칭을 가지는 미국 출원들에 관한 것이고; 이들 각각은 전부 본 명세서에 의해 참고문헌으로 통합되어 있다.
본 발명은 중추신경계 (CNS)로 치료제들의 직접적인 전달을 위한 효과적이고 덜 침습적인 접근법을 제공한다. 본 발명은 부분적으로 리소좀 축적병 (lysosomal storage disease)의 대체 효소가 치료의 필요가 있는 개체의 뇌척수액 (cerebrospinal fluid, CSF) 내로 직접 높은 농도 (예로, 약 3 mg/ml, 4 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml 이상)로 도입될 수 있어 효소가 다양한 표면들을 거쳐서 효과적으로 또한 광범위하게 확산되고 깊은 뇌의 부위들을 포함하는 뇌를 거쳐서 다양한 부위들을 침투하는 점의 예기치 않은 발견에 기초하고 있다. 보다 놀랍게도, 본 발명자들은 이러한 높은 단백질 농도 전달이 단순한 식염수 또는 완충액-기초 제형물을 사용하고 개체에서 심각한 면역 반응과 같은 실질적인 역효과들을 유발하지 않고도 성취될 수 있는 점을 기술하였다. 따라서, 본 발명은 CNS 성분들을 가지는 다양한 질환들 및 장애들, 상세하게는 리소좀 축적병의 치료를 위한 직접적인 CNS 전달의 매우 효율적이고, 임상적으로 바람직하며 환자-친근한 접근법을 제공한다. 본 발명은 CNS 표적 (CNS targeting) 및 효소 대체 요법 (enzyme replacement therapy)의 분야에서 중대한 진보를 보여주고 있다.
무엇보다도, 본 발명은 치료의 필요가 있는 개체에게 치료제 (예로, 대체 효소 (replacement 효소))의 경막내 (IT) 투여 방법들을 제공한다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 재조합, 유전자-활성화 또는 천연의 효소일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, "경막내 투여 (intrathecal administration)," "경막내 주사 (intrathecal injection)," "경막내 전달 (intrathecal delivery)," 또는 문법적 동등물들은 척수관 (척수를 감싸는 경막내 공간) 내로 주입을 말한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 "경막내 투여" 또는 "경막내 전달"은 요추 영역 또는 부위를 통한 IT 투여 또는 전달, 예로 요추 IT 투여 또는 전달을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "요추 부위 (lumbar region)" 또는 "요추 영역 (lumbar area)"은 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이의 영역, 보다 자세하게는 척추 (spine)의 L2-S1 부위를 말한다. 요추 IT 투여 또는 전달은 무엇보다도 대수공 전달이 전형적으로 말단 척수관으로 잘 전달되지 못하는 반면, 우리의 발명에 따른 요추 IT 투여 또는 전달은 말단 척수관으로 더 나은 또한 더 효과적인 전달을 제공하는 점에서 대수공 전달 (예로, 두개골 및 척추의 첨단 사이의 구멍 (opening)을 통한 소뇌 주위 및 아래의 공간을 통한 주입)과는 구별되는 것으로 참작된다.
한 가지 관점에서, 본 발명은 리소좀 효소의 대체 효소를 약 5 mg/ml이상 (예로, 6 mg/ml, 7 mg/ml, 8 mg/ml, 9 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 또는 100 mg/ml 이상)의 농도로 포함하는 조성물을 리소좀 효소의 감소된 수준 또는 활성과 연관된 리소좀 축적병을 않거나 이에 취약한 개체에게 경막내로 투여하는: 단계를 포함하는 방법들을 제공한다.
일정 구현예들에서, 조성물은 좀 더 나아가 (i) 완충제 (buffering agent), (ii) 표면활성제 (surfactant), 또는 (iii) 긴장화제 (tonicifier)의 하나 이상을 포함한다. 일정 구현예들에서, 조성물은 대략 3.0-8.0 (예로, 4.0-7.5, 5.0-7.5, 5.5-7.7, 5.5-7.0, 6.0-7.0, 6.5-7.5, 6.5-7.0, 또는 5.5-6.5)의 pH를 가진다. 일정 구현예들에서, 조성물은 합성 CSF가 아닌 제형물에 넣는 대체 효소를 포함한다.
일정 구현예들에서, 조성물은 약 15 mL 이하 (예로, 약 10 ml, 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1.5 ml, 1.0 ml, 또는 0.5 ml 이하)의 단일 용량 부피로 투여된다.
일정 구현예들에서, 조성물의 경막내 투여는 개체에서 실질적인 역효과를 유발하지 않는다. 소정의 구현예들에서, 조성물의 경막내 투여는 적응적 T-세포 매개성 면역 반응을 유발하지 않는다.
보다 또 다른 관점에서, 본 발명은 리소좀 효소의 대체 효소를 포함하는 조성물을 리소좀 효소의 감소된 수준 또는 활성과 연관된 리소좀 축적병을 않거나 이에 취약한 개체에게 경막내로 투여하고, 투여는 동시적인 면역억제 요법 (concurrent immunosuppressant therapy)의 부재 시 조성물의 경막내 투여가 관여하는: 단계를 포함하는 방법들을 제공한다. 일정 구현예들에서, 방법은 치료되는 개체에서 면역 내성 (immune tolerance)이 관여하지 않는다. 소정의 구현예들에서, 방법은 T-세포 면역억제제 (T-cell immunosuppressive agent)를 사용하는 개체의 전-치료 (pre-treatment) 또는 전조정 (preconditioning)이 관여하지 않는다.
좀 더 나아간 관점에서, 본 발명은 리소좀 효소의 대체 효소를 포함하는 조성물을 뇌, 척수 및 말초 기관들의 하나 이상 조직들에서 리소좀 효소의 정상 수준들 또는 활성들의 적어도 약 10% (예로, 적어도 약 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%)가 달성되는 치료적 유효량 및 투여 간격으로 리소좀 효소의 감소된 수준 또는 활성과 연관된 리소좀 축적병을 않거나 이에 취약한 개체에게 경막내로 투여하는: 단계를 포함하는 방법들을 제공한다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 뇌의 하나 이상의 조직들은 뇌척수막 조직을 포함한다. 일정 구현예들에서, 뇌척수막 조직은 연질막 (pia mater), 경질막 (dura mater), 및 거미막 (arachnoid) 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 뇌의 하나 이상의 조직들은 대뇌의 조직을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 대뇌의 조직은 대뇌의 표면 또는 얕은 조직이다. 소정의 구현예들에서, 대뇌의 표면 또는 얕은 조직은 연질막 조직들, 대뇌 피질 리본 (cerebral cortical ribbon) 조직들, 해마 (hippocampus), 대뇌 표면의 표면으로부터 4 mm 이내의 조직들, 버코우 로빈 공간 (Virchow Robin space), VR 공간 내의 혈관들, 해마, 뇌의 하부 표면 상의 시상하부 (hypothalamus) 의 일부들, 시신경들 및 관들, 후각 망울 (olfactory bulb) 및 돌출부들, 또한 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 대뇌의 조직은 대뇌의 깊은 조직을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 대뇌의 깊은 조직은 대뇌 피질 리본, 대뇌 표면의 표면으로부터 4 mm 미만의 조직들, 대뇌 표면의 표면으로부터 6 mm 미만의 조직들, 대뇌 표면의 표면으로부터 10 mm 미만의 조직들, 간뇌 (diencephalon), 시상하부 (hypothalamus), 시상 (thalamus), 시상 전부 (prethalamus), 및 시상 아래부, 후뇌 (metencephalon), 대뇌다리 (cerebral peduncles), 적색핵 (red nucleus), 뇌신경 제 III형 핵 (cranial nerve III nuclei), 깊은 회색질 (deep grey matter) 렌즈핵 (lentiform nuclei), 기저 신경절 (basal ganglia), 미상엽 (caudate), 조가비핵 (putamen), 편도핵 (amygdale), 창백핵 (globus pallidus), 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 뇌의 하나 이상의 조직들은 소뇌의 조직을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 소뇌의 조직은 분자층 (molecular layer)의 조직들, 퍼킨지 세포층 (Purkinje cell layer), 과립 세포층 (granular cell layer)의 조직들, 대뇌다리 (cerebellar peduncles), 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 소뇌의 조직들은 소뇌의 깊은 조직이다. 소정의 구현예들에서, 소뇌의 깊은 조직은 퍼킨지 세포층, 과립 세포층의 조직들, 깊은 소뇌 백색질 조직, 및 깊은 소뇌 핵 조직 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 뇌의 하나 이상의 조직들은 뇌줄기 (brainstem)의 조직을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 뇌줄기의 조직은 뇌 줄기 백색질 조직 및/또는 뇌줄기 핵 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 척수의 하나 이상의 조직들은 척수의 표면 또는 얕은 조직이다. 소정의 구현예들에서, 척수의 표면 또는 얕은 조직은 연질막 (pia matter), 백색질의 관들 (tracts of white matter), 및 척수 표면의 표면으로부터 4 mm 이내의 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 척수의 하나 이상의 조직들은 척수의 깊은 조직이다. 소정의 구현예들에서, 척수의 깊은 조직은 척수 회색질 및 뇌실막 세포들 (ependymal cells), 또한 척수 표면의 표면으로부터 4 mm 미만의 조직으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 뇌의 하나 이상의 조직들은 표면 또는 얕은 조직들을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 표면 또는 얕은 조직들은 뇌척수막 (meningeal)의 연질막 (pia mater), 경질막 (dura mater), 및 거미막 (arachnoid) 조직들, 대뇌 피질 리본 조직들 (cerebral cortical ribbon tissues), 대뇌 표면의 표면으로부터 4 mm 이내의 조직들 또한 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 조직들은 깊은 조직들을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 깊은 뇌 조직은 소뇌의 깊은 백색질, 척수의 깊은 회색질, 뇌들보 (corpus collosum), 뇌실주위 조직 (periventricular tissue), 시상 (thalamus), 해마술 (fimbria), 대뇌 피질 리본 아래의 조직들, 대뇌 표면의 표면으로부터 4 mm 미만의 조직들, 대뇌 표면의 표면으로부터 6 mm 미만의 조직들, 대뇌 표면의 표면으로부터 10 mm 미만의 조직들, 퍼킨지 세포층, 과립 세포층의 조직들, 깊은 소뇌 백색질 조직, 및 깊은 소뇌 핵 조직 또한 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 치료적 유효량은 0.005 mg/kg의 뇌 무게로부터 100 mg/kg의 뇌 무게까지의 범위이다. 소정의 구현예들에서, 치료적 유효량은 1 mg/kg 이상의 뇌 무게 (예로, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 또는 50 mg/kg 이상의 뇌 무게)이다. brain weight). 소정의 구현예들에서, 치료적 유효량은 10 mg/kg 이상의 뇌 무게이다. 소정의 구현예들에서, 치료적 유효량은 30 mg/kg 이상의 뇌 무게이다.
일정 구현예들에서, 투여 간격은 2주마다 한 번이다. 일정 구현예들에서, 투여 간격은 매월 한 번이다. 일정 구현예들에서, 투여 간격은 2개월마다 한 번이다. 일정 구현예들에서, 투여 간격은 매월 두 번이다. 일정 구현예들에서, 투여 간격은 매주 한 번이다. 일정 구현예들에서, 투여 간격은 매주 두 번 또는 여러 번이다. 일정 구현예들에서, 투여는 연속식 관류 펌프 (perfusion pump)를 통하는 것과 같이 연속적이다. 간격은 2주마다 한 번이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 리소좀 효소의 대체 효소를 포함하는 조성물을 리소좀 효소의 감소된 수준 또는 활성과 연관된 리소좀 축적병을 않거나 이에 취약한 개체에게 투여하고, 투여는 상기 대체 효소가 외부 표면 아래의 적어도 5 mm (예로, 외부 표면 아래의 적어도 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 10 mm, 11 mm, 또는 12 mm 이상)의 깊은 뇌 조직으로 전달되도록 조성물의 경막내 투여가 관여하는: 단계를 포함하는 방법들을 제공한다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 외부 표면 아래의 적어도 10 mm의 깊은 뇌 조직으로 전달된다. 소정의 구현예들에서, 대체 효소는 특이적으로 깊은 뇌 조직의 세포성 리소좀들로 전달된다.
일정 구현예들에서, 효소가 전달되는 깊은 뇌 조직은 대뇌의 깊은 백색질, 척수의 깊은 회색질, 뇌들보, 뇌실주위 조직, 시상, 해마술, 대뇌 피질 리본 아래의 조직들, 대뇌 표면의 표면으로부터 4 mm 미만의 조직들, 대뇌 표면의 표면으로부터 6 mm 미만의 조직들, 대뇌 표면의 표면으로부터 10 mm 미만의 조직들, 퍼킨지 세포층, 과립 세포층의 조직들, 깊은 소뇌 백색질 조직 및 깊은 소뇌 핵 조직 또한 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
보다 또 다른 관점에서, 본 발명은 인간 세포들로부터 생산된 리소좀 효소의 대체 효소를 포함하는 조성물을 리소좀 효소의 감소된 수준 또는 활성과 연관된 리소좀 축적병을 않거나 이에 취약한 개체에게 투여하는: 단계를 포함하는 방법들을 제공한다.
일정 구현예들에서, 리소좀 축적병은 아스파틸글루코사민 뇨증 (aspartylglucosaminuria), 콜레스테롤 에스테르 축적병 (cholesterol ester storage disease), 울만병 (Wolman disease), 시스틴증 (cystinosis), 다논병 (Danon disease), 파브리병 (Fabry disease), 파버 지질육아종증 (Farber lipogranulomatosis), 파버병 (Farber disease), 퓨코시드 축적증 (fucosidosis), 갈락토시알산증 (galactosialidosis) 제 I/II형, 가우셔병 (Gaucher disease) 제 I/II/III형, 구형세포 백색질장애 (globoid cell leukodystrophy), 크래브병 (Krabbe disease), 글리코겐 축적병 (glycogen storage disease) 제 II형, 폼프병 (Pompe disease), GM1-갱글리오사이드 축적증 (gangliosidosis) 제 I/II/III형, GM2- 갱글리오사이드 축적증 제 I형, 테이삭스병 (Tay Sachs disease), GM2-갱글리오사이드 축적증 제 II형, 샌드호프병 (Sandhoff disease), GM2-갱글리오사이드 축적증, α-만노사이드증 (α-mannosidosis) 제 I/II형, β-만노사이드증 (β-mannosidosis), 이염색성 백색질장애 (metachromatic leukodystrophy), 점액지질증 (mucolipidosis) 제 I형, 시알산증 제 I/II형, 점액지질증 제 II/III형, I-세포병 (I-cell disease), 점액지질증 제 IIIC형, 유사-헐러 다중장애 (pseudo-Hurler polydystrophy), 점액다당류증 (mucopolysaccharidosis) 제 I형, 점액다당류증 제 II형, 헌터 증후군 (Hunter syndrome), 점액다당류증 제 IIIA형, 산필리포 증후군 (Sanfilippo syndrome) A형, B형 또는 D형, (점액다당류증 제 IIIB호, 점액다당류증 제 IIIC형, 점액다당류증 제 IIID형), 점액다당류증 제 IVA형, 모르퀴오 증후군 (Morquio syndrome), 점액다당류증 제 IVB형, 점액다당류증 제 VI형, 점액다당류증 제 VII형, 슬라이 증후군 (Sly syndrome), 점액다당류증 제 IX형, 다중 설파타제 결핍 (multiple sulfatase deficiency), 신경 세로이드 지질갈색소증 (neuronal ceroid lipofuscinosis), CLN1 바튼병 (Batten disease), CLN2 바튼병, 니만-피크병 (Niemann-Pick disease) A/B형, 니만-피크병 C1형, 니만-피크병 C2형, 피크노다이소스토 왜소증 (pycnodysostosis), 쉰들러병 제 I/II형, 가우셔병 및 시알산 축적병 (sialic acid storage disease)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 리소좀 축적병은 헌터 증후군, 이염색성 백색질장애 (MLD) 질환, 산필리포 증후군 A형, 산필리포 증후군 B형, 및 구형세포 백색질 장애 (GLD) 질환으로이루어진 그룹으로부터 선택된다. 소정의 구현예에서, 대체 효소는 재조합 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S), 아릴설파타제 A (ASA), 헤파란 N-설파타제 (HNS), 알파-N-아세틸글루코스아미니다제 (Naglu) 및 β-갈락토시다제 (GLC)로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 만노스-6-포스페이트 (M6P) 잔기들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 리소좀 표적 분체 (lysosomal targeting moiety )를 포함하는 융합 단백질이다.
일정 구현예들에서, 대체 효소는 뉴런들, 아교세포들, 혈관주위 세포들 및/또는 뇌척수막 세포들로 전달된다. 소정의 구현예들에서, 대체 효소는 좀 더 나아가 척수에 있는 뉴런들로 전달된다.
일정 구현예들에서, 경막내 투여는 좀 더 나아가 말초 표적 조직들에서 대체 효소의 전신적 전달을 유도한다. 소정의 구현예들에서, 말초 표적 조직들은 간, 신장, 및/또는 심장, 내피세포, 골수 및 세포들로부터 유래한 골수, 비장, 폐, 림프절, 뼈 및 연골, 난소 및 정소로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 대체 효소의 리소좀 정착 (lysosomal localization)을 유도한다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 GAG 축적의 감소를 유도한다. 소정의 구현예들에서, GAG 축적은 대조군과 대비하여 적어도 20%, 40%, 50%, 60%, 80%, 90%, 1배, 1.5배, 또는 2배로 감소된다.
일정 구현예들에서, 경막내 투여는 뉴런들에서 감소된 공포화 (vacuolization) 를 유도한다. 일정 구현예들에서, 뉴런들은 퍼킨지 세포들을 포함한다.
일정 구현예들에서, 경막내 투여는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들 및/또는 말초 표적 조직들에서 대체 효소의 증가된 효소 활성을 유도한다. 소정의 구현예들에서,
효소 활성은 대조군과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가된다. 소정의 구현예들에서, 증가된 효소 활성은 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg 또는 600 nmol/hr/mg이다.
일정 구현예들에서, 효소 활성은 요추 부위 (lumbar region)에서 증가된다. 소정의 구현예들에서, 요추 부위에서 증가된 효소 활성은 적어도 대략 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 또는 10,000 nmol/hr/mg이다.
일정 구현예들에서, 리소좀 축적병은 말초 증상들과 연관되고, 좀 더 나아가 방법은 개체에게 대체 효소를 정맥내 투여하는 것을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 정맥내 투여는 많아야 매월 (monthly) 투여의 빈도이다 (예로, 많아야 격주, 매월, 2개월마다 한 번, 3개월마다 한 번, 4개월마다 한 번, 5개월마다 한 번, 또는 6개월마다 한 번의 빈도). 소정의 구현예들에서, 정맥내 투여는 매주 두 번, 매주, 격주, 또는 매월 두 번과 같은 매월 투여 이상의 빈도이다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여는 동일한 날짜에 수행된다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 적어도 2일 이내, 적어도 3일 이내, 적어도 4일 이내, 적어도 5일 이내, 적어도 6일 이내, 적어도 7일 이내, 또는 적어도 한 주 이내와 같이 서로의 소정의 시간 간격 이내에서 수행되지 않는다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 매주 교대하는 투여들, 2주마다 교대로, 매월 두 번, 또는 매월과 같이 교대하는 스케쥴로 수행된다. 일정의 구현예들에서, 경막내 투여는 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 정맥내 투여의 스케쥴에서 본 스케쥴의 세 번째, 네 번째 또는 다섯 번째 투여가 정맥내 투여를 대신하여 경막내 투여로 대체될 수 있는 것과 같은 투여 스케쥴로 정맥내 투여를 대체한다. 일정의 구현예들에서, 정맥내 투여는 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 경막내 투여의 스케쥴에서 본 스케쥴의 세 번, 네 번 또는 다섯 번째 투여는 경막내 투여를 대신하여 정맥내 투여로 대체될 수 있는 것과 같이 경막내 투여를 대체한다. 일정 구현예들에서, 정맥내 및 경막내 투여들은 먼저 정맥내 투여들을 수행하고 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 경막내 투여들로 이어지는 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 것과 같이 순서적으로 수행된다. 일정 구현예들에서, 먼저 경막내 투여들을 수행하고 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여) 정맥내 투여들로 이어진다 (예로, 2주, 1개월, 2개월, 3개월, 4개월, 5개월, 6개월, 또는 1년 이상 동안 매주, 격주, 매월 두 번, 또는 매월의 용량 투여).
일정 구현예들에서, 리소좀 축적병은 말초 증후군들 (peripheral symptoms)과 연관되고, 또한 방법은 개체에게 대체 효소를 정맥내 투여하는 것이 관여하지 않지만 대체 효소를 경막내 투여하는 것을 포함한다. 소정의 구현예들에서, 대체 효소들의 경막내 투여는 개체의 효소 대체 결핍의 하나 이상 말초 증상들을 개선하거나 감소시킨다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 치료의 필요가 있는 개체에게 재조합 이듀로네이트-2-설파타제 (iduronate-2-sulfatase, I2S) 효소를 헌터 증후군 (Hunters Syndrome)의 적어도 하나의 증상 또는 특징이 강도 (intensity), 중증도 (severity), 또는 빈도 (frequency)가 감소되거나, 지연된 발병을 가지도록 치료적 유효량 및 투여 간격으로 투여하는: 단계를 포함하는 헌터 증후군을 치료하는 방법들을 제공한다. 헌터 증후군의 적어도 하나의 증상 또는 특징은 인지 장애 (cognitive impairment); 백색질 손상들 (white matter lesions); 뇌 실질 (brain parenchyma), 신경절 (ganglia), 뇌들보 (corpus callosum), 및/또는 뇌줄기 (brainstem)에서 팽창된 혈관주위 공간들; 위축증 (atrophy); 및 뇌실비대 (ventriculomegaly)이다.
보다 또 다른 관점에서, 치료의 필요가 있는 개체에게 재조합 아릴설파타제 A (arylsulfatase A, ASA) 효소를 이염색성 백색질장애 (metachromatic leukodystrophy, MLD) 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징이 강도, 중증도, 또는 빈도가 감소되거나, 지연된 발병을 가지도록 치료적 유효량 및 투여 간격으로 투여하는: 단계를 포함하는 이염색성 백색질장애 (MLD) 질환을 치료하는 방법들을 제공한다. 일정 구현예들에서, MLD 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징은 증가된 두개내압 (intracranial pressure), 외수두증 (hydrocephalus ex vacuo), 중추 및 말초 신경계에 있는 미엘린초들 (myelin sheaths)에서 축적된 설페이트화된 당지질들, 내장 기관들에서 진행성 탈미엘린화 (progressive demyelination), 및 CNS 및 PNS에서 축삭 소실 (axonal loss), 및/또는 운동 및 인지 기능이상 (motor and cognitive dysfunction)이다.
보다 또 다른 관점에서, 치료의 필요가 있는 개체에게 재조합 헤파란 N-설파타제 (heparan N-sulfatase, HNS) 효소를 산필리포 A형 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징이 강도, 중증도, 또는 빈도가 감소되거나, 지연된 발병을 가지도록 치료적 유효량 및 투여 간격으로 투여하는: 단계를 포함하는 산필리포 증후군 A형 (Sanfilippo syndrome type A)(산필리포 A형) 질환을 치료하는 방법들을 제공한다.
또 다른 관점에서, 치료의 필요가 있는 개체에게 재조합 알파-N-아세틸글루코스아미다제 (alpha-N-acetylglucosaminidase, Naglu) 효소를 산필리포 B형 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징이 강도, 중증도, 또는 빈도가 감소되거나, 지연된 발병을 가지도록 치료적 유효량 및 투여 간격으로 투여하는: 단계를 포함하는 산필리포 증후군 B형 (산필리포 B형) 질환을 치료하는 방법들을 제공한다.
일정 구현예들에서, 산필리포 A형 또는 산필리포 B형 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징은 난청 (hearing loss), 손상된 언어 발달, 운동 능력들의 결여, 운동성 과다활성 (motoric hyperactivity), 진행성 정신지체 (progressive cognitive impairment), 공격성 (aggressiveness) 및/또는 수면 방해들 (sleep disturbances)이다.
일정 구현예들에서, 재조합 Naglu 효소는 Naglu 및 리소좀 표적 분체 (lysosomal targeting moiety)를 포함하는 융합 단백질이다. 소정의 구현예들에서, 리소좀 표적 분체는 IGF-II이다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 치료의 필요가 있는 개체에게 재조합 β-갈락토시다제 (β-galactosidase, GLC) 효소를 구형세포 백색질장애 (globoid cell leukodystrophy, GLD) 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징이 강도, 중증도, 또는 빈도가 감소되거나, 지연된 발병을 가지도록 치료적 유효량 및 투여 간격으로 투여하는: 단계를 포함하는 구형세포 백색질장애 (GLD) 질환을 치료하는 방법들을 제공한다. 일정 구현예들에서, GLD 질환의 적어도 하나의 증상 또는 특징은 흥분성 (irritability), 경련 (convulsion), 정신 황폐 (mental deterioration), 난청 (deafness), 실명 (blindness), 간대성근 경련발작 (myoclonic seizures), 과다 근육 긴장 (excessive muscle tone), 발달 지연 (developmental delay), 발달 능력들의 퇴행 (regression of developmental skills), 과다민감성 (hypersensitivity), 진전 (tremor), 실조 (ataxia), 경직 (spasticity), 발작성 심한 구토 (episodic severe vomiting), 백색질장애 (leukodystrophy), 뇌 위축 (cerebral atrophy), 구형세포들의 손상된 발달 및/또는 탈미엘린화 (demyelination)이다.
보다 또 다른 관점에서, 본 발명은 체액 유입 포트 (fluid access port); 체액 유입 포트와 액체 소통하는 첫 번째 유동 입구 (flow orifice) 및 척수 내로의 삽입을 위해 형성된 두 번째 유동 입구를 가지는 공동체 (hollow body); 또한 척수에서 공동체의 삽입을 보장하는 안전 기작 (securing mechanism):을 포함하는, 경막내 투여 장치들을 제공한다. 일정 구현예들에서, 안전 기작은 공동체의 표면 위에 올려진 하나 이상의 돌기들 (nobs) 및 하나 이상의 돌기들 위로 조절가능한 연결된 고리 (sutured ring)를 포함한다. 소정의 구현예들에서, 체액 유입 포트는 저장조 (reservoir)를 포함한다. 소정의 구현예들에서, 체액 유입 포트는 이식가능한 것 (implantable)이다. 소정의 구현예들에서, 체액 유입 포트는 주사가능한 포트 (injectable port)이다. 일정 구현예들에서, 체액 유입 포트는 기계적인 펌프이다.
본 출원에서 사용되는 바, 용어들 "약 (about)" 및 "대략 (approximately)"은 동등한 것들로서 사용된다. 본 출원에서 사용되는 숫자들은 모두 약/대략이 있거나 없이도 당업자라면 인정하는 정상적인 변동들 (fluctuations)이라면 모두를 포괄하도록 의미한다.
본 발명의 기타 다른 특징들, 목적들, 및 장점들은 다음의 자세한 기술내용에서 자명하다. 그러나, 자세한 기술내용이 본 발명의 구현예들을 가리키면서 제한됨이 없이 단지 설명으로 주어지는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 범위 내에서 다양한 변화들 및 변형들은 자세한 기술내용으로부터 당업자라면 자명하게 여길 것이다.
정의들
본 발명을 더욱 잘 이해하기 위하여, 소정의 용어들이 먼저 하기에 정의된다. 다음의 용어들 및 기타 다른 용어들에 대한 추가적인 정의들이 본 명세서 전체를 통하여 설명된다.
대략 (Approximately) 또는 약 (about): 본 명세서에서 사용되는 바, "대략" 또는 "약"은 관심있는 하나 이상의 수치들에 적용되는 바와 같이 진술된 기준 수치와 유사한 수치를 말한다. 소정의 구현예들에서, 용어 "대략" 또는 "약"은 달리 진술되지 않거나 달리 내용으로부터 분명하지 않는 둘 중 하나의 경우라면 (이러한 숫자가 가능한 수치의 100%를 초과하는 경우를 제외함) 진술된 기준 수치의 방향 (이상 또는 이하)으로 25%, 20%, 19%, 18%, 17%, 16%, 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 이하 이내에 속하는 수치들의 범위를 말한다.
개선 (Amelioration): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "개선"은 개체의 상태의 예방 (prevention), 감소 (reduction) 또는 완화 (palliation), 또는 상태의 향상 (improvement)을 의미한다. 개선은 질환 병폐의 완벽한 회복 또는 완벽한 예방을 포함하지만 이들을 요구하지는 않는다. 일정 구현예들에서, 개선은 적절한 질환 조직들에서 결핍되는 적절한 단백질 또는 그의 활성의 증가된 수준들을 포함한다.
생물학적으로 활성을 가진 (Biologically active): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 (phrase) "생물학적으로 활성을 가진"은 생물학적 체계 (biological system)에서, 상세하게는 생물에서 활성을 가지는 제제라면 모두의 특징을 말한다. 예를 들어, 생물에게 투여될 때 본 생물에 미치는 생물학적 효과를 가지는 제제는 생물학적으로 활성을 가지는 것으로 고려된다. 상세한 구현예들에서, 단백질 또는 폴리펩타이드가 생물학적으로 활성을 가지는 경우, 단백질 또는 폴리펩타이드의 생물학적 활성 적어도 하나를 공유하는 단백질 또는 폴리펩타이드의 부분은 "생물학적으로 활성을 가진" 부분으로서 언급된다.
충전제 (Bulking agent): 본 명세서에서 사용되는 바, "충전제"는 동결건조된 혼합물에 질량을 더하는 화합물을 말하고 동결건조된 케이크 (lyophilized cake)의 물리적 구조에 기여한다 (예로, 개방 공극 구조를 유지하는 필수적으로 일정한 동결건조된 케이크의 생산을 용이하게 함). 대표적인 충전제들로는 만니톨 (mannitol), 글리신 (glycine), 염화나트륨 (sodium chloride), 하이드록시에틸 전분 (hydroxyethyl starch), 락토스 (lactose), 슈크로스 (sucrose), 트레할로스 (trehalose), 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol) 및 덱스트란 (dextran)을 포함한다.
양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체 (Cation-independent mannose-6-phosphate receptor, CI-MPR): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체 (CI-MPR)"는 리소좀에 운반될 골지체 (Golgi apparatus)에 있는 산 가수분해효소 전구체들 상에 만노스-6-포스페이트 (M6P) 태그들 (tags)을 결합시키는 세포성 수용체를 말한다. 만노스-6-포스페이트들에 추가하여, CI-MPR는 IGF-II를 포함하는 기타 다른 단백질도 역시 결합시킨다. CI-MPR는 "M6P/IGF-II 수용체," "CI-MPR/IGF-II 수용체," "IGF-II 수용체" 또는 "IGF2 수용체"라고도 역시 알려져 있다. 본 명세서에서 이들 용어들 및 그들의 약어들은 상호교환적으로 사용된다.
동시적인 면역억제 요법 (Concurrent immunosuppressant therapy): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "동시적인 면역억제 요법"은 전-치료, 전조정 또는 치료 방법과 평등한 것으로서 사용되는 면역억제 요법이라면 모두를 포함한다.
희석제 (Diluent): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "희석제"는 재구성된 제형물의 제조에 유용한 약제학적으로 허용가능한 (예로, 인간에게 투여 시 안전하고 비-독성) 희석 물질 (diluting substance)을 말한다. 대표적인 희석제들은 무균수 (sterile water), 주사용 정균수 (bacteriostatic water)(BWFI), pH 완충액 (예로, 인산염-완충 식염수), 무균 식염수 용액, 링거 용액 또는 덱스트로스 용액을 포함한다.
용량 형태 (Dosage form): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "용량 형태" 및 "단위 용량 형태 (unit dosage form)"는 치료될 환자를 위한 치료적 단백질의 물리적으로 명확한 단위를 말한다. 각 단위는 원하는 치료적 효과를 생산하도록 계산된 활성 물질의 선결정된 정량 (predetermined quantity)을 포함한다. 그러나, 조성물의 전체 용량은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 참석한 의사가 결정하는 것으로 이해될 것이다.
효소 대체 요법 (효소 replacement therapy, ERT): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "효소 대체 요법 (ERT)"은 소실된 효소를 제공하여 효소 결핍을 교정하는 치료적 전략 (therapeutic strategy)이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 소실된 효소는 경막내 투여에 의해 제공된다. 일정 구현예들에서, 소실된 효소는 혈류 내에 주입하여 제공된다. 일단 투여되면, 효소는 세포들에 의해 흡수되고 리소좀으로 운반되고, 여기에서 효소는 효소 결핍으로 인해 리소좀들에 축적되었던 물질을 제거하도록 작용한다. 전형적으로, 효과적인 리소좀 효소 대체 요법 (lysosomal 효소 replacement therapy)의 경우, 치료적 효소가 축적 결함이 나타나는 표적 조직들에서 적절한 세포들에 있는 리소좀들로 운반된다.
개선하다 (Improve), 증가하다 (increase) 또는 감소하다 (reduce): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다" 또는 문법적 동등물들은 본 명세서에서 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정 또는 본 명세서에서 기술된 치료의 부재 시 대조군 개인 (또는 다수의 대조군 개인들)에서의 측정과 같은 기저선 측정 (baseline measurement)과는 대비되는 수치들을 가르킨다. "대조군 개인 (control individual)"은 치료될 개인과 리소좀 축적병의 동일한 형태로 고생하고, (치료된 개인 및 대조군 개인(들)에서 질환의 단계들이 비교가능한 점을 보장하는) 치료될 개인과 거의 동일한 연령인 개인이다.
개인 (Individua), 개체 (subject), 환자 (patien)t: 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개체", "개인" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물 개체를 말한다. 치료된 개인 ("환자" 또는 "개체"라도도 말함)은 질환을 앓는 개인 (태아, 유아, 아동, 청소년, 또는 성인 인간)이다.
경막내 투여 (Intrathecal administration): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "경막내 투여" 또는 "경막내 주사 (intrathecal injection)"는 척수관 (spinal canal) (척수 주변의 경막내 공간) 내로의 주사를 말한다. 다양한 기법들 (techniques)이, 제한되지 않고 천두공 (burrhole) 또는 대수공 (cisternal) 또는 요추 (lumbar) 천자 (puncture) 등을 통한 측뇌실 주사 (lateral cerebroventricular injection)를 포함하여 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 "경막내 투여" 또는 "경막내 전달 (intrathecal delivery)"은 요추 IT 투여 또는 전달과 같은 요추 영역 또는 부위를 통한 IT 투여 또는 전달을 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "요추 부위(lumbar region)" 또는 "요추 영역 (lumbar area)"은 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이의 영역, 보다 더욱 자세하게는 척추 (spine)의 L2-S1 부위를 말한다.
링커 (Linker): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "링커"는 천연의 단백질에 서, 특정한 위치에서 나타나는 것이 아닌 아미노산 서열을 말하고 일반적으로 단백질 분체들 사이에서 유연하고 알파-나선과 같은 구조를 부여하도록 설계된다.
동결보호제 (Lyoprotectant): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "동결보호제"는 동결건조 (lyophilization) 및 연속적 보관 시 단백질 또는 기타 다른 물질의 화학적 및/또는 물리적 불안정성을 예방하거나 감소시키는 분자를 말한다. 대표적인 동결보호제들로는 슈크로스 또는 트레할로스와 같은 당류들; 모노소듐 글루타메이트 (monosodium glutamate) 또는 히스티딘과 같은 아미노산; 베타인 (betaine)과 같은 메틸아민; 마그네슘 설페이트와 같은 친액성 (lyotropic) 염; 삼수소 (trihydric) 또는 고차 당 알코올들, 예로 글리세린 (glycerin), 에리트리톨 (erythritol), 글리세롤 (glycerol), 아라비톨 (arabitol), 자일리톨 (xylitol), 소비톨 (sorbitol), 및 만니톨 (mannitol)과 같은 폴리올 (polyol); 프로필렌 글리콜 (propylene glycol); 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol); 플루로닉스 (Pluronics); 및 그들의 조합들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 동결보호제는 트레할로스 또는 슈크로스와 같은 비-환원성 당이다.
리소좀 효소 (Lysosomal 효소): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "리소좀 효소"는 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들을 감소시킬 수 있고 하나 이상의 리소좀 축적병 증상들을 회복시키거나 개선시킬 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 본 발명에 적합한 리소좀 효소들은 야생형 또는 변형된 리소좀 효소들을 둘 다 포함하고, 재조합 및 합성 방법들을 사용하여 생산되거나 천연의 출처들로부터 정제될 수 있다. 대표적인 리소좀 효소들은 표 1에 나열되어 있다.
리소좀 효소 결핍 (Lysosomal enzyme deficiency): 본 명세서에서 사용되는 바, "리소좀 효소 결핍"은 리소좀들에서 거대분자들 (예로, 효소 기질들)을 펩타이드들, 아미노산들, 단당류들, 핵산들 및 지방산들로 분해하는 데 요구되는 효소들 적어도 하나의 결핍으로부터 유발되는 유전적 장애들의 그룹을 말한다. 그 결과, 리소좀 효소 결핍들을 앓고 있는 개인들은 다양한 조직들 (예로, CNS, 간, 비장, 장, 혈관 벽들 및 기타 다른 기관들)에서 축적된 물질들을 가지고 있다.
리소좀 축적병 (lysosomal storage disease): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "리소좀 축적병"은 천연의 거대분자들을 대사하는 데 필요한 리소좀 효소들 적어도 하나의 결핍으로부터 유발되는 질환이라면 모두를 말한다. 전형적으로, 이들 질환들은 리소좀들에서 분해되지 않은 분자들의 축적을 유도하여, 축적 과립들 (storage granules) (축적 소포들이라고도 명명함)의 수적 증가를 유도한다. 이들 질환들 및 다양한 예들이 보다 자세하게 하기에 기술된다.
폴리펩타이드 (Polypeptide): 본 명세서에서 사용되는 바, "폴리펩타이드"는 일반적으로 말하자면 펩타이드 결합에 의해 서로 부착된 적어도 두 개의 아미노산들의 연결 (string)을 말한다. 일정 구현예들에서, 폴리펩타이드는 적어도 하나의 펩타이드 결합에 의해 다른 것들에 각각 부착된 적어도 3 내지 5개의 아미노산들을 포함할 수 있다. 당업자라면 폴리펩타이드들이 그럼에도 불구하고 임의적으로 폴리펩타이드 사슬 내에 통합될 수 있는 "비-천연의 (non-natural)" 아미노산들 또는 기타 다른 실체들을 때로 포함할 수 있는 점을 인정할 것이다.
대체 효소 (Replacement 효소): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "대체 효소"는 치료될 질환에서 적어도 부분적으로 결핍되거나 소실된 효소를 대체하도록 작용할 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 용어 "대체 효소"는 치료될 리소좀 축적병에서 적어도 부분적으로 결핍되거나 소실된 효소를 대체하도록 작용할 수 있는 효소라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 포유동물 리소좀들에서 축적된 물질들을 감소시킬 수 있거나, 하나 이상의 리소좀 축적병 증상들을 회복시키거나 개선시킬 수 있다. 본 발명에 적합한 리소좀 효소들은 야생형 또는 변형된 리소좀 효소들을 둘 다 포함하고, 재조합 및 합성 방법들을 사용하여 생산되거나 천연의 출처들로부터 정제될 수 있다. 대체 효소는 재조합, 합성, 유전자-활성화 또는 천연의 효소일 수 있다.
용해성 (Soluble): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "용해성)"은 균질한 용액을 형성하는 치료제의 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 치료제가 투여되고 작용의 표적 부위 (예로, 뇌의 세포들 및 조직들) 내로 운반되는 용액에서 치료제의 용해도 (solubility)는 작용의 표적 부위로 치료적 유효량의 치료제의 전달을 허용하는데 충분하다. 여러 가지 요인들이 치료제들의 용해도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 단백질 용해도에 영향을 줄 수 있는 적절한 요인들은 이온 강도, 아미노산 서열 및 기타 다른 공-용해화 (co-solubilizing) 제제들 또는 염들 (예로, 칼슘 염들)의 존재를 포함한다. 일정 구현예들에서, 약제학적 조성물들은 칼슘 염들이 이러한 조성물들로부터 배제되도록 제형화된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 제제들은 해당하는 그의 약제학적 조성물에서 용해성이다. 일반적으로 등장액들이 비경구 투여 약물들을 위해 선호되는 한편, 등장액들 (isotonic solutions)의 사용은 일정의 치료제들, 상세하게는 일정의 단백질들 및/또는 효소들에 대한 적당한 용해도를 제한할 수 있는 점이 인정될 것이다. 약간 고장액들 (hypertonic solutions) (예로, 175mM까지의 염화나트륨) 및 당-포함 용액들 (예로, pH 7.0에서 5mM 소듐 포스페이트에 녹인 2%까지의 슈크로스)는 원숭이들에서 잘 내성화되는 (tolerated) 것으로 나타났다. 예를 들어, 가장 공통적인 CNS 볼루스 제형 조성물은 식염수 (물에 녹인 150mM NaCl)이다.
안정도 (Stability): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "안정한 (stable)"은 연장된 기간 동안 그의 치료적 효능 (예로, 의도된 생물학적 활성 및/또는 물리화학적 본성의 모두 또는 대다수)을 유지하는 치료제 (예로, 재조합 효소)의 능력을 말한다. 치료제의 안정도, 및 이러한 치료제의 안정도를 유지하는 약제학적 조성물의 능력은 연장된 기간 동안 (예로, 적어도 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36개월 이상 동안) 평가될 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에서 기술된 약제학적 조성물들은 이로 제형화된 하나 이상의 치료제들 (예로, 재조합 단백질들)을 안정화하거나, 임의적으로 그의 분해를 지연시키거나 방지할 수 있도록 제형화되어 왔다. 제형물의 문맥에서, 안정한 제형물은 안에 있는 치료제가 필수적으로 보관 시 및 공정들 (냉동/해동, 기계적인 혼합 및 동결건조와 같음) 동안 그의 물리적 및/또는 화학적 본성 및 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 단백질 안정도의 경우, 고분자량 (HMW) 응집체들 (aggregates)의 형성, 효소 활성의 상실, 단백질 단편들의 생성 및 전하 프로파일들의 이동 (shift)에 의해 측정될 수 있다.
개체 (Subject): 본 명세서에서 사용되는 바, "개체"는 인간을 포함하는 포유동물이라면 모두를 의미한다. 본 발명의 소정의 구현예들에서, 개체는 인간, 청소년 또는 유아이다. 또한 본 발명에 의해 약제학적 조성물들의 투여 및/또는 자궁내 (in-utero) 치료 방법의 성적이 참작된다.
실질적인 상동성 (Substantial homology): 본 발명에서 용어구 "실질적인 상동성"은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 말하는 것으로 사용된다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 일반적으로 두 개의 서열들은 그들의 해당하는 위치들에서 상동한 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 상동한 (substantially homologous)"인 것으로 고려된다. 상동한 잔기들은 일치하는 잔기들 (identical residues)일 수 있다. 임의적으로, 상동한 잔기들은 대략적으로 유사한 구조적 및/또는 기능적 특징들을 가지는 비-일치하는 잔기일 수 있다. 예를 들어, 당업자라면 잘 숙지하고 있는 바와 같이, 전형적으로 소정의 아미노산들은 "소수성" 또는 "친수성" 아미노산들로서, 및/또는 "극성" 또는 "비극성" 측쇄들을 가지는 것으로서 분류된다. 하나의 아미노산이 동일한 유형의 또 다른 것으로의 치환은 종종 "상동한" 치환이라고 고려될 수 있다.
당해 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열들은 뉴클레오타이드 서열들의 경우 BLASTN, 아미노산 서열들의 경우 BLASTP, 갭 (gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램들에서 입수가능한 것들을 포함하는 다양한 알고리즘들이라면 모두를 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있다. 상동한 서열들을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 상동성의 정도 표시를 제공한다. 일정 구현예들에서, 두 개의 서열들은 잔기들의 적절한 연장길이 (stretch)에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 상동한 경우라면 실질적으로 상동한 것으로 고려된다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 완전한 서열이다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는 500개 이상의 잔기들이다.
실질적인 일치도 (Substantial identity): 본 명세서에서 용어구 "실질적인 일치도"는 은 아미노산 또는 핵산 서열들 간의 비교를 말하는 것으로 사용된다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 일반적으로 두 개의 서열들은 그들의 해당하는 위치들에서 일치하는 잔기들을 포함하는 경우 "실질적으로 일치하는 (substantially identical)" 것으로 고려된다. 당해 기술 분야에서 알려져 있는 바와 같이, 아미노산 또는 핵산 서열들은 뉴클레오타이드 서열들의 경우 BLASTN, 아미노산 서열들의 경우 BLASTP, 갭 (gapped) BLAST, 및 PSI-BLAST와 같은 시판되는 컴퓨터 프로그램들에서 입수가능한 것들을 포함하는 다양한 알고리즘들이라면 모두를 사용하여 비교될 수 있다. 이러한 대표적인 프로그램들은 Altschul, et al., Basic local alignment search tool, J. Mol. Biol., 215(3): 403-410, 1990; Altschul, et al., Methods in Enzymology; Altschul, et al., "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs", Nucleic Acids Res. 25:3389-3402, 1997; Baxevanis, et al., Bioinformatics : A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Wiley, 1998; and Misener, et al., (eds.), Bioinformatics Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, Vol. 132), Humana Press, 1999에 기술되어 있다. 일치하는 서열들을 확인하는 것에 추가하여, 상기에 언급된 프로그램들은 전형적으로 일치도의 정도 표시를 제공한다. 일정 구현예들에서, 두 개의 서열들은 잔기들의 적절한 연장길이 (stretch)에 걸쳐서 해당하는 그들의 잔기들의 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상이 일치하는 경우라면 실질적으로 일치하는 것으로 고려된다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 완전한 서열이다. 일정 구현예들에서, 적절한 연장길이는 적어도 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 또는500개 이상의 잔기들이다.
합성 CSF (Synthetic CSF): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "합성CSF"는 척수액과 합치되는 pH, 전해질 조성, 포도당 함량 및 삼투도를 가지는 용액을 말한다. 합성 CSF는 인공 CSF (artifical CSF)라고도 역시 말한다. 일정 구현예들에서, 합성 CSF는 엘리어트 B 용액 (Elliott's B solution)이다.
CNS 전달에 적합한 (Suitable for CNS delivery): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어구 본 발명의 약제학적 조성물들에 관한 "CNS 전달에 적합한" 또는 "경막내 전달에 적합한 (suitable for intrathecal delivery)"은 일반적으로 이러한 조성물들의 안정도, 내성 (tolerability), 및 용해도 성질들 뿐만 아니라 이에 포함되는 치료제의 유효량을 전달의 표적 부위 (예로, CSF 또는 뇌)로 전달하는 이러한 조성물들의 능력을 말한다.
표적 조직들 (Target tissues): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "표적 조직들"은 치료될 리소좀 축적병에 의해 영향을 받는 조직이라면 모두 또는 결핍 리소좀 효소가 정상적으로 발현되는 조직이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 리소좀 축적병을 않거나 이에 취약한 환자들에서 예를 들어 조직의 세포성 리소좀들에 축적된 효소 기질의 검출가능하거나 비정상적으로 많은 양이 존재하는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 질환-연관된 병리학, 증상, 또는 특징을 나타내는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 결핍 리소좀 효소가 올라간 수준으로 정상적으로 발현되는 이들 조직들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 표적 조직은 뇌 표적 조직, 척수 표적 조직 및/또는 말초 표적 조직일 수 있다. 대표적인 표적 조직들은 하기에 상술되고 있다.
치료적 분체 (Therapeutic moiety): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료적 분체"는 분자의 치료적 효과를 가져오는 분자의 일부를 말한다. 일정 구현예들에서, 치료적 분체는 치료적 활성을 가지는 폴리펩타이드이다.
치료적 유효량 (therapeutically effective amount): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료적 유효량"은 의학적 치료라면 모두에 적용가능한 합리적인 유익/위험 비율로 치료되는 개체에 미치는 치료적 효과를 부여하는 치료적 단백질 (예로, 대체 효소)의 양을 말한다. 치료적 효과는 주관적 (예로, 일정의 테스트 또는 마커에 의해 측정가능) 또는 객관적 (예로, 개체가 효과의 표시를 주거나 느낌)일 수 있다. 상세하게, "치료적 유효량"은 질환과 연관된 증상들을 개선하거나 질환의 발병을 예방하거나 지연시키는 것, 및/또는 질환의 증상들의 중증도 또는 빈도도 역시 감소시키는 것에 의해서와 같이 원하는 질환 또는 병폐를 치료하거나, 개선하거나, 예방하는 데, 또는 검출가능한 치료적 또는 예방적 효과를 나타내는 데 효과적인 치료적 단백질 또는 조성물의 양을 말한다. 치료적 유효량은 공통적으로 다수의 단위 용량들을 포함할 수 있는 용량 요법 (dosing regimen)으로 투여된다. 특정한 치료적 단백질이라면 모두의 경우, 치료적 유효량 (및/또는 효과적인 용량 요법 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어 투여의 경로 또는 다른 치료제들과의 조합에 의존하여 변화될 수 있다. 또한, 특정한 환자를 위한 치료적 유효량 (및/또는 단위 용량)은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 치료제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 적용되는 특이적 융합 단백질의 대사; 치료의 지속기간; 및 의학적 기술분야에서 잘 알려져 있는 요인들 등을 포함하는 다양한 요인들에 의존할 수 있다.
내성 (Tolerable): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "내성" 및 "내성도 (tolerability)"는 본 발명의 약제학적 조성물들이 이러한 조성물이 투여된 개체에서 역효과를 발현하지 않도록, 임의적으로 이러한 조성물이 투여된 개체에서 심각한 역효과를 발현하지 않도록 하는 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물들은 이러한 조성물들이 투여된 개체에 의해 내성화된다.
치료 (Treatment): 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "치료" (또한 "치료하다 (treat)" 또는 "치료하는 (treating)")은 부분적으로 또는 완벽하게 특정한 질환, 장애, 및/또는 병폐 (예로, 헌터 증후군, 산필리포 증후군 B형)의 하나 이상의 증상들 또는 특징들을 완화시키고, 개선시키고, 안정시키고, 억제하고, 발병을 지연시키고, 중증도를 감소시키고 및/또는 이의 빈도를 감소시키는 치료적 단백질 (예로, 리소좀 효소)의 투여라면 모두를 말한다. 이러한 치료는 적절한 질환, 장애 및/또는 병폐의 징후들을 발현하지 않는 개체 및/또는 단지 질환, 장애 및/또는 병폐의 초기 징후들만을 나타내는 개체에게 할 수 있다. 임의적으로 또는 추가적으로, 이러한 치료는 적절한 질환, 장애 및/또는 병폐의 하나 이상의 확립된 징후들을 발현하는 개체에게 할 수 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 무엇보다도, 중추신경계 (CNS)로의 치료의 효과적인 직접 전달을 위한 개선된 방법들을 제공한다. 상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 부분적으로 리소좀 축적병 (lysosomal storage disease)의 대체 효소가 치료의 필요가 있는 개체의 뇌척수액 (CSF) 내로 높은 농도로 개체에서 실질적인 역효과들을 유발하지 않고도 직접 도입될 수 있는 점의 예기치 않은 발견에 기초하고 있다. 보다 놀랍게도, 본 발명자들은 합성 CSF를 사용하지 않고도 단순한 식염수 또는 완충액-기초 제형물을 사용하여 전달될 수 있는 점을 발견하였다. 보다 더 예기치 않게도, 본 발명에 따른 경막내 전달은 개체에서 심각한 면역반응과 같은 실질적인 역효과들을 유발하지 않는다. 따라서, 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 전달은 동시적인 면역억제 요법의 부재 시 (예로, 전-치료 또는 전-조정에 의한 면역 내성의 유발 없음) 사용될 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 전달은 표면, 얕은 및/또는 깊은 뇌 부위들에 있는 다양한 표적 뇌 조직들에서 대체 효소의 효과적인 전달을 유도하여 다양한 뇌 조직들을 거친 효율적인 확산을 허용한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 전달은 말초 순환에 들어가는 충분량의 대체 효소들을 유도하였다. 그 결과, 일정 경우에서는, 본 발명에 따른 경막내 전달이 간, 심장, 및 신장과 같은 말초 조직들에서 대체 효소의 전달을 유도하였다. 본 발견은 예측되지 않고 특히 CNS 및 말초 성분들 둘 다를 가지는 리소좀 축적병의 치료에 유용할 수 있고, 이는 전형적으로 규칙적인 경막내 투여 및 정맥내 투여 둘 다를 요구할 것이다. 본 발명에 따른 경막내 전달은 말초 증상들을 치료하는 것에서 치료적 효과들과 타협하지 않고도 감소된 용량 투여 및/또는 정맥내 (iv) 주사의 빈도를 허용할 수 있는 점을 보여준다.
본 발명은 다양한 뇌 표적 조직들로 대체 효소들의 효율적이고 편리한 전달을 허용하여CNS 표시들 (CNS indications)을 가지는 리소좀 축적병들의 효과적인 치료를 유도하는 다양한 예기치 못한 유익한 특징들을 제공한다.
본 발명의 다양한 관점들은 다음의 섹션들에서 상술되고 있다. 섹션들의 사용은 본 발명을 제한하도록 의미하지는 않는다. 각 섹션은 본 발명의 각 관점에 적용될 수 있다. 본 명세서에서, 달리 진술되지 않는 경우라면 "또는 (or)"은 "및/또는 (and/or)" 을 의미한다.
리소좀 축적병들 및 대체 효소들
본 발명의 방법들은 리소좀 축적병이라면 모두, 상세하게는 이에 제한되는 것은 아니지만 아스파틸글루코사민 뇨증 (aspartylglucosaminuria), 콜레스테롤 에스테르 축적병 (cholesterol ester storage disease), 울만병 (Wolman disease), 시스틴증 (cystinosis), 다논병 (Danon disease), 파브리병 (Fabry disease), 파버 지질육아종증 (Farber lipogranulomatosis), 파버병 (Farber disease), 퓨코시드 축적증 (fucosidosis), 갈락토시알산증 (galactosialidosis) 제 I/II형, 가우셔병 (Gaucher disease) 제 I/II/III형, 구형세포 백색질장애 (globoid cell leukodystrophy), 크래브병 (Krabbe disease), 글리코겐 축적병 (glycogen storage disease) 제 II형, 폼프병 (Pompe disease), GM1-갱글리오사이드 축적증 (gangliosidosis) 제 I/II/III형, GM2-갱글리오사이드 축적증 제 I형, 테이삭스병 (Tay Sachs disease), GM2-갱글리오사이드 축적증 제 II형, 샌드호프병 (Sandhoff disease), GM2-갱글리오사이드 축적증, α-만노사이드증 (mannosidosis) 제 I/II형, 베타-만노사이드증 (beta-mannosidosis), 이염색성 백색질장애 (metachromatic leukodystrophy), 점액지질증 (mucolipidosis) 제 I형, 시알산증 제 I/II형, 점액지질증 제 II/III형, I-세포병 (I-cell disease), 점액지질증 제 IIIC형, 유사-헐러 다중장애 (pseudo-Hurler polydystrophy), 점액다당류증 (mucopolysaccharidosis) 제 I형, 점액다당류증 제 II형, 헌터 증후군 (Hunter syndrome), 점액다당류증 제 IIIA형, 산필리포 증후군 (Sanfilippo syndrome) (A형, B형, C형 또는 D형), 점액다당류증 제 IIIB호, 점액다당류증 제 IIIC형, 점액다당류증 제 IIID형, 점액다당류증 제 IVA형, 모르퀴오 증후군 (Morquio syndrome), 점액다당류증 제 IVB형, 점액다당류증 제 VI형, 점액다당류증 제 VII형, 슬라이 증후군 (Sly syndrome), 점액다당류증 제 IX형, 다중 설파타제 결핍 (multiple sulfatase deficiency), 신경 세로이드 지질갈색소증 (neuronal ceroid lipofuscinosis), CLN1 바튼병 (Batten disease), CLN2 바튼병, 니만-피크병 (Niemann-Pick disease) A/B형, 니만-피크병 C1형, 니만-피크병 C2형, 피크노다이소스토 왜소증 (pycnodysostosis), 쉰들러병 제 I/II형, 가우셔병 및 시알산 축적병 (sialic acid storage disease)을 포함하는, CNS 병인학 및/또는 증상들을 가지는 이들 리소좀 축적병을 치료하는 데 사용될 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명의 방법들을 사용하여 치료될 리소좀 축적병은 헌터 증후군, 이염색성 백색질장애 (MLD) 질환, 산필리포 증후군 A형, 산필리포 증후군 B형, 및 구형세포 백색질장애 (GLD) 질환을 포함한다.
리소좀 축적병들의 유전적 병인학, 임상적 소견들, 및 분자생물학의 자세한 리뷰들은 Scriver et al., eds., The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Disease, 7.sup.th Ed., Vol. II, McGraw Hill, (1995)에 상술되고 있다. 따라서, 상기 질환들에서 결핍되는 효소는 당업자라면 숙지하고 있고, 이들의 일부는 하기 표에 예시되고 있다.
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대체 효소들
본 발명에 따른 발명적 방법들은 대체 효소들이라면 모두를 전달하는 데 사용될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 본 발명에 적합한 대체 효소들은 치료될 리소좀 축적병에서 결핍 또는 소실된 리소좀 효소의 적어도 부분적 활성을 대체하도록 작용할 수 있는 효소라면 모두를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 리소좀들에서 축적된 물질을 감소시킬 수 있고 리소좀 축적병 증상들을 하나 이상 회복시키거나 개선시킬 수 있다.
일정 구현예들에서, 적합한 대체 효소는 치료될 리소좀 축적병과 연관되는 것으로 알려진 리소좀 효소라면 모두일 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 대체 효소는 상기 표 1에 나열된 효소로부터 선택된 효소이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S), 아릴설파타제 A (ASA), 헤파란 N-설파타제 (HNS), 알파-N-아세틸글루코스아미니다제 (Naglu) 및 베타-갈락토시다제 (GLC)이다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 야생형 또는 자연적으로 발생한 서열을 가질 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 야생형 또는 자연적으로 발생한 서열과 실질적인 상동성 또는 일치도를 가지는 변형된 서열을 가질 수 있다 (예로, 야생형 또는 자연적으로 발생한 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 서열 일치도).
본 발명에 적합한 대체 효소는 사용가능한 수단이라면 모두에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 대체 효소들은 대체 효소-인코딩 핵산을 발현하도록 조작된 숙주세포 시스템을 사용하여 재조합적으로 생산될 수 있다. 임의적으로 또는 추가적으로, 대체 효소들은 화학적 합성에 의해 부분적으로 또는 전적으로 제조될 수 있다. 임의적으로 또는 추가적으로, 대체 효소들은 또한 천연의 출처들로부터 정제될 수 있다.
효소들이 재조합적으로 생산되는 경우, 발현 시스템이라면 모두가 사용될 수 있다. 몇 가지의 예들을 제시하면, 기지의 발현 시스템들은 예를 들어 계란, 배큘로바이러스, 식물, 효모, 또는 포유동물 세포들을 포함한다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 효소들은 포유동물 세포들에서 생산된다. 본 발명에 따라 사용될 수 있는 포유동물 세포들의 비-제한적인 예들로는 BALB/c 마우스 마이엘로마 세포주 (NSO/l, ECACC No: 85110503); 인간 망막모세포들 (PER.C6, CruCell, Leiden, 네델란드); SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651); 인간 배아 신장 세포주 (현탁 배양에서의 성장을 위해 계대배양된 293 또는 293 세포들, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); 인간 섬유육종 세포주 (예로, HT1080); 새끼 햄스터 신장세포들 (BHK, ATCC CCL 10); 중국 햄스터 난소 세포들 +/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); 마우스 세르톨리 세포들 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); 원숭이 신장세포들 (CV1 ATCC CCL 70); 아프리카 녹색 원숭이 신장세포들 (VERO-76, ATCC CRL-1 587); 인간 자궁암종 세포들 (HeLa, ATCC CCL 2); 고양이 신장세포들 (MDCK, ATCC CCL 34); 버팔로 래트 간세포들 (BRL 3A, ATCC CRL 1442); 인간 폐세포들 (W138, ATCC CCL 75); 인간 간세포들 (Hep G2, HB 8065); 마우스 유방세포들 (MMT 060562, ATCC CCL51); TRI 세포들 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); MRC 5 세포들; FS4 cells; 및 인간 간암세포들 (Hep G2)을 포함한다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 방법들은 인간 세포들로부터 생산된 대체 효소들을 전달하는 데 사용된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 방법들은 CHO 세포들로부터 생산된 대체 효소들을 전달하는 데 사용된다.
일정 구현예들에서, 본 발명의 방법을 사용하여 전달된 대체 효소들은 세포성 흡수 및/또는 리소좀 표적화를 용이하게 하도록 뇌 세포들의 표면 상의 수용체에 결합하는 분체를 포함한다. 예를 들어, 이러한 수용체는 만노스-6-포스페이트 (M6P) 잔기들을 결합시키는 양이온-비의존성 만노스-6-포스페이트 수용체 (CI-MPR)일 수 있다. 추가적으로, CI-MPR도 역시 IGF-II를 포함하는 기타 다른 단백질들을 결합시킨다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 단백질의 표면 상에 M6P 잔기들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 적합한 대체 효소는 CI-MPR에 더 높은 결합 친화도를 가지는 비스-인산화 올리고다당들 (bis-phosphorylated oligosaccharides)를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 효소는 효소 당 약 적어도 20%까지의 비스-인산화 올리고사카라이드들 를 포함한다. 다른 구현예들에서, 적합한 효소는 효소 당 약 10%, 15%, 18%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%의 비스-인산화 올리고다당류들을 포함할 수 있다. 이러한 비스-인산화 올리고다당류들은 효소 상에 자연적으로 존재할 수 있으면서도, 효소들은 이러한 올리고다당류들을 소유하도록 변형될 수 있는 점을 주목해야 한다. 예를 들어, 적합한 대체 효소들은 리소좀 효소들 상에서 UDP-GlcNAc 로부터 α-1,2-결합 만노스들의 6' 위치로 N-아세틸글루코사민-L-포스페이트의 이동을 촉매할 수 있는 소정의 효소들에 의해 변형될 수 있다. 이러한 효소들을 생산하고 사용하는 방법들 및 조성물들은, 예를 들어 캔필드 등 (Canfield et al.)에 의해 미국 특허 제 6,537,785호 및 미국 특허 제 6,534,300호에서 기술되고 있고, 이들 각각은 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명에서 사용되는 대체 효소들은 뇌 세포들의 표면 상의 수용체에 결합할 수 있는 리소좀 표적화 분체와 결합하거나 융합될 수 있다. 적합한 표적화 분체는 IGF-I, IGF-II, RAP, p97, 및 변이체들 (variants), 상동물들 (homologues) 또는 그들의 단편들 (예로, 야생형 성숙한 인간 IGF-I, IGF-II, RAP, p97 펩타이드 서열과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 또는 95%일치하는 서열을 가지는 이들 펩타이드를 포함함)일 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 대체 효소들은 BBB를 거쳐서 또한 CNS 내로 이러한 제제들의 전달 또는 이동을 증진하도록 변형되지 않았다.
경막내 전달
본 발명에 따르면, 대체 효소는 CNS로 전달된다. 일정 구현예들에서, 대체 효소는 치료의 필요가 있는 개체의 뇌척수액 (CSF) 내로 투여하여 CNS로 전달된다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여는 원하는 대체효소를 CSF 내로 전달하는 데 사용된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 경막내 투여 (경막내 주사라고도 말함)는 척수관 (척수 주위의 경막내 공간) 내로의 주사를 말한다. 다양한 기법들 (techniques)이, 제한되지 않고 천두공 또는 대수공 또는 요추 (lumbar) 천자 (puncture) 등을 통한 측뇌실 주사를 포함하여 사용될 수 있다. 대표적인 방법들이 Lazorthes et al. Advances in Drug Delivery Systems and Applications in Neurosurgery, 143-192 and Omaya et al., Cancer Drug Delivery, 1: 169-179에 기술되고, 그의 내용이 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있다.
본 발명에 따르면, 효소는 척수관 주위의 부위라면 모두에 주사될 수 있다. 일정 구현예들에서, 효소는 요추 영역 또는 대수공 내로 또는 뇌실 공간 내로 뇌실내 주사된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "요추 부위" 또는 "요추 영역"은 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이의 영역, 보다 자세하게는 척추의 L2-S1 부위를 말한다. 전형적으로, 요추 부위 또는 요추 영역을 통한 경막내 주사도 역시 "요추 IT 전달" 또는 "요추 IT 투여" 라고 말한다. 용어 "대수공 (cisterna magna)"은 두개골 및 척추의 첨단 사이의 구멍을 통한 소뇌 주위 및 아래의 공간을 말한다. 전형적으로, 대수공을 통한 경막내 투여도 역시 "대수공 전달"이라고 말한다. 용어 "뇌실 (cerebral ventricle)"은 척수의 중앙관과 연속되는 뇌의 공동들 (cavities)을 말한다. 전형적으로, 뇌실을 통한 주사들은 뇌실내 뇌 (ICV) 전달이라고도 말한다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 "경막내 투여" 또는 "경막내 전달"은 예를 들어 세 번째 및 네 번째 요추 (등쪽 하부) 사이, 보다 자세하게는 척추의 L2-S1 부위 사이에 전달되는 요추 IT 투여를 말한다. 요추 IT 투여 또는 전달은 전형적으로 무엇들보다 대수공 전달이 말단 척수관으로 잘 전달되지 못하는 한편, 우리의 발명에 따른 요추 IT 투여 또는 전달은 말단 척수관으로 더 나은 또한 더 효과적인 전달을 제공하는 점에서 대수공 전달과는 구별되는 것으로 참작된다.
IT 전달을 위한 안정한 제형물들
일정 구현예들에서, 원하는 효소는 경막내 전달을 위해 안정 제형물들로 전달된다. 본 발명의 소정의 구현예들은 적어도 부분적으로는 본 명세서에서 기재된 다양한 제형물들이 CNS의 표적된 조직들, 세포들 및/또는 소기관들로 하나 이상의 치료제들 (예로, 효소들)의 효과적인 전달 및 분배를 용이하게 하는 점의 발견을 기초로 한다. 무엇보다도, 본 명세서에서 기술된 제형물들은 치료제들 (예로, 단백질들 또는 효소들)의 높은 농도들을 용해화할 수 있고 CNS 성분 및/또는 병인학을 가지는 질환들의 치료를 위해 개체들의 CNS로 이러한 치료제들의 전달에 적합하다. 본 명세서에서 기술된 조성물들은 좀 더 나아가 그의 필요가 있는 개체의 CNS로 (예로, 경막내) 투여될 때 향상된 안정도 및 향상된 내성도를 특징으로 한다.
본 발명 이전에, 통상적인 비완충 등장성 식염수 및 인공 CSF인 엘리어트 B 용액이 전형적으로 경막내 전달에 사용되었다. 엘리어트 B 용액에 대비하여 CSF의 조성들을 보여주는 비교가 하기 표 2에 포함되어 있다. 표 2에서 나타난 바와 같이, 엘리어트 B 용액의 농도는 CSF의 농도와 매우 유사하다. 그러나 엘리어트 B 용액은 매우 낮은 완충액 농도를 포함하고 따라서 특히 연장된 기간 동안 (예로, 축적 조건들 동안) 치료제들 (예로, 단백질들)을 안정화하는 데 필요한 적당한 완충화 능력을 제공할 수 없다. 또한, 엘리어트 B 용액은 일정 치료제들, 상게하게는 단백질들 또는 효소들을 전달하도록 의도된 제형물들과는 부적합할 수 있는 소정의 염들을 포함한다. 예를 들어, 엘리어트 B 용액에 존재하는 칼슘 염들은 단백질 침전을 매개할 수 있고 이에 의해 제형물의 안정도를 감소시킬 수 있다.
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따라서, 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 전달에 적합한 제형물들은 합성 또는 인공 CSF가 아니다.
일정 구현예들에서, 경막내 전달용 제형물들은 이로 제형화된 하나 이상의 치료제들 (예로, 재조합 단백질들)을 안정화하거나, 임의적으로 그의 분해를 지연시키거나 방지할 수 있도록 제형화되어 왔다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "안정한"은 연장된 기간 동안 그의 치료적 효능 (예로, 의도된 생물학적 활성 및/또는 물리화학적 본성의 모두 또는 대다수)을 유지하는 치료제 (예로, 재조합 효소)의 능력을 말한다. 치료제의 안정도, 및 이러한 치료제의 안정도를 유지하는 약제학적 조성물의 능력은 연장된 기간 동안 (예로, 적어도 1, 3, 6, 12, 18, 24, 30, 또는 36개월 이상 동안) 평가될 수 있다. 제형물의 문맥에서, 안정한 제형물은 안에 있는 치료제가 필수적으로 보관 시 및 공정들 (냉동/해동, 기계적인 혼합 및 동결건조와 같음) 동안 그의 물리적 및/또는 화학적 본성 및 생물학적 활성을 보유하는 것이다. 단백질 안정도의 경우, 고분자량 (HMW) 응집체들의 형성, 효소 활성의 상실, 단백질 단편들의 생성 및 전하 프로파일들의 이동 (shift)에 의해 측정될 수 있다.
치료제의 안정도를 특히 중요하다. 치료제의 안정도는 좀 더 나아가 연장된 기간 동안 치료제의 생물학적 활성 또는 물리화학적 본성과 대비하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 주어진 시점에서의 안정도는 이전 시점 (예로, 제형화0일)에서의 안정도와 대비하여 또는 비제형화된 치료제 및 백분율로서 표시되는 본 비교의 결과들과 대비하여 비교될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 약제학적 조성물들은 연장된 기간 동안 치료제의 생물학적 활성 또는 물리화학적 본성의 적어도 100%, 적어도 99%, 적어도 98%, 적어도 97%, 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55% 또는 적어도 50%를 유지한다 (예로, 적어도 약 6 내지 12개월 동안 상온에서 또는 가속된 보관 조건들 하에서 측정된 바와 같음).
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 원하는 효소들)은 본 발명의 제형물들에서 용해가능하다. 용어 "용해성 (soluble)"은 이것이 본 발명의 치료제들에 관한 바 균질한 용액을 형성하는 이러한 치료제들의 능력을 말한다. 바람직하게, 치료제가 투여되고 작용의 표적 부위 (예로, 뇌의 세포들 및 조직들) 내로 운반되는 용액에서 치료제의 용해도는 작용의 표적 부위로 치료적 유효량의 치료제의 전달을 허용하는데 충분하다. 여러 가지 요인들이 치료제들의 용해도에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 단백질 용해도에 영향을 줄 수 있는 적절한 요인들은 이온 강도, 아미노산 서열 및 기타 다른 공-용해화 제제들 또는 염들 (예로, 칼슘 염들)의 존재를 포함한다. 일정 구현예들에서, 약제학적 조성물들은 칼슘 염들이 이러한 조성물들로부터 배제되도록 제형화된다.
따라서, 경막내 투여에 적합한 제형물들은 다양한 농도들로 관심있는 치료제 (예로, 효소)를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 제형물들은 약 300 mg/ml까지 (예로, 약 250 mg/ml까지, 200 mg/ml까지, 150 mg/ml까지, 100 mg/ml까지, 90 mg/ml까지, 80 mg/ml까지, 70 mg/ml까지, 60 mg/ml까지, 50 mg/ml까지, 40 mg/ml까지, 30 mg/ml까지, 25 mg/ml까지, 20 mg/ml까지, 10 mg/ml까지)의 농도로 관심있는 단백질 또는 효소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 제형물들은 약 0 내지 300 mg/ml (예로, 약 1 내지 250 mg/ml, 약 1 내지 200 mg/ml, 약 1 내지 150 mg/ml, 약 1 내지 100 mg/ml, 약 10 내지 100 mg/ml, 약 10 내지 80 mg/ml, 약 10 내지 70 mg/ml, 약 1 내지 60 mg/ml, 약 1 내지 50 mg/ml, 약 10 내지 150 mg/ml, 약 1 내지 30 mg/ml) 사이 범위의 농도로 관심있는 단백질 또는 효소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 경막내 전달에 적합한 제형물들은 대략 1 mg/ml, 3 mg/ml, 5 mg/ml, 10 mg/ml, 15 mg/ml, 20 mg/ml, 25 mg/ml, 50 mg/ml, 75 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml 또는 300 mg/ml의 농도로 관심있는 단백질을 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 등장성 용액들이 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 약간 고장성 용액들 (예로, 300 mM까지 (예로, 250 mM, 200 mM, 175mM, 150 mM, 125 mM까지) pH 7.0에서 5mM 소듐 포스페이트에 녹인 염화나트륨) 및 당-포함 용액들 (예로, 3%까지 (예로, 2.4%, 2.0%, 1.5%, 1.0%까지) pH 7.0에서 5mM 소듐 포스페이트에 녹인 슈크로스)는 원숭이들에서 잘 내성화되는 것으로 나타났다. 일정 구현예들에서, 적합한 CNS 볼루스 제형 조성물은 식염수 (예로, 물에 녹인 150mM NaCl)이다.
많은 치료제들, 상세하게는 본 발명의 단백질들 및 효소들은 본 발명의 약제학적 조성물들에서 그들의 용해도 및 안정도를 유지하도록 조절된pH 및 특이적 운반체들을 요구한다. 하기 표 3은 본 발명의 단백질 치료제들의 용해도 및 안정도를 유지하는 데 중요한 것으로 고려되는 단백질 제형물들의 소정의 대표적인 관점들을 확인시켜주고 있다.
Figure 112021011816093-pat00005
약제학적 조성물의 pH는 수성의 약제학적 조성물에서 치료제 (예로, 효소 또는 단백질)의 용해도를 변경시킬 수 있는 추가적인 요인이다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물들은 하나 이상의 완충액들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 조성물들은 상기 조성물의 최적의 pH를 약 4.0 내지 8.0 사이, 약 5.0 내지 7.5 사이, 약 5.5 내지 7.0 사이, 약 6.0 내지 7.0 사이, 및 약 6.0 내지 7.5 사이로 유지하도록 충분량의 완충액을 포함한다. 다른 구현예들에서, 완충액은 약 50 mM까지 (예로, 약 45 mM, 40 mM, 35 mM, 30 mM, 25 mM, 20 mM, 15 mM, 10 mM, 5 mM까지)의 소듐 포스페이트를 포함한다. 예를 들어, 적합한 완충액들로는 아세테이트 (acetate), 숙시네이트 (succinate), 시트레이트 (citrate), 포스페이트 (phosphate), 기타 다른 유기산들 및 트리스(하이드록시메틸)아미노메탄 ("트리스 (Tris)")를 포함한다. 적합한 완충액 농도들은, 예를 들어 완충액 및 제형물의 원하는 등장도 (isotonicity)에 의존하여 약 1 mM 로부터 약 100 mM까지, 또는 약 3 mM으로부터 약 20 mM까지일 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 완충제 (buffering agent)는 대략 1 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, 55 mM, 60 mM, 65 mM, 70 mM, 75 mM, 80 mM, 85 mM, 90 mM, 95 mM, 또는 100 mM의 농도로 존재한다.
일정 구현예들에서, 제형물들은 등장성으로 제형물들을 유지하도록 등장성 제제 (isotonicity agent)를 포함한다. IT 전달과 연결하여 사용되는 바, "등장성"에 의하여 관심있는 제형물이 필수적으로 인간 CSF와 동일한 삼투도를 가지는 것을 의미한다. 일반적으로, 등장성 제형물들은 약 240 mOsm/kg 으로부터 약 350 mOsm/kg까지의 삼투도를 가질 것이다. 등장도는, 예를 들어 증기압 또는 어는점 유형의 삼투 측정기 (osmometers)를 사용하여 측정될 수 있다. 대표적인 등장성 제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 글리신, 소비톨, 만니톨, 염화나트륨 및 아르기닌을 포함한다. 일정 구현예들에서, 적합한 등장성 제제들은 무게로 약 0.01내지 5 % (예로, 0.05, 0.1, 0.15, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.75, 1.0, 1.25, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0, 4.0 또는 5.0%)로부터 나온 농도로 제형물들에 존재할 수 있다.
일정 구현예들에서, 제형물들은 단백질을 보호하도록 안정화제를 포함할 수 있다. 전형적으로, 적합한 안정화제는 슈크로스, 라피노스, 트레할로스와 같은 비-환원 당, 또는 글리신, 아르기닌 및 메티오닌과 같은 아미노산들이다. 일반적으로 제형물에서 안정화제의 양은 제형물이 등장성이 될 양이다. 그러나, 고장성 제형물들도 역시 적합할 수 있다. 또한, 안정화제의 양은 너무 낮아서 치료제의 분해/응집이 허용가능하지 않은 양으로 발생해서는 안된다. 제형물에서 대표적인 안정화제 농도들은 약 1 mM 로부터 약 400 mM까지 (예로, 약 30 mM 로부터 약 300 mM까지, 및 약 50 mM 로부터 약 100 mM까지)의 범위, 또는 임의적으로 무게로 0.1% 로부터 15%까지 (예로, 1% 로부터 10%까지, 5% 로부터 15%까지, 5% 로부터 10%까지)의 범위일 수 있다. 일정 구현예들에서, 안정화제 및 치료제의 질량의 비율은 약 1:1이다. 다른 구현예들에서, 안정화제 및 치료제의 질량의 비율은 약 0.1:1, 0.2:1, 0.25:1, 0.4:1, 0.5:1, 1:1, 2:1, 2.6:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10;1, 또는 20:1이다. 일정 구현예들에서, 동결건조에 적합한 안정화제는 역시 동결보호제들 (lyoprotectants)이다.
본 발명의 약제학적 조성물들, 제형물들 및 관련 방법들은 개체의 CNS로 다양한 치료제들을 전달하는데 (예로, 경막내, 뇌실내 (intraventricularly) 또는 대수공내 (intracisternally)) 또한 연관된 질환들의 치료에 유용하다. 본 발명의 약제학적 조성물들은 특히 리소좀 축적 장애들을 앓는 개체에게 단백질들 및 효소들을 전달하는 데 유용하다.
일정 구현예들에서, 제형물들에 표면활성제를 첨가하는 것이 바람직하다. 대표적인 표면활성제들로는 폴리솔베이트들 (Polysorbates) (예로, 폴리솔베이트 20 또는 80); 폴록사머들 (poloxamers) (예로, 폴록사머 188); 트리톤 (Triton); 소듐 도데실 설페이트 (SDS); 소듐 라우렐 설페이트; 소듐 옥실 글리코사이드; 로릴-, 미리스틸-, 리노레일-, 또는 스테아릴-설포베타인 (sulfobetaine); 미리스틸-, 리노레일-, 또는 스테아릴-사르코신 (sarcosine); 리노레일-, 미리스틸-, 또는 세틸-베타인; 라우로아미도프로필 (lauroamidopropyl)-, 코크아미도프로필 (cocamidopropyl)-, 리노레아미도프로필 (linoleamidopropyl)-, 미리스트아미도프로필 (myristamidopropyl)-, 팔미도프로필 (palmidopropyl)-, 또는 이소스테아르아미도프로필 (isostearamidopropyl)-베타인 (예로, 라우로아미도프로필); 미리스트아미도프로필-, 팔미도프로필-, 또는 이소스테아르아미도프로필-디메틸아민; 소듐 메틸 코코일-, 또는 디소듐 메틸 오페일-타우레이트; 또한 MONAQUATTM 시리즈 (Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필 글리콜, 폴리에틸 글리콜, 폴리프로필 글리콜 및 에틸렌 및 프로필렌 글리콜의 공중합체들 (예로, 플루로닉스 (Pluronics), PF68 등)와 같은 비이온성 표면활성제들을 포함한다. 전형적으로, 첨가된 표면활성제의 양은 이것이 단백질의 응집을 감소시키고 미립자들 또는 포기들 (effervescences)의 형성을 최소화하는 양이다. 예를 들어, 표면활성제는 약 0.001 내지 0.5% (예로, 약 0.005 내지 0.05%, 또는 0.005 내지 0.01%)로부터 나온 농도로 제형물에 존재할 수 있다. 상세하게, 표면활성제는 대략 0.005%, 0.01%, 0.02%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 또는 0.5% 등의 농도로 제형물에 존재할 수 있다.
일정 구현예들에서, 적합한 제형물은 좀 더 나아가 하나 이상의 충전제들, 상세하게는 동결건조된 제형물들을 위한 것을 포함할 수 있다. "충전제 (bulking agents)"는 동결건조된 혼합물에 질량을 첨가하고 동결건조된 케이크의 물리적 구조에 기여한다. 예를 들어, 충전제는 동결건조된 케이크 (예로, 필수적으로 일정한 동결건조된 케이크)의 모을 개선시킬 수 있다. 적합한 충전제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 염화나트륨, 락토스, 만니톨, 글리신, 슈크로스, 트레할로스, 하이드록시에틸 전분을 포함한다. 대표적인 충전제들의 농도들은 약 1% 로부터 약 10%까지 (예로, 1.0%, 1.5%, 2.0%, 2.5%, 3.0%, 3.5%, 4.0%, 4.5%, 5.0%, 5.5%, 6.0%, 6.5%, 7.0%, 7.5%, 8.0%, 8.5%, 9.0%, 9.5%, 및 10.0%)이다.
본 발명에 따른 제형물들은 제품 품질 분석, 재구성 시간 (동결건조된 경우), 재구성의 품질 (동결건조된 경우), 고분자량, 수분, 및 유리 전이 온도를 기초로 하여 평가될 수 있다. 전형적으로, 단백질 품질 및 제품 분석은, 이에 제한되는 것은 아니지만 크기 배제 HPLC (SE-HPLC), 양이온 교환-HPLC (CEX-HPLC), X-선 회절 (XRD), 조정된 차별 스캐닝 열량측정법 (modulated differential scanning calorimetry, mDSC), 역상 HPLC (RP-HPLC), 다각도 광 분산 (MALS), 형광, 자외선 흡수, 혼탁측정법 (nephelometry), 모세관 전기영동 (capillary electrophoresis, CE), SDS-PAGE, 및 그들의 조합을 포함하는 방법들을 사용하는 제품 분해율 분석을 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 제품의 평가는 모양 (액체 또는 케이크 모양)을 평가하는 단계를 포함할 수 있다.
일반적으로, (동결건조된 또는 수성의) 제형물들은 상온에서 연장된 기간들 동안 보관될 수 있다. 보관 온도는 전형적으로 0 ℃로부터 45 ℃까지의 범위 (예로, 4℃, 20 ℃, 25 ℃, 45 ℃ 등)일 수 있다. 제형물들은 개월 단위 기간 내지 연 단위 기간 동안 보관될 수 있다. 일반적으로 보관 시간은 24개월, 12개월, 6개월, 4.5개월, 3개월, 2개월 또는 1개월일 것이다. 제형물들은 이동 단계들을 없애려고 투여에 사용되는 용기에 직접 보관될 수 있다.
제형물들은 이동 단계들을 없애려고 재구성 관 (reconstitution vessel)로서도 역시 기능할 수 있는 동결건조 용기에 직접 보관될 수 있다. 임의적으로, 동결건조된 제품 제형물들은 보관을 위해 더 작은 증분들 (increments) 내로 측정될 수 있다. 일반적으로 보관은 단백질의 분해를 유발하는, 이에 제한되는 것은 아니지만 태양광 노출, UV 조사, 다른 형태들의 전자기 조사, 과도한 열 또는 추위, 급속한 열적 충격, 및 기계적인 충격을 포함하는 환경들을 피해야 한다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 제형물들은 액체 또는 수성의 형태로 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 제형물은 동결건조된다. 이러한 동결건조된 제형물들은 개체에게 투여 이전에 하나 이상의 희석제들을 이에 첨가하여 재구성될 수 있다. 적합한 희석제들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 무균수, 주사용 정균수 및 무균 식염수를 포함한다. 바람직하게, 재구성 시, 여기에 포함되는 치료제는 안정하고 용해성이며 개체에게 투여 시 내성 (tolerability )을 나타낸다.
본 발명의 약제학적 조성물은 그들의 내성을 특징으로 한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "내성 (tolerable)" 및 "내성도 (tolerability)"은 본 발명의 약제학적 조성물들이 이러한 조성물이 투여된 개체에서 역효과를 발현하지 않도록, 임의적으로 이러한 조성물이 투여된 개체에서 심각한 역효과를 발현하지 않도록 하는 능력을 말한다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 약제학적 조성물들은 이러한 조성물들이 투여된 개체에 의해 내성화된다.
경막내 전달을 위한 장치
다양한 장치들이 본 발명에 따른 경막내 전달에 사용될 수 있다. 일정 구현예들에서, 경막내 투여장치는 체액 유입 포트; 체액 유입 포트와 액체 소통하는 첫 번째 유동 입구 및 척수 내로의 삽입을 위해 형성된 두 번째 유동 입구를 가지는 공동체; 또한 척수에서 공동체의 삽입을 보장하는 안전 기작:을 포함한다. 도 1에 나타난 비-제한적인 예로서, 적합한 안전 기작은 공동체가 척수로부터 벗어나는 것을 막도록 공동체의 표면 위에 올려진 하나 이상의 돌기들 및 하나 이상의 돌기들 위로 조절가능한 연결된 고리를 포함한다. 다양한 구현예들에서, 체액 유입 포트는 저장조를 포함한다. 일정의 구현예들에서, 체액 유입 포트는 기계적인 펌프 (예로, 주입 펌프)를 포함한다. 일정 구현예들에서, 이식된 카테터는 저장조 (예로, 일시 주사용), 또는 주입 펌프 둘 중 하나로 연결된다. 액체 유입 포트는 이식되어 있거나 외부에 있을 수 있다.
일정 구현예들에서, 경막내 투여는 요추 천자 (예로, 저속 볼루스)에 의해 또는 포트-카테터 전달 시스템 (예로, 주입 또는 볼루스)를 통해 수행될 수 있다. 일정 구현예들에서, 카테터는 요추 판들 (laminae) 사이에 삽입되고 말단은 원하는 수준 (일반적으로 L3-L4)까지 경막 공간 위로 올려진다 (threaded up) (도 2).
전형적으로 정맥내 투여와 대비하여, 경막내 투여에 적합한 단일 용량 부피는 적다. 전형적으로, 본 발명에 따른 경막내 전달은 CSF조성물의 균형뿐만 아니라 개체의 구개내 압력을 유지시킨다. 일정 구현예들에서, 경막내 전달은 개체로부터 해당하는 CSF 제거 없이 수행된다. 일정 구현예들에서, 적합한 단일 용량은, 예로 약 10 ml, 8 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1.5 ml, 1 ml, 또는 0.5 ml 일 수 있다. 일정 구현예들에서, 적합한 단일 용량 부피는 약 0.5-5 ml, 0.5-4 ml, 0.5-3 ml, 0.5-2 ml, 0.5-1 ml, 1-3 ml, 1-5 ml, 1.5-3 ml, 1-4 ml, 또는 0.5-1.5 ml일 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 경막내 투여는 먼저 원하는 양의 CSF를 제거하는 단계가 관여한다. 일정 구현예들에서, 약 10 ml 이하 (예로, 약 9 ml, 8 ml, 7 ml, 6 ml, 5 ml, 4 ml, 3 ml, 2 ml, 1 ml 이하)의 CSF가 IT 투여 이전에 먼저 제거된다. 이들 경우들에서, 적합한 단일 용량 부피는, 예로 약 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml, 또는 20 ml 이상이다.
다양한 다른 장치들이 치료적 조성물의 경막내 투여에 효과를 주도록 사용될 수 있다. 예를 들어, 원하는 효소들을 포함하는 제형물들이 수막성 암종증 (meningeal carcinomatosis)을 위한 약물들을 경막내 투여하는 데 공통적으로 사용되는 오마야 저장조 (Ommaya reservoir)를 사용하여 주어질 수 있다 (Lancet 2: 983-84, 1963). 보다 상세하게, 본 방법에서는 뇌실 튜브가 전방각 (anterior horn)에 형성되는 구멍을 통해 삽입되고 두피 하에 설치된 오마야 저장조로 연결되며, 저장조는 들어있는 특정한 효소를 경막내 전달하도록 피하적으로 천자된다. 개인에게 치료적 조성물들 또는 제형물들의 경막내 투여를 위한 다른 장치들이 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있는 미국 특허 제 6,217,552호에 기술되어 있다. 임의적으로, 약물은 예를 들어 단일 주사 또는 연속식 주입에 의해 경막내로 주어질 수 있다. 투여량 치료 (dosage treatment)는 단일 용량 투여 또는 다중 용량들의 형태일 수 있다.
주사의 경우, 본 발명의 제형물들은 액체 용액들로 제형화될 수 있다. 또한, 효소는 고형으로 제형화되어 사용 바로 직전에 재-용해되거나 현탁될 수 있다. 동결건조된 형태들도 역시 포함된다. 예를 들어, 주사는 효소의 일시 주사 또는 연속식 주입 (예로, 주입 펌프들을 사용함)의 형태일 수 있다.
본 발명의 한 가지 구현예에서, 효소는 개체의 뇌내로 측뇌실 주사에 의해 투여된다. 예를 들어, 주사는 개체의 두개골 내에 만들어진 천두공을 통하여 이루어진다. 또 다른 구현예들에서, 효소 및/또는 다른 약제학적 제형물은 개체의 측뇌실 내로 외과적으로 삽입된 지름길 (shunt)을 통하여 투여된다. 예를 들어, 주사는 더 큰 측뇌실들 내로 이루어진다. 일정 구현예들에서, 세 번째 및 네 번째로 작은 뇌실들 내로의 주사도 역시 이루어진다.
보다 또 다른 구현예에서, 본 발명에 사용되는 약제학적 조성물은 개체의 대수공 또는 요추 영역 내로의 주사에 의해 투여된다.
본 발명의 방법의 또 다른 구현예에서, 약제학적으로 허용가능한 제형물은 지속적인 전달, 예로 본 발명에 사용되는 효소 또는 다른 약제학적 조성물의 "저속 방출 (slow release)"을 개체에게 약제학적으로 허용가능한 제형물이 개체에게 투여된 이후 적어도 1, 2, 3, 4주 이상의 기간 동안 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "지속적인 전달 (sustained delivery)"은 투여에 이어지는 초과기간, 바람직하게 적어도 수 일, 한 주 또는 수 주 동안 생체내 (in vivo)에서 본 발명의 약제학적 제형물의 연속적인 전달을 말한다. 조성물의 지속적인 전달은 예를 들어 초과기간 동안 효소의 계속되는 치료적 효과에 의해 확인될 수 있다 (예로, 효소의 지속적인 전달은 개체에서 축적 과립들의 계속적인 감소량에 의해 확인될 수 있다). 임의적으로, 효소의 지속적인 전달은 초과기간 동안 생체내 효소의 존재를 검출하여 확인될 수 있다.
표적 조직들로의 전달
상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명의 놀랍고도 중요한 특징들의 하나는 치료제들, 상세하게는 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물을 사용하여 투여된 대체 효소들이 뇌 표면을 거쳐서 효과적으로 또는 광범위하게 확산되고 깊은 뇌의 부위들을 포함하는 뇌의 다양한 층들 또는 부위들을 침투하는 점이다. 또한, 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물들은 치료제들 (예로, 대체 효소들)을 ICV 주사와 같은 기존의 CNS 전달 방법들에 의해 표적하는 것이 어려운 다양한 조직들, 뉴런들 또는 요추 부위를 포함하는 뇌척수의 세포들로 효과적으로 전달시킨다. 또한, 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물들은 혈류 및 다양한 말초 기관들 및 조직들로 충분량의 치료제들 (예로, 대체 효소들)을 전달시킨다.
따라서, 일정 구현예들에서, 치료적 단백질 (예로, 대체 효소)은 개체의 중추신경계로 전달된다. 일정 구현예들에서, 치료적 단백질 (예로, 대체 효소)은 뇌, 척수 및/또는 말초 기관들의 하나 이상의 표적 조직들로 전달된다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "표적 조직들 (target tissues)"은 치료될 리소좀 축적병에 의해 영향을 받는 조직이라면 모두 또는 결핍 리소좀 효소가 정상적으로 발현되는 조직이라면 모두를 말한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 리소좀 축적병을 앓거나 이에 취약한 환자들에서 효소 기질, 예를 들어 조직의 세포성 리소좀들에 축적된 것의 검출가능하거나 비정상적으로 많은 양이 존재하는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 질환-연관된 병리학, 증상 또는 특징을 나타내는 이들 조직들을 포함한다. 일정 구현예들에서, 표적 조직들은 결핍 리소좀 효소가 올라간 수준으로 정상적으로 발현되는 이들 조직들을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 표적 조직인 뇌 표적 조직, 척수 표적 조직 및/또는 말초 표적 조직일 수 있다. 대표적인 표적 조직들은 하기에 상술되고 있다.
뇌 표적 조직들
일반적으로, 뇌는 서로 다른 부위들, 층들 및 조직들로 구분될 수 있다. 예를 들어, 뇌척수막 조직은 뇌를 포함하는 중추신경계를 감싸는 막들의 시스템이다. 뇌척수막들은 경질막, 거미막 및 연질막을 포함하는 세 가지의 층들을 포함한다. 일반적으로, 뇌척수막 및 뇌척수액의 일차적인 기능은 중추신경계를 보호하는 것이다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 단백질은 뇌척수막들의 하나 이상의 층들로 전달된다.
뇌는 대뇌 (cerebrum), 소뇌 (cerebellum), 및 뇌줄기 (brain stem)를 포함하는 세 가지의 일차 소구분들을 가진다. 대뇌 반구들 (cerebral hemispheres)는 뇌 구조들의 가장 위에 위치하고 피질층 (cortical layer)으로 덮혀있다. 뇌줄기는 대뇌가 부착되는 줄기와 유사하고 대뇌 아래에 놓여있다. 뇌의 후반구에는, 소뇌가 대뇌 아래 및 뇌줄기 뒤에 있다.
뇌의 중간선 근처에 또한 중뇌 (mesencephalon) 위에 위치하는 간뇌 (diencephalon)는 시상 (thalamus), 시상 후부 (metathalamus), 시상 하부 (hypothalamus), 시상 상부 (epithalamus), 시상 전부 (prethalamus), 및 덮개 전부 (pretectum)를 포함한다. 중간뇌라고도 불리는 중뇌는 덮개 (tectum), 뒷판 (tegumentum), 뇌실 중배강 (ventricular mesocoelia), 및 대뇌다리 (cerebral peduncels), 적색핵, 및 뇌신경 III 핵을 포함한다. 중뇌는 시각, 청각, 운동 조절, 수면/기상, 각성 및 온도 조절과 연관되어 있다.
뇌를 포함하는 중추신경계의 조직들의 부위들은 조직의 깊이를 기초로 하여 특징지어진다. 예를 들어, CNS (예로, 뇌) 조직들은 표면 또는 얕은 조직들, 중간-깊이 조직들, 및/또는 깊은 조직들로서 특징지어진다.
본 발명에 따르면, 치료제 (예로, 대체 효소)는 개체에서 치료될 특정한 질환과 연관된 적절한 뇌 표적 조직(들)이라면 모두로 전달될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제 (예로, 대체 효소)는 표면 또는 얕은 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 중간-깊이 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 깊은 뇌 표적 조직으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 표면 또는 얕은 뇌 표적 조직, 중간-깊이 뇌 표적 조직, 및/또는 깊은 뇌 표적 조직의 조합으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료제는 뇌의 외부 표면 아래로 (또는 내부로) 적어도 4 mm, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm 이상의 깊은 뇌 표적 조직으로 전달된다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 대뇌의 표면 또는 얕은 조직들의 하나 이상으로 전달된다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 대뇌의 표면으로부터 4 mm 이내에 위치한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 연질막 조직들, 대뇌 피질 리본 조직들, 해마, 버코우 로빈 공간 (Virchow Robin space), VR 공간 내의 혈관들, 해마, 뇌의 하부 표면 상의 시상하부의 일부들, 시신경들 및 관들, 후각 망울 및 돌출부들, 또한 그들의 조합으로부터 선택된다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 하나 이상의 대뇌의 깊은 조직들로 전달된다. 일정의 구현예들에서, 표적된 표면 또는 얕은 조직들은 대뇌의 표면 아래로 (또는 내부로) 4 mm (예로, 5 mm, 6 mm, 7 mm, 8 mm, 9 mm, 또는 10 mm)에 위치한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 깊은 조직들은 대뇌 피질 리본을 포함한다. 일정 구현예들에서, 대뇌의 표적된 깊은 조직들은 하나 이상의 간뇌 (예로, 시상하부, 시상, 시상 전부, 시상 아래부 등), 후뇌, 렌즈핵 (lentiform nuclei), 기저 신경절 (basal ganglia), 미상엽 (caudate), 조가비핵 (putamen), 편도핵 (amygdale), 창백핵 (globus pallidus), 및 그들의 조합을 포함한다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 소뇌의 하나 이상의 조직들로 전달된다. 소정의 구현예들에서, 소뇌의 표적된 하나 이상의 조직들은 분자층 의 조직들, 퍼킨지 세포층 (Purkinje cell layer), 과립 세포층 (granular cell layer)의 조직들, 대뇌다리, 및 그들의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 퍼킨지 세포층의 조직들, 과립 세포층의 조직들, 깊은 소뇌 백색질 조직 (예로, 과립 세포층에 대비하여 깊음), 및 깊은 소뇌 핵 조직을 포함하는 소뇌의 하나 이상의 깊은 조직들로 전달된다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 뇌줄기의 하나 이상의 조직들로 전달된다. 일정의 구현예들에서, 뇌줄기의 표적된 하나 이상의 조직들은 뇌 줄기 백색질 조직 및/또는 뇌줄기 핵 조직을 포함한다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 회색질, 백색질, 뇌실주위 영역들, 연질-거미막, 뇌척수막, 신생피질 (neocortex), 소뇌, 대뇌 피질에서의 깊은 조직들, 분자층, 미상엽핵/조가비핵 부위, 중간뇌, 교뇌 (pons) 또는 연수 (medulla)의 깊은 부위들, 및 그들의 조합을 포함하는 다양한 뇌 조직들로 전달된다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은, 이에 제한되는 것은 아니지만 뉴런들. 아교세포들, 혈관주위 세포들 및/또는 뇌척수막 세포들을 포함하는 다양한 세포들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 치료적 단백질은 깊은 백색질의 희소돌기아교세포들 (oligodendrocytes)로 전달된다.
척수
일반적으로, 척수의 부위들 또는 조직들은 조직들의 깊이를 기초로 하여 특징지어질 수 있다. 예를 들어, 척수 조직들은 표면 또는 얕은 조직들, 중간-깊이 조직들, 및/또는 깊은 조직들로서 특징지어질 수 있다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 척수의 하나 이상의 표면 또는 얕은 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 표면 또는 얕은 조직은 척수의 표면으로부터 4 mm 이내에 위치한다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 표면 또는 얕은 조직은 연질막 및/또는 백색질의 관들을 포함한다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 척수의 하나 이상의 깊은 조직들로 전달된다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 깊은 조직은 척수의 표면으로부터 4 mm 내부에 위치한다. 일정 구현예들에서, 척수의 표적된 깊은 조직은 척수 회색질 및/또는 뇌실막 세포들을 포함한다.
일정 구현예들에서, 치료제들 (예로, 효소들)은 척수의 뉴런들로 전달된다.
말초 표적 조직들
본 명세서에서 사용되는 바, 말초 기관들 또는 조직들은 중추신경계 (CNS)의 일부가 아닌 기관들 또는 조직들이라면 모두를 말한다. 말초 표적 조직들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 간, 신장, 및/또는 심장, 내피세포, 골수 및 세포들로부터 유래한 골수, 비장, 폐, 림프절, 뼈 및 연골, 난소 및 정소를 포함할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료적 단백질 (예로, 대체 효소)는 하나 이상의 말초 표적 조직들로 전달된다.
생체분배 및 생물 유용성
다양한 구현예들에서, 일단 표적 조직으로 전달되면 치료제 (예로, 대체 효소)는 세포 내에 정착된다. 예를 들어, 치료제 (예로, 효소)는 표적 세포 (예로, 퍼킨지 세포들과 같은 뉴런들)의 엑손들, 축삭들, 리소좀들, 미토콘드리아 또는 소포들에 정착될 수 있다. 예를 들어, 일정 구현예들에서 경막내-투여된 효소들은 전위 역학 (translocation dynamics)을 나타내어 효소는 혈관 주위 공간 내에서 움직인다 (예로, 박동성 전도 기작들 (pulsation-assisted convective mechanisms)에 의함). 또한, 투여된 단백질 또는 효소의 신경미세섬유 (neurofilaments)와 연결과 관련된 활동성 축삭 전달기작들도 역시 중축신경계의 심부 조직들 내로 경막내-투여된 단백질들 또는 효소들의 분배에 기여하거나 다른 경우라면 이를 용이하게 할 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달된 치료제 (예로, 대체 효소)는 본 명세서에서 기술된 다양한 표적 조직들에서 치료적 또는 임상적 유효 수준들 또는 활성들을 달성할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 바, 치료적 또는 임상적 유효 수준 또는 활성은 표적 조직에서 치료적 효과를 부여하는 데 충분한 수준 또는 활성이다. 치료적 효과는 객관적 (예로, 일정 테스트 또는 마커에 의해 측정가능함) 또는 주관적 (예로, 개체가 효과의 표시를 주거나 느낌)일 수 있다. 예를 들어, 치료적 또는 임상적 유효 수준 또는 활성은 표적 조직에서 질환과 연관된 증상들 (예로, GAG 축적)을 개선시키는 데 충분한 효소적 수준 또는 활성일 수 있다
일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 표적 조직에서 해당하는 리소좀 효소의 정상적인 수준 또는 활성의 적어도 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%가 되는 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 대조군 (예로, 치료가 없는 내인성 수준들 또는 활성들)과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 증가되는 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 표적 조직에서 적어도 대략 10 nmol/hr/mg, 20 nmol/hr/mg, 40 nmol/hr/mg, 50 nmol/hr/mg, 60 nmol/hr/mg, 70 nmol/hr/mg, 80 nmol/hr/mg, 90 nmol/hr/mg, 100 nmol/hr/mg, 150 nmol/hr/mg, 200 nmol/hr/mg, 250 nmol/hr/mg, 300 nmol/hr/mg, 350 nmol/hr/mg, 400 nmol/hr/mg, 450 nmol/hr/mg, 500 nmol/hr/mg, 550 nmol/hr/mg 또는 600 nmol/hr/mg로 증가된 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 상세하게 요추 부위를 표적하는 데 유용하다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 요추 부위에서 적어도 대략 500 nmol/hr/mg, 600 nmol/hr/mg, 700 nmol/hr/mg, 800 nmol/hr/mg, 900 nmol/hr/mg, 1000 nmol/hr/mg, 1500 nmol/hr/mg, 2000 nmol/hr/mg, 3000 nmol/hr/mg, 4000 nmol/hr/mg, 5000 nmol/hr/mg, 6000 nmol/hr/mg, 7000 nmol/hr/mg, 8000 nmol/hr/mg, 9000 nmol/hr/mg, 또는 10,000 nmol/hr/mg로 증가된 효소적 수준 또는 활성을 달성할 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 CSF 또한 뇌, 척수, 및 말초 기관들의 표적 조직들에서 충분하게 긴 반감기를 가진다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 적어도 대략 30분, 45분, 60분, 90분, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 8시간, 9시간, 10시간, 12시간, 16시간, 18시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 3일까지, 7일까지, 14일까지, 21일까지 또는 한 달까지의 반감기를 가질 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 투여에 이어서12시간, 24시간, 30시간, 36시간, 42시간, 48시간, 54시간, 60시간, 66시간, 72시간, 78시간, 84시간, 90시간, 96시간, 102시간 또는 한 주 이후에 CSF 또는 혈류에서 검출가능한 수준 또는 활성을 보유할 수 있다. 검출가능한 수준 또는 활성은 당해 기술분야에 알려져 있는 다양한 방법들을 사용하여 결정될 수 있다.
소정의 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 투여에 이어서 (예로, 개체에게 약제학적 조성물의 경막내 투여에 이어서 한 주, 3일, 48시간, 36시간, 24시간, 18시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 30분 이하) 개체의 CNS 조직들 및 세포들에서 적어도 30ug/ml의 농도를 달성하고 있다. 소정의 구현예들에서, 본 발명에 따라 전달되는 치료제 (예로, 대체 효소)는 이러한 개체로의 투여에 이어서 (예로, 개체에게 약제학적 조성물의 경막내 투여에 이어서 한 주, 3일, 48시간, 36시간, 24시간, 18시간, 12시간, 8시간, 6시간, 4시간, 3시간, 2시간, 1시간, 30분 이하) 개체의 표적된 조직들 또는 세포들 (예로, 뇌 조직들 또는 뉴런들)에서 적어도 20ug/ml, 적어도 15ug/ml, 적어도 10ug/ml, 적어도 7.5ug/ml, 적어도 5ug/ml, 적어도 2.5ug/ml, 적어도 1.0ug/ml, 또는 적어도0.5ug/ml의 농도를 달성하고 있다.
경막내 투여에 의한 리소좀 축적병의 치료
리소좀 축적병은 리소좀 기능에서의 결함들로부터 발생하는 비교적 희귀한 유전되는 대사 장애들의 그룹을 대표한다. 리소좀 질환들은 리소좀들 내에 이들 효소 기질들을 포함하는 미소화된 (undigested) 거대분자들의 축적을 특징으로 하고 (표 1 참조), 이는 이러한 리소좀들의 크기 및 숫자에서 증가를 또한 궁극적으로 세포성 기능이상 및 임상적 이상들을 가져온다.
유익하게, 본 명세서에서 기술된 발명적 방법들은 표적된 소기관들에게로 하나 이상의 치료제들 (예로, 하나 이상의 대체 효소들)의 전달을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병은 침범된 세포들의 리소좀들에서 글리코사미노글리칸 (GAG)의 축적을 특징으로 하고, 리소좀들은 리소좀 축적병들의 치료를 위한 원하는 표적 소기관을 대표한다.
상세하게, 본 발명의 발명적 방법들 및 조성물들은 CNS 병인학 또는 성분을 가지는 이들 질환들을 치료하는 데 유용하다. CNS 병인학 또는 성분을 가지는 리소좀 축적병들은 예를 들어 제한 없이 산필리포 증후군 A형, 산필리포 증후군 B형, 헌터 증후군, 이염색성 백색질 장애 빛 구형세포 백색질 장애를 포함한다. 본 발명의 이전에, 통상적인 요법들은 개체들에게 정맥내로 투여하는 것에 제한되고, 일반적으로 내재된 효소 결합의 신체 증상들을 치료하는 데만 효과적이다. 유익하게, 본 발명의 조성물들 및 방법들은 이러한 CNS 병인학을 가지는 질환을 앓고 있는 개체의 CNS 내로 직접 투여되 고 이에 의해 CNS (예로, 뇌)의 영향받은 세포들 및 조직들 내에서 치료적 농도를 달성할 수 있고, 따라서 이러한 치료제들의 통상적인 전신적 투여와 연관된 문제점들을 극복할 수 있다.
일정 구현예들에서, 본 발명의 발명적 조성물들은 리소좀 축적병들의 신경적 및 신체적 후유증 또는 증상들 둘 다를 치료하는데 유용하다. 예를 들어, 본 발명의 일정 구현예들은 리소좀 축적병의 CNS 또는 신경적 후유증 및 소견들의 치료를 위해 개체의 CNS에 하나 이상의 치료제들을 (예로, 경막내, 뇌실내 또는 대수공내) 전달하는 한편 본 리소좀 축적병의 전신적 또는 신체적 소견들을 치료하는 조성물들 및 방법들에 관한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 일정 조성물들은 개체에게 경막내로 투여되고, 이에 의해 개체의 CNS 로 치료제들을 전달하고 신경학적 후유증을 치료할 수 있으며, 이러한 치료제들을 전신적 순환의 세포들 및 조직들 (예로, 심장, 폐들, 간, 신장 또는 림프절들의 세포들 및 조직들) 둘 다로 전달하여 신체적 후유증을 치료하도록 하나 이상의 치료제들의 정맥내 투여와 결합될 수 있다. 예를 들어, 리소좀 축적병 (예로, 헌터 증후군)을 가지거나 이에 의해 침범된 개체에게 신경학적 후유증을 치료하도록 하나 이상의 치료제들 (예로, 이듀로네이트-2-설파타제)을 포함하는 약제학적 조성물이 적어도 매주, 격주, 매월, 2개월마다 또는 그 이상마다 한 번 투여될 수 있고, 한편 서로 다른 치료제가 개체에게 질환의 전신적 또는 신체적 소견들을 치료하도록 더 빈번하게 (예로, 매일, 격일, 매주 세 번 또는 매주) 정맥내 투여된다.
예를 들어, 헌터 증후군을 않고 있는 환자들은 위축 (atrophy), 피질 뉴런 종창 (cortical neuronal swelling), 대뇌 백색질 감소, 확장된 혈관주위 공간들 및 퍼킨지 세포 가지 종창 (Purkinje cell dendrite swelling)를 포함할 수 있는 뇌에서의 조직학적인 변화들을 나타낸다. 자기 공명 영상화/분광분석 연구들은 백색질이 관여하는 심각한 확장 상처들, 뇌 위축, 및 수두증 (hydrocephalus)은 장애가 없는 것들과 대비하여 인지 장애를 가지는 환자들에서 더욱 공통적이었던 점을 보여주었다 (Vedolin, L., et al., AJNR Am J Neuroradiol (2007) 28, 1029-1033). 정신지체 또는 발달 지연들과 같은 극단적인 신경학적 후유증이 없는 환자들이라도 위축, 뇌실비대, 및 확장된 혈관주위 공간들을 포함하였던 뇌 이상들을 가지는 것으로 확인되었다. (Matheus, MG, et al., Neuroradiology (2004) 46, 666-672.)
비-제한적인 예로서, 점액다당류증 제 IIIA형 (MPS IIIA; 산필리포 증후군 A형)은 가장 심한 형태의 산필리포 증후군 A형이고 전세계적으로 인구 100,000명 당 대략 1명이 걸린다. 산필리포 증후군 A형 (산필리포 A형)은 글리코사미노글리칸 (GAG) 헤파란 설페이트의 리소좀 이화작용에 관여하는 효소 헤파란 N-설페이트 (HNS)의 결핍을 특징으로 한다 (Neufeld EF, et al. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease (2001) pp. 3421-3452). 본 효소의 부재 시, GAG 헤파란 설페이트가 뇌의 외부에는 더 적게 축적되면서 뉴런들 및 아교세포들의 리소좀에 축적된다.
비-제한적인 예로서, 점액다당류증 제 IIIB형 (MPS IIIB; 산필리포 증후군 B형 질환)은 알파-N-아세틸-글루코사미니다제 (Naglu)의 결핍을 특징으로 하는 상염색체 열성 장애이다. 본 효소의 부재 시, GAG 헤파란 설페이트가 뇌의 외부에는 더 적게 축적되면서 뉴런들 및 아교세포들의 리소좀에 축적된다.
비-제한적인 예로서, 구현세포 백색질장애 (GLD)는 갈락토세레브로시다제 (GALC)의 기능 결함에 의해 초래되는 희귀한 상염색체 열성 리소좀 축적 장애이다. GALC는 미엘린의 정상적인 성분인 갈락토실세라마이드를 갈락토스 및 세라마이드로 또한 갈락토실세라마이드 합성의 독성 부산물인 사이코신 (psychosine) (갈락토실스핑고신 (galactosylsphingosine))을 갈락토스 및 스핑고신으로 분해하는 용해성 리소좀 산 가수분해 효소이다. GALC 결핍은 두 개의 관련되지만 구분되는 경로들로 중앙 및 말초 신경계 (각각 CNS 및 PNS)의 신경학적 손상을 유발한다. 첫 번째 경로는 미엘린화 세포들의 결과적인 사멸 (apoptosis)과 함께 과다한 사이코신 축적을 유발한다. 두 번째 경로에서는, 갈락토실세라마이드가 축적되고 활성화된 미세교아세포에 포식되어 질환이 명명된 특징적인 구형세포를 생산한다. 분해되지 않은 기질을 축적하는 다른 리소좀 축적병들과 대조하여, 일반적으로 신경 조직에서는 전체 갈락토실세라마이드에서 증가가 전혀 없다.
본 장애의 명확한 임상적 특징은 중추신경계 (CNS)의 퇴화이고, 이는 주요 발단 지표들의 소실, 또는 이를 획득하는 데 부전을 유발한다. 진행성 인지 감소는 치매 및 조기 사망으로 이어진다. 질환은 어린 아이들 (조기 발병 GLD), 또는 나이든 개인들 누구라도 (만기 발병 GLD) 걸릴 수 있다. 전형적으로 조기-발병 GLD으로 침범된 개인의 수명은 2년의 연령을 넘어 연장되지 못한다. 만기-발병 GLD나이든 개인들 누구에게도 출현할 수 있고 질환의 진행은 매우 다양해질 수 있다.
이염색성 백색질장애 질환 (MLD)은 효소 아릴설파타제 A (ASA)의 결합으로부터 유발되는 상염색체 열성 장애이다. 인간들에서 ARSA 유전자에 의해 인코드되는 ASA는 세레브로사이드 3-설페이트 또는 스핑고지질 3-O-설포갈락토실세라마이드 (설파타이드)를 세레브로사이드 및 설페이트로 자르는 효소이다. 본 효소의 부재 시, 설파타이드들이 신경계에 (예로, 미엘린초들, 뉴런들 및 아교세포들) 축적되고 내장 기관들에는 적은 정도로 축적된다. 이들 분자성 및 세포성 사건들의 결과는 CNS 및 PNS 내에서 진행성 미엘린화 및 축삭 소실이고, 이는 심각한 운동 및 인지 기능이상이 임상적으로 동반된다.
본 장애의 명확한 임상적 특징은 중추신경계 (CNS)의 퇴화이고, 이는 인지 장애 (예로, 무엇보다도 정신 지체, 신경 장애들 및 실명)을 유발한다.
비-제한적인 예로서, MLD는 어린 아이들 (만기-소아 형태)에서 발현될 수 있고, 전형적으로 침범된 어린이들은 인생의 첫 해 직후 (예로, 약 15 내지 24개월)에 증상을 나타내기 시작하고, 일반적으로 5년의 연령을 넘어 생존하지 못한다. MLD는 어린이들 (소아 형태)에서 발현될 수 있고, 전형적으로 침범된 어린이들은 약 3 내지 10년의 연령까지 인지 장애를 나타내고, 수명은 다양해질 수 있다 (예로, 증상들의 발병 이후 10 내지 15년의 범위).
따라서, 일정 구현예들에서, 발명적 방법들 및 조성물들은 다양한 리소좀 축적병들을 효과적으로 치료하도록 표적 조직들 및 뇌, 척수 및/또는 말초 기관들의 세포들의 하나 이상의 소기관들 (예로, 리소좀들)로 하나 이상의 치료제들 (예로, 하나 이상의 대체 효소들)을 전달한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "치료하다" 또는 "치료"는 질환과 연관된 하나 이상의 증상들의 개선, 질환의 하나 이상 증상들의 발병 예방 또는 지연, 및/또는 질환의 하나 이상 증상들의 중증도 또는 빈도의 감소를 말한다.
일정 구현예들에서, 치료는 리소좀 축적병을 앓고 있거나 이에 취약한 환자에서 신경학적 손상의 부분적 또는 완벽한 완화, 개선, 안정, 억제, 발병의 지연, 중증도 및/또는 발생의 감소를 말한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "신경학적 손상 (neurological impairment)"은 중추신경계 (예로, 뇌 및 척수)의 손상과 연관된 다양한 증상들을 포함한다. 예를 들어, 신경학적 손상의 증상들은 발달 지연, 진행성 정신지체, 청력 상실, 손상된 언어 발달, 운동 능력들의 결여, 과다활동, 공격성 및/또는 수면 방해들을 포함할 수 있다.
일정 구현예들에서, 치료는 다양한 조직들에서 감소된 리소좀 축적 (예로, GAG와 같은 축적된 거대분자들)을 말한다. 일정 구현예들에서, 치료는 뇌 표적 조직들, 척수 뉴런들, 및/또는 말단 표적 조직들에서 감소된 리소좀 축적을 말한다. 소정의 구현예들에서, 리소좀 축적은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 리소좀 축적은 대조군과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 감소된다. 일정 구현예들에서, 리소좀 축적은 리소좀 축적 과립들 (예로, 얼룩무늬 모양)의 존재에 의해 측정된다.
일정 구현예들에서, 치료는 뉴런들 (예로, 퍼킨지 세포들을 포함하는 뉴런들)에서 감소된 공포화 (vacuolization)를 말한다. 소정의 구현예들에서, 공포화는 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 공포화는 대조군과 대비하여 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 6배, 7배, 8배, 9배 또는 10배로 감소된다.
소정의 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료는 리소좀 축적병들과 연관된 병리학적 또는 생물학적 마커들 하나 이상의 존재, 또는 임의적으로 축적의 감소 (예로, 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 40%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97.5%, 또는 99% 이상의 감소) 또는 완벽한 제거를 가져온다. 상세하게 이러한 감소 또는 제거는 CNS의 세포들 및 조직들 (예로, 뉴런들 및 희소돌기아교세포들)에서 입증될 수 있다. 예를 들어, 일정 구현예들에서, 개체에게 투여 시 본 발명의 약제학적 조성물들은 개체의 CNS 세포들 및 조직들에서 (예로, 대뇌 피질, 소뇌, 미상엽 핵 및 조가비핵, 백색질 및/또는 시상에서) 막 단백질 1 (LAMP1) 연관된 리소좀 바이오마커의 축적에서의 감소를 나타내거나 성취한다. LAMP1은 리소좀 막들에서 높게 발현되는 당단백질이고 그의 존재는 리소좀 축적 장애를 가지는 많은 환자들에서 올라간다 (Meikle, et al. Clin. Chem. (1997)43:1325-1335.). 따라서, 리소좀 축적병을 가진 환자들에서 LAMP1의 존재 또는 부재 (예로, LAMP 염색에 의해 결정되는 바와 같음)는 리소좀 활성의 유용한 표시자 및 리소좀 축적병들의 진단 및 감시 둘 다를 위한 마커를 제공할 수 있다.
따라서, 본 발명의 일정 구현예들은 질환 (예로, 리소좀 축적병)과 연관된 하나 이상의 병리학적 또는 생물학적 마커들의 존재 또는 축적을 감소시키거나 다른 경우라면 제거하는 방법들에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명의 일정 구현예들은 리소좀 축적병들과 연관된 하나 이상의 병리학적 또는 생물학적 마커들 (예로, LAMP1)의 분해 (또는 분해율)을 증가시키는 방법들에 관한 것이다.
일정 구현예들에서, 치료는 인지 능력 상실의 진행 감소를 말한다. 소정의 구현예들에서, 인지 능력 상실의 진행은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다. 일정 구현예들에서, 치료는 감소된 발달 지연을 말한다. 소정의 구현예들에서, 발달 지연은 대조군과 대비하여 약 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100% 이상으로 감소된다.
일정 구현예들에서, 치료는 증가된 생존 (예로, 생존 시간)을 말한다. 예를 들어, 치료는 환자의 증가된 수명 기대치를 가져올 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명 에 따른 치료는 한 명 이상의 유사한 질환을 가진 대조군 개인들의 치료가 없는 평균 수명 기대치와 대비하여 약 5%, 약 10%, 약 15%, 약 20%, 약 25%, 약 30%, 약 35%, 약 40%, 약 45%, 약 50%, 약 55%, 약 60%, 약 65%, 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 약 95%, 약 100%, 약 105%, 약 110%, 약 115%, 약 120%, 약 125%, 약 130%, 약 135%, 약 140%, 약 145%, 약 150%, 약 155%, 약 160%, 약 165%, 약 170%, 약 175%, 약 180%, 약 185%, 약 190%, 약 195%, 또는 약 200% 이상으로 증가된 수명 기대치를 가져온다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료는 한 명 이상의 유사한 질환을 가진 대조군 개인들의 치료가 없는 평균 수명 기대치와 대비하여 약 6개월, 약 7개월, 약 8개월, 약 9개월, 약 10개월, 약 11개월, 약 12개월, 약 2년, 약 3년, 약 4년, 약 5년, 약 6년, 약 7년, 약 8년, 약 9년, 또는 약 10년 이상으로 증가된 수명 기대치를 가져온다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 치료는 환자의 강기 생존을 가져온다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "장기 생존 (long term survival)"은 40년, 45년, 50년, 55년, 또는 60년 이상보다 긴 수명 기대치의 생존 시간을 말한다.
본 명세서에서 사용되는 바, 용어들 "개선하다", "증가하다" 또는 "감소하다"는 대조군과 대비한 수치들을 가르킨다. 일정 구현예들에서, 적합한 대조군은 본 명세서에서 기술된 치료의 개시 이전에 동일한 개인에서의 측정 또는 본 명세서에서 기술된 치료의 부재 시 대조군 개인에서의 측정과 같은 기저선 측정이다. "대조군 개인 (control individual)"은 (치료된 개인 및 대조군 개인(들)에서 질환의 단계들이 비교가능한 점을 입증하도록) 치료될 개인과 거의 동일한 연령 및/또는 성별인 동일한 질환을 앓고 있는 개인이다.
치료된 개인 ("환자" 또는 "개체"라고도 말함)은 질환을 가지거나 질환이 생길 잠재력을 가지는 개인 (태아, 유아, 아동, 청소년, 또는 어른 인간)이다. 개인은 남아있는 내인성 리소좀 효소 발현 및/또는 활성을 가지거나, 측정가능한 활성을 전혀 가지지 않을 수 있다. 예를 들어, 산필리포 증후군 A형을 가지는 개인은 약 30 내지 50% 이하, 약 25 내지 50% 이하, 약 20 내지 25% 이하, 약 15 내지 20% 이하, 약 10 내지 15% 이하, 약 5 내지 10% 이하, 약 0.1 내지 5% 이하의 정상적인 HNS 발현 수준들인 HNS 발현을 가질 수 있다.
면역 내성
일반적으로, 본 발명에 따른 치료제 (예로, 대체 효소)의 경막내 투여는 개체에서 심각한 역효과들을 유발하지 않는다. 본 명세서에서 사용되는 바, 심각한 역효과들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 실질적인 면역 반응, 독성, 또는 사망을 유도한다. 본 명세서에서 사용되는 바, 용어 "실질적인 면역 반응 (substantial immune response)"은 적응성 T-세포 면역 반응과 같은 중증 또는 심각한 면역 반응들을 말한다.
따라서, 많은 구현예들에서 본 발명에 따른 발명적 방법들은 동시적인 면역억제 요법 (예로, 전-치료/전-조정 또는 본 방법과 평등한 것으로서 사용되는 면역억제 요법이라면 모두)이 관여하지 않는다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 치료될 개인에서 면역 내성 유도가 관여하지 않는다. 일정 구현예들에서, 본 발명에 따른 발명적 방법들은 T-세포 면역억제제를 사용하는 개체의 전-치료 또는 전조정이 관여하지 않는다.
일정 구현예들에서, 치료제들의 경막내 투여는 이들 제제들에 대한 면역 반응을 유발시킬 수 있다. 따라서, 일정 구현예들에서, 개체가 효소 대체 요법에 내성을 가지는 대체 효소를 수여하도록 하는 것이 유용할 수 있다. 면역 내성은 당해 기술분야에서 알려져 있는 다양한 방법들을 사용하여 유도될 수 있다. 예를 들어, 사이클로스포린 A (CsA)와 같은 T-세포 면역억제제 또한 아자티오프린 (azathioprine, Aza)와 같은 항증식제의 초기 30 내지 60일 섭생이 원하는 대체 효소의 저용량들의 매주 경막내 주입들과 조합하여 사용될 수 있다.
당업자라면 숙지하고 있는 면역억제제라면 모두가 본 발명의 조합 요법과 함께 적용될 수 있다. 이러한 면역억제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 사이클로스포린 (cyclosporine), FK506, 라파마이신 (rapamycin), CTLA4-Ig, 및 에타너셉트 (etanercept)와 같은 항-TNF 제제들 (예로, Moder, 2000, Ann. Allergy Asthma Immunol. 84, 280-284; Nevins, 2000, Curr. Opin. Pediatr. 12, 146-150; Kurlberg et al., 2000, Scand. J. Immunol. 51, 224-230; Ideguchi et al., 2000, Neuroscience 95, 217-226; Potteret al., 1999, Ann. N.Y. Acad. Sci. 875, 159-174; Slavik et al., 1999, Immunol. Res. 19, 1-24; Gaziev et al., 1999, Bone Marrow Transplant. 25, 689-696; Henry, 1999, Clin. Transplant. 13, 209-220; Gummert et al., 1999, J. Am. Soc. Nephrol. 10, 1366-1380; Qi et al., 2000, Transplantation 69, 1275-1283 참조)를 포함한다. 이식 환자들에서 효과적인 것으로 확인되었던 항-IL2 수용체 (알파-단위체) 항체 다크리주마브 (daclizumab) (예로, 제나팍스 TM (Zenapax.TM.))도 역시 면역억제제로서 사용될 수 있다 (예로, Wiseman et al., 1999, Drugs 58, 1029-1042; Beniaminovitz et al., 2000, N. Engl J. Med. 342, 613-619; Ponticelli et al., 1999, Drugs R. D. 1, 55-60; Berard et al., 1999, Pharmacotherapy 19, 1127-1137; Eckhoff et al., 2000, Transplantation 69, 1867-1872; Ekberg et al., 2000, Transpl. Int. 13, 151-159 참조). 추가적인 면역억제제들로는, 이에 제한되는 것은 아니지만 항-CD2 (Branco et al., 1999, Transplantation 68, 1588-1596; Przepiorka et al., 1998, Blood 92, 4066-4071), anti-CD4 (Marinova-Mutafchieva et al., 2000, Arthritis Rheum. 43, 638-644; Fishwild et al., 1999, Clin. Immunol. 92, 138-152), 및 항-CD40 리간드 (Hong et al., 2000, Semin. Nephrol. 20, 108-125; Chirmule et al., 2000, J. Virol. 74, 3345-3352; Ito et al., 2000, J. Immunol. 164, 1230-1235)를 포함한다.
투여
본 발명의 발명적 방법들은 본 명세서에서 기술된 치료제들 (예로, 대체 효소)의 치료적 유효량의 단일 뿐만 아니라 다중 투여들을 고려하고 있다. 치료제들 (예로, 대체 효소들)은 개체의 조건 (예로, 리소좀 축적병)의 본성, 중증도 및 정도에 의존하여 규칙적인 간격들로 투여될 수 있다. 일정 구현예들에서, 본 발명의 치료제들 (예로, 대체 효소들)의 치료적 유효량은 규칙적인 간격들 (예로, 매년 한 번, 6개월마다 한 번, 5개월마다 한 번, 3개월마다 한 번, 격월 (2개월마다 한 번), 매월 (매월 한 번), 격주 (2주마다 한 번), 매주)로 경막내 투여될 수 있다.
일정 구현예들에서, 경막내 투여는 다른 경로들의 투여와 결합하여 사용될 수 있다 (예로, 정맥내, 피하, 근육내, 비경구, 경피적, 또는 경점막 (예로, 경구적 또는 비강내)). 일정 구현예들에서, 이들 다른 경로들의 투여 (예로, 정맥내 투여)는 격주, 매월, 2개월마다 한 번, 3개월마다 한 번, 4개월마다 한 번, 5개월마다 한 번, 6개월마다 한 번, 매년의 투여의 빈도로 수행될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 바, "치료적 유효량 (therapeutically effective amount)"은 주로 본 발명의 약제학적 조성물들에 포함되는 치료제의 전체량을 기초로 하여 결정된다. 일반적으로, 치료적 유효량은 개체에게 의미있는 유익을 주는 데 (예로, 내재된 질환 또는 병폐를 치료하고, 조정하고, 치유하고, 예방하고 및/또는 개선하는 데) 충분하다. 예를 들어, 치료적 유효량은 리소좀 효소 수용체들 또는 그들의 활성을 조정하여 이러한 리소좀 축적병 또는 그의 증상들을 치료 (예로, 개체에게 본 발명의 조성물들의 투여에 이어지는 "얼룩무늬체들 (zebra bodies)"의 존재 또는 출현 또는 세포성 공포화에서의 감소 또는 이의 제거)하는 데 충분량과 같은 원하는 치료적 및/또는 예방적 효과를 달성하는 데 충분량일 수 있다. 일반적으로, 필요로 하는 개체에게 투여되는 치료제 (예로, 재조합 리소좀 효소)의 양은 개체의 특징들에 의존할 것이다. 이러한 특징들은 개체의 병폐, 질환의 중증도, 일반적인 건강, 연령, 성별 및 체중을 포함한다. 당업자라면 이들 및 기타 다른 관련 요인들에 의존하여 적절한 용량들을 바로 결정할 것이다. 또한, 임의적으로 객관적 및 주관적인 검정법들 둘 다가 최적의 용량 범위들을 확인하도록 적용될 수 있다.
공통적으로 치료적 유효량은 다수의 단위 용량들을 포함할 수 있는 투여량 요법으로 투여된다. 특정한 치료적 단백질이라면 모두의 경우, 치료적 유효량 (및/또는 효과적인 투여량 요법 내의 적절한 단위 용량)은, 예를 들어 투여의 경로, 다른 약제학적 제제들과의 조합에 의존하여 다양해질 수 있다. 또한, 특정한 환자라면 모두를 위한 특이적 치료적 유효량 (및/또는 단위 용량)은 치료되는 장애 및 장애의 중증도; 적용되는 특이적 약제학적 제제의 활성; 적용되는 특이적 조성물; 환자의 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별 및 식이요법; 적용되는 특이적 융합 단백질의 투여 시간, 투여 경로, 및/또는 배출율 또는 대사율; 치료의 지속기간; 등의 의학적 기술분야들에 잘 알려져 있는 바와 같은 요인들을 포함하는 다양한 요인들에 의존할 수 있다.
일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 500 mg/kg 뇌 무게까지의 범위, 예로, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 400 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 300 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 200 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 100 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 90 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 80 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 70 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 60 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 50 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 40 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 30 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 25 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 20 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 15 mg/kg 뇌 무게까지, 약 0.005 mg/kg 뇌 무게로부터 10 mg/kg 뇌 무게까지의 범위이다.
일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 약 0.1 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 0.5 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 1.0 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 3 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 5 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 10 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 15 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 20 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 30 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 40 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 50 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 50 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 60 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 70 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 80 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 90 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 100 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 150 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 200 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 250 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 300 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 350 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 400 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 450 mg/kg 뇌 무게 이상, 약 500 mg/kg 뇌 무게 이상이다.
일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량도 역시 mg/kg 체중으로 정의될 수 있다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 뇌 무게들 및 체중들은 교정될 수 있다. Dekaban AS. "Changes in brain weights during the span of human life: relation of brain weights to body heights and body weights," Ann Neurol 1978; 4:345-56. 따라서, 일정 구현예들에서, 투여량은 표 4에 나타난 바와 같이 전환될 수 있다. 하기 표 4는 투여량 전환을 나타낸 것이다.
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일정 구현예들에서, 치료적 유효 용량은 또한 mg/15 cc CSF로 정의될 수 있다. 당업자라면 인정할 바와 같이, 뇌 무게들 및 체중들을 기초로 하는 치료적 유효 용량은 mg/15 cc CSF로 전환될 수 있다. 예를 들어, 어른 인간들에서 CSF의 부피는 대략 150 mL이다 (Johanson CE, et al. "Multiplicity of cerebrospinal fluid functions: New challenges in health and disease," Cerebrospinal Fluid Res. 2008 May 14;5:10). 따라서, 어른들에게 0.1 mg 내지 50 mg 단백질의 단일 용량 주사들은 어른들에서 대략 0.01 mg/15 cc CSF (0.1 mg) 내지 5.0 mg/15 cc CSF (50 mg) 용량들일 것이다.
좀 더 나아가, 특정한 개체라면 모두를 위해 특이적 투여량 요법들이 필요한 개인 및 투여하고 효소 대체 요법의 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 조절되어야 하고 또한 본 명세서에서 설명된 투여량 범위들이 대표적인 것일 뿐이고 청구된 발명의 범위 또는 관행을 제한하도록 의도하지는 않는 것으로 이해되어야 한다.
키트들
본 발명은 좀 더 나아가 본 발명의 제형물을 포함하는 키트들 또는 기타 물품들을 제공하고 그의 재구성 (동결건조된 경우) 및/또는 사용을 위한 지침들을 제공한다. 키트들 또는 기타 물품들은 용기, IDDD, 카테터 및 기타 물품들, 경막간 (interthecal) 투여 및 연관된 수술에 유용한 장치들 또는 장비를 포함할 수 있다. 예를 들어, 적합한 용기들은 병들, 바이알들, 주사기들 (예로, 미리-충전된 주사기들), 앰풀들, 카트리지들, 저장조들, 또는 동결건조-용기 (lyo-jects)를 포함한다. 일정 구현예들에서, 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질들로 만들어질 수 있다. 적합한 미리-충전된 주사기들은, 이에 제한되는 것은 아니지만 구운 실리콘 코팅을 가진 보로실리케이트 유리 주사기들, 분사된 실리콘을 가진 보로실리케이트 유리 주사기들, 또는 실리콘이 없는 플라스틱 레진 주사기들을 포함한다.
전형적으로, 용기들은 제형물을 보유할 수 있고, 재구성 및/또는 사용을 위한 안내들을 표시할 수 있는 라벨이 용기 위에 연결되어 있다. 예를 들어, 라벨은 제형물이 상기에 기술된 바와 같이 단백질 농도들로 재구성되는 것을 표시할 수 있다. 좀 더 나아가 라벨은 제형물이 예를 들어 IT 투여에 유용하거나 이를 의도하는 점을 표시할 수 있다. 일정 구현예들에서, 용기는 치료제 (예로, 대체 효소)를 포함하는 안정한 제형물의 단일 용량을 포함할 수 있다. 다양한 구현예들에서, 안정한 제형물의 단일 용량은 약 15 ml, 10 ml, 5.0 ml, 4.0 ml, 3.5 ml, 3.0 ml, 2.5 ml, 2.0 ml, 1.5 ml, 1.0 ml, 또는 0.5 ml 이하의 부피로 존재한다. 임의적으로, 제형물을 보유하는 용기는 제형물의 반복적 투여들 (예로, 2 내지 6회 투여들로부터)을 허용하는 다용도 바이알일 수 있다. 키트들 및 기타 다른 제조 물품들은 좀 더 나아가 적합한 희석제 (예로, BWFI, 식염수, 완충된 식염수)를 포함하는 두 번째 용기를 포함할 수 있다. 희석제 및 제형물의 혼합 시, 일반적으로 재구성된 제형물에서 최종 단백질 농도는 적어도 1 mg/ml (예로, 적어도 5 mg/ml, 적어도 10 mg/ml, 적어도 25 mg/ml, 적어도 50 mg/ml, 적어도 75 mg/ml, 적어도 100 mg/ml)일 것이다. 키트들 및 기타 다른 제조 물품들은 좀 더 나아가 시판 및 사용자의 관점으로부터 바람직한, 다른 완충액들, 희석제들, 필터들, 바늘들, IDDD들, 카테터들, 주사기들 및 사용 시 지침들을 가진 포장 삽입물들을 포함하는 기타 다른 물질들을 포함할 수 있다.
본 발명은 다음의 실시예들을 참조하여 보다 완벽하게 이해될 것이다. 그러나, 그들은 본 발명의 범위를 제한하는 것으로서 해석되지는 않는다. 모든 인용 문헌들은 참고문헌으로 통합되어 있다.
도면들은 제한하려는 것이 아니라, 단지 도시 (illustration)의 목적들을 위한 것이다.
도 1은 안전 기작을 가진 경막내 약물 전달 장치 (intrathecal drug delivery device, IDDD)의 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 2A IDDD가 놓여질 수 있는 환자의 신체 안에 대표적인 위치들을 나타낸 것이고; 도 2B는 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)의 다양한 구성요소들을 나타낸 것이고; 또한 도 2C는 IT-요추 주사를 위한 환자의 신체 안의 대표적인 삽입 위치를 나타낸 것이다.
도 3은 어른 원숭이들에서 테스트된 운반체들 (vehicles)을 요약한 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 4는 hGalC의 열적 검색에서GalC의 안정도를 pH의 함수로서 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 5는 hGalC의 특이 활성을 pH의 함수로서 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 6는 hGalC의 열적 검색을 염 농도의 함수로서 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 7은 5mM Na 포스페이트, pH 6.0 완충액에서 서로 다른 이온 강도들을 비교하는 GalC의 침전 속도 진행을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 도 7A는 50mM NaCl 및 hGalC를 사용하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 도 7B는 150mM NaCl 및 hGalC를 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 도 7C는 500 mM NaCl 및 hGalC를 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 도 7D는 150mM NaCl 및 마우스 GalC를 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 8은 GalC AUC 프로파일을 염 농도의 함수 (1mg/mL GalC, 5mM Na 포스페이트, pH 6.0)(Y 축 = s*g(s*); X 축 = s*)로서 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 9는 보편 완충액, pH 6.0 (Y-축 = <g(s*)/C0>(1/스베드베르그); X-축 = s*(스베드베르그))에서 hGalC의 일련 희석을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 10은 GalC AUC 프로파일을 pH의 함수 (1mg/mL, 50mM NaCl 을 가진 3mM 시트레이트, 포스페이트 및 보레이트 완충액)로서 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 11은 5mM Na 포스페이트 및 150mM NaCl에서 pH 6.0으로 최고 농도에서 WDA 분석으로부터 얻은 기저선 해독 (baseline reading)을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 12는 5mM Na 포스페이트 및 150mM NaCl에서 pH 6.0으로 최고 농도에서 WDA 분석으로부터 얻은 자극된 해독 (stressed reading)을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 13은 기저선 및 자극된 GalC 시료들을 그래프로 비교하고 중복시킨 것이다.
도 14는 1% NaTC의 존재 시 hGalC의 일련 희석을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 15는 1% NaTC의 존재 시 hGalC의 일련 희석을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다 (1.0mg/mL 및 0.3mg/mL).
도 16은 서로 다른 완충액들 및 pHs에서 hGalC (1mg/mL)의 내재 형광 (intrinsic fluorescence)을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 17은 hGalC 의 선회 편광분석 (circular dichroism)을 pH의 함수로서 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 18은 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청, 혈액 및 적혈구에서 방사능 활성의 그룹 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 19은 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청, 심장, 신장들, 간, 폐들, 비장에서 방사능 활성의 그룹 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 20은 125I-hGalC 의 단일 정맥내 일시 주사 (bolus injection)에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청, 심장, 신장들, 간, 폐들, 비장에서 방사능 활성의 그룹 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 21은 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여 및 정맥내 일시 주사에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청, 심장, 신장들, 간, 폐들, 비장에서 방사능 활성의 그룹 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 22는 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청 및 다양한 조직들 (지방 조직들 (신장 패스트), 부신들, 뼈 (대퇴), (골격)근, 좌골 신경)에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 23은 125I-hGalC 의 단일 정맥내 일시 주사에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청 및 다양한 조직들 (지방 조직들 (신장 패스트), 부신들, 뼈 (대퇴), (골격)근, 좌골 신경)에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 24는 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여 및 정맥내 일시 주사에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청 및 다양한 조직들 (지방 조직들 (신장 패스트), 부신들, 뼈 (대퇴), (골격)근, 좌골 신경)에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 25는 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청, 뇌척수액 및 다양한 기타 조직들에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 26는 125I-hGalC 의 단일 정맥내 일시 주사에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청, 뇌척수액 및 다양한 기타 조직들에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 27은 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여 및 정맥내 일시 주사에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청, 뇌척수액 및 다양한 기타 조직들에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 28은 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청 및 조직들에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 29는 125I-hGalC 의 단일 정맥내 일시 주사에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청 및 조직들에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 30은 125I-hGalC 의 단일 경막내 용량 투여 및 정맥내 일시 주사에 이어지는 수컷 스프라그-다우리 래트들의 혈청 및 조직들에서 방사능 활성의 평균 농도들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 31은 트위처 마우스에서 rmGalC의 IP 투여가 뇌 사이코신 수준들을 감소시키는 점을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 데이타는 치료 그룹 당 n=4 마우스의 평균 ℃± SEM를 나타낸다.
도 22는 ICV만 및 ICV/IP rmGalC 요법으로 증가된 생존을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 33은 트위처 마우스에서 rmGalC의 ICV 및 ICV/IP 주사들 이후에 뇌 사이코신이 유의하게 감소되는 점을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 34는 40 ug의 rmGalC로 치료된 트위처 마우스에서 관찰되는 조직학적 마커들에서의 향상을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 신경교 원섬유 산성 단백질 (GFAP)이 별아교세포 마커로서 사용되었다. Iba 1은 was used as a 미세교아세포/대식세포 마커로서 사용되었다. 리소좀 연관 막 단백질-1 (LAMP-1)은 리소좀 마커로서 사용되었다.
도 35는 rmGalC 또는 운반체의 단일 ICV 주사에 이어서 사이코신 재축적을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 36은 PND19/20에서 rmGalC의 단일 ICV 주사로 치료된 트위처 마우스에서 생존 백분율을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 데이타는 그룹 당 n= 8을 나타낸다.
도 37은 rmGalC and rhGalC로 ICV/IP 치료된 마우스에서 생존 백분율을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 38 은 rmGalC and rhGalC로 단일 ICV 치료된 마우스에서 보행 분석을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 39는 트위처 마우스에서 rmGalC 또는 rhGalC 에 대한 항원성 반응을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 40은 미처리 및 rhGalC-치료된 GLD 개들의 CSF에서 사이코신 수준들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 41는 소뇌에서 그룹 1 폴리클론 항체로 IT 주사된 GalC의 IHC 염색을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 42는 대뇌에서 그룹 2 폴리클론 항체로 IT 주사된 GalC의 IHC 염색을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 43은 대뇌에서 마우스 모노클론 항체로 IT 주사된 GalC의 IHC 염색을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 44는 대뇌에서 마우스 모노클론 항체로 IT 주사된 GalC의 IHC 염색을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 45은 간에서 마우스 모노클론 항체로 IT 주사된 GalC의 IHC 염색을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 46은 간에서 그룹 2 폴리클론 항체로 IT 주사된 GalC의 IHC 염색을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 47은 뇌에서 평균 GalC 활성을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 48은 간에서 평균 GalC 활성을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 49는 뇌에서 GalC 면역염색을 10배로 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 50는 뇌에서 GalC 면역염색을 40배로 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 51은 활성화된 미세교아세포의 Iba 염색을 40배로 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 52는 뇌에서 LFB/PAS 염색을 10배로 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다.
도 53은 I2S의 3번 용량의 경막내 주사들에 이어서 뇌의 표면을 감싸는 (화살표 머리) 뇌척수막 세포들의 층을 포함하는 대뇌 및 소뇌 피질에 있는 뉴런들 (화살표)에서 검출되는 I2S를 보여주는 대표적인 I2S IHC를 나타낸 것이다. 2번 용량 주사된 뇌들에서는 I2S IHC의 염색이 더 약하였다 (사진 미도시). 운반체 대조군 동물들의 뇌에 있는 세포 유형이라면 모두의 경우 양성 I2S 염색이 전혀 관찰되지 않았다. 40배.
도 54는 경막내-요추 I2S 주사들 이후 IKO마우스의 뇌에서 병리학의 대표적인 역전을 나타낸 것이다. H&E 염색된 뇌 조직들은 운반체 대조군 동물들에서 수많은 세포성 축적 공포들 (화살표)을 보여주었다. 세포성 공포화 (cellular vacuolation)는 3번 용량 (사진 미도시) 및 3번 용량 주사된 마우스 둘 다에서 뇌 전체를 통하여 감소되었다. 현저한 감소가 3번 주사된 마우스에서 확인되었다. 40배
도 55는 대표적인 LAMP-1의 면역조직화학적 염색을 나타낸 것이다. 운반체 대조군 마우스와 대비하여, I2S 치료의 2번 용량들 (사진 미도시) 및 3번 용량들 이후 뇌들에서 리소좀 활성의 현저한 감소가 있었다. 감소는 뇌 전체를 통한 부위들에서 LAMP-1 양성 세포들의 수 감소 및 더 옅은 염색 강도를 특징으로 한다. 40배.
도 56은 대뇌 피질 (Cortex), 미상엽핵 (CP), 시상 (TH), 백색질 (WM) 및 소뇌 (CBL)에 있는 야생형 (WT), 운반체 미치료 및 I2S (2 및 3번 용량들) 마우스 중의 평균 LAMP-1 양성 영역의 비교로부터 얻은 대표적인 형태측정 결과들 나타낸 것이다. 평가된 뇌의 모든 영역들에서 LAMP-1 양성 염색에서 유의한 감소가 있었던 점을 검증하였다. 데이타는 평균 ℃± s.d로서 나타낸다. # = P<0.05; * = P<0.01; ** = P<0.001.
도 57은 초구조적 수준에서 병리학적 향상들을 보여주는 뇌 세포들의 대표적인 전자현미경 사진들을 나타낸 것이다. 운반체 처리된 마우스의 뉴런들은 라멜라화된 봉입들, 얼룩무늬체-유사 구조들, 및 과립 축적 물질 (삽입)을 포함하는 공포들을 가졌고, 이는 I2S 주사된 마우스에서 감소되었다. 운반체 처리된 마우스의 희소돌기아교세포들은 큰 전자-발광 축적 공포들 (화살표)를 보여주었고 한편 I2S-주사된 마우스의 희소돌기아교세포들은 최소의 공포화를 가졌다. 척도 막대기: 뉴런들에서, 2um; 희소돌기아교세포들에서, 500 nm.
도 58은 I2S의 3번 용량들의 경막내 주사들에 이어서 간의 시누소이드 세포들에서 검출되는 I2S를 보여주는 대표적인 면역조직화학 결과들을 나타낸 것이다. 2번 용량 주사된 간들에서 2S IHC 염색은 더 약하였다 (사진 미도시). 운반체 조절된 동물들의 간에서는 양성 I2S 염색이 전혀 관찰되지 않았다. 40배.
도 59는 간으로부터 얻은 대표적인 조직을 나타낸 것이다. 심한 세포성 공포화 및 비정상적으로 높은 리소좀 활성이 H&E 염색에 의해 드러났고, 강한 LAMP-1 면역염색이 WT 마우스와 대비하여 운반체 조절된 동물들에서 확인되었다. 3 및 2번 (사진 미도시) 용량들의 I2S 처리로 경막내 치료 이후 세포성 공포화 및 LAMP-1 면역염색의 현저한 감소가 확인되었다. H&E 염색은 세포질내 공포화가 거의 정상적 간 세포 구조를 가지며 거의 완벽하게 사라지는 점을 드러냈다. H&E, 40배; LAMP-1, 20배.
도 60은 3 mg 처리 그룹 동물의 대뇌를 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 양성 I2S 염색이 뉴런들 및 뇌척수막세포들에서 관찰되었다. 4배.
도 61은 30 mg 처리 그룹 동물의 대뇌를 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 양성 I2S 염색이 뉴런들 및 뇌척수막세포들에서 관찰되었다. 4배.
도 62는 100 mg 처리 그룹 동물의 대뇌를 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 뉴런들 및 뇌척수막세포들에서의 양성 I2S 염색이 3 및 30 mg 처리 동물들에서보다 더 강하였다. 4배.
도 63은 150 mg 처리 그룹 동물의 대뇌를 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 큰 집단의 뉴런들이 강하게 양성인 뇌척수막 세포들과 함께 I2S 양성인 것으로 관찰되었다. 4배.
도 64는 30 mg 처리 그룹 동물에서 대뇌의 층 I 안에 있는 I2S 양성 뉴런들 및 교아세포들을 뇌척수막 세포들과 함께 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 40배.
도 65는 30 mg 처리 그룹 동물에서 대뇌의 층 III 안에 있는 I2S 양성 뉴런들, 교아세포들을 혈관주위 세포들과 함께 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 40배.
도 66은 30 mg 처리 그룹 동물에서 백색질에 인접한 대뇌의 층 IV 안에 있는 I2S 양성 뉴런들 및 교아세포들을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 40배.
도 67은 150 mg 처리 그룹의 뉴런들 (대뇌)에서 강한 양성 I2S 염색을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 100배.
도 68은 150 mg 처리 그룹에서 경부 척수의 I2S 면역염색을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 4배.
도 69는 150 mg 처리 그룹 동물의 요부 척수에서 강한 I2S 면역염색을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 4배.
도 70은 150 mg 처리 그룹 동물의 요부 절편에서 뇌척수막 세포들, 교아세포들, 및 신경외/신경주위/신경내막 (연결 세포들)의 강한 양성 I2S 면역염색을 보여주는 대표적인 조직들을 나타낸 것이다. 40배.
도 71은 150 mg 처리 그룹 동물의 요부 척수에 있는 뉴런들이 강한 I2S 양성인 점을 보여주는 그림을 나타낸 것이다. 4배.
도 72는 3 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 간으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 시누소이드 세포들만이 I2S 양성이었다. 40배.
도 73은 30 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 간으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 시누소이드 세포들 및 간세포들 (hepatocytes)이 I2S 양성이었다. 40배.
도 74는 100 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 간으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S 면역염색은 시누소이드 세포들 및 간세포들에서 강하였다. 40배.
도 75는 150 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 간으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 강한 양성 I2S 염색이 시누소이드 세포들 및 간세포들에서 확인되었다. 40배.
도 76은 3 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 심장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S 면역염색은 음성이었다. 40배.
도 77은 30 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 심장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 간질 세포들은 I2S 양성이었다. 40배.
도 378은 100 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 심장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S에 대한 양성 간질 세포 염색이 관찰되었다. 40배.
도 79는 150 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 심장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S에 대한 강한 양성 간질 세포 염색이 관찰되었다. 40배.
도 80은 3 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 신장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S 면역염색은 양성이었다. 40배.
도 81은 30 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 신장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 사구체 및 간질 세포들은 I2S 양성이었다.
도 82는 100 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 신장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. I2S에 대한 증가된 사구체 및 간질 세포 염색이 관찰되었다. 40배.
도 83은 150 mg 처리 그룹 동물로부터 나온 신장으로부터의 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 근위세관, 사구체 및 간질 세포들의 양성 I2S 염색이 관찰되었다. 40배.
도 84는 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 매주 용량들이 투여된 사이노몰 원숭이들의 CNS 조직들을 평가하는 면역조직화학 (IHC) 연구들의 결과들을 나타낸 것이다. (IHC)에 의해 결정된 바와 같이, CNS 전체를 통하여 I2S의 세포성 침전이 있었다. 회색질에서, I2S 가 모든 그룹들의 대뇌, 소뇌, 뇌줄기, 및 척수의 뉴런들에서 용량-의존적 방식으로 검출되었다. 더 높은 용량 그룹들의 표면 회색질에서는, 많은 뇌 뉴런들이 피질 표면에서 I2S 염색에 대해 양성이었다 (도 84A). I2S는 시상 (도 84B), 해마 (도 84C), 미상엽핵 (도 84D) 및 척수 (도 84E)에 있는 뉴런들에서도 역시 검출되었다. 뇌척수막 및 혈관주위 세포들도 역시 I2S 염색 양성이었다 (도 84F). 확인된 크기 막대는 25um에 해당한다.
도 85는 두개골 및 척수 풀들에서 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 청소를 투여에 이어진 시간과 대비하여 이러한 풀들에서 I2S양을 좌표 표시하여 그래프로 비교한 것이다.
도 86은 6개월 동안 비인간 영장류들에게 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 용량 의존적 회색질 침전을 나타낸 것이다. 도시된 염색 강도는 시상에서 이듀로네이트-2-설파타제의 축적과 부합한다. 본 도 86에서, 핵은 DAPI에 의해 반대염색되어 청색으로 나타나고 단백질 (I2S) 은 녹색으로 나타난다.
도 87은 6개월 기간 동안 단일 주사에 이어서 또한 다중 주사들에 이어서 비인간 영장류들에게 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 용량 의존적 축적을 나타낸 것이다. 도시된 염색 강도는 대뇌 피질에서 I2S단백질의 축적과 부합한다. 도 88은 영장류의 대뇌 전체를 통하여 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 세포성 정착을 나타낸 것이다. 도 88A는 영장류의 대뇌로부터 추출된 뇌 조직의 교차-단면을 나타내는 한편, 도 88B는 도 88A에서 확인된 단면의 백색질 조직들의 세 가지 영역들 (W1, W2 및 W3라고 명명됨), 뇌실 근처의 백색질 (VW) 및 표면 회색질 (SG) 조직들에 해당하는 부위의 특정한 영역들을 도시한다.
도 89A-D는 6개월 기간 동안 매주 주사들에 이어서 영장류에게 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 신경적 및 희소돌기아교세포 흡수 및 축삭 결합을 나타낸 것이다. 상세하게, 도 89A, 도 89B, 도 89C 및 도 89D는 영장류 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 대뇌 조직들의 필라멘트 염색을 도시하고 또한 도 87B에서 확인된 백색질 조직들의 세 가지 영역들 (W1, W2 및 W3라고 명명됨) 및 표면 회색질 (SG) 부위들에 각각 해당한다. 도 89B 및 도 89C는 W2 및 W3 백색질 조직들에서 경막내 투여된 I2S의 희소돌기아교세포 흡수 및 축삭 연관성을 각각 도시한다. 도 89D는 표면 회색질 (SG) 조직들에서 경막내 투여된 I2S의 신경적 흡수를 도시한다.
도 90은 비인간 영장류 (왼쪽 위 화살표들)의 뇌실 근처 백색질 (VW)에서 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 세포성 동정을 나타낸 것이다. 겹쳐진 그림에서 도시된 바와 같이 (오른쪽 아래 화살표들), 이듀로네이트-2-설파타제는 미엘린과 연관되지 않는다 (오른쪽 위). 본 도 90에서, 핵은 DAPI (왼쪽 아래)에 의해 반대염색되고 단백질 (I2S)은 왼쪽 위 박스에 나타난다.
도 91은 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S)의 단일 주사가 뇌실내 (ICV) 또는 경막내 (IT) 투여된 건강한 비글종 개들의 조직들에서의 염색을 나타낸 것이다. 그림들 a-h에서 도시된 바와 같이, I2S는 면역조직화학 (IHC)에 의해 결정된 바와 같이 IT 및 ICV 그룹들 둘 다의 회색질 전체를 통하여 널리 분포되었다. 그림 a 및 b는 대뇌 피질에서, 뉴런들이 IT 및 ICV 그룹들 둘 다에서 표면 분자층으로부터 깊은 내부 층까지 모두 6개의 뉴런 층들에서 I2S에 양성이었던 점을 도시한다. 그림 c 및 d는 IT 및 ICV 그룹들의 대뇌 피질에서, I2S가 퍼킨지 세포들을 포함하는 뉴런들에서 검출되었던 점을 도시한다. 그림 e 및 f은 IT 및 ICV 그룹들 둘 다에서 해마에 있는 큰 집단의 뉴런들은 I2S에 양성이었던 점을 도시한다. 마지막으로, 그림 g 및 h는 IT 및 ICV 둘 다의 그룹들에서 I2S 양성 뉴런들이 시상 및 미상엽 핵에서도 역시 발견되었던 점을 도시한다. 본 도 91에서, I2S 염색은 화살표들로 표시된다.
도 92는 미치료 또는 I2S가 경막내 투여된 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 녹아웃 (IKO) 마우스의 뇌들보 조직들을 비교하여 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 치료된 IKO 마우스는 I2S-치료된 IKO 마우스의 뇌들보 및 뇌활 조직들에서 소정의 리소좀 축적병들의 특징적인 세포성 공포화의 감소를 보여주었다.
도 93은 치료된 IKO 마우스 (도 93A)의 표면 대뇌 피질 조직들에서 리소좀 질환 병리학적 바이오마커인 리소좀 연관 막 단백질 (LAMP1)의 존재에서의 현저한 감소를 미치료된 IKO 대조군 마우스 (도 93B)과 대비하여 20 배 및 40배 둘 다의 확대 하로 나타낸 것이다.
도 94는 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 95는 대표적인 PORT-A-CATH® 로우 프로파일 경막내 이식가능한 접근 시스템을 나타낸 것이다.
도 96은 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 97은 CNS 효소 대체 요법 (ERT)을 위한 가정용 투여를 허용하는 대표적인 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 나타낸 것이다.
도 98은 뉴런들 (퍼킨지 세포들)에서 이듀설파제의 단일 뇌내 주사 이후에 공포화 효과를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 99는 뇌에서 용량 및 부위에 의한 I2S 활성을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 100은 대뇌 피질의 서로 다른 깊이들에서 이듀설파제의 면역조직화학적 정착 데이타를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 101은 이듀설파제로 경막내 투여에 이어지는 원숭이의 척수에서 I2S 활성을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 102는 이듀설파제로 경막내 투여에 이어지는 원숭이 간, 심장 및 신장에서 I2S 활성을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 103은 상승 헌터-IT 시험 프로그램을 위한 대표적인 모식도를 나타낸 것이다.
도 104는 30 mg 용량 이후에 뇌 조직의 다양한 단면들에서 I2S 농도들의 측정들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 서로 다른 좌표들은 서로 다른 측정 시간들에 해당한다.
도 105는 다양한 산물 농도들을 위한 다양한 투여 경로들에 의해 기간 동안 투여 이후 I2S 농도들의 측정들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 106은 사이노몰 원숭이에서 IV, IT-L, 또는 ICV 투여에 이어서 t=5 시간에 124I-표지된 이듀설파제-IT의 PET 영상화를 나타낸 것이다.
도 107은 정맥내 투여 이후에 혈청에서 ASA 농도 데이타를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 108은 IT-요추 투여 이후에 혈청에서 ASA 농도 데이타를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 109는 IV 투여 이후에 CSF에서 ASA 농도를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 110은 IT-요추 투여 이후에 CSF에서 ASA 농도를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 111은 치료 이후에 뇌 조직, 뇌척수막, 침윤물 (중간 및 고용량 그룹들, 둘 다의 성별)의 대표적인 사진들을 나타낸 것이다.
도 112는 치료 이후에 뇌 조직, 뇌척수막, 침윤물 (중간 및 고용량 그룹들, 둘 다의 성별)의 또 다른 대표적인 사진들을 나타낸 것이다.
도 113은 치료 이후에 뇌 조직, 혈관주위, 침윤물 (중간 용량 수컷들; 고용량 암컷들)의 대표적인 사진들을 나타낸 것이다.
도 114는 rhASA1으로 치료된 면역내성 MLD 마우스 척수의 대표적인 알시안 블루 염색. 또한 1, 8, 15 및 22일에 520 mg/kg 뇌 무게 용량들로 rhASA의 경막내 주사들 또는 운반체 대조군을 수여받았던 동물들에서 경부 척수의 알시안 블루 염색에 의해 결정되는 설파타이드 감소를 도시하는 결과들을 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, 경막내 주사된 rhASA로의 치료는 척수의 경부를 포함하는 척수에서 설파타이드 축적의 감소를 유도하였다.
도 115는 rhASA1로 치료된 면역내성 MLD 마우스로부터 얻은 알시안 블루 염색된 척수 단면들의 대표적인 형태측정 분석, 또한 전체 척수 (T-Spinal Cord), 전체 회색질 (T-GM), 요추 회색질 (L-GM), 경추 회색질 (C-GM), 전체 백색질 (T-WM), 요추 백색질 (L-WM), 및 경추 백색질 (C-WM)에서 알시안 블루의 광학 밀도를 도시하는 결과들을 나타낸 것이다. 도시된 바와 같이, rhASA 로 치료된 동물들에서는 운반체 대조군과 대비하여 알시안 블루 염색에서 통계적으로 유의한 감소가 관찰되었다.
도 116은 rhASA1로 치료된 면역내성 MLD 마우스의 백색질 (해마술)에서 대표적인 LAMP 염색의 감소를 나타내고, 면연조직화학에 의해 결정되는 해마술에서의 LAMP-1 수준들을 도시하는 대표적인 결과들을 나타낸 것이다. 확대 = 20배. 도시된 바와 같이, 경막내 주사된 rhASA로의 치료는 대뇌 백색질에서 LAMP-1의 감소를 유도하였다.
도 117은 rhASA1로 치료된 면역내성 MLD 마우스로부터 얻은 뇌의 LAMP 염색의 대표적인 형태측정 분석, 또한 20 mg/kg 정맥내 rhASA, 300 mg/kg 뇌 무게 경막내 rhASA, 520 mg/kg 뇌 무게 경막내 rhASA 또는 운반체 대조군으로 치료된 동물들의 뇌들보 (CC), 해마술 (F), 소뇌 백색질 (CB-WM) 및 뇌줄기 (BS)에서 LAMP-1 염색 강도를 도시하는 결과들을 나타낸 것이다.
도 118은 6개월 동안 격주 (EOW) IT 투여에 이어서 운반체-투여된 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 ASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 119는 6개월 동안 1.8 mg/용량으로 rhASA의 EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 ASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 120은 6개월 동안 6.0 mg/용량으로 rhASA의 EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 ASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 121은 6개월 동안 18.6 mg/용량으로 rhASA의 EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 122는 6개월 동안 EOW IT 투여 (PBS-대조군)에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 123은 6개월 동안 운반체의 EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 124는 6개월 동안 1.8 mg/용량으로 rhASA의 EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 125는 6개월 동안 6.0 mg/용량으로 rhASA의 EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 124는 6개월 동안 18.6 mg/용량으로 rhASA의 EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 (주요 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 127은 장치 대조군, 운반체, 1.8 mg, 6.0 mg 및 18.6 mg 처리된 동물들의 경우 뇌의 표면으로부터 얻은 선택된 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. (수컷 및 암컷 분리, 장치 대조군 데이타는 회복 부검으로부터, 다른 모든 데이타는 주요 부검으로부터 나온다)
도 128은 장치 대조군, 운반체, 1.8 mg, 6.0 mg 및 18.6 mg 처리된 동물들의 경우 뇌의 깊은 백색 영역으로부터 얻은 선택된 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. (수컷 및 암컷 분리, 장치 대조군 데이타는 회복 부검으로부터, 다른 모든 데이타는 주요 부검으로부터 나온다)
도 129는 장치 대조군, 운반체, 1.8 mg, 6.0 mg 및 18.6 mg 처리된 동물들의 경우 뇌의 깊은 회색 영역으로부터 얻은 선택된 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. (수컷 및 암컷 분리, 장치 대조군 데이타는 회복 부검으로부터, 다른 모든 데이타는 주요 부검으로부터 나온다)
도 130은 장치 대조군, 운반체, 1.8 mg, 6.0 mg 및 18.6 mg 처리된 동물들의 경우 다양한 부위들로부터 얻은 선택된 천자물들에서 rhASA 농도를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. (수컷 및 암컷 분리, 장치 대조군 데이타는 회복 부검으로부터, 다른 모든 데이타는 주요 부검으로부터 나온다)
도 131은 6개월 동안 EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 척수 단면들에서 rhASA 농도를 보여주는 (회복 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 132는 6개월 동안 (047-021) EOW IT 투여에 이어서 어린 사이노몰 원숭이들의 간에서 rhASA 농도를 보여주는 (회복 부검) 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 133은 피질하 WM, 뇌실주위 WM (및 깊은 백색질) 및 피질하 WM에서 뇌 천자물들의 해부적 위치들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 134는 뇌들보 및 뇌들보주위 피질하 WM, 속섬유막 - GPi, 속섬유막 -미상엽핵, 깊은 백색질, 피질하 WM 및 피질, 조가비핵, 및 일시적 피질하 WM 및 피질에서 뇌 천자물들의 해부적 위치들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 135는 깊은 회색질, 깊은 WM (전방 뇌실주위 및 피질하), 및 피질하 백색 및 피질 - 시상 표피에서 뇌 천자물들의 해부적 위치들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 136은 뇌들보 및 뇌들보주위 피질하 WM, 깊은 피질하 WM, 깊은 회색, 뇌실주위 WM, 피질하 WM 및 해마에서 뇌 천자물들의 해부적 위치들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 137은 뇌들보 및 깊은 WM에서 뇌 천자물들의 해부적 위치들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 138은 피질하 WM-후두엽 및 치아핵 (WM)을 포함하는 소뇌 백색질에서 뇌 천자물들의 해부적 위치들을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다.
도 139A-G는 운반체, 1.8mg rhASA 또는 18.6mg rhASA가 투여된 어른 및 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌 조직들로부터 얻은 추출된 조직 천자물들에서 재조합 인간 아릴설파타제 A (ASA)의 농도를 나타낸 것이다. 도 139A-G 각각은 도 134에서 도시된 뇌 조직의 부위에 해당한다.
도 140A 및 도 140B는 rhASA가 경막내 (IT) 또는 뇌실내 (ICV) 투여된 어른 및 어린 사이노몰 원숭이들의 깊은 백색질 (도 140A) 또는 깊은 회색질 (도 140B) 뇌 조직들에서 검출되는 재조합 인간 아릴설파타제 A (ASA)의 농도 비교를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다..
도 141A는 재조합 인간 아릴설파타제 A (rhASA)의 18.6 또는 1.8mg 용량이 IT 투여된 어린 사이노몰 원숭이들 (< 12개월령)로부터 얻은 여러 가지 조직 천자물들에서 검출되는 ASA 농도를 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 도 140A-B둘 다에서 도시된 바와 같이, 조직들로 전달된 ASA 농도는 2.5ng/mg rhASA의 목표 치료 농도 이내 또는 다른 경우라면 이를 초과하였다. 도 140A 및 140B에 도시된 천자물 번호들 각각에 해당하는 뇌 조직의 해부적 부위들은 피질하 백색질 (1); 뇌실주위 백색질 및 깊은 백색질 (2); 피질하 백색질 (3); 피질하 백색질 (4); internal 속섬유막 (5); 속섬유막 미상엽핵 (6); 깊은 백색질 (7); 피질하 백색질 및 피질 (8); 조가비핵 (9); 일시적 피질하 백색질 및 피질 (10), 깊은 회색질 (11), 깊은 회색질 (12), 전방 뇌실주위 및 피질하 (13); 피질하 백색질, 피질 겸주위 표피 (superficial perifalxian) (14); 뇌들보 및 뇌들보주위 피질하 백색질 (15); 깊은 피질하 백색질 (16); 깊은 회색질 (17); 깊은 회색질 (18); 뇌실주위 백색질 (19); 깊은 피질하 백색질 (20); 해마 (21); 뇌들보 (22); 깊은 백색질 (23); 피질하 백색질, 후두엽(24); 및 소뇌 백색질 (25):이었다.
도 142A는 1.8mg의 ASA가 IT 투여된 사이노몰 원숭이로부터 추출된 깊은 백색질 조직의 영역을 나타낸 것이다. 도 142B는 깊은 백색질 조직의 면역염색 및 적절한 세포들에서 ASA의 분포를 도시한다. 도 142B에서, 단백질 (ASA)은 오른쪽 아래 박스로 표시된다. 도 142C는 IT-투여된 ASA가 사이노몰 원숭이의 깊은 백색질 조직들, 상세하게는 리소좀들에서 소기관 공동-정착을 보여주었던 점을 도시한다. 도 142C에서, ASA 면역염색은 왼쪽 위 박스에 도시된다.
도 143은 표지된 ASA의 IT- 또는 ICV-투여에 이어서 24시간에 PET 스캐닝을 사용하여 124I-표지된 아릴설파타제A (ASA)의 분포를 비교하여 나타낸 것이다.
도 144는 사이노몰 원숭이에게 ICV 투여에 이어서 즉시 124I-표지된 ASA 의 분포를 나타내고, 2-5시간 이내의IT-투여된 124I-표지된 ASA의 분포를 비교한 것이다. 도시된 바와 같이, IT 투여는 ICV 투여의 경우 나타난 바와 동일한 초기 구획들 (대수공 및 근위 척수)로 124I-표지된 ASA를 전달하였다.
도 145는 마우스 모델에서 대표적인 ICV 및 IT 투여를 나타낸 것이다.
도 146A는 6개월의 투여에 이어서 1.5, 4.5 및 8.3 mg 용량들에서 HNS의 CSF 농도들을 시간의 함수로서 도시하는 대표적인 결과를 나타낸 것이다. 도 146B는 원숭이들에서 1.5, 4.5 및 8.3 mg 용량들의 IT 투여의 6개월 이후 CSF에서 항-HNS 항체 농도들을 도시하는 대표적인 결과를 상술하고 있다. 데이타는 수컷 및 암컷들이 조합된 것이다. 도 146C는 6개월의 투여에 이어서 원숭이들에서 1.5, 4.5 및 8.3 mg 용량들의 IT 투여의 6개월 이후 CSF에서 항-HNS 항체 농도들을 도시하는 대표적인 결과를 상술하고 있다. 데이타는 수컷 및 암컷들이 조합된 것이다. 8.3 mg의 HNS로 IT 투여 6이후 두 가지 최고 농도들 (32,205 ng/mL 및 15,467 ng/mL)은 CSF 시료들이 투여전 6이 채취되지 못하였기 때문에 좌표로부터 배제되었다.
도 147은 헤마톡실린 및 에오신으로 염색된 뇌의 뇌척수막 및 실질로부터 얻은 조직 절편들의 대표적인 영상들을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸 것이다. 도 147A는 DC 원숭이에서 IT 카테터에 국소적인 호중성구 침윤물들의 저해상도 단면을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다. 도 147B는 고용량 (8.3 mg/dose) 원숭이의 뇌척수막에서 호산구 침윤물들의 고해상도 단면을 도시하는 대표적인 결과를 나타내고; 침윤물들의 전반적인 중증도는 중간 용량 (4.5 mg/dose) 그룹과 유사하였다 (미도시). 도 147C는 혈관주위 공간 (뇌 실질)에서 호산구들을 보여주는 저용량 (1.5 mg/dose) 원숭이의 고 해상도면을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다. 도 147D 는 혈관주위 공간 및 결합 실질에서 호산구들을 보여주는 저용량 (1.5 mg/dose) 원숭이의 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다. 도 147E 저용량 그룹 동물의 척수 실질 (화살표로 표시됨)에서 호산구들을 도시하는 대표적인 결과를 나타내고; 영역에서 뉴런들은 정상이다. 도 147F는 저용량 (1.5 mg/용량) 원숭이에서 호산구들 및 미세신경아교증의 영역 (화살표는 호산구들을 가리키고; 박스는 미세아교증의 영역을 가르킨다)을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다. 모두 정상인 영역에서 여러 큰 뉴런들이 존재한다. 크기 막대: 200 um.
도 148은 원숭이 척수들 및 뇌들에서 HNS 효소 활성을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸 것이다. 도 148A/B는 (A) 수컷 및 (B) 암컷 원숭이들의 척수들에서 활성을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다. 조각 -3 = 요추, 조각들 3, 6 = 흉추, 및 조각 9 = 경추; 0 = 카테터 팁. 도 148C/D는 (C) 수컷 및 (D) 암컷 원숭이들의 뇌들에서 HNS 활성을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다. 조각들은 입쪽부터 꼬리쪽으로 번호 매겨진다 (3 내지 15). 모든 조직 시료들은 회복 동물들의 경우 마지막 용량 이후 대략 24시간 또는 4주에 수집되었다. DC, 장치 대조군. 데이타는 치료 그룹 당 n=4 원숭이들의 평균 ℃± SEM을 나타낸다.
도 149는 원숭이 뇌 및 간에서 HNS 효소 활성을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸 것이다. 도 148A는 고용량 (8.3 mg/용량) 그룹 원숭이 뇌에서 HNS 활성 분포를 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다. 뇌의 표면, 깊은 및 매우 깊은 (뇌실주위) 영역들의 활성에서 변화-배수를 내인성 수준들과 대비하여 (DC 그룹) 보여준다. 모든 조직 시료들은 회복 동물들의 경우 마지막 용량 이후 대략 24시간 또는 4주에 수집되었다. DC, 장치 대조군. 데이타는 치료 그룹 당 n=6 원숭이들 (둘 다의 성별) 뇌 조작 6 및 9의 평균 ℃± SEM을 나타낸다. 두 마리 원숭이들의 데이타는 포함되지 않았고; 부검시 카테터들이 작동한 것으로 확인되지 않았다. 도 149B는 원숭이 간에서 HNS 활성을 보여준다. 모든 조직 시료들은 회복 동물들의 경우 마지막 용량 이후 대략 24시간 또는 4주에 수집되었다. DC, 장치 대조군. Rec. 회복. 데이타는 저용량 (4.5 mg/용량) 암컷 그룹 (n=3)을 제외하고 치료 그룹 당 n=4원숭이들의 평균 ℃± SEM을 나타낸다.
도 150는 어린 사이노몰 원숭이 소뇌에서의 HNS 정착을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸 것이다. 도 150A는 HNS 면역염색에 대해 음성인 운반체 대조군 동물 (0 mg/용량) 의 소뇌를 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다; 20배 확대. 도 150B는 분자층에 제한되는 최소의 양성 염색을 보여주는 저용량 (1.5 mg/용량) 동물의 소뇌를 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다; 20배 확대. 도 150C는 외부 과립층에서 최소의 염색을 보여주는 중간-용량 (4.5 mg/용량) 동물의 소뇌를 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다; 20배 확대. 도 150D는 분자층, 외부 과립층 및 퍼킨지 세포들을 포함하는 고용량 (8.3 mg/용량) 동물의 소뇌에서 적당한 염색을 도시하는 대표적인 결과를 나타낸다; 20배 확대.
도 151은 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 처음 20분에 시간으로 좌표 표시된 머리 부위에서의 대표적인 HNS 농도의 연구를 나타낸 것이다.
도 152는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 뇌에서의 대표적인 HNS 농도의 연구를 나타낸 것이다.
도 153는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 뇌 부위에서의 대표적인 HNS 농도의 연구를 나타낸 것이다.
도 154는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 머리 부위에서의 대표적인 HNS 농도의 연구를 나타낸 것이다.
도 155는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 근위 척수에서의 대표적인 HNS 농도의 연구를 나타낸 것이다.
도 156는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 중간-척수에서의 대표적인 HNS 농도의 연구를 나타낸 것이다.
도 157는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 말단 척수에서의 대표적인 HNS 농도의 연구를 나타낸 것이다.
도 158는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 간에서의 대표적인 HNS 농도의 연구를 나타낸 것이다.
도 159는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 뇌에서의 대표적인 HNS 농도의 연구, 개별 (위) 및 평균 ℃±SD (아래)를 나타낸 것이다.
도 160은 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 대표적인 HNS 간 농도의 연구, 개별 (위) 및 평균 ℃±SD (아래)를 나타낸 것이다.
도 161은 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 대표적인 HNS 신장 농도의 연구, 개별 (위) 및 평균 ℃±SD (아래)를 나타낸 것이다.
도 162는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 대표적인 HNS 심장 농도의 연구, 개별 (위) 및 평균 ℃±SD (아래)를 나타낸 것이다.
도 163은 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 대표적인 HNS 피부 농도의 연구, 개별 (위) 및 평균 ℃±SD (아래)를 나타낸 것이다.
도 164는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 대표적인 HNS 뇌 농도의 연구 (위), 또한 뇌에서 비구획 PK 변수들의 비교 (아래)를 나타낸 것이다.
도 165는 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 좌표 표시된 대표적인 HNS 간 농도의 연구 (위), 또한 간에서 비구획 PK 변수들의 비교 (아래)를 나타낸 것이다.
도 166은 rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 세포성 내재화 연구에 사용되는 정상 인간으로부터 나온 대표적인 일차 섬유모세포들을 나타낸 것이다. rhNaglu의 세포성 흡수는 최소인 한편, Naglu-IGFII의 세포성 흡수는 더 현저하였다. Naglu-IGFII 내재화의 포화 곡선은 수용체 매개성 흡수를 가르켰다. 본 흡수는 IGFII에 의해 저해되었지만, 만노스-6-포스페이트에 의한 것은 아니었다.
도 167는 산필리포 B형 개체의 섬유모세포들 (GM01426)을 사용한 대표적인 공초점 현미경 연구의 결과를 나타낸 것이다. Lamp-1으로 Naglu-IGFII의 광범위한 내재화 및 공동-정착이 관찰되었다.
도 168는 야생형 (WT), Naglu-/- (KO) 및 이형접합 Naglu+/- (Het) 마우스에서 Naglu 활성을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 산필리포 B 형 마우스에서 Naglu의 전부 결핍이 뇌, 간, 신장 및 비장에서 관찰되었다.
도 169는 대수공내 주사 (IC)의 부위를 가리키는 마우스 뇌의 정면 및 측면 또한 조직한 분석들을 위한 단면을 나타낸 것이다. 중간 도면, 1배로 관찰된 마우스 뇌의 횡단면. 박스친 영역은 아래 그림에서의 4배 현미경 영상의 영역을 가르킨다. 아래 그림, 조직학 슬라이드의 4배 영상. 박스 A 및 B는 도 170 및 도 171에서의 40배 현미경 영상의 영역을 가르킨다.
도 170는 대수공내 주사 (IC)이후 7일에 산필리포 B형 마우스에서 대뇌 피질의 대표적인 면역조직화학을 나타낸 것이다 40배. rhNaglu 및 Naglu-IGFII 둘 다가 뉴런들 뿐만 아니라 교아세포들에서 광범위한 세포성 흡수를 나타내고, 분포 및 세포성 흡수의 양상들은 두 단백질들 간에 유사하였다 (항-인간 Naglu 모노클론 항체).
도 171는 대뇌 피질의 대표적인 LAMP-1 면역염색을 40배 확대로 나타낸 것이다. 증가된 LAMP-1 면역염색 양성 점들에 의해 도시된 바와 같이, 야생형 마우스의 뇌와 대비하여 증가된 리소좀 축적이 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 관찰되었다. rhNalgu 및 Naglu-IGFII 둘 다가 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌는 wt 마우스와 매우 유사한 리소좀 축적의 감소를 보여주었다.
도 172A는 Naglu IT 투여된 Naglu-결핍 마우스의 백색질 조직들에서 운반체 투여된 동일한 Naglu-결핍 마우스와 대비한 세포성 공포화의 광범위한 감소를 나타낸 것이다. 도 172B는 Naglu 경막내 투여된 Naglu-결핍 마우스의 백색질 조직들에서 운반체 투여된 동일한 Naglu-결핍 마우스와 대비한 리소좀 연관 막 단백질 1 (LAMP 1) 면역염색의 현저한 감소를 나타낸다.
도 173은 Naglu 투여된 Naglu-결핍 마우스의 대뇌 피질, 미상엽핵 및 조가비핵 (CP), 시상 (TH), 소뇌 (CBL) 및 백색질 (WM)에서 야생형 및 운반체 투여된 Naglu-결핍 마우스와 대비하여 측정된 LAMP의 농도를 정량적으로 나타내고 비교한 것이다. 7일의 과정 동안 Naglu의 3번 용량들의 경막내 투여에 이어서 (도 173A) 분석된 뇌 조직의 각 영역에서 LAMP-양성 영역들은 두 주의 과정 동안 Naglu의 두 번 용량들과 대비하여 (도 173B) 좀 더 감소되었다.
도 174는 wt 관삽입된 래트에서 IT 주사 부위를 보여주도록 본 그림의 기준으로서 사용된 인간 CNS의 대표적인 중간시상 해부적 도면을 나타낸 것이다. 화살표들은 면역조직화학 연구를 위해 조직들을 가져온 척수 및 대뇌 피질에서 IT 주사의 대략적 해부 위치를 가르킨다.
도 175는 IT 주사 이후 뇌에서 대표적인 Naglu 활성을 나타낸 것이다. Naglu 활성은 Naglu-TAT 및 Naglu-IGFII 주사된 wt 래트에서 유의하게 더 높았다.
도 176는 IT 주사 이후 24시간에 rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII, Naglu-kif 및 PerT-Naglu 치료된 wt 관삽입된 래트의 대뇌 피질의 대표적인 Naglu 면역염색을 나타낸 것이다. 20배. Naglu-IGFII는 뇌의 실질 내로 광범위한 배분을 잘 보여주는 유일한 단백질이었다. 뉴런들 및 교아세포들 내로 세포성 흡수가 Naglu-IGFII 치료된 래트에서도 역시 명백하다. 한편, rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu kif 및 PerT-Naglu 치료된 그룹들에서, 단백질은 뇌척수막 (M)에 남아있었다.
도 177는 도 176으로부터 얻은 선택된 슬라이드들의 대표적인 고성능 확대를 나타낸 것이다. 상부 패널, rhNaglu 치료된 wt 관삽입된 래트에서 rhNaglu 는 뇌의 실질에서 확인되는 양성이 전혀 없이 뇌척수막 (M)에 남아있었다. 하부 패널, rhNaglu 치료된 wt 관삽입된 래트에서 광범위한 배분이 뇌의 실질 내로 잘 관찰되었고, 세포성 흡수는 뉴런들 및 교아세포들에서 관찰되었다.
도 178는 마지막 IT 주사 이후 24시간에 뇌 및 간에서 대표적인 Naglu 활성을 나타낸 것이다. 세 가지 치료된 그룹들 중에서, 뇌의 Naglu 활성은 유의한 차이들을 보여주지 안았고, 간의 Naglu 활성의 경우도 동일하였다. 본 결과는 뇌 및 간에서 검출되는 Naglu 활성이 주로 희생 이전 24시간에 시행되는 마지막 주사로 인해서인 점을 가르켰다.
도 179는 Naglu-IGFII 의 IT 주사 이후 뇌 및 간에서 대표적인 전체 GAG 수준을 나타낸 것이다. 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 전체 GAG는 산필리포 B형 마우스 노화로서 축적 효과를 반영하는 계속적 증가들을 보여주었다. 뇌에서 GAG의 통계적으로 유의한 감소는 3x 주사 그룹에서 관찰되었다 (p<0.05). 간에서도 GAG의 통계적으로 유의한 감소가 역시 2x 및 3x 주사 그룹들에서 관찰되었다 (p<0.05). 뇌보다 간에서 더 빠르고 더 극적인 GAG 변화들이 헌터 증후군을 위한 I2S의 IT 전달에서도 역시 관찰되었던 현상이다.
도 180은 IT 주사 이후에 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 대표적인 Naglu 재분배를 나타낸 것이다. Naglu 면역형광 염색은 뇌척수막 (M) 및 뇌 실질 상의 Naglu-IGFII 단백질을 나타냈다. 세포성 흡수는 2x 및 3x 주사 그룹들에서 관찰되었다. G: 교아세포들.
도 181은 마우스 뇌의 관상 단편을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 박스들은 LAMP-1 면역염색의 도면들이 만들어진 곳을 가르킨다. 단백질 배분 및 효능의 정도를 보여주기 위하여, 대뇌 피질 또한 미상엽핵, 시상 및 백색질과 같은 피질하 조직들이 LAMP-1 면역염색을 위해 선택되었다.
도 182는 대뇌 피질의 LAMP-1 면역염색을 보여주는 대표적인 도면을 40배 확대로 나타낸 것이다. 야생형 마우스의 뇌와 비교하여, 증가된 리소좀 축적이 증가된 LAMP-1 면역염색에 의해 관찰되는 바와 같이 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 관찰되었다. Naglu-IGFII IT 주사 이후에 리소좀 축적의 감소는 2x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기, 또한 3x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기와 수에 의해 명백하였다.
도 183은 미상엽핵, 피질하 핵의 LAMP-1 면역염색을 보여주는 대표적인 도면을 (40배) 나타낸 것이다. 대뇌 피질에서 관찰된 것과 유사하게, 증가된 리소좀 축적이 증가된 LAMP-1 면역염색 양성 점들에 의해 관찰되는 바와 같이 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 관찰되었다. Naglu-IGFII IT 주사 이후에 리소좀 축적의 감소는 2x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기, 또한 3x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기와 수에 의해 명백하였다.
도 184는 시상, 간뇌 핵의 LAMP-1 면역염색을 보여주는 대표적인 도면을 (40배) 나타낸 것이다. Naglu-IGFII IT 주사 이후에 리소좀 축적의 감소가 2x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기, 또한 3x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기와 수에 의해 명백하였다.
도 185는 백색질의 LAMP-1 면역염색을 보여주는 대표적인 도면을 (40배) 나타낸 것이다. 뉴런 축삭 섬유들의 수평적 추적은 백색질을 도 181-184에 표현된 회색질과 구별시킨다. 그럼에도 불구하고, 동일한 양상의 리소좀 축적 증가들이 운반체 처리된 산필리포 B형 마우스의 뇌에서 야생형 마우스와 대비하여 관찰될 수 있었다. Naglu-IGFII IT 주사 이후에 리소좀 축적의 감소가 2x 및 3x 주사 처리된 산필리포 B형 마우스 뇌의 양성 점들의 감소된 크기와 수에 의해 명백하였다.
도 186는 소뇌 피질의 LAMP-1 면역염색을 보여주는 대표적인 도면을 (40배) 나타낸 것이다. 소뇌 피질의 형태는 진하게 군집된 과립 뉴런들, 과소세포성 분자층, 또한 과립 뉴런들 및 분자층 간 퍼킨지 뉴런들의 단일층으로 나타났다. 퍼킨지 뉴런들은 분자층 내로 돌출된 큰 세포질 및 간헐적인 가지세포들에 의해 확인되었다.
도 187는 뇌, 척수 및 간에서 Naglu 염색을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 뇌 및 척수에서, 주사된 Naglu는 IHC에 의해서만 뇌척수막 (M)에서 검출되었고 기타 다른 부위들에서는 Naglu 양성 염색이 전혀 검출되지 않았다. 간에서, 시누소이드 세포들 (S)은 Naglu 양성이었고 Naglu 흡수는 간세포들 (H)에서 전혀 확인되지 않았다.
도 188는 간 및 척수의 LAMP-1 면역염색 및 H & E 염색을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 운반체 동물들과 비교하여, LAMP 염색은 Naglu로 치료된 간들 및 척수들 둘 다의 전체를 통하여 감소되었다. H & E 염색은 간세포들에서 세포성 공포화가 운반체 동물들과 비교하여 치료된 그룹에서 감소되는 점을 보여주었다.
도 189 A 및 도 189 B은 3개월 동안 Naglu의 6번 격주 (EOW) IT 주사들 이후 뇌의 H & E 염색 및 뇌의 형태 향상을 보여주는 대표적인 도면을 나타낸 것이다. 치료된 뇌에서, 조사된 부위들 모두의 세포성 공포화 (화살표들)는 운반체 그룹과 비교하여 감소되었다.
도 190 A 및 도 190 B는 3개월 동안 6번 IT Naglu 주사들 이후 다양한 뇌 부위들에서의 LAMP 면역염색을 보여주는 대표적인 도면들을 나타낸 것이다. 운반체 처리된 그룹과 비교하여, 산필리포 B형 마우스에게 Naglu IT 투여는 LAMP 면역염색이 드러나는 모든 조사된 부위들에서 리소좀 활성의 감소를 가져왔다. 본 감소는 LAMP 양성 세포들의 수 감소, 더 작은 세포 크기 및 더 옅은 염색을 특징으로 하였다. 현저한 감소는 다른 뇌 부위들과 비교하여 척수에 가까운 뇌의 미상엽핵에 위치한 소뇌 및 뇌줄기에서 발견되었다. 명백한 감소도 역시 백색질, 해마 및 시상을 포함하는 깊은 뇌 부위들에서 확인되었다.
도 191 A 및 도 190 B는 3개월 동안 6번 IT Naglu 주사들 이후 다양한 뇌 부위들에서 미세교아세포들의 활성화를 드러내는 Iba IHC 면역염색을 보여주는 대표적인 도면들을 나타낸 것이다. 운반체 처리된 그룹과 비교하여, 양성 세포들의 수 및 염색 강도의 감소가 Naglu 치료된 그룹에서 전혀 관찰되지 않았다. 그러나, 양성 미세교아 세포들의 세포 형태는 운반체 그룹에서 큰 공포화된 형태들과 대비하여 (삽입) 모든 조사된 뇌 부위들에서 감소된 세포 크기를 가지고 변화하였다.
도 192 A 및 도 192 B는 3개월 동안 6번 IT Naglu 주사들 이후 다양한 뇌 부위들에서 별아교세포들의 활성화를 드러내는 GFAP IHC 면역염색을 보여주는 대표적인 도면들을 나타낸 것이다. 운반체 처리된 그룹과 비교하여, GFAP 양성 염색은 소뇌 및 뇌줄기에서 감소되었고 다른 조사된 부위들에서도 약간 감소되었다.
GalC 단백질의 IT 전달의 실시예들
실시예 1. 경막내 전달을 위한 Galc 제형물의 물리화학적 특성분석
본 실시예는 GalC의 물리화학적 특성분석을 단백질의 경막내 (IT) 전달 동안 서로 다른 용액 조건들 하에서 그의 행동 및 안정도를 이해하도록 기술하고 있다.
무엇보다도, 본 실시예는 성공적인 GalC의 IT 전달을 위해 중요한 GalC 제형물을 기술하고 있다. 일정 구현예들에서, 본 제형물은 5 mM Na 포스페이트 + 150 mM NaCl, pH 6.0 + 0.005% 폴리솔베이트 20를 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 제형물은 <5 mM, <10 mM, <15 mM 및 <20 mM Na 포스페이트를 포함한다. 일정 구현예들에서, 본 제형물은 150 mM NaCl를 가진 pH ≥ 5.5 및 ≤ pH 7.0를 포함한다.
변화하는 포스페이트 몰라 농도 (molarity) 및 pH의 PBS 전달 운반체들이 어른 사이노몰 원숭이들 (cynomologous monkeys)에서 테스트되었다 (도 3). pH 5.5 내지 7.0 범위에 있는 5 mM 포스페이트는 역효과를 전혀 나타내지 않았던 반면, pH 7.0 내지 7.5 사이의 20 mM 포스페이트 및 pH 7.5 내지 8.0 사이의 10-20 mM 포스페이트는 원숭이들에서 역효과를 나타내었다 (도 3). 50 mM NaCl를 사용한 3 mM 시트레이트, 포스페이트 및 보레이트 완충액에서 hGalC (1mg/ml)의 열적 안정도는 pH 5.0 내지 8.0 범위 내에서 pH 함수로서 조사되었다 (도 4). hGalC 특이 활성은 기저선 (20 내지 25℃)에서 또한 pH 6.0 내지 6.5 사이에서 보유된 최고 특이 활성을 40℃에서 2주째 측정되었다 (도 4). 추가적으로, hGalC 특이 활성은 pH 6.0 내지 6.5 사이에서 보유된 최고 특이 활성을 5℃에서 3개월째에 측정되었다 (도 5). hGalC의 용융 온도는 pH의 함수로서 측정되었고 (표 5) 또한 서로 다른 제형물들에서 독립적으로도 측정되었다 (표 6). 표 5는 pH의 함수로서 hGalC (mg/mL)의 용융 온도를 나타낸다. *침전으로 인해 [GalC]<1 mg/mL.
Figure 112021011816093-pat00007
표 6은 서로 다른 제형물에서 hGalC (1mg/mL)의 용융 온도를 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00008
hGalC 특이 활성의 보유에 의해 ~3주째 5℃ 및 2주째 40℃에서 결정된 바와 같이, hGalC의 열적 안정도도 역시 염 농도의 함수로서 평가되었다 (도 6). 결과들은 hGalC가 pH 6.5에서 5 mM 포스페이트 + 50 mM NaCl (본 명세서에서 5+50으로서 약칭됨)으로부터 50 mM 포스페이트 + 150 mM NaCl (본 명세서에서 50+150으로 약칭됨)까지의 범위를 가지는 다양한 염 농도들로 5℃에서 3주 이후에 높은 특이 활성을 보유하는 것을 보여주었다 (도 6).
hGalC의 침전 분석
침전 속도 (sedimentation velocity)는 분자들이 원심분리기에서 생성되는 원심력들과 반응하여 움직이는 속도를 측정하는 분석적 초원심분리 (AUC) 방법이고, 용액에서 단백질 연관 상태를 결정하는 유용한 기법이다. 첫 번째 침전 속도 진행은 시료를 자가-결합 및/또는 비이상도 (nonideality)에 대해 평가하도록 5 mM Na 포스페이트, pH 6.0에서 150 mM NaCl 로의 인간 GalC의 일련 희석 (dilution series)이었다 (도 7). 일련 희석은 각 농도에서 g(s*) 곡선들 (g(s*)) vs s*)로서 좌표표시되었다. 희석 시 s 수치들을 낮추도록 곡선들에서 일반적인 이동 (general shift)은 해리를 가리키고, 이것은 급속한 가역 자가-결합 시스템이다. 서로 다른 이온 강도들을 비교하여 (도 7A, B 및 C), 이온 강도를 올릴 시 s 수치들을 낮추도록 곡선들의 세트들이 이동하는 것이 분명하고 이온 상호작용들도 결합 공정에 관여하고 자가 결합이 더 높은 염 농도들에서 감소되는 것을 가르킨다.
hGalC 와 비교하도록 마우스 GalC도 동시에 150 mM NaCl에서 역시 진행된다. 해당하는 이온 강도들 (150 mM NaCl)을 비교하면서, mGalC의 자가-결합의 자유에너지가 hGalC의 것보다 작은 것이 분명하다. 도 7에서의 곡선들은 해리를 보다 명확하게 보여주도록 약 20S에서 컷오프 되었지만; 이들 진행들은 광범위 분포 (WDA)를 사용하여 분석되었고 결과들이 로그 단위로 좌표 표시되었을 때, 더 높은 응집체들 (s*>20S)이 명확하게 보여질 수 있다. 특히 높은 올리고체들로의 응집 (도 8)이 50 mM NaCl에서 가시적이고 10 mM NaCl에서 약간 감소되며 500 mM NaCl에서 pH 6.0로는 존재하지만 유의하게 감소된다. 이온 강도들의 각각으로부터 최고 농도로부터 나온 WDA 곡선은 도 8에 좌표 표시된다.
pH 6.0로 보편 완충액에서 자가-결합
보편 완충액으로 이들 조건들 하에서, 자가 결합은 도 9에 나타난 바와 같이, 포스페이트 완충액, pH 6.0에서와 약 동일한 크기인 것을 보여준다. 보편 완충액에서 hGalC 자가-결합의 에너지학에 미치는 pH의 효과도 역시 조사되었다. 일련 희석은 pH 4.5, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0 및 7.5에서 수행되었다. pH 4.5 및 5.0에서의 시료들은 필수적으로 100%의 hGalC 가 침전되는 불용성이고 상청액에는 측정할 것도 남지 않는다.
pH의 효과가 도 10에 명확하게 나타나는 한편, 가장 적은 양의 자가-결합이 pH 7.5에서 관찰되고 상당한 자가-결합이 pH 6.0에서 관찰된다. 경향성은 더 높은 pH를 가진 이온 강도의 변화들로 관찰되는 것과 유사하다. 이온 강도 및 pH 둘 다를 증가시키는 것은 최고 농도 (모두 약 1.0 mg/mL)에서 더 작은 올리고체들을 선호하도록 평형을 이동시킨다. 1/3 일련 희석에 의한 농도에서의 감소 (도 7 참조)는 약 5.2S의 침전 계수를 가지는 것으로 보이는 가장 작은 종으로 평형을 이동시킨다. 약 10 내지 13S에서 생기는 피크는 5S 종들의 사량체를 나타내는 것 같다. 이들 데이타를 자가-결합에 맞추려는 노력들은 지금까지 성공하지 못하였고 다양한 정도들의 당화로부터 발생하는 본질적인 미세-불균질도 (micro-heterogeneity)로 인한 것 같다.
pH 6.0로 보편 완충액에서 자가-결합
150 mM NaCl을 사용한 5mM Na 포스페이트, pH 6.0에서 GalC의 자극된 및 기본 시료들이 일련 희석 실험 (적색 → 청색 → 녹색 → 검정색)에서 비교되었다. 최저 농도 (검정색) ~0.03 mg/mL의 경우 결과들은 완만하고 이는 곡선이 소음을 적게 가지는 것으로 보이는 이유이다. 자극된 시료에서는, 기본 시료들에서보다 훨씬 더 높은 농도에 존재하는 ln(s*) =3.0 (~20S) 주변에 응집체가 존재한다. 희석 시 그의 지속성에 의해 입증된 바와 같이, 이것은 정상화된 좌표들에서 시료의 거의 일정한 분획을 나타낸다 (도 11, 도 12, 도 13).
용액에서 소듐 타우로콜레이트를 가진 hGalC
소듐 타우로콜레이트 (NaTC)(1%)에서, 자가 결합은 유의하게 감소된다. 주요 경계는 s 수치들을 낮추도록 이동되고 더 고차 올리고화가 억제된다 (도 14).
5% 덱스트로스를 가진 hGalC
5mM Na 포스페이트, pH 6.0 에 녹인 GalC에 5% 덱스트로스의 첨가는 큰 응집체들의 형성을 유도하였다 (도 15). 18S에서의 피크는 약 440 kDa의 최소 몰라 질량에 해당하고 56S에서의 피크는 10.0 MDa 이상의 몰라 질량들에 해당하는 150S를 초과하여 연장된 꼬리를 가지는 2.4 MDa의 최소 몰라 질량에 해당한다. 1.0로부터 0.3 mg/mL까지의 희석 시 본 경향에서 변화는 매우 적고, 이들 올리고체들이 침전 실험의 시간 규모, 5 내지 6시간의 기간에서 대부분 비가역적임 점을 가르킨다.
hGalC 내재 형광
hGalC의 내재 형광 연구들 (23 Trp 사용함)은 분자적 상호작용들 시 pH 및 염 농도의 역할을 평가하도록 수행되었다 (도 16 및 도 17). 분자적 상호작용들은 500mM NaCl 또는 1% NaTC 둘 중 하나에서 가장 적었다 (330nm 내지 350nm에서 최고 상대 형광) (도 16). 이차 구조에서 작은 변화가 pH의 함수로서 관찰되었다. 침전은 pH 4.5 및 5.0에서 관찰되었다 (도 17).
요약
hGalC 및 mGalC의 상대 용해도를 평가하도록, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)-유도성 고체상 접근법이 사용되었다 (Middaugh et al., J. Biol. Chem. 1979, 254, 367-370). 본 접근법은 단백질들의 상대 용해도가 정량가능한 방식으로 측정되도록 허용한다. 용해도 측정들은 각 GalC의 완충된 용액들 (150 mM NaCl를 사용한 5 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0)을 서로 다른 농도들의 PEG (10kDa)에 도입하여 수행되었다. 로그 단백질 용해도 vs. PEG 농도들의 좌표들은 직선상 경향을 생성하였다. 외관상 용해도의 제로 PEG 농도로의 외삽이 각 단백질의 상대 용해도를 획득하도록 작성되었다. mGalC vs. hGalC의 상대 용해도는 차이를 보이지 않았다. hGalC의 용해도 실험들에서 침전 또는 활성의 상실이 2 내지 8?C에서 3주 이후 (서로 다른 농도들을 가지는 5mM 소듐 포스페이트, pH 6.0-6.5에서) 관찰되지 않았다. ~30 mg/mL에서 용해도는 제형물 5 mM Na 포스페이트 + 150 mM NaCl, pH 6.0을 사용하여 달성되었고 침전은 2-8℃에서 50일 이후에 전혀 관찰되지 않았다.
AUC 데이타는 GalC의 "본래 (native)" 상태가 고차 올리고체들에 대한 농도 의존성 가역적 결합인 점을 제시한다. 생물물리적 데이타는 고차 올리고체들에 대한 기능적 및 구조적 중요성이 존재할 수 있는 점을 제시한다. 더 높은 pH 수치들에서는, AUC에 의해 결정된 바와 같이 더 낮은 활성 보유, 더 낮은 Tm 수치들 및 더 균질한 시스템이 존재한다. 150 mM NaCl를 사용한 5 mM 소듐 포스페이트, pH 6.0에서 단량체, 사량체 및 기타 다른 고차 종들 간에 평형이 존재하는 것 같다. 또한, pH는 6.5-7.5의 pH 범위에서 AUC 프로파일들에 극적인 영향을 주지 않는다. 전반적으로, GalC 시스템은 테스트된 완충액들에서 급속한 가역성, 높게 자가-결합하는 시스템이다.
실시예 2. 스프라그 달리 래트들에서 125I-hGALC의 단일 경막내 투여 또는 단일 정맥내 일시 주사에 이어지는 약물역학 및 방사능의 조직 분포
본 실시예는 스프라그 달리 래트들에서 단일 경막내 투여 또는 단일 정맥내 일시 주사에 이어지는 약물역학 (pharmacokinetics) 및 125I-hGALC의 조직 분포를 묘사하는 대표적인 결과를 기술하고 있다. 전혈, 적혈구 세포들, 뇌척수액 (CSF) 및 조직들에서 방사능의 농도 및 함량이 측정되었고 그 결과로 나온 데이타 상에서 비-구획 (non-compartmental) 약물역학적 분석들 (pharmacokinetic analyses)이 수행되었다. 경막내 및 정맥내 경로들이 인간들에서 의도되는 투여 경로들이기 때문에 선택되었다. 용량 수준들은 가능한 인간 노출, 기존의 독성 및 약물역학적 데이타 또는 테스트 항목에 의해 부여되는 제한들이라면 모두를 기초로 하여 선택되었다. 래트는 약물역학 및 조직 분포 연구들에서 사용이 허용되는 종이기 때문에 연구를 위해 선택되었다. 본 연구에 사용되는 동물들의 숫자는 각 시간대에 기대되는 변화를 적당하게 평가하고 실험적 목적들을 만족시키는 데 필요한 최소한이었다.
재료들 및 방법들
테스트 시스템
82마리의 수컷 스프라그-달리 래트들 (Rattus norvegicus)이 캐나다 챨스 리버사 (Charles　River Canada Inc. St. Constant, Quebec, Canada)로부터 2009년 4월 15일에 입수되었다. 치료의 개시 (onset) 시 동물들은 대략 10 내지 11주령이었다. 좀 더 나아가 9마리의 래트들이 2009년 4월 28일에 캐나다 챨스 리버사로부터 입수되었고; 이들 동물들은 도착 시 대략 9주령이었으며 본 연구의 투여량을 완성하도록 충분히 관삽입 (cannulated) 동물들이 사용가능한 점을 입증하도록 요구되었다.
치료 개시 시 수컷 래트들의 체중들은 342 로부터 453 g까지 범위이었다. 투여 시 수컷 래트 한 마리를 제외한 모두의 체중들이 프로토콜에 진술된 범위보다 높았지만 (250-350　g), 본 소수의 편차는 동물들이 건강하기 때문에 연구 및 획득된 데이타에 영향을 주도록 고려되지 않았고 실제 체중이 용량 투여에 사용되었다.
동물 관리
PCS-MTL에 도달한 다음, 모든 동물들은 자격을 갖춘 많은 수의사들에 의한 일반적인 신체 검사를 받았다. 입수된 동물들에서는 유의한 이상들이 전혀 검출되지 않았다. 동물들은 개별적으로 와이어-메시 바닥 및 자동 수분공급 밸브를 가진 스테인레스강 상자에 가두었다. 환경적 강화 프로그램은 적절한 SOP에 따랐다. 각 사육상자는 연구, 그룹, 동물 수들 및 성별을 표시하는 색상-코드 상자 카드로 라벨되었다. 각 동물은 AIMS® 문신 시스템을 사용하여 독특하게 확인되었다. 본 연구 수행 동안 환경적 조건들은 19 내지 25℃ 및 30 내지 70%의 목표 온도 및 상대 습도에서 각각 조절되었다. 광주기성 (photoperiod)은 계획된 활동으로 인해 간섭될 때를 제외하고 광 12시간 및 암 12시간이었다.
사료
모든 동물들에게는 표시된 절차들 동안을 제외하고 표준 인증된 펠렛화 시판 연구실 사료 (PMI　Certified Rodent Diet 5002: PMI Nutrition International Inc.)가 자유롭게 주어졌다. 식이요법에서 최대 허용가능한 오염물들 (예로, 중금속들, 아플라톡신, 오가노포스페이트, 염화 탄화수소, PCBs)의 농도들은 조절되었고 제조사들에 의해 일상적으로 분석되었다. 표시된 절차들 동안을 제외하고는 인간 소비에 적합한 수돗물 (0.5 um 정균 폴리카보네이트 필터를 통해 여과됨)이 동물들에게 원하는 대로 사용가능하다. 본 연구의 목적들과 상충될 수 있는 사료 물질들에서 기지의 오염물들이 없는 것으로 사료되었다.
순응 및 무작위 배정
동물들이 신체적 및 환경적 조건들에 순응하도록 허용하기 위하여, 동물들의 입수 및 경막내 관삽입하는 수술 사이에 적어도 6일 (2009년 4월 15일에 입수된 동물들의 경우) 또는 3일 (2009년 4월 28일에 입수된 동물들의 경우)이 허용되었다. 순응 기간 동안, 모든 동물들은 체중이 측정되었고 컴퓨터-기초 무작위 배정 절차를 사용하여 무작위 배정되었다. 무작위 배정은 변수로서 체중을 사용하는 계층화 (stratification)에 이어서 수행되었다. 체중 범위의 양극단들에서는 동물들이 그룹으로 배정되지 않았다.
동물들은 다음과 같이 연구 그룹들로 배정되었다:
Figure 112021011816093-pat00009
*a: IV용량은 경막내 용량 이후 5분 이내에 투여되었다.
그룹들 1 및 2의 각 래트는 대략3　uCi/동물의 명목상의 방사능화학적 용량을 수여받았다. 그룹 3의 각 래트는 대략6　uCi/동물의 명목상의 방사능화학적 용량을 수여받았다.
경막내 투여 제형물
경막내 투여 제형물은 경막내 용량의 첫 번째 투여일에 바로 제조되었다. 충분한 125I-hGALC 용액이 측정되었고 충분하게 측정된 미표지된 hGALC 용액에 첨가되었다. 측정된 부피의 운반체가 첨가되었고 전체가 가만히 혼합되었다. 대략 150 uCi/mL의 표적 방사능 수준에서 농도 3 mg/ml의 용액이 제조되었다. 그 결과 얻은 제형물은 낮은 단백질 결합 필터 (0.22 um GV PVDF 필터 유닛)을 통해 무균의 용기 내로 여과되었고 또한 냉동 보관되어 (2-8℃), 투여를 위한 사용 전에 광보호되었다.
정맥내 투여 제형물
정맥내 투여 제형물은 정맥내 용량의 첫 번째 투여일에 바로 제조되었다. 충분한 125I-hGALC 용액이 측정되었고 충분하게 측정된 미표지된 hGALC 용액에 첨가되었다. 측정된 부피의 운반체가 첨가되었고 전부 가만히 혼합되었다. 대략 150 uCi/mL의 표적 방사능 수준에서 농도 3 mg/ml의 용액이 제조되었다. 그 결과 얻은 제형물은 낮은 단백질 결합 필터 (0.22 um GV PVDF 필터 유닛)을 통해 무균 용기 내로 여과되었고 또한 냉동 보관되어 (2-8℃), 투여를 위한 사용 전에 광보호되었다.
용량 제형물들의 분석
각 방사선 표지된 용량 제형물은 치료 전후의 방사능 농도를 결정하도록 액체 신틸레이션 분광측정법 (liquid scintillation spectroscopy)에 의해 각 투여일에 분석되었다. 방사능 농도는 운반체로 용량 제형물의 적절한 희석들을 제조하여 결정되고 각 희석의 두 벌의 분량들이 분석되었다. 남아있는 용량 제형물들은 분석 (반복 분석을 포함)이 완료되고 제거되었다.
테스트 항목의 특이적 활성의 계산
용량 제형물들에서 테스트 항목의 특이적 활성은 방사능의 평균 (전후 용량) 측정된 수준들 및 용량 제형물들에서 테스트 항원의 전체 질량 (제공된 농도들을 기초함)으로부터 계산되었다.
임상적 관찰들
모든 동물들은 치사 및 아픈 징후들 또한 순응기간 동안 치료에 대한 반응에 대하여 도착일 및 연구 종료일에 동물들이 단 한 번 조사되었던 것을 제외하고 매일 두번 조사되었다.
체중
개별적 체중들은 수술 전 순응기간 동안 한 번, 또한 용량 투여 전날에 측정되었다. 용량 투여 전날에 기록된 체중들만이 보고되었다.
수술
최소 6일 (또는 추가적인 9마리의 동물들의 경우 3일)이 동물들의 입수 및 수술 사이에 동물들이 연구실 환경적 조건들에 익숙해지도록 허용되었다. 여유분을 포함하는 모든 동물들이 수술일에 또한 수술에 이어서 2일째에 다시 벤자민 페니실린 G + 프로케인 페니실린 G 항생제의 단일 근육내 주사를 맞았다. 일반적으로, 부프레노르핀 (Buprenorphine) 0.05 mg/kg이 8 내지 12시간 대신에 첫 번째 투여 이후 대략6시간에 투여되었다. 래트들에서 부프레노르핀의 반감기를 고려하여, 프로토콜로부터 나온 본 편차가 이들 동물들의 건강에 영향을 주지 않았고, 따라서 본 연구에서 획득된 타당성 또는 데이타에 영향을 주지 않았다.
동물들은 수술을 위해 두개골로부터 목의 등-가슴 부위까지 면도하여 준비되었다. 동물들은 이소플루란/산소 기체로 수술 이전에 마취되었고 수술 과정 동안 이소플루란 기체 마취 하에서 유지되었다. 수술 이전에 또한 수술 과정의 말에 마취 하에서 부드러운 광택성 안약제가 각 눈에 투여된다. 수술 이전에, 또한 첫 번째 투여에 이어서 대략 24시간 간격들로 2번의 다른 경우들에, 각 동물은 항-염증제 (5 mg/k의 카프로펜 (Carprofen))을 피하 주사로 맞았다.
동물들은 입체 탁자 (stereotaxic table)내에 놓여졌다. 대략 2 cm의 피부 절개가 두개골의 미상엽으로부터 목까지 되었다. 등목 근육이 환추-후두 막 (atlanto-occipital membrane)을 노출하도록 분리되었다. 막에 접근을 용이하게 하도록 견인기 (retractor)가 사용되었다. 환추-후두 막은 절개되고 경막내 카테터가 카테터가 요추 부위에 위치할 때까지 미상엽으로 천천히 삽입되었다. 면봉을 사용하여 남는 체액은 제거되고 환추-후두 막은 건조되었다. 이후에 바로, 접착제가 카테터 벌브를 막에 고정하는 데 사용되었다. 일단 풀이 건조되어 카테터가 굳게 고정되면, 견인기들이 제거되었다. 카테터로 작은 루프가 두개골 위에 만들어지고 벌브가 비-흡수성 물질의 봉합을 사용하여 부착된다. 일단 카테터가 안정되면, 이것은 접근 포트를 설치하도록 절개된 등 가슴 부위로 연결되었다. 이것은 비-흡수성 물질을 사용하여 봉합되었다.
목 근육들을 봉합하기 이전에, 2 mL의 따뜻한 식염수 (예로, 대략 37.5℃)가 상처에 흘려졌다. 근육들은 흡수성 물질의 단순한 봉합을 사용하여 닫혔다. 접근 포트는 2 mL의 따뜻한 식염수를 흘려주고 피부는 흡수성 봉합 물질의 연속적 피하 봉합을 사용하여 닫혔다. 국소적 항생제 연고가 수술 이후에 또한 그 이후 매일 한번 불필요한 것으로 판단될 때까지 수술 부위들에 투여되었다.
카테터 및 접근 포트의 사장 용적 (dead volume)이 수술 시 결정되었다. 개방 검토 (patency check)가 수술일 및 치료일 사이에 전-치료 기간 동안 한 번 수행되었다.
치료
적당한 회복이 가능하도록 적어도7일의 기간이 카테터/접근 포트의 외과적 이식 및 치료 개시 사이에 허용되었다. 경막내 투여 이전에 필요한 경우라면, 접근 포트영역이 면도되었다. 천자 부위는 클로르헥시딘 글루코네이트 (chlorhexidine gluconate) 및 물을 사용하여 세척되었고 무균수에 적신 거즈로 닦고 포비돈 요오드 10%의 3번 소독이 이어졌다. 접근 포트는 투여 주사기에 연결된 바늘로 천자되었고 테스트 항목들이 천천히 투여되었다. 투여 이후에, 부위는 오염을 제한하도록 요오드로 닦았다.
연구 1일째, 그룹 1의 동물들은 60 ug/동물의 표적 투여량 수준 및 대략 3 uCi/동물의 방사능 양을 전달하도록 저속 볼루스 경막내 주사에 의해 피하 요추 접근 포트 내로 제형화된 125I-hGALC가 투여되었고 이어서 0.04 mL의 식염수를 흘려주었다.
연구 2일째, 그룹 3의 동물들은 60 ug/동물의 표적 투여량 수준 및 대략 3 uCi/동물의 방사능 양을 전달하도록 저속 볼루스 경막내 주사에 의해 피하 요추 접근 포트 내로 제형화된 125I-hGALC가 투여되었고 이어서 0.04 mL의 식염수를 흘려주었다. 저속 볼루스 경막내 주사 5분 이내에, 그룹 3의 동물들도 역시 대략 3 uCi/동물의 방사능 양과 함께 60 ug/동물의 표적 투여량 수준을 전달하도록 꼬리 정맥 내로 정맥내 카테터를 통한 정맥내 주사를 수여받았고 (3.33 mL/kg) 이어서 0.6 mL의 식염수를 흘려주었다.
연구 3일째에, 그룹 2 동물들은 60 ug/동물의 표적 투여량 수준 및 대략 3 uCi/동물의 방사능 양을 전달하도록 꼬리 정맥 내로 정맥내 카테터를 통한 정맥내 주사에 의해 제형화된 125I-hGALC가 투여되었고 (3.33 mL/kg) 이어서 0.6 mL의 식염수를 흘려주었다.
투여된 부피는 각 동물의 가장 최근의 실제 체중을 기초로 하였다. 제형화된 125I-hGALC로 채워진 주사기들 및 전달 이후에 빈 주사기들의 무게들이 기록되었다. 각 동물에게 전달된 용량은 주사기로부터 나간 투여 제형물의 순무게 및 제형화된 용량에서 측정된 방사능 농도를 기초로 하여 계산되었다.
투여하는 동안, 거즈들이 적은 양들의 용량 제형물의 환류를 흡수하도록 사용가능하고, 테스트 항목 소실이 특이적 프로젝트 절차에 따른 액체 신틸레이션 계수법에 의해 설명될 수 있다. 제형화된 테스트 항목의 투여에 사용되는 주사기들 및 정맥내 카테터들이 보유되었다. 정맥내 카테터들 및 선택된 경막내 접근 포트/카테터들이 특이적 프로젝트 절차에 따라 방사능 수준에 대해 분석되었다.
시료 채취
혈액/혈청 및 조직들
말단 혈액 시료 (최대 가능 부피)가 그룹 1 내지 3의 경우에 투여 이후 10분, 30분, 1, 3, 6, 24, 48 및 96 시간에 3마리 동물들/시간대로부터 채취되었다. 그룹 3에서는 경막내 투여가 정맥내 투여를 선행하였고 말단 혈액 시료의 시간대는 정맥내 투여의 시간을 기초로 하였다. 말단 혈액 시료들이 이소플루란 마취제 하에 마취된 래트 (그룹들 1, 2 및 3, 또한 3마리의 여분의 동물들)의 복부 동맥으로부터 복부 동맥으로부터의 큰 출혈 (exsanguinations)에 의해 채취되었다. 대략 3 mL의 혈액 (그룹들 1, 2 및 3)이 전혈 시료들을 제공하도록 K3-EDTA를 포함하는 적합한 튜브에 전달되고 기다리는 동안 녹은 얼음 위에 유지시켰다. 그룹들 2 및 3, 또한 여분 동물들의 경우, 추가적인 1.5 mL의 혈액이 프로트롬빈 시간 (PTT), 활성화된 부분적 트롬보플라스틴 시간 (APTT) 및 피브리노겐의 분석을 위해 소듐 시트레이트를 포함하는 튜브들 내로 전달되었다. 혈액 시료들은 2700 RPM 및 4℃ 에서 5분 동안 원심분리를 기다리며 녹은 얼음 위에 보관되었다. 혈장 시료들은 배송 및 출원인이 지정한 연구실에서 분석 이전에 대략 -80℃로 냉동되었다. 여분의 동물들로부터 나온 혈장은 PTT, APTT 및 피브리노겐의 분석을 위해 공 (blank) 시료들로서 제공되었다. 모든 분석들 (그룹들 1, 2 및 3)을 수행하는데 불충분한 혈액 양이 획득된 경우 다음으로 방사능 분석을 위한 혈액이 우선적이다.
남아있는 혈액 (그룹들 1, 2 및 3, 또한 3마리의 여분 동물들)은 혈청 생산을 위해 응고 활성인자를 포함하는 튜브들로 전달되었고 원심분리 이전 대략 30분의 기간 동안 상온에서 응고디도록 허용되었다. 여분의 동물들로부터 채취된 시료들은 미치료된 동물들로부터 나온 혈액 시료들의 응고를 평가하는 데 사용되었다
큰 출혈에 이어서, 다음의 조직들이 표시된 바와 같이 그룹들 1 내지 3으로부터 나온 3마리 동물들/시간대로부터 채취되었다: 지방 조직 (신장 지방), 부신샘들, 뼈 (대퇴), 뇌, 눈들, 심장, 신장들, 대장, 대장 함유물, 간, 폐들, 근육 (골격), 좌골 신경, 소장, 소장 함유물, 척수 (요추, 흉추, 경추), 비장, 위, 위장 함유물, 갑상샘/부감상샘, 방광 함유물.
채취 시, 조직들은 무게 측정되었고, 다음으로 처리되어 전체 방사능에 대해 분석되었다. 상기에서 언급된 조직들 모두 뿐만 아니라 말단 혈액 및 혈청도 역시 여분의 동물로부터 채취되었고 방사능의 기저 수준들을 결정하는 데 사용되었다. 남아있는 사체들은 생물학적 쓰레기로서 처분되기 이전에 방사능 붕괴를 허용하도록 지정된 냉동고에 냉동 보관되었다 (-10℃ 내지 -20℃). 그룹들 1 및 3로부터 나온 각 시간대에서 첫 번째 동물의 사체가 냉동고로부터 회수되어 해동되었고 접근 포트 및 카테터가 제거되었으며 물을 흘리고 잔여 방사능에 대해 확인하였다.
뇌척수액
뇌척수액 (CSF) 시료들이 안락사 직전 부검에서 모든 동물들로부터 채취되었다. 그룹들 1 내지 3으로부터 나온 세 마리 동물들/시간대가 투여 이후 10분 30분, 1, 3, 6, 24, 48 및 96 시간에서 안락사되었다. CSF의 시료 (최대 가능 부피)가 대수공를 통해 제거되었고 입체 탁자를 사용하는 것이 머리를 정렬하는 데 필요하였다. CSF는 튜브 내로 옮겨졌고 녹은 얼음 위에 두었다. 일정량 (대략 20 uL)이 처리되었고 전체 방사능 함량에 대해 분석되었다. CSF는 여분의 동물로부터도 역시 채취되었고 기저 수준들의 방사능을 결정하는 데 사용되었다.
기저 수준 방사능 수준들의 결정
여분 동물로부터 채취한 혈액, 혈청 및 조직들은 그룹들 1, 2 및 3에서 혈액, 혈청 및 조직들에 대한 기저 방사능 수준들의 결정에 사용되었다. 여분의 동물로부터 채취한 CSF는 CSF에 대한 기저 방사능 수준들의 결정에 사용되었다.
방사능 측정들을 위한 시료 처리
모든 시료들은 혈액, 혈장, 혈청 및 CSF를 제외하고 채집에 이어서 무게가 측정되었다. 모든 그룹들의 경우, K3-EDTA 상에서 채집된 전혈의 100 uL 무게 측정된 분량들 두 벌을 방사능 분석을 위해 가져왔다. 삼염화아세트산 (TCA)를 사용한 전혈의 단백질 침전이 다음과 같이 수행되었다: TCA의 15% 수용액의 동등한 부피가 전혈의 100 uL 무게 측정된 분량들 두 벌에 첨가되었다. 시료들 (100 uL 전혈 + 100 uL TCA)은 볼텍스를 시행하여 혼합되었고 다음으로 10000 rpm에서 대략 15분 동안 4℃에서 원심분리되었으며 분리 튜브 내로 상청액이 비워졌다. 상청액 및 펠렛 둘 다가 방사능 함량에 대해 분석되었다.
혈청 수집을 위한 혈액은 혈청을 분리하도록 대략 10분 동안 4℃에서 2700 rpm (1250 rcf)으로 원심분리되기 이전에 응고를 허용하도록 대략 30분 동안 상온에서 유지되었다. 다음으로 혈청 시료들은 방사능 분석을 위한 분량 작업을 기다리며 녹은 얼음 위에 놓아두었다 (2 x 100 uL 무게 측정된 분량들). 포장된 적혈구 세포들 (혈청 분리 이후에 획득됨)은 방사능 분석을 위한 처리를 기다리며 녹은 얼음 위에 놓아두었다. 남아있는 혈청은 냉동 보관되었다 (-10℃ 내지 -20℃). 두 벌의 100 uL 무게 측정된 전형 및 적혈구 세포들 (혈청 분리 이후에 획득되고 동일한 부피의 탈이온화된 물 (w/v)과 혼합되고 폴리트론 에멀전화제 (Polytron emulsifier)로 균질화됨)은 솔루엔-350 (Soluene-350)에서 용해되었고 과산화수소 (30%　w/v)로 탈색되었으며, 방사능 분석을 위해 액체 신틸레이션 액과 혼합되었다.
TCA 혈액 침전 펠렛은 35% 테트라에틸암모니움 하이드록사이드 (TEAH)에 용해되었고 과산화수소 (30%　w/v)로 탈색되었으며, 방사능 측정을 위해 액체 신틸레이션 액과 혼합되었다. 방광 함유물, TCA 혈액 상청액, 용량 제형물들의 두 벌의 무게 측정된 분량들 (희석됨) 및 혈청이 방사능 측정을 위해 액체 신틸레이션 액과 직접 혼합되었다. 두 벌의 무게 측정된 CSF의 분량들 (대략 10 uL/분량)은 방사능 측정을 위해 액체 신틸레이션 액과 혼합되기 이전에 35% TEAH에서 용해되었다.
조직 시료들은 35% TEAH에서 전부 (in toto) 용해되었다. 다음으로 두 벌의 분량들은 방사능 측정 이전에 액체 신틸레이션 액과 혼합되었다. 대장 함유물들은 물의 기지의 양으로 균질화되었다. 두 벌의 무게 측정된 분량들의 대장 함유물 (LINC) 균질물들, 위장 함유물들 (STC) 및 소장 함유물 (SINC) 35% TEAH에서 용해되었고 방사능 측정을 위해 액체 신틸레이션 액과 혼합되었다.
방사능 측정들
방사능 측정들은 표준 작동 절차들 (SOP)에 따라 액체 신틸레이션 분광분석법에 의해 시행되었다. 각 시료는 처음 발생하는 0.1%의 2-시그마 오차로 5분 동안 계수되었다. 모든 계수들은 외부 표준을 위한 스펙트럼의 이동을 기초로 한 자동 소멸 교정에 의해 절대 방사능 (DPM)으로 전환되었다. 적절한 기저 DPM 수치들은 모든 시료 DPM 수치들로부터 차감되었다. 기저 차감에 이어서, 기저 수치들 이하 또는 이와 동등한 방사능을 나타내는 시료들은 모든 연속 조작들의 경우에 제로로서 판단되었다.
데이타 분석
방사능 농도
모든 방사능 농도 측정들이 시료에서 방사능 농도들 (dpm/g 및 mass eq/g) 또한 백분율-투여된 방사능의 계산을 위해 표준 컴퓨터 데이타베이스 프로그램 (데브라 버전 5.2)에 들어갔다. dpm/g 및 mass eq/g로 방사능의 혈액, 혈청, 조직들 및 CSF 농도들이 투여 용액들에서 방사선 표지된 테스트 항목의 측정된 특이 활성 (dpm/mg 또는 적절한 질량 단위)을 기초로 하여 계산되었다. 혈액 시료들에서 방사능 농도는 래트 혈액의 밀도를 기초로 하여 질량 eq/mL로 전환되었다. 전체 조직 함량이 전체 기관 무게들을 위해 계산되었다.
약물역학 (Pharmacokinetics)
혈액, 혈청, CSF 및 조직들에서 전체 방사능의 약물역학적 (PK) 프로파일은 입증된 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 (WinNonlin, version 3.2, Pharsight Corp., Mountain View, California, USA) 농도 대비 시간 프로파일의 비-분리 분석에서 특성분석 되었다. 정맥내 및 혈관외 투여 경로들을 기초로 하여 모델들이 선택되었다. 검출가능 또는 정량가능하지 않은 것으로 보고된 농도 수치들은 평가되지 않고; 부재 시료들로서 처리되었다. 농도 데이타가 각 시간대에 서로 다른 동물들로부터 획득되었고, 평균 수치들이 복합 약물역학적 프로파일을 생성하는데 사용되었다. 그룹 1 (동물 번호 1001, 1002, 1003) 및 그룹 2 (동물 번호 2001, 2002, 2003)의 경우 10-분 시료 채취, 또한 그룹 1의 경우 48시간 (동물 번호 1019, 1020)이 10% 이상 또는 6분의 시간대로 편차가 생겼다. 본 프로토콜로부터 나온 편차는 평균 시간이 약물역학적 분석들에서 계산되고 사용되었기 때문에 연구 또는 획득된 데이타의 타당성에 영향을 주지 않았다.
방사능 농도 vs. 시간 곡선 (AUC) 아래의 영역은 직선 사방형 방법 (linear trapezoidal method) (선형 간입)을 사용하여 계산되었다. 실제로, PK프로파일의 말단 제거 단계는 적어도 최종 세 가지의 관찰된 농도 수치들을 사용하여 최고 적정 선 (R2)을 기초로 하여 확인되었다. 말단 제거 단계의 기울기는 무게 측정되지 않은 농도 데이타를 사용하는 로그-선형 회귀를 사용하여 계산되었다. kel 결정에 의존하는 변수들은 결정 계수 (R2)가 0.8 이하인 경우 또는 무한대로 AUC 외삽이 전체 영역의 20% 이상으로 나타난 경우에는 보고되지 않았다.
결과들
투여 제형물들의 분석 (표 8)
투여일에는, 각 제형물의 분량들이 모든 그룹들에게 용량 투여 이전 또는 이에 이어서 액체 신틸레이션 분광분석법에 의해 분석되었고, 테스트 항목들의 특이적 활성은 이들 분석들로부터 계산되었다. 경막내 투여를 위한 제형물에서 전반적인 평균 방사능 농도 (℃±S.D.)는 그룹 1의 경우 345.4　x　106 ℃±　4.92　x　106　dpm/g (155.60　uCi/g) 또한 그룹 3의 경우 334.4　x　106 ℃±　5.87　x　106　dpm/g (150.62　uCi/g)이었다. 정맥내 투여를 위한 제형물에서 전반적인 평균 방사능 농도는 그룹 2의 경우 4.4　x　106 ℃±　4.22　x　105　dpm/g (1.97　uCi/g) 또한 그룹 3의 경우 4.7　x　106 ℃±　2.31　x　105　dpm/g (2.11　uCi/g)이었다. 경막내 제형물에서 테스트 항목의 특이적 활성은 그룹 1 용량의 경우 51.16 uCi/mg, 또한 그룹 3 용량의 경우 49.53 uCi/mg으로서 계산되었다. 정맥내 제형물에서 테스트 항목의 특이적 활성은 그룹 2 용량의 경우 6.53 uCi/mg 또한 그룹 3 용량의 경우 6.99 uCi/mg로서 계산되었다. 표 8은 액체 신틸레이션 분광분석법에 의한 투여 제형물들에서의 방사능 농도의 결과 요약을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00010
동물 체중들 및 투여량들 (표 9)
투여 이전에 그룹들 1, 2 및 3에서 래트들의 평균 체중들은 각각 405 g (373 g 내지 452 g 범위), 410 g (367 g 내지 453 g 범위), 및 395 g (342 g 내지 444 g 범위) 이었다. 그룹 1 동물들에게 경막내 투여된 125I-hGALC의 계산된 평균 용량은 41 ℃± 0.014 ug/동물이었고, 이것은 방사선화학적 용량 2.12 ℃± 0.72 uCi/동물과 동등하였다. 그룹 2 동물들에게 정맥내 투여된 125I-hGALC의 평균 용량은 1.00℃± 0.02 mg/kg (2.69℃± 0.14 uCi/동물)이었다. 그룹 3의 경우는, 경막내 및 정맥내 투여된 125I-hGALC의 계산된 평균 용량이 1.08℃± 0.04 mg/kg (5.72℃± 0.31 uCi/동물)이었다. 표 9는 그룹 평균 체중들 및 수컷 스프라그-달리 래트들에게 투여된 125I-hGALC 용량의 명세표를 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00011
그룹 1에서 래트들에게 투여된 평균 화학적 용량 및 방사선화학적 용량은 표적 용량 수준들보다 더 낮았고 (각각 대략 32% 및 29%), 이것은 프로토콜로부터 나온 편차를 구성하였다. 그러나, 동물들에게 투여된 실제 용량들이 계산들 전체를 통하여 사용되었기 때문에, 이들 더 낮은 수치들은 연구 또는 획득된 데이타의 타당성에 영향을 주지 않는 것으로 판단되었다.
임상적 관찰들
치료와 관련 임상적 징후들이 125I-hGALC 의 60 g /동물로 경막내 투여 및/또는 1 mg/kg으로 정맥내 투여에 어어서 래트들에서 전혀 관찰되지 않았다.
응고 평가
이른 시간대들에서 (투여 이후 10분 내지 6시간) 치료된 동물들로부터 채취된 혈액이 허용된 30분 이내에 전부 응고되지 않은 것으로 확인되었다. 그러나 3마리의 미치료된 여분의 래트들로부터 채취된 혈액은 바로 응고되었고 응고 과정과 테스트 항목의 간섭을 제시하고 있다. 30분 이하 또는 이상의 응고 시간들은 프로토콜로부터 편차를 만들었다. 그러나, 더 긴 응고 시간들은 일정 시료들이 분석을 위한 일정 혈청을 제공하도록 요구하였다. 획득된 결과들의 검토는 혈청에서 획득된 농도 및 혈액이 응고되는 시간 길이 간에 상호관련성을 전혀 보여주지 않았다. 따라서, 본 연장되거나 단축된 응고 시간은 연구 또는 획득된 데이타의 타당성에 영향을 주지 않았다.
혈액, 혈청, 적혈구 세포들, CSF 및 조직들에서 전체 방사능의 약물역학
혈액, 혈청 및 적혈구 세포들에서 전체 방사능 농도들 (표 10, 표 11, 표 12, 도 18-21)
125I-hGALC의 경막내 및/또는 정맥내 용량들에 이어서 수컷 래트들의 혈청에서 방사선 표지된 물질의 평균 농도들은 표 10에 주어졌다. 전혈에서 또한 적혈구 세포들에서 방사선 표지된 물질의 평균 농도들은 표 11에 나타나 있다. 평균 데이타는 도 18에 그래프로 나타나 있다. TCA 침전에 이어서 상청액 및 혈액의 펠렛에서 회수된 방사능의 평균 백분율은 표 12에 나타나 있다.
그룹 1 (41 ug/동물의 경막내 평균 용량)
경막내 투여에 이어서, 혈청 및 혈액에서의 방사선 표지된 물질의 최고 평균 농도 (Cmax)는 투여 3시간 이후에 관찰되었다 (각각 0.108 ℃± 0.026 ug eq/g 및 0.093 ℃± 0.023 ug eq/g). 혈액에서 방사능 수준들은 투여 이후 3 및 6시간 사이에서 비교적 일정하게 유지되었다. 다음으로, 혈청 및 혈액에서 방사능 농도들도 감소되었고 투여 이후 48시간까지 정량의 한계 (LOQ) 미만이 되었다. 적혈구 세포들의 경우, Cmax 가 투여 이후 6시간에 관찰되었고 0.089 ℃± 0.024 ug eq/g이었다. 다음으로, 적혈구 세포들 방사능 농도들이 감소되었고 투여 이후 48시간 까지 LOQ 미만이 되었다. 경막내 투여에 이어지는 평균 혈액 대비 혈청 비율들은 연구 기간 전체를 통하여 1 미만 (0.7로부터 0.9까지의 범위)이었고, 상세하게 방사선 표지된 물질이 혈액 세포들과 연관되지 않는 점을 가르킨다. 적혈구 세포들 대비 혈청 비율들의 수치들 (0.8로부터 0.9까지의 범위)도 역시 방사능이 혈액 세포들과 실질적으로 연관되지 않은 점을 지지하였다. 혈액에서 발견되는 용량의 백분율이 표준 혈액 부피/체중 (예로, 64.0 mL/kg)를 사용하여 추정되었다. tmax (최고 방사능 농도가 발생하였던 시간)에서, 투여된 용량의 대략 6% 가 혈액과 연관된다.
그룹 2 (1.00 mg/kg의 정맥내 평균 용량)
정맥내 투여에 이어서, 혈청 (14.864 ℃± 0.853 ug eq/g) 및 혈액 (10.228 ℃± 0.447 ug eq/g)에서의 방사선 표지된 물질의 최고 평균 농도 (Cmax)는 투여 10분 이후에 관찰되었다 (예로, 분석된 첫 번째 시간대). 다음으로, 혈청 및 혈액에서 방사능 농도들은 천전히 감소되었지만 68.4%로부터 0.3%까지 감소하는 혈액에서 추정된 용량의 백분율을 가지고 투여 이후 96시간째 여전히 검출가능하였다 (혈청: 0.088 ℃± 0.006 ug eq/g, Cmax 0.59% Cmax; 혈액: 0.051 ℃± 0.002 ug eq/g, Cmax 0.50%). 다음으로, 적혈구 세포들 방사능 농도들이 감소되었고 투여 이후 96시간까지 LOQ 미만이 되었다. 정맥내 투여에 이어지는 평균 혈액 대비 혈청 비율들은 연구 기간 전체를 통하여 1 미만 (0.6로부터 0.8까지의 범위)이었고, 상세하게 방사선 표지된 물질이 혈액 세포들과 연관되지 않는 점을 가르킨다. 적혈구 세포들 대비 혈청 비율들의 수치들 (0.4로부터 0.6까지의 범위)도 역시 방사능이 혈액 세포들과 실질적으로 연관되지 않은 점을 지지하였다.
그룹 3 (정맥내 용량에 이어지는 경막내 용량: 1.08 mg/kg (조합된 용량))
경막내 투여 (표적 60 ug/동물) 및 정맥내 투여 (1 mg/kg)에 이어서, 혈청 (14.675 ℃± 0.810 ug eq/g) 및 혈액 (9.974 ℃± 0.558 ug eq/g)에서 방사선 표지된 물질의 최고 평균 농도 (Cmax)는 투여 10분 이후에 관찰되었다 (예로, 분석된 첫 번째 시간대). 다음으로, 혈청 및 혈액에서 방사능 농도들은 천전히 감소되었지만 32.6%로부터 0.1%까지 감소하는 혈액에서 추정된 용량의 백분율을 가지고 투여 이후 96시간째 여전히 검출가능하였다 (혈청: 0.077 ℃± 0.010 ug eq/g, Cmax 0.52%; 혈액: 0.037 ℃± 0.033 ug eq/g, Cmax 0.37%). 적혈구 세포들의 경우, Cmax 6.113 ℃± 1.748 ug eq/g가 투여 이후 10분에 관찰되었다. 다음으로 적혈구 세포들 방사능 농도들이 감소되었고 투여 이후 96시간까지 정량 한계 미만이었다. 1 미만의 평균 혈액 대비 혈청 및 적혈구 세포 대비 혈청 비율들에 의해 확인되는 바와 같이 (각각 0.7로부터 0.8 및 0.4로부터 0.7까지의 범위)이었고, 상세하게 방사선 표지된 물질이 혈액 세포들과 연관되지 않았다.
표 10a는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈청에서의 그룹 평균 방사능 농도를 나타낸다. 표 10b는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈청에서의 그룹 평균 방사능 농도를 나타낸다. 표 10c는 125I-hGALC의 단일 경막내 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈청에서의 그룹 평균 방사능 농도를 나타낸다.
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표 11a는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈액에서 방사능의 그룹 평균 농도 및 함량 또한 혈액 대비 혈청의 비율들을 나타낸다. 표 11b는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈액에서 방사능의 그룹 평균 농도 및 함량 또한 혈액 대비 혈청의 비율들을 나타낸다. 표 11c는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈액에서 방사능의 그룹 평균 농도 및 함량 또한 혈액 대비 혈청의 비율들을 나타낸다. 표 11d는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 적혈구 세포들에서 방사능의 그룹 평균 농도 및 함량 또한 적혈구 세포들 대비 혈청의 비율들을 나타낸다. 표 11e는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 적혈구 세포들에서 방사능의 그룹 평균 농도 및 함량 또한 적혈구 세포들 대비 혈청의 비율들을 나타낸다. 표 11f는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 적혈구 세포들에서 방사능의 그룹 평균 농도 및 함량 또한 적혈구 세포들 대비 혈청의 비율들을 나타낸다.
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표 12a는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들로부터 나온 혈액의 상청액 및 펠렛에서 회수되는 방사능 평균 백분율을 나타낸다. 표 12b는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들로부터 나온 혈액의 상청액 및 펠렛에서 회수되는 방사능 평균 백분율을 나타낸다. 표 12c는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들로부터 나온 혈액의 상청액 및 펠렛에서 회수되는 방사능 평균 백분율을 나타낸다.
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전혈에서 125 I-침전
(표 12)
그룹 1, 2 및 3의 경우, 전혈에서 삼염화 아세트산 (TCA)에 의한 침전에 이어서 펠렛 및 상청액에서의 방사능 회수의 평균 수치들이 표 12에 정리되어 있다. 전혈에서 단백질들을 침전시키도록 TCA의 15% 수용액을 사용할 때, 방사능은 주로 혈액의 펠렛에서 회수되었고 (그룹 1에서100% 내지 67%; 그룹 2에서 100% 내지 91%; 그룹 3에서 100% 내지 88%), 순환하는 방사능의 대다수가 단백질과 연관되었고 따라서 자유 125요오드를 반영하지 않는 점을 제시하고 있다.
조직 및 뇌척수액 (CSF)에서 방사능 농도
(표 13, 표 14, 표 15, 도 19 내지 30)
125I-hGALC의 단일 경막내 및/또는 정맥내 용량에 이어지는 조직들 및 CSF에서의 평균 방사능의 농도들이 표 1에 주어지고 있다. 평균 데이타는 도 19 - 30에 그래프로 표현된다. 평균 조직 댑 혈청 비율들은 표 14에 표현되고 또한 조직들, CSF 및 위장관 및 방광 함유물들에서 투여된 용량의 회수가 표 15에 주어지고 있다. 표 13a는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들, 뇌척수액에서 방사능의 그룹 평균 농도를 나타낸다. 표 13b는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들, 뇌척수액에서 방사능의 그룹 평균 농도를 나타낸다. 표 13c는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들, 뇌척수액에서 방사능의 그룹 평균 농도를 나타낸다.
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표 14a는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 그룹 평균 조직, 뇌척수액 대비 혈청 방사능 비율들을 나타낸다. 표 14b는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 그룹 평균 조직, 뇌척수액 대비 혈청 방사능 비율들을 나타낸다. 표 14c는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 그룹 평균 조직, 뇌척수액 대비 혈청 방사능 비율들을 나타낸다.
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표 15a는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들, 뇌척수액, 위장관, 방광 함유물들에서 그룹 평균 방사능 함량을 나타낸다. 표 15b는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들, 뇌척수액, 위장관, 방광 함유물들에서 그룹 평균 방사능 함량을 나타낸다. 표 15c는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들, 뇌척수액, 위장관, 방광 함유물들에서 그룹 평균 방사능 함량을 나타낸다.
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그룹 1 (41 ug/동물의 경막내 평균 용량)
경막내 투여에 이어서, 모든 조사된 조직들 내로 125I-표지된 물질의 일반적인 분포가 있었지만, CSF에서의 방사능 수준들은 LOQ 미만이었다. 수컷 래트들의 조직들에서 125I-표지된 물질의 최고 평균 농도들은 투여 이후 48 시간째 감상샘/부갑상샘에서 (4.127℃± 1.635 ug eq/g) 및 3시간째 위장 (0.203℃± 0.101 ug eq/g), 신장 (0.096 ℃± 0.014 ug eq/g) 및 폐들 (0.058 ℃± 0.014 ug eq/g)에서 관찰되었다. 수준들은 투여 이후 3 및 6시간 사이에서 일반적으로 관찰되는 tmax 수치들을 가지는 다른 조직들에서 더 낮았다. 최저 Cmax 수치들은 뇌 (0.005℃± 0.001 ug eq/g) 및 신장 지방 (0.006℃± 0.000 ug eq/g)에서 관찰되었다. 투여 이후 48 및 96시간까지 대다수 조직들에서 방사능 수준들은 갑상샘/부갑상샘, 신장들 및 위장을 제외하고는 검출 한계 미만이었다. 투여 이후 96시간에, 최고 평균 농도가 갑상샘/부갑상샘 (1.927℃± 1.585 ug eq/g, Cmax 46.7%)에서 관찰되었고 신장들 (0.005℃± 0.001 ug eq/g, Cmax 5.2%) 및 위장 (0.002℃± 0.001 ug eq/g, Cmax 1%)으로 이어졌다.
일반적으로 조직 대비 혈청 비율들은 경막내 투여 이후 24시간까지의 조직들의 경우 1미만이었다. 예외들로는 갑상샘/부갑상샘, 신장들 및 위장들이었다. 지금까지 가장 높은 비율들은 갑상샘/부갑상샘의 경우에 관찰되었다. 투여 이후 48 및 96 시간들까지 혈청 농도들은 LOQ 미만이었기 때문에 계산될 수 없었다.
모든 조직들에서 회수된 방사능의 수준들은 투여 이후 3시간에 간 (0.91%) 에서 관찰된 가장 높은 비중들 (proportions)을 가지는 투여된 용량의 1% 이하이었다. 투여 1시간에, 투여된 용량의 1% 이상의 부분들만이 위장 함유물들 (1.8%)에서 발견되었다. 투여 3시간에, 투여된 용량의 1% 이상의 부분들이 소장 함유물들 (2.6%)에서 발견되었다. 투여 6시간에, 투여된 용량의 1% 이상의 부분들이 소장 함유물들 (2.6%), 위장 함유물들 (5.0%) 및 방광 함유물들 (1.2%)에서 발견되었다. 투여 이후 96시간째 적은 양들의 125I-hGALC-유래 방사능 (0.1% 이하)이 여전히 신장들, 갑상샘/부갑상샘, 위장 및 뇨방관 함유물들에서 여전히 회수되었고, 갑상샘/부갑상샘에서 가장 높은 회수들 (0.09%)이 관찰되었다.
그룹 2 (1.00 mg/kg의 정맥내 평균 용량)
정맥내 투여에 이어서, 그룹 2 래트들의 조직들에서 방사선 표지된 물질의 최고 평균 농도 (Cmax)는 갑상샘/부갑상샘 (294.521 ℃± 52.953 ug eq/g; 투여 48시간)에서 관찰되었고, 폐들 (20.629 ℃± 2.125 ug eq/g; 투여 30분), 간 (11.335 ℃± 1.436 ug eq/g; 투여 10분), 부신샘들 (8.827 ℃± 2.435 ug eq/g; 투여 10분), 비장 (6.595 ℃± 0.625 ug eq/g; 투여 10분) 및 신장들 (3.027 ℃± 0.330 ug eq/g; 10분)이 이어졌다. 조직들에 대한 tmax 수치들은 갑상샘/부갑상샘를 제외하고는 (투여 이후 48시간) 10분 및 3시간 사이에서 발생하였다. 가장 낮은 평균 방사능 Cmax 수치들은 신장 지방 (0.158 ℃± 0.019 ug eq/g), CSF (0.210 ℃± 0.363 ug eq/g), 뇌 (0.252 ℃± 0.041 ug eq/g), 골격근 (0.275 ℃± 0.025 ug eq/g) 및 척수 (0.293 ℃± 0.028 ug eq/g)에서 관찰되었다. 투여 이후 96시간까지 방사능이 분석된 18 개 조직들의 7개에서 여전히 검출되었고, 최고 평균 농도들은 갑상샘/부갑상샘 (218.917 ℃± 45.098 ug eq/g, Cmax 74.3%)에서 검출되고 간 (0.126 ℃± 0.014 ug eq/g, Cmax 1.1%), 비장 (0.111 ℃± 0.009 ug eq/g, Cmax 1.7%) 및 신장들 (0.099 ℃± 0.010 ug eq/g, Cmax 3.3%)이 이어졌다.
투여 이후 10분에, 평균 조직-대비-혈청 비율들은 분석된 모든 조직들의 경우 1이하이었다. 투여 이후 30분 및 1시간까지는, 평균 조직-대비-혈청 비율들이 간, 폐들 및 갑상샘/부갑상샘의 경우 1시간 이상이었다. 투여 이후 3시간 및 6시간까지는, 평균 조직-대비-혈청 비율들이 간, 폐들 및 갑상샘/부갑상샘의 경우 1시간 이상이었다. 투여 이후 24시간 및 48시간에서는, 간, 폐들, 비장 및 갑상샘/부갑상샘은 1 초과의 평균 조직-대비-혈청 비율들을 가졌다. 투여 96시간에서, 신장들, 간, 비장 및 갑상샘/부갑상샘의 경우 평균 조직-대비-혈청 비율들이 1 이상이었다. 최고 평균 조직-대비-혈청 비율들이 갑상샘/부갑상샘 (96시간에서 2485), 폐들 (24시간에서 6.5) 및 간 (24시간에서 2.2)에서 관찰되었다.
투여된 방사능의 비중의 측면에서, 조직들에서 최고 평균 수치들은 간 (투여 이후 10분에 41.7%), 폐들 (투여 이후 30분에 7.0%), 신장들 (투여 이후 10분에 2.2%), 소장 (투여 이후 1시간에 1.5%) 및 갑상샘/부갑상샘 (48시간에 1.4%)에서 관찰되었다. 위-장관 함유물들에서, 최고 평균 수치들은 위장 함유물에서 용량의 10.3% (투여 이후 3시간), 소장 함유물에서 5.4% (투여 이후 3시간), 및 대장 함유물들에서 1.1% (6시간)이었다. 투여 이후 96시간까지, 투여량의 가장 높은 비중들은 갑상샘/부갑상샘 (1.0%), 간 (0.5%), 및 신장들 (0.1%)에서 검출되었다. 투여 이후 본 시간대에서, 투여량의 0.01%은 위장 및 뇨방관 함유물들에 남아있었다.
그룹 3 (정맥내 용량에 이어지는 경막내 용량: 1.08 mg/kg (조합된 용량))
경막내 및 정맥내 투여에 이어서, 그룹 3 래트들의 조직들에서 방사선 표지된 물질의 최고 평균 농도 (Cmax)는 갑상샘/부갑상샘 (296.957 ℃± 57.793 ug eq/g; 투여 24시간)에서 관찰되었고, 간 (10.181 ℃± 0.600 ug eq/g; 투여 이후 10분), 부신샘들 (9.567 ℃± 1.678ug eq/g; 투여 이후 10분), 폐들 (5.305 ℃± 0.194 ug eq/g; 투여 이후 1시간), 비장 (5.042 ℃± 0.902 ug eq/g; 투여 이후 10분), 위장 (4.454 ℃± 1.455 ug eq/g; 투여 이후 3시간), 신장들 (3.390 ℃± 0.183 ug eq/g; 1시간) 및 CSF (2.087 ℃± 2.912ug eq/g; 10 minutes)가 이어졌다. 조직들에 대한 tmax 수치들은 대장 (투여 이후 6시간) 및 갑상샘/부갑상샘 (투여 이후 24시간)을 제외하고는 10분 및 3시간 사이에서 발생하였다. 가장 낮은 평균 방사능 Cmax 수치들은 신장 지방 (0.188 ℃± 0.020 ug eq/g), 뇌 (0.283 ℃± 0.062 ug eq/g), 척수 (0.327 ℃± 0.062 ug eq/g) 및 골격근 (0.411 ℃± 0.009 ug eq/g)에서 관찰되었다. 투여 이후 96시간까지 방사능이 분석된 18 개 조직들의 8개에서 여전히 검출되었고, 최고 평균 농도들은 갑상샘/부갑상샘 (43.962 ℃± 23.164 ug eq/g, Cmax 14.8%)에서 관찰되었고, 간 (0.137 ℃± 0.018 ug eq/g, 1.3% Cmax), 신장들 (0.124 ℃± 0.005 ug eq/g, 3.7% Cmax), 비장 (0.083 ℃± 0.009 ug eq/g, 1.6% Cmax) 및 부신샘들 (0.069 ℃± 0.016 ug eq/g, 0.7% Cmax)이 이어졌다.
투여 이후 10분에, 평균 조직-대비-혈청 비율들은 분석된 모든 조직들의 경우 1이하이었다. 투여 이후 30분 및 1시간까지, 평균 조직-대비-혈청 비율들이 간, 폐들 및 갑상샘/부갑상샘의 경우 1시간 이상이었다. 투여 이후 3시간 및 6시간에서는, 위장 및 갑상샘/부갑상샘의 경우 평균 조직-대비-혈청 비율들이 1이상이었다. 투여 이후 24시간에서는, 간 및 갑상샘/부갑상샘은 1초과의 평균 조직-대비-혈청 비율들을 가졌다. 투여 이후 48시간 및 96시간에서는, 신장들, 간 및 갑상샘/부갑상샘의 경우 또한 비장의 경우 (96시간) 평균 조직-대비-혈청 비율들이 1이상이었다. 최고 평균 조직-대비-혈청 비율들이 갑상샘/부갑상샘 (48시간에서 854), 간 (48시간에서 1.8) 및 신장들 (96시간에서 1.6)에서 관찰되었다.
투여된 방사능의 비중의 측면에서, 조직들에서 최고 평균 수치들은 간 (투여 이후 10분에 19.0%), 신장들 (1시간에서 1.2%) 및 소장 (3시간에서 1.2%)에서 관찰되었다. 위-장관 함유물들에서, 최고 평균 수치들은 위장 함유물에서 용량의 8.8% (투여 이후 3시간), 소장 함유물에서 4.3% (투여 이후 3시간), 및 대장 함유물들에서 1.0% (6시간)이었다. 투여 이후 96시간까지, 투여량의 가장 높은 비중들은 간 (0.3%), 갑상샘/부갑상샘들 (0.1%), 및 신장들 (0.05%)에서 검출되었다. 투여 이후 본 시간대에서, 투여량의 0.01%은 부신샘들, 심장, 폐들, 비장, 위장 및 뇨방관 함유물들에 남아있었다.
혈액, 혈청, 적혈구 세포들, CSF 및 조직들에서 방사능의 약물역학
(표 16 및 표 17)
125I-hGALC 의 단일 경막내 및/또는 정맥내 투여에 이어서 래트들의 혈액, 혈청, 적혈구 세포들, CSF 및 조직들에서 방사능에 대한 평균 약물역학적 변수들은 표 16 및 표 17에 주어져 있다. 표 16a는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈청, 혈액 및 적혈구 세포들에서 전 방사능의 침전 역학을 나타낸다. 표 16b는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈청, 혈액 및 적혈구 세포들에서 전 방사능의 침전 역학을 나타낸다. 표 16c는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 혈청, 혈액 및 적혈구 세포들에서 전 방사능의 침전 역학을 나타낸다.
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표 17a는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들 및 뇌척수액에서 전 방사능의 침전 역학을 나타낸다. 표 17b는 125I-hGALC의 단일 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들 및 뇌척수액에서 전 방사능의 침전 역학을 나타낸다. 표 17c는 125I-hGALC의 단일 경막내 용량 및 정맥내 일시 주사에 이어서 수컷 스프라그-달리 래트들의 조직들 및 뇌척수액에서 전 방사능의 침전 역학을 나타낸다.
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혈액, 혈청 및 적혈구 세포들
경막내 투여 (그룹 1: 41 ug/동물)에 이어서, 0시간부터 마지막 측정가능한 시간대 (AUC0-tlast)까지 방사능 농도 vs. 시간 곡선들 아래의 평균 계산된 영역들은 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들의 경우 각각 1.48 ug eq.h/g, 1.33 ug eq.h/g 및 1.24 ug eq.h/g이었다. 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들에서 방사능에 대해 보고된 외관상의 최종 t1/2은각각 5.34, 5.02 및 4.08 시간이었다. 제거율 상수 k는 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들에서 각각 0.130 h-1, 0.138 h-1 및 0.170 h-1 로서 계산되었다. AUC0-inf 는 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들에서 각각 1.54 ug eq.h/g, 1.37 ug eq.h/g 및 1.25 ug eq.h/g로서 계산되었다. 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들로부터 방사능의 제거 단계들이 AUC0-inf 계산에 요구되는 매우 낮은 백분율 외삽 수치들 (각각 4.0, 3.2 및 1.4%)에 의해 입증된 바와 같이 잘-정의되었다.
정맥내 투여 (그룹 2: 1.00 mg/kg)에 이어서, 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들의 경우 평균 AUC0-inf 수치들은 71.1 ug eq.h/g, 51.2 ug eq.h/g 및 33.9 ug eq.h/g이었고, 외관상의 말단 t1/2 수치들은 각각 30.7, 27.1 및 10.9시간이었다. k 수치는 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들에서 각각 0.0226 h -1, 0.0256 h-1 및 0.0635 h-1 로서 계산되었다. 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들로부터 방사능의 제거 단계들은 잘 정의되었고, AUC0-inf 는 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들에서 각각 75.0 ug eq?h/g (외삽 5.21%), 53.2 ug eq.h/g (외삽 3.75%) 및 35.7 ug eq.h/g (외삽 4.94%)으로서 계산되었다. 분포 (Vz)의 외관상 부피는 전혈에서 가장 컸고 (735 mL/kg) 혈청 (591 mL/kg) 및 적혈구 세포들 (441 mL/kg)이 이어졌다. 테스트 항목들의 청소 (clearance)은 혈청으로부터 13.3　mL/h/kg에서 또한 전혈의 경우8.8 mL/h/kg에서 추정되었다.
그룹 3 동물들에게 경막내 투여 및 정맥내 투여 (조합 1.08 mg/kg)에 이어서, 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들의 경우 평균 AUC0-tlast 수치들은 각각 89.8 ug eq.h/g, 66.9 ug eq.h/g 및 49.2 ug eq.h/g이었다. 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들에서 방사능에 대해 보고된 외관상의 최종 t1/2 수치들은 각각 25.5, 20.9 및 9.61 시간이었고, k는 0.0272 h-1, 0.0332 h-1 및 0.0721 h-1로서 계산되었다. 다시, 모두 세 가지의 매트릭스에 대한 제거 단계들이 잘 정의되었고, 혈청, 전혈 및 적혈구 세포들에서 AUC0-inf는 각각 92.6 ug eq.h/g, 68.0 ug eq.h/g 및 51.0 ug eq.h/g (외삽 3.06%, 1.64% 및 3.69%)으로서 계산되었다. Vz 는 전혈에서 더 컸으며 (478 mL/kg) 혈청 (429 mL/kg) 및 적혈구 세포들 (293 mL/kg)가 이어졌다. 청소 수치들은 전혈의 경우 15.9 mL/h/kg 또한 혈청의 경우 11.7 mL/h/kg이었다.
조직들
125I-hGALC (그룹 1: 41 ug/동물)의 경막내 투여에 이어서, 래트로부터 나온 조직들에서 최고 AUC0-tlast 수치들이 갑상샘/부갑상샘에서 관찰되었고 (313 ug eq.h/g), 위장 (2.60 ug eq.h/g) 및 신장들 (1.84 ug eq.h/g)이 이어졌다. 여러 조직들의 경우, 무한대까지 AUC의 % 외삽이 20%보다 크기 때문에 또는 최종 단계에서 데이타 부족으로 인해 k 및 k로부터 유래한 변수들이라면 모두 (예로, t1/2 및 AUC0-inf) 를 추정하는 것이 가능하지 않았다. 추정될 수 있는 이들 조직들의 경우 (눈들, 심장, 신장들, 대장들, 폐들, 소장 및 위장), k 는0.01로부터 0.17 h-1까지의 범위이었고, t1/2는 일반적으로 신장들의 경우 58.6시간 또한 위장의 경우 39.1 시간인 것을 제외하고는 4로부터 6시간의 범위이었다.
정맥내 투여 (그룹 2; 1.00 mg/kg)에 이어서, AUC0-tlast의 최고 수치들이 갑상샘/부갑상샘에서 관찰되었고 (24989 ug eq.h/g), 폐들 (165 ug eq.ㅗ/g), 간 (100 ug eq.h/g), 비장 (56.1 ug eq.h/g), 부신샘들 (43.1 ug eq.h/g) 및 신장들 (40.7 ug eq.h/g)이 어어졌다. 가장 낮은 AUC0-tlast 수치들은 신장 지방 (0.617 ug eq.h/g) 및 뇌 (0.735 ug eq.h/g)의 경우에 관찰되었다. 제거 단계가 잘 정의되지 않은 조직들 (갑상샘/부갑상샘 및 CSF), 또는 AUC0-inf의 외삽이 20% 이상 (신장 지방 및 뇌)인 경우 k로부터 유래한 변수들이 보고되지 않았다. 단지 간 및 폐들의 AUC0-inf 수치들이 혈청의 수치보다 컸다 (75 ug eq.h/g). 보고된 최고 AUC0-inf 수치들은 폐의 경우이었으며 (167 ug eq.h/g; 외삽 0.832%), 다음으로 간 (105 ug eq.h/g; 외삽 4.15%), 비장 (61.2 ug eq.h/g; 외삽 8.33%), 부신샘들 (46.8 ug eq.h/g; 외삽7.89%) 및 신장들 (46.7 ug eq.h/g; 외삽12.7%)이 이어졌다.
AUC0-inf 수치의 보고된 가장 낮은 수치가 척수의 경우에서 계산되었고 (2.51ug eq.h/g; 외삽 4.87%), 다음으로 근육 (2.69 ug eq.h/g; 외삽 1.93%) 및 눈들 (5.64ug eq.h/g; 외삽 5.19%)이 이어졌다. 조직들에서 계산가능한 가장 긴 t1/2 는 신장들의 경우 41.6 시간들이었고, 다음으로 부신샘들의 경우 34.6 시간 또한 비장의 경우 31.8 시간이 이어졌다. 보고된 가장 짧은 t1/2은 좌골신경의 경우 4.18시간이었다.
그룹 3의 경우, 경막내 및 정맥내 투여 (1.08 mg/kg, 조합 용량) 이후에, AUC0-tlast 의 가장 높은 수치들은 갑상샘/부갑상샘에서 관찰되었고 (16776 ug eq.h/g), 다음으로 간 (96.5 ug eq.h/g), 위장 (72.1 ug eq.h/g), 신장들 (57.9 ug eq.h/g), 비장 (46.9 ug eq.h/g), 폐들 (44.1 ug eq.h/g) 및 부신샘등 (43.9 ug eq.h/g)이 이어졌다. 가장 낮은 AUC0-tlast 수치들은 신장 지방 (0.954　ug　eq.h/g) 및 뇌 (1.03 ug eq.h/g)의 경우에서 관찰되었다. AUC0-inf의 외삽이 20% 이상 (신장 지방 및 뇌)이거나 R2 가 0.8보다 낮은 (CSF) 조직들의 경우 k로부터 유래한 변수들이 보고되지 않았다. 단지. 갑상샘/부갑상샘 및 간의 AUC0-inf 수치들은 혈청의 수치보다 더 컸다 (92.6 ug eq.h/g). 보고된 최고 AUC0-inf 수치는 갑상샘/부갑상샘의 경우이었고 (18390 ug eq.h/g; 외삽 8.78%), 다음으로 간 (102 ug eq.h/g; 외삽 5.0%), 위장 (72.6 ug eq.h/g; 외삽 0.766%), 신장들 (64.4 ug eq.h/g; 외삽10.1%), 비장 (49.3 ug eq.h/g; 외삽 4.85%), 부신샘들 (45.8 ug eq.h/g; 외삽 4.25%) 및 폐들 (45.4 ug eq.h/g; 외삽 2.88%)이 이어졌다. 보고된 가장 낮은 AUC0-inf 수치는 척수의 경우에 계산되었고 (3.77 ug eq.h/g; 외삽 6.55%), 다음으로 근육 (4.66 ug eq.h/g; 외삽 6.25%)이 이어졌다. 조직들에서 계산가능한 가장 긴 t1/2는 신장들의 경우 36.4 시간이었고, 다음으로 폐의 27.5 시간, 간의 25.7 시간 또한 갑상샘/부갑상샘의 25.4시간이 이어졌다. 보고된 최단 t1/2는 좌골 신경의 4.71 시간이었다.
논의
경막내 투여에 이어서, 혈청 및 전혈에서 방사능의 최고 평균 농도들은 투여 이후 3시간에서 관찰되었고, 전신적 순환에 용량-관련 물질의 상대적으로 신속한 분배를 제시하고 있다. 정맥내 투여에 이어서, 혈청 및 전혈에서 방사능의 최고 평균 농도들은 측정된 최초 시간대에서 관찰되었다. 1 이하의 혈액-대비-혈청 비율들에 의해 반영되는 바와 같이, 혈청에서의 농도들은 항상 전혈에서의 농도들보다 높았다. 이것은 용량-관련 물질이 특히 투여 이후 시간대라면 모두에서 그룹이라면 모두의 혈액 세포들과 연관되지 않았던 점을 가르켰다. 혈액 단백질들의 TCA 침전에 이어서, 방사능은 주로 펠렛에서 회수되었고, 순환하는 방사능의 대다수가 단백질과 연관되었던 것을 제시하고 관찰된 방사능 분포가 자유 125요오드의 처분을 많이 반영하지 않는 점을 제시하고 있다.
그룹 2 (정맥내 용량 1.00 mg/kg)를 그룹 3 (경막내 및 정맥내 조합 용량 1.08 mg/kg)과 비교할 때, 그룹 3 혈청 및 전혈에서의 농도들은 일반적으로 그룹 2의 농도들과 유사한 것으로 보였다. 둘 다의 그룹의 기질 둘 다에서 방사능의 강하도 역시 혈액-대비-혈청 비율들에 의해 평가된 바와 같이, 매우 유사하였다. 그룹 2 및 그룹 3혈청 및 전혈에 대한 AUC0-tlast 및 AUC0-inf 를 비교하여, 용량-관련 물질이 그룹 3 동물들의 경우 약간 더 높았던 점을 가르켰다.
그룹 1에서, CSF의 방사능 수준들이 매우 낮았고, 뇌에서 매우 낮은 수준들이 관찰되었더라도 직접 경막내 공간으로 테스트 항목의 투여와 부합되도록 보이지 않는 발견이다. 그러나, 방사능은 투여에 이어서 바로 전신적 순환에서 또한 전신적 조직들에서 관찰되었고, 용량-관련 물질이 투여에 이어서 경막내 공간으로부터 매우 신속하게 분배되는 점을 제시하고 있다. 위 및 장 함유물들에서 더 높은 수준들은 용량-관련 물질이 본 면구에서는 분비물에서의 직접적인 측정이 수행되지 않았더라도 대변을 통해 배출되는 점을 제시하였다. 또한, 방광 함유물들에서 높은 수준들도 역시 소변을 통한 배출을 제시하고 있다. 테스트 항목 자체의 분배/지속이 아닌 본 조직에서 요오드 라벨의 소실 및 라벨의 지속을 반영하는 것으로 고려되는 갑상샘/부갑상샘에서 높은 수준들이 아닌 높은 수준들의 방사능이 간, 폐들, 부신샘들, 비장 및 신장들; 테스트 항목의 대사 및/또는 배출에서 관여할 것 같은 조직들에서 관찰되었다.
방사능의 분포는 그룹들 2 및 3에서 투여 이후 최초 시간대까지 일반적이고 광범위하다. 일반적으로, 최고 농도들은 간, 폐들, 신장들, 비장, 부신샘들, 및 상세하게는 갑상샘/부갑상샘들과 연관되었다. 따라서 세 가지 그룹들 모두의 조직들에서 방사능의 분포 양상은 많이 유사하였다. 다시, 모든 동물들의 갑상샘/부갑상샘들에서 관찰되는 높은 수준들의 방사능은, 상세하게 투여 이후 시간이 증가하면서 현저한 농도 증가를 고려하여, 아마도 테스트 항목 자체의 분배/지속이 아닌 오히려 본 조직에서 요오드 라벨의 소실 및 라벨의 지속을 가르켰다. CSF 수준들은 투여 이후 최초 시간대에서 그룹 1과 비교한 바 이들 그룹들에서 더 높았고, 방사선 표지된 물질이 혈액-뇌 장벽을 통과할 수 있는 점을 제시하였다. 다시 투여 이후 최초 시간대에서 약간 더 높은 수준들이 그룹 3에서 본 기질로 관찰되었고, 본 농도는 정맥내 투여로부터 배분되는 테스트 항목-관련 물질 및 경막내 공간 내로 직접 주사되는 물질에 의해 설명되는 점을 제시하였다. 따라서 그룹 1의 경우 관찰되는 LOQ 미만의 수치들은 매우 적은 시료 부피들에서 매우 낮은 농도들의 결과일 수 있고, 본 분석 방법에 의해 가능한 정량 미만이다.
일반적으로 조직-대비-혈청 비율들은 투여 이후 96시간까지 모든 그룹들에서 대다수의 조직들이 1 이하이었고, 용량-관련 물질이 조직들 내로 배분되고 일반적으로 혈청으로부터 보다는 조직들로부터 바로 청소되는 점을 제시하였다. 모든 그룹의 경우, 용량-관련 물질에 대한 대다수 조직들의 노출은 혈청의 것 이하였다 (AUC0-tlast에 의해 평가되는 바와 같음).
결론
수컷 래트들에게 125I-hGALC 의 단일 경막내 (숫자상 60 ug/동물) 및 정맥내 일시 주사 (숫자상 농도 1 mg/kg)에 이어서, 혈액, 혈청, 적혈구 세포들, CSF 및 조직들에서 방사능의 농도들이 결정되었다.
혈청 및 전혈 둘 다에서 관찰된 방사능의 최고 농도들은 경막내 투여에 이어서 투여 3시간에서 발생하였고, 비교적 신속한 전신적 순환의 분포를 가르켰으나 정맥내 투여에 이어서는 투여 최초 시간대 (10분)이었다. 혈청에서 농도들은 혈액에서보다 높았고 테스트 항목-관련 물질이 상세하게는 전혈과 연관되지 않는 점을 가르켰다. 조직들 내로 방사능의 배분은 투여 이후 이른 시간대까지 일반적이고 광범위하였고, 일반적으로 조직들로의 배분 양상은 세 가지 그룹들 모두 간 유사하였다. 모든 그룹의 경우, 용량-관련 물질에 대한 대다수 조직들의 노출은 혈청의 것 이하였다 (AUC0-tlast에 의해 평가되는 바와 같음). 모든 동물들의 갑상샘/부갑상샘들에서 높은 수준들의 방사능은, 본 조직에서 용량-관련 물질의 배분 및 지속이 아닌 오히려 요오드 라벨의 소실 및 라벨의 지속을 가리키는 것으로 고려되었다. 정맥내 투여 이후 96시간까지, 방사능이 조사된 몇 가지 조직들에서 검출되었다.
실시예 3. ICV 및 ICV/IP rmGALC 주사의 전임상적 연구 및 트위처 마우스에서 연장된 생존
본 실시예는 rmGALC 의 매주 IP 주사들이 공급된 트위처 마우스에서 연장된 생존을 설명하는 전임상적 연구의 한 가지 구현예를 기술하고 있다. 본 구현예에서, 향상된 미엘린화가 좌골 신경에서 감소된 사이코신 수준들 및 총 (gross) 운동 기능 (예로, 보행) 향상과 함께 관찰되었다. 일정 구현예들에서, 단일 ICV 또는 ICV/IP rmGALC 주사로 치료된 트위처 마우스는 증가된 생존 및 뇌 사이코신의 수준들에서 63%까지의 감소를 나타내었다. 전신적 투여 (ICV/IP)의 추가 이후에 이들 점에서 최소의 개선과 함께 rmGALC의 단일 ICV 투여에 이어지는 중요한 점 (예로, 생존, 뇌 사이코신 수준들)에서의 결과들은 CNS 요법만이 GLD의 치료를 위한 생존가능한 임상적 선택사양인 점을 제시하고 있다.
서문
구형세포 백색질 장애 (GLD)는 대략 1:100,000 출생들 (스칸디나비아 국가들에서 1.9:100,000 출생들)의 빈도로 발생하는 상염색체 열성 리소좀 축접병이다. 진행성 말초 (PNS) 및 중추 (CNS) 신경계 장애인 GLD는 지질들 기질을 분해하는 [예로, 갈락토실세라마이드를 갈락토스 및 세라마이드로; 갈락토실스핑고신 (사이코신)을 갈락토스 및 스핑고신으로] 갈락토세레브로시다제 (GALC)의 효소 활성에서의 결핍을 초래하는 유전적 돌연변이들의 결과이다. 본 장애는 희소돌기아교세포들 및 미엘린의 소실뿐만 아니라 갈라토실세라마이드-충진 대식세포들 ("구형 (globoid)"세포들)의 존재를 특징으로 한다.
본 질환의 임상적 특징들은 두 가지 형태들로 존재한다: 소아 및 만기-발병. 소아 형태의 GLD (크래브 질환 (Krabbe disease)이라고도 알려짐)는 GALC 결핍으로 진단된 환자들의 90%에서 발생되고 증상들은 보통 출생 이후 3 내지 6개월 이내에 관찰되며; 2 내지 3주 정도의 연령에도 증상을 나타내는 보고들이 있다 (Wenger, D.A. et al., 2001, Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A. L., Sly, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음). 본 질환의 만기-발병 변이는 보통 19세 연령까지 임상적으로 발현되지만, 40세 연령에서 진단된 환자들이 보고되어 왔다 (Wenger, D.A. et al., 2001, Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A. L., Sly, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음). 만기-발병 환자들에서는 기능의 강하가 수 년의 기간 동안 점차 진행된다.
전신적 효소 대체 요법 (ERT)이 가우셔병, 파브리병 및 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병들 (LSDs)을 앓는 환자들에게 유익을 제공하여 왔다 (Wenger , D.A. et al., 2001, Galactosylceramide Lipidosis: Globoid Cell Leukodystrophy (Krabbe Disease), in The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, C.R. Scriver, Beaudet, A. L., Sly, W.S., and Valle, D, Editor. 2001, McGraw-Hill. p. 3669-3687; Neufeld, E.F., 2004, Enzyme Replacement therapy. Lysosomal disorders of the Brain, ed. F.M.a.W. Platt, S.V. 2004: Oxford University Press. 327-338; Desnick, R.J., 2004. J. Inherit. Metab. Dis., 27(3): p. 385-410; 이들 모두는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음). GLD의 경우 ERT는 아마도 본 질환이 PNS 및 CNS 둘 다에 영향을 주기 때문에 왕성하게 연구되지 못하여 왔다. GLD를 가지는 환자들을 위한 최신의 치료들은 조혈세포 이식 (HCT)을 포함하지만, 본 절차는 유의한 역효과들 (예로, 30%의 치료-관련 치사, 전생애 면역억제 요법) 및 증상이전 환자들만에서의 효능으로 인해 한계를 가진다.
트위처 마우스는 GLD를 연구하는 데 사용되는 가장 공통적인 실험 동물 모델이고 본 질환에 관한 많은 실험적 연구를 구성하고 있지만 (Wenger, D.A., 2000, Mol. Med. Today, 6(11): p. 449-451; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음), GLD의 다른 자연적으로 발생한 동물 모델들이 다양한 정도들의 특성분석으로 존재한다. 자발적인 돌연변이들이 웨스 하이랜드 화이트/케언 테리어들 (Kobayashi T., et al., 1980, Brain Res., 202:479-83; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음), 양들 (polled Dorset Sheep) (Pritchard D., et al., 1980, Vet. Pathol., 17:399-405), 집 고양이 (Johnson K., 1970, J. Am. Vet. Med. Assoc., 157:2057-64; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음) 및 비-인간 영장류 레서스 머카크 (Rhesus macaque) (Baskin G., et al., 1998, Lab Anim. Sci., 48:476-82; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음)에서 존재한다.
초기 신경 동종이식 (allograft) 연구들은 트위처 마우스 슈반 세포들 (Schwann cells)의 말초 신경 기능을 향상하는 능력은 동종이식 트리처 마우스 세포들 내로 이 제자리에 (in situ) 효소 대체에 의해 매개되고, 손상된 트리처 말단 미엘리화 세포들의 장기 회복이 가능한 점을 보여주었다. 그러나, 본 기법은 트리처 마우스의 전반적인 요법으로서 일반화될 수 없었다 (Baskin G., et al., 1998, Lab Anim. Sci., 48:476-82; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음). 침범된 마우스에서, HCT은 침범된 동물들의 수명 및 체중 증가에서 유의한 향상을 보여주었지만, 다양한 효능이 44일 내지 100일 이상 사이에서 (미엘린감소 조정을 받은 마우스에서) 보고된 생존율로 관찰되고 있다 in mice receiving myeloreductive conditioning) (Lin, D., et al., 2007, Mol. Ther., 15(1): p. 44-52; Hoogerbrugge, P.M., et al., 1998, J. Clin. Invest., 81(6): p. 1790-4; both of which are 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음). 이들 연구들에서 미치료된 마우스의 전형적인 수명은 대략 40일이었다.
이들 및 기타 다른 연구들에서, 재미엘린화 (remyelination) 속도 또는 기존의 뇌 병리학 둘 다가 미치료된 대조군들과 대비하여 치료된 마우스에서 향상되지 않았다 (Yeager A., et al., 1984, Science, 225:1052-4; Toyoshima, E., et al., 1986, J. Neurol. Sci., 74(2-3), p. 307-18; 이들 둘 다는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음). HCT단독 또는 이와 조합하여 L-사이클로세린을 사용하는 스핑고신 합성을 표적하는 기질 저해는 트위처 마우스의 수명을 증가시킨다 (LeVine S., et al., 2000, J. Neurosci. Res., 60:231-6; Biswas S., et al., 2003, Neurosci. Lett., p347:33-6; 이들 둘 다는 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음). L-사이클로세린은 그의 입체이성질제 D-사이클로세린과는 달리 인간 용도로 너무 독성이 크고, 이는 힘든 치료를 가르킨다. 유전자 요법 실험들은 단일요법 (monotherapy) 또는 HCT와의 조합으로 형질전환된 세포들에서 효소를 생성하고 트위처 마우스에서 수명을 향상시키는 능력을 보여주었다 (Lin, D., et al., 2007, Mol. Ther., 15(1): p. 44-52; 본 명세서에서 참고문헌으로 통합되어 있음). 기질 감소, HCT, 및 유전자 요법 모두는 증상을 가진 동물들에서 질환에 전혀 없거나 제한된 영향을 가지면서 증상이전의 동물들에 사용될 때 가장 유의한 효능을 제공하고 있다. 따라서, ERT는 특히 증상이전의 환자들에게 주어질 때GLD의 치료에서 생존가능한 선택사양을 제공할 수 있다.
결과들
HEK 293 유래한 마우스 GALC (rmGALC; 5 mg/kg)를 사용하는 전신적으로 투여된 효소 대체 요법은 다중의 복강내 (IP) 주사들로서 말단에 주어져서, 트리처 마우스의 수명을 향상시켰고 운반체-처리된 동물들과 대비할 때 15%로 사이코신 축적을 감소시켰다 (표 18, 도 31). 표 18은 rmGALC의 IP 투여가 트위처 마우스에서 생존을 향상시키는 것을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00040
rmGALC로 IP 처리된 마우스는 보행 테스트에서 더 나은 성적을 얻었고 좌골신경 조직병리학은 미치료되거나 운반체-처리된 동물들과 대비하여 향상되었다. 말초 (IP) 투여된 rmGALC는 뇌에 최소로 전달되어 뇌 사이코신의 약간 감소를 유도하였다. 그러나, 뇌 조직병리학에는 변화를 주지 않은 것으로 보인다. 따라서, rmGALC (5 mg/kg)의 반복된 매주 전신적 투여 (IP)로 치료된 트위처 마우스에서 관찰된 결과들은 생존 유익, 뇌 사이코신 수준들의 약간 감소, 및 총 운동 기능에서 향상을 가져왔다.
트위처 마우스에서 단일 ICV 및 조합 ICV/IP rmGALC
결과들은 고용량 ICV/IP 치료 그룹이 운반체 처리된 동물들은 단지 36일 생존하는 데 평균 50일 (120 ug/5 mpk)을 생존하였던 점을 가르킨다 (도 32). ICV rmGALC 로 처리된 마우스만이 42일 (40 ug) 및 48 일 (120 ug)의 용량-반응성 평균 생존시간을 나타내었다. 단일 120 ug ICV 주사는 사이코신의 뇌 수준을 감소시켰던 (63%) 한편 40 ug rmGALC의 단일 ICV 주사는 사이코신에서 39% 감소를 유도하였다 (도 33). ICV/IP 투여가 ICV 단독과 대비하여 사이코신 감소에서 추가적인 유익을 제공하지 않았더라도, 조합된 섭생으로 관찰된 사이코신에서 관찰된 48% 감소는 매주 IP 치료 단독 (15%)로 관찰된 것보다 유의하게 더 낮았다. 또한, 주사 부위의 먼 부위들에서 뇌 조직학에서 향상은 40 ug 수준에서 ICV 치료들로도 관찰되었다 (도 34). 이들 결과들은 직접 ICV 주사에 이어서 rmGALC의 뇌에서 활성 및 생체분배을 검증하였다. 그러나, ICV rmGALC 처리된 마우스만이 좌골 신경섬유 형태 또는 미엘린화의 회복을 보여주는데 실패하였고 총 운동 기능 (예로, 보행 분석)에서의 약간의 향상들만이 있었다. rmGALC의 단일 ICV 투여에 이어서 중요한 점에서 유의한 개선 (예로, 생존, 뇌 사이코신 수준들)은 전신적 순환에서 충분한 효소 농도의 결여를 제시하고 있다.
임상적 투여 변수들: 트위처 마우스에서 사이코신 재축적율
다음의 연구들은 적절한 임상적 용량 범위를 정의하는 노력으로 트위처 마우스 모델에서 수행되었다:
- PND19에서 단일 ICV 주사에 이어서 트위처 마우스에서 뇌 사이코신 재흡수율
- 트위처 마우스에서 조합된 복강내 (IP) + 뇌실내 (ICV) rmGALC 을 사용한 용량 확인 연구들.
중추신경계에서 사이코신 재축적의 비율을 평가하기 위하여, 트위처 마우스는 PND19에서 12 ug 또는 40 ug의 rmGALC의 단일 ICV 주사로 처리되었다. 마우스의 그룹들 (n = 3)은 주사 (PND 20) 이후 24시간에 희생되었고 다음으로 3일마다 계속되었다. 뇌 조직이 분리되었고 사이코신 분석, 조직병리학, 및 효소 활성 분석을 위해 제출되었다. 동물들의 소집합 (n = 8)이 생존에 대해 감시되었고, 운동 기능 (보행 분석)이 PND 40에서 분석되었다.
단일 ICV 주사에 이어서 뇌 균질물에서의 사이코신 수준들이 질량 분광분석 법 (LCMS Ltd., North Carolina)에 의해 분석되었고, rmGALC 투여의 24시간 이내에 사이코신에서의 신속한 감소를 제시한다 (도 35). 사이코신 감소의 경향은 효소 투여 이후 24일 기간 동안 유지되었다. 또한, 사이코신 농도에서 감소는 운반체-처리된 동물들과 대비하여 본 기간 동안 용량 의존적인 것으로 보였다: 운반체 처리 (평균: 4.5 ng/ml 사이코신) 대비 12 ug rmGALC (평균: 2.5 mg/ml 사이코신) 대비 40 ug/ml rmGALC (평균: 1.6 ng/ml 사이코신). 흥미롭게도, 본 연구의 말에 (치료 이후 28 내지 32일) 둘 다의 용량 그룹들에서 관찰되는 증가하는 사이코신 수준들은 매월 기준으로 투여되는 경우라면 ERT가 성공적일 수 없는 점을 제시하고 있다. 더 빈번한 투여 스케쥴이 요구될 수 있다. 각 시료채취 시간대에서 적은 수의 동물들로 인해, 결과들에서 다양성이 분명하였다. 그러나, 이들 결과들을 기초로 하여, 사이코신 재축적이 대략 4주 (28일) 스케쥴로 발생하는 것이 분명하다.
생존 시간이 분석되었을 때, 결과들은 12 ug/mL 및 40 ug/mL rmGALC처리 그룹들 둘 다가 운반체 처리된 동물들은 40일 생존하는 데 48 일 (12 ug/mL) 및 50.5 일 (40 ug/mL) 의 생존 중앙값을 가지는 것을 가르켰다 (도 36). 예기치 않게도, 40 ug의 인간 GALC (rhGALC)으로 치료된 마우스는 운반체 처리된 동물들은 40일 생존하는 것과 대비하여 단지 42일까지 생존 유익을 보여주었다. rhGALC를 사용한 본 감소된 효능의 이유(들)은 미지이지만, 이후 섹션에서 논의될 것이다. 그러나. 본 연구의 결과들로부터, rmGALC의 더 낮은 용량들이라도 트위처 마우스 모델에서 생존 유익을 나타내는 데 효과적인 점은 명백하다.
임상적 투여 변수들: 트위처 마우스에서 rmGALC 및 rhGALC용량 범위 연구
이전의 결과들은 ICV/IP rmGALC (120 ug 및 5 mpk)로 처리된 트위처 마우스가 운반체-처리된 동물들보다 14일 더 사는 점을 가르켰다. 그러나, 직접 CNS 주사들만으로 처리된 트위처 마우스는 12일 (120 ug ICV) 및 6 일 (40 ug ICV)의 평균 생존에서 용량-반응성 향상을 보여주었다. 마우스 뇌에서 120 ug의 용량은 환자들에서 300 mg/kg 뇌의 용량으로 전환된다; 따라서 이것은 rmGALC의 더 낮은 용량들의 효능을 조사하는 데 중요하였다. 또한, rhGALC의 초기 로트가 트위처 마우스에서 효능에 대해 조사되었다. 마우스 그룹들은 PND 10 에서 시작하는rmGALC의 매주 IP 주사들 (5 mg/kg)에 추가하여 PND19에서 12 ug (30 mg/kg 뇌 무게) 또는 26 ug (60 mg/kg 뇌 무게)의 rmGALC 또는 rhGALC 둘 중 하나의 단일 ICV 주사로 치료되었다. PND39에서, 마우스의 소집합 (n=3/그룹)이 조직 수확을 위해 (뇌, 좌골 신경, 간, 혈청) 희생되었다. 뇌 조직은 사이코신 분석, 조직병리학, 및 효소 활성 정량을 위해 제출되었다. 남아있는 동물들 생존 (n = 8)이 생존 및 보행 분석을 위해 분석되었다.
논의
본 용량 확인 연구의 결과들은 용량 의존성으로의 경향을 가지고 rmGALC 투여의 생존 유익을 보여준다 (도 37). rmGALC의 조합 용량들12 ug/5 mpk 및 26 ug/5 mpk은 트위처 마우스의 평균 수명을 운반체-치료된 동물들의 경우 40.5일과 대비하여 각각 44.5 및 45.5일 연장하였다. rhGALC의 12 ug/5 mpk (38 일) 및 26 ug/5 mpk (39.5일)의 경우 생존 유익이 없었다. rhGALC의 26 ug/5 mpk는 침범된 트위처 마우스의 수명을 1.5일 연장하였지만, rhGALC 용량 모두는 운반체-처리된 동물들의 생존 일수에 도달하지 못하였다 (도 37). rmGALC으로 전신적-치료된 (IP) 동물들을 사용하여 이전에 관찰된 바와 같이, 보행 분석에서 향상은 rmGALC의 조합 ICV/IP 투여를 받은 동물들 모두의 경우 관찰되었고, 단일 ICV 주사로 치료된 동물들은 운동 기능에서 유익을 덜 보여주었다 (도 38). 수명에서 유익에 대해 관찰된 바와 같이, 보행 분석에서는 rhGALC으로 치료된 마우스에서 유익이 전혀 관찰되지 않았다. 그러나, rhGALC의 특이적 활성은 rmGALC 시험관내 활성의 대략 33%인 것으로 확인되었다 (표 19). 따라서, 이들 최신 결과들은 rmGALC의 더 낮은 농도에서도 생존 및 운동 기능 둘 다에서 유익이 있고 GLD 치료를 위한 ERT의 기회를 강화하고 있다. 사이코신 재축적이 대략 4주 (28일) 스케쥴로 발생하는 것이 분명하다. 표 19는 rmGALC 및 rhGALC 활성을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00041
rmGALC 및 rhGALC의 항원성은 트위처 마우스가 무효 모델인 것으로 추정되도록 한다 [예로, 그들은 교차-반응하는 면역학적 물질 (CRIM)-음성이다]. 전반적으로, rhGALC-처리된 마우스 (ICV/IP 요법)에서 최대 혈청 항체 역가는 비교가능한 ICV/IP rmGALC 요법으로 처리된 마우스보다 유의하게 더 높았다 (도 39). 항체들이 직접 CNS 주사들로 치료한 마우스에 존재하였더라도, 최대 역가는 ICV/IP 치료를 받은 동물들보다 수 배 더 낮았다. 중화 항체들이 생성되었을 가능점이 존재한다.
GALC-결핍 고양이들을 사용한 연구가 rhGALC의 항원성을 특성분석하도록 개시되었다. 본 연구에서, 침범된 동물들 (출생 6주)이 인간 GALC 또는 운반체 단독의 2 mg/kg 매주 IV 및/또는 2.25 mg (30 mg/kg 뇌 무게) IT 투여로 치료되었다. 추가적인 치료들이 8주에 또한 나머지 연구 동안 매주 (출생 이후 ~ 16주까지) 수행되었다. CSF가 안락사 이전에 분리되었고 항체 형성 및 사이코신 수준들을 위해 분석되었다 (도 40).
MPSIIIA 의 헌타웨이 (Huntaway) 개 모델에서 재조합 인간 헤파란 N-설파타제를 사용한 이전의 연구들은 외인성 효소에 대한 현저한 항체 반응을 보여주었고, 본 연구에서 동물들의 내성화에 대한 필요를 가져왔다. 그러나, 순수한 및 rhGALC-처리된 개들로부터 나온 CSF를 조사한 예비적인 결과들은 미처리된 대조군들과 대비하여 사이코신 수준들에서 명백한 감소를 나타내었다 (도 40).
실시예 4. 마우스에서 뇌 및 간 조직학/ IT-주사 GalC의 표지화
본 실시예들은 마우스에서 IT-주사된 hGalC 및 mGalC또한 다양한 조직들에서 해당하는 GalC 항체의 검출 및 정착의 한 가지 구현예를 기술하고 있다.
실험적 설계
Figure 112021011816093-pat00042
조직 채취 및 조직학 염색
*그룹 B 및 C 각각으로부터 조직학적 분석에 사용가능한 단 세 마리의 동물들이 존재하였다. 뇌들 밀 간들로부터 나온 시료들은 10% 중성 완충 포르말린에서 고정되었고 연속하여 파라핀 포매되었다. 5 um의 파라핀 절편들이 주사된 단백질을 검출하는 I2S의 면역조직화학을 위해 제조되었다. 세 가지의 항-GalC 항체들이 GalCA의 IHC 염색에 사용되었다.
1. 마우스 모노클론 항체 (에크만 (Eckman) 박사의 연구실에 의해 생성됨)
2. 토끼 폴리클론 항체 (그룹 1에 의해 생성됨)
3. 토끼 폴리클론 항체 (그룹 2에 의해 생성됨)
매우 민감한 ABC + 티라마이드 (Tyramide) 형광 증폭 방법이 표적된 단백질을 표지하는 데 사용되었다. 염색 결과들은 핵은 DAPI 청색 반대염색, 또한 배경 영역들은 검은색이면서 GalC 양성 세포들을 녹색으로 보여주었다.
결과들
그룹 1 폴리클론 항체는 마우스 뇌들에서 내인성 단백질들과 강한 교차-반응을 가졌다. 운반체 대조군 뇌들에서도, 모든 CNS 세포들이 강하게 양성 염색되었다. 주사된 단백질들은 이러한 강한 배경으로 확인되지 못했다 (도 41). 그룹 2 폴리클론 항체는 마우스 뇌들에서 내인성 단백질들과 더 약한 교차-반응을 가졌지만, 운반체 대조군 뇌들에서 CNS 세포들은 여전히 양성이었다. 주사된 단백질들은 배경을 넘어 검출되지 못했다 (도 42). 마우스 모노클론 항체는 운반체 대조군 뇌들에서 훨씬 더 낮은 신호들을 가지면서 허용가능한특이도를 가졌다 (결과 미도시). IT 주사 이후에, 모든 단백질들은 뇌의 표면 상의 뇌척수막에서 검출되었다. 그룹 1 및 그룹 2의 hGalC 둘 다는 그룹 1 치료된 동물들의 hGalC에서는 상대적으로 더 강한 신호들을 가지면서 뇌척수막 아래의 부위들에 있는 CNS 세포들 (뉴런들 및 교아세포들)에서 검출되었다. mGalC 치료된 뇌들에서는 양성 뉴런들 및 교아세포들이 전혀 검출되지 않았다 (도 43). 소뇌에서는, hGalC가 뇌척수막들 및 과립영역의 표면 위에 염색을 생성하였던 반면 mGalC는 아니었다 (도 44). 마우스 모노클론 항체는 마우스 뇌에서 작용하였지만 간에서 시누소이드 세포들 (sinusoidal cells)과는 강한 교차-반응성을 보여주어 간에서 IT 주사된 단백질들의 세포성 흡수를 평가하는 데 사용될 수 없었다 (도 45). 그룹 2 폴리클론 항체는 부형체 대조군 뇌들에서 훨씬 더 낮은 신호들을 가지고 간 조직들에서 특이성을 보여주었다. 모든 IT 주사된 단백질들은 그룹 1 치료된 동물들의 hGalC에서는 더 적은 양성 세포들 및 더 약한 신호들을 가지면서, 치료 이후에 간에서 시누소이드 세포들 및 간세포들 둘 다에서 검출되었다 (도 46). 치료된 그룹들이라면 모두에서 더 높은 GalC 활성이 확인되지 않았더라도, 양성 염색이 주변 부위들에 있는 뇌척수막 및 CNS 세포들에서 발견되었고, IHC가 세포 수준에서 흡수되었던 주사된 단백질을 검출하는 데 만감한 점을 가르켰다 (도 47). 간에서, mGalC는 더 높은 활성을 보였지만 그룹 2 Ab를 통한 IHC는 mGalC 및 hGalC 간의 매우 적은 차이를 검출하였다 (도 48). hGalC에서 그룹 1 Ab를 사용한 낮은 검출가능한 활성은 관찰된 낮은 IHC 수준들과 부합하였다.
요약
IT 주사 이후에, 모든 주사된 단백질들이 IHC를 통해 대뇌의 척수막에서 검출되었다. 그룹 1 및 그룹 2 둘 다의 주사된 hGalC의 세포성 흡수는 그룹 1 치료된 뇌들의 hGalC에서는 상대적으로 더 강한 신호들을 가지면서 CNS 세포들 (뉴런들 및 교아세포들)에서 검출되었다. mGalC 치료된 뇌들에서는 양성 뉴런들 및 교아세포들이 전혀 검출되지 못했다. 소뇌에서, 뇌척수막에서 양성 신호에 추가하여 그룹 1 및 그룹 2 둘 다의 주사된 hGalC가 과립 영역의 표면 위에 있는 세포들 층에서 확인되었다. 모든 치료된 그룹들의 간들에서, 주사된 단백질들이 시누소이드 세포들 및 간세포들에서 검출되었고 순환계 내로 경막내 I2S의 궁극적인 흡수를 제시하였다. 그룹 2의 mGalC 및 hGalC는 그룹 1의 hGalC과 대비하여 유사한 강한 염색 신호들을 가졌다.
실시예 5. 개에서 뇌 및 간 조직학/ IT-주사 GalC의 표지화
본 실시예들은 개들에서 IT-주사된 GalC 또한 뇌에서 해당하는 GalC 항체의 검출 및 정착의 한 가지 구현예를 기술하고 있다. 본 구현예에서, IT 주사된 단백질은 뇌척수막 및 뇌척수막 아래의 표면 피질 부위에서 검출되었다. ICV 주사된 단백질은 뇌실주위 부위들에서 발견되었다 (도 49). GalC IHC는 뉴런들에서 음성 신호를 가지면서 (원표시) IT 주사 이후 피질에서 확산된 세포외 염색 양상을 보여주었다 (도 50). 양성 Iba 염색을 가지는 활성화된 미세교아 세포들의 제한된 감소가 ICV 주사된 뇌실주위 부위들 및 IT 주사된 피질에서 관찰되었다 (도 51). 형태학적인 변화 (구형세포들)는 운반체 그룹의 경우 LFB/PAS로 피질에서 전혀 발견되지 않았고 그룹들을 통하여 차이는 전혀 관찰되지 않았다. Iba 염색으로 표시된 구형세포들 (화살표)은 뇌실주위 부위들의 4개 제한된 영역들에서 ICV 치료 이후 감소되었다 (도 52).
I2S 단백질의 IT 전달의 실시예들
실시예 6: IT 전달된 I2S의 생체분배
본 연구의 주요 목적은 재조합 인간 I2S가 경막내-요추 경로에 의해 어른 MPS II 마우스의 뇌로 전달되는지 여부를 결정하는 것이었다. 하기 표 20은 8 내지 12주령의 수컷 마우스의 6가지 그룹들이 처리된 것을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00043
주사 계획: 동물들은 경막내-요추 경로를 통한 3번까지의 이듀설파제 (10 uL) 주사들을 맞았다:
* 그룹들A & D: 1, 8 및 15일에 3번의 I2S의 투여 용량
* 그룹 B: 1 및 8일에 2번의 I2S의 투여 용량
* 그룹들 C & E: 미처리 대조군 (IKO) 마우스
* 그룹 F: 미처리 야생형 대조군 마우스
재료들 및 방법들
동물들:
마우스는 상자 당 4마리까지의 그룹들로 사육실 (colony room)에서 12시간 명암 순환 하에 가두었다. 설치류식 (LabDiet-5001, St Louis, MO) 및 물 (Lexington, MA 역삼투에 의해 정제된 수돗물)이 실험기간 동안 자유롭게 사용가능하였다. 동물들의 보호는 연구실 동물들의 보호 및 이용을 위한 가이드 (National Academy Press, Washington D.C., 1996)에 기술된 지침들에 따라 시행되었다. 최신 IKO 사육집단은 조세프 뮤엔저 박사 (Joseph Muenzer, University of North Carolina)로부터 입수한 IKO 돌연변이에 대해 이종유래인 네마리의 보균자 암컷 마우스로부터 확립되었다. 보균자 암컷들은 C57BL/6 배경 품종의 수컷 마우스 (C57BL/6NTac, Taconic, Hudson, NY)와 교배되어 이종유래 암컷들 및 반수유래 (hemizygous) 수컷 녹아웃 마우스, 뿐만 아니라 야생형 수컷 및 암컷 마우스 한배 새끼들을 생산하였다. 모든 자손은 DNA 조직의 PCR 분석에 의해 유전형 분석되었다. 본 실험에 사용된 모든 마우스는 8 및 12주 령 사이의 반수유래 IKO (-/0) 또한 야생형 (WT) 한배새끼들 (+/0) 마우스 둘 중 하나로 확인되었다.
이듀설파제
22 mL I2S [재조합 인간 듀로설파제]가 2L 포스페이트 완충 식염수 (PBS)의 네 번 변화들로 투석되었다. 다음으로 I2S는 비바스핀 (Vivaspin) 컬럼에 의해 농축되었고, 최종 1 mL PBS 부피로 재현탁되었으며, 0.2 um 필터를 사용한 필터 무균화가 이어졌다. 최종 농도는 51 mg/mL이었다.
경막내-요추 주사들:
*어른 마우스는 200-300 uL/10그램 체중 (250-350 mg/kg)으로 1.25% 2,2,2 트리브로모에탄올 (Avertin)을 사용한 복강내 주사에 의해 마취되었다. 등의 털은 꼬리 기저부 및 어깨 사이가 제거되었고 면도된 영역은 포비딘/베타딘 스크럽으로 소독되었고 이소프로필 알코올이 이어졌다. 작은 중앙선 피부 절개 (1-2 cm)가 허리엉치 척수 위로 만들어졌고, 등 중앙선과 회장 (단일 회장) 날개들의 두개골 면의 교차가 확인되었다. 장골와 (iliac fossa, (gluteus medius))에서의 근육은 심장 모양의 근육이고 "심장"의 첨단의 두 면들은 대략 회장의 날개들의 위치에 온다. 기체가 채워진 10-20 uL 유리 해밀턴 주사기에 부착된 32게이지 바늘은 내재하는 뼈로부터 저항이 느껴질 때까지 삽입되었다. 테스트 항목의 10 uL 주사가 2 uL/20초 (10 uL/2분)의 대략적인 속도로 수행되었다. 피부 절개는 적절한 상처 클립을 사용하여 닫혔고 동물들은 적절한 사육상자로 복귀하기 이전에 회복실에서 회복하도록 허용되었다.
조직학 절차들:
동물들은 최종 주사 한 시간 이후에 희생되었다.
뇌 및 간 조직들이 수집되었고 10% 중성의 완충 포르말린으로 고정된 다음 파라핀에 처리되고 포매되었다. 5 um 절편들이 헤마톡실린/에오신 (H&E) 및 면역조직화학 (IHC) 염색을 위해 준비되었다.
헤마톡실린 및 에오신 염색:
뇌 및 간 절편들은 H&E로 염색되었다. 염색 결과들은 핵을 보라색으로 세포질은 분홍색과 적색으로 보여주었다. H&E 염색된 슬라이드들은 조직병리학적 형태 평가를 위해 사용되었다.
면역조직화학:
I2S 생물분포 평가를 위하여, 탈파라핀화되고 재수환된 뇌 및 간 절편들이 재조합 인간 I2S에 대한 마우스 모노클론 항체 2C4-2B2 (Maine Biotechnology Services, Portland, ME) (또는 음성 대조군 항체로서 부적절한 마우스 IgG; Vector Laboratories, Burlingame, CA)와 주사된 I2S를 검출하도록 하룻밤 배양되었다. 2-8℃에서 밤샘 배양에 이어서, 호스래디쉬 퍼옥시다제와 결합된 이차 염소 항-마우스 IgG conjugated with 가 첨가되었다. 추가적으로 37℃에서 30분의 배양 이후에, 티라아미드-알렉사 형광 488 (Tyramide-Alexa Fluor 488) 표지화 용액 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA)이 추가 10분 동안 첨가되었다. 절편들은 1.5 ug/ml 의 4'-6-디아미디노-2-페닐인돌 (DAPI)을 핵 반대염색으로서 포함하는 항소멸 마운팅 배지 (VectaShield; Vector Laboratories)를 사용하여 커버를 덮었고, 다중 채널의 니콘 형광현미경으로 관찰되었다. 염색 결과들은 핵은 청색 또한 배경 영역은 검은색이면서 I2S 양성 세포들은 녹색으로 보여주었다.
효능 분석을 위해, 뇌 및 간 절편들은 일차 항체로서 래트 항-LAMP-1 (리소좀 마커로서 리소좀 연관 막 단백질) IgG (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)로 염색되었다. 부적절한 항체로서 래트 IgG가 음성 대조군으로서 사용되었다. ABC (Vector Labs로부터 시판되는 아비딘 바이오틴 복합 키트들, Burlingame, California) 방법이 표적된 마커를 중폭하는 데 사용되었다.
간략하게, 탈파라핀화된 절편들이 재수화되고 일차 항체와 배양되었다. 2-8℃에서 하룻밤 배양에 이어서, 이차 바이오틴화 토끼 항-래트 IgG (Vector Labs, Burlingame, California)가 첨가되었고 37℃에서 30분 동안 배양된 다음 시료들은 세척되었으며 아비딘-바이오틴-퍼옥시다제 복합체 (Vector Laboratories)로 처리되었다. 색상 현상을 위해, 3,3'-디아미노벤지딘 테트라하이드로클로라이드 (DAB)가 색소원 (chromagen)으로서 사용되었다. 다음으로 절편들은 헤마톡실린으로 반대염색 되었고 커버를 덮었다. 염색 결과들은 LAMP-1 양성 세포들은 갈색으로 핵은 청색으로 보여주었다.
대표적인 사진들을 찍어두었고 LAMP-1 양성 세포들의 영역은 이미지-프로 플러스 소프트웨어 (Image-Pro Plus software (Media Cybernetics, Inc., Bethesda, MD)로 분석되었으며 또한 비교 통계학들이 스튜던트 t-테스트를 사용하여 수행되었다.
전자현미경 방법:
3번 용량의 I2S 처리된 동물들로부터 뇌 조직들이 4℃에서 0.1M 소듐 카코딜레이트 완충액 pH 7.4 에 넣은 2.5% PFA/2.5% 글루타르알데하이드로 고정되었다. 다음으로 시료들은 카코딜레이트 완충액 (0.1M, pH7.4)으로 세척되었고 오스뮴 테트옥사이드로 후-고정되어 알코올 및 프로필렌 옥사이드로 재수화되고 에폰 (Epon) 레진에 침지되었다. 초박 절편들이 100 nm로 절단되었고 납 시트레이트로 염색되었으며 TecnaiTM G2 Spirit BioTWIN 투과 전자현미경으로 조사되었다.
결과들
뇌에서 면역조직화학 (IHC)에 의해 조사된 바와 같이, I2S는 운반체 대조군 동물들에서 전혀 발견되지 않았다. 대조적으로, 뇌척수막 세포들 대뇌 및 소뇌의 뉴런들은 I2S 주사된 동물들에서 I2S에 대해 양성 염색되었다. 염색 신호는 3번 투여된 동물들에서 더 강하였다 (도 53).
운반체-처리된 IKO 마우스의 뇌 조직들에서, 리소좀 축적병의 조직병리학적 표식인 세포성 공포화가 야샹형 동물들과 대비하여 뇌들 전체를 통하여 발견되었다. I2S 처리된IKO 마우스에서는, 미처리된 것들과 대비하여, 표면 대뇌 피질, 미상엽핵, 시상, 소뇌로부터 백색질까지 세포성 공포화의 광범위한 감소가 존재하였다 (도 54). 야생형 동물들과 대비할 때 운반체-처리된 IKO 마우스의 미세교아, 뇌촉수 및 혈관주위 세포들에서 리소좀 활성 및 질환 상태의 표시인자로서 비정상적으로 높은 리소좀 활성이 리소좀-연관 막 단백질-1 (LAMP-1) 염색에 의해 확인되었다 (도 55). I2S 경막내 처리된 마우스는 LAMP-1 면역염색에서 현저한 감소를 가졌다. 본 감소는 LAMP-1 양성 세포들의 수 및 밝은 염색에서 감소를 특징으로 하였다. 감소는 I2S 처리된 동물들의 2 및 3번 용량들 둘 다에서 표면 대뇌 피질, 미상엽핵, 시상, 소뇌로부터 백색질까지 뇌 전체를 통하여 발견되었다 (도 56). 다양한 뇌 부위들의 LAMP-1 면역염색의 형태측정 분석 (morphometrical analysis)은 평가된 뇌의 모든 영역들에서 LAMP-1 양성 염색에서의 유의한 감소들이 존재하는 점을 검증하였다 (도 56).
운반체-처리된 IKO 마우스에서 뇌 세포들의 전자현미경 조사는 무정형의 과립 축적물질 및 라멜라화된 얼룩무늬체-유사 구조들을 가지는 봉입물들을 포함하는 확대된 소포들을 밝혀주었다. 초구조적 수준에서 리소좀 축적의 이들 전형적인 병리학적 특징들은 I2S 경막내-요추 주사된 마우스에서 감소되었다 (도 57).
간에서, 운반체 처리된 동물들에서 I2S의 양성 염색은 존재하지 않았다. I2S 경막내 주사된 마우스에서, 주사된 I2S의 많은 양이 시누소이드 세포들에서 분명하게 발견되었고 (도 58), 이는 경막내 공간 내에 주사된 I2S가 CSF 와 함께 순환하고 다음으로 거미막 과립화를 통하여 순환계 내로 흡수되는 점을 가르켰다.
운반체-처리된 IKO 마우스의 간 조직들에서, H&E 염색 및 강한 LAMP-1 면역염색에 의해 나타나는 심한 세포성 공포화 및 비정상적으로 높은 리소좀 활성이 WT 마우스와 대비하여 드러났다. 간들에서 세포성 공포화 및 LAMP-1 면역염색의 현저한 감소는 I2S로의 경막내 치료 이후에 확인되었다. H&E 염색은 거의 정상적 간 세포 구조를 가지고 거의 완벽하게 사라졌던 세포질내 공포화를 드러냈다 (도 59).
IKO 마우스에서, 재조합 인간 I2S가 경막내-요추 경로에 의해 뇌로 전달되었고 주사된 I2S는 뇌에 있는 다양한 부위들에서 광범위한 조직병리학적 향상을 유도하고 있다.
* 주사된 I2S는 뇌에 있는 뇌척수막 세포들 및 뉴런들에서 검출되었다.
* 뇌 전체를 통하여 광학 및 전자현미경 수준들에서 감소된 세포성 공포화.
* 뇌 전체를 통하여 감소된 LAMP-1 리소좀 마커
* 경막내 주사된 I2S는 말초 순환으로 들어갔고 간의 형태 및 조직학적 마커를 향상시켰다.
*실시예 7. I2S의 IT 전달의 독성학
본 실시예는 사이노몰 원숭이들에서 매월 볼루스 경막내 요추 투여를 통한 이듀설파제와 연관된 임상적 징후들을 설명하고 있다. 이것을 달성하기 위하여, 14마리의 수컷 사이노몰 원숭이들이 다음의 표 21에서 나타난 바와 같이 5가지 치료 그룹들로 무작위 배정되었다. 하기 표 21은 실험적 설계를 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00044
모든 그룹들에서 동물들은 요추 수준에서 매주 간격들 IT로 세 번 투여되었다. 1 ml 투여량이 0.3 ml의 PBS와 함께 카테터 시스템으로부터 흘려졌다. 각 투여 1 내지 2일 이전에, 대략 2 ml의 CSF가 대수공 수준에서 IT 척수 탭으로부터 채취되었다. 혈액 시료들 (2 ml)도 본 시간에 역시 채취되었다. 첫 번째 투여 이후에 혈액 (2 ml) 및 CSF (0.1 ml) 가 투여전, 투여 이후 0.5, 1, 2, 4, 8, 24, 및 48시간의 그룹 5 동물들로부터 채취되었다. 임상적 징후들이 매일 적어도 두 번 기록되었다. 세 번째 투여 이후 24시간에서 부검이 수행되었고 선택된 조직들이 수확되어 사용되었다.
1일째, 모두 3마리의 그룹 4 (150 mg) 동물들은 투여 이후 3-12분 이내에 후반부로 향한 경향을 최소로 나타내고 5-15분 지속되었다; 본 징후는 테스트 항목과 관련되는 것으로 판단되었다. 테스트 항목과 관련되는 것으로 고려되는 체중, 먹이 소비 및 신경학적/신체 검사 변수들에서는 변화들이 전혀 없었다
혈청 및 CSF 시료들의 분석 및 투여 용액 분석들이 설명되었다. 내인성 이듀설파제 활성에서 다양성들이 사이노몰 원숭이로부터 나온 서로 다른 조직들에서 관찰되었고; 뇌 및 척수는 간, 심장 및 신장을 포함하는 조사된 기타 말초 기관들보다 더 큰 내인성 활성을 가졌다. 이듀설파제 투여는 다양한 뇌 부위들 뿐만 아니라 뇌줄기 및 척수에서 이듀설파제 활성의 용량-의존적 증가들과 연관되었다. IT 전달은 좌우 대뇌 반구들 사이에 분포에서 관찰가능한 차이를 가져오지 않았다. 다음의 기관들에서 이듀설파제 활성에서 분명한 용량-의존적 증가가 존재하였다: 뇌, 간, 심장, 및 신장. 뇌에서 이듀설파제의 면역염색은 염색 강도에서 용량-의존적 증가를 보여주었다. 3 mg 그룹에서는, 뇌척수막 아래에 뇌척수막 세포들 및 제한된 교아세포들이 관찰되었고; 뉴런 염색은 3 mg 처리 그룹으로부터 나온 동물들에서 분명하지 않았다. 이듀설파제 염색은 이듀설파제의 IT 투여가 일어나는 요추 부위에서 최고의 염색 강도를 가지면서 척수에서 양성 및 용량 의존적이었다. 간, 신장 및 심장에서 이듀설파제 염색 강도는 용량-의존적이고 이들 기관들에서 증가된 이듀설파제 활성와 부합되었다.
결론적으로, 150 mg까지 매주 간격들로 전달된 이듀설파제의 IT 투여는 역효과들을 전혀 가지지 않았다. 따라서, 관찰된 역효과 수준 (NOAEL)이 본 연구에서 테스트된 최고의 용량인 150 mg인 것으로 해석되지 않았다. 이듀설파제 투여는 CNS에서 이듀설파제 활성의 용량-의존적 증가들과 연관되어 있었고 간, 신장 및 심장에서 전신적 수준들을 유도하였다.
테스트 항목인 이듀설파제는 154 mM NaCl, 0.005% 폴리솔베이트 20, pH 5.3 - 6.1에 녹은 투여액들로서 공급되었다. 공급된 투여액들의 명목상 농도들은 0, 3, 30 는 150 mg/ml이었다. 테스트 항목은 -82 내지 -79℃로 냉동고에서 보관되었다. 포스페이트 완충 식염수 (PBS), pH 7.2가 용량들이 투여된 이후 또한 일련의 CSF 채취 이후에 세척제 (flushing agent)로서 사용되었다. PBS는 집코사 (Gibco, Invitrogen Corporation)로부터 입수되었다,
테스트 항목 투여 조제물
각 시간 간격의 첫째 투여일에, 각 농도의 한 개 바이알이 -80℃ 냉동고로부터 분리되었고 상온까지 탁자 (countertop) 위에서 해동되도록 하였다. 일단 해동되면, 그룹들 1, 2, 및 3의 바이알들은 라벨되고 무게를 달고 1 ml은 투여 계획된 각 동물을 위해 0.22 um 필터를 통해 주어졌다. 모든 용량들이 투여된 이후에, 바이알들은 다시 무게를 달아 냉장고에 놓아두었다.
다음날 (동물 003, 그룹 4, 및 그룹 5에게 투여일) 그룹들 1 및 4를 위한 투여액들은 냉장고로부터 분리되어 상온에 도달하도록 탁자 위에 놓아두었다. 일단 상온으로 되면, 그룹들 1 및 4를 위한 바이알들은 무게를 달고, 그룹 4 바이알은 라벨되었으며 1 ml은 그룹들 1 및 4에서 투여 계획된 각 동물을 위해 0.22 um 필터를 통해 주어졌다. 다음으로 그룹 5를 위한 투여액이 적절한 양의 그룹 4 투여액 및 그룹 1 (운반체)을 무균의 폴리프로필렌 바이알 내에 주사하여 준비되었다. 그룹 1 및 4로부터 첨가된 양이 기록되었다. 용액은 바이알을 가만히 역전시키면서 혼합되었고 2-1 ml 용량들이 그룹 5의 동물들을 위해 필터를 통해 주어졌다. 그룹 1 및 4를 위한 바이알들은 투여 종결 시 다시 무게를 달았고 모든 바이알들 (그룹 1-5)는 냉동고에 놓아두었다.
표 21에 기술된 바와 같이, 14마리 동물들이 치료 그룹들로 무작위 배정되었다.
IT 투여 경로는 이것이 인간 투여를 위해 의도된 경로이기 때문에선택되었다. 본 연구에 선택된 이듀설파제의 용량들 (3, 30, 100, 및 150 mg/ml)이 세 번의 연속적 매주 볼루스 IT 요추 주사들 이후에 비-인간 영장류 중추신경계 (CNS) 내에 효소의 다양한 용량 수준들의 생체분배을 평가하도록 선택되었다.
임상적 관찰들
임상적 징후들의 전반적인 빈도는 최소이었다. 그룹 1(대조군), 그룹2 (3 mg), 그룹 3 (30 mg), 또는 그룹 5 (100 mg)에서 동물들은 연구 기간 동안 어떤 시간대에서도 테스트 항목과 관련되는 것으로 고려되는 임상적 징후들을 전혀 가지지 않았다.
1일째, 모두 세 마리의 그룹 4 (150 mg) 동물들은 투여 이후 3-12분 이내에 후반부로 경향을 최소로 나타내고 5-15분 지속되었다; 본 징후는 테스트 항목과 관련되는 것으로 판단되었고 더 저용량 그룹들이라면 모두에서 관찰되지 않았다. 첫 번째 용량 이후에 또는 테스트 항목 투여에 이어서 바로 해당일에는 기타 다른 임상적 징후들이 없었다. 그룹 4 동물들의 경우 관찰되는 기타 증후는 단지 35일째 동물 013의 경우에 단일 구토이었다.
단일 매월 경막내 볼루스로서 테스트 항목의 투여는 이식된 약물 전달 장치를 사용한 본질적인 변화들을 고려할 때 해로운 총 (gross) 또는 현미경적 변화라면 모두와 연관되지는 않았다. 대조군을 포함한 모든 그룹들이 약물 전달 시스템에 염증성 반응들을 가리키는 뇌척수막에서 현미경적 변화들을 가졌다. 30 mg이상의 테스트 항목의 투여를 받은 동물들은 뇌척수막에서 염증성 반응이 더 현저한 호산구 성분을 가지는 경향이 있었지만 본 차이가 생물학적으로 유의한 것으로 고려되지는 않았다.
대조군 및 테스트 항목 처리된 동물들 사이에 차이들이 매우 약하기 때문에, 관찰된 역효과 수준 (NOAEL) 이 본 연구에서 테스트된 최고 용량이 150 mg인 것으로 해석되지는 않았다.
모든 그룹들 (대조군 포함)에서 뇌척수막의 전반적인 염증 반응이 원숭이들에서 본 기간의 경막내 연구에서 일반적으로 알려진 것보다 약간 더 현저하였다. 그러나, 이것은 운반체의 일정 특징 또는 부검 24시간 이전에 투여 행위와 관련될 수 있는 것으로 고려되었다.
뇌 이듀설파제 염색은 150 mg 그룹 (도 60, 61, 62 및 63)에서 확인되는 최고의 염색 강도를 가지면서 3 mg 그룹에서 한 마리 동물을 제외하고 모든 치료된 동물들에서 양성이었다. 3 mg 그룹에서는, 단지 뇌척수막 아래에서 뇌척수막 세포들 및 소수의 교아세포들이 양성이었고; 주사된 이듀설파제는 뉴런들에서 전혀 검출되지 않았다. 더 높은 용량 그룹들 (30, 100 및 150 mg)에서, 큰 집단의 뇌 뉴런들이 뇌척수막 세포들, 교아세포들 및 혈관주위 세포들과 함께 이듀설파제 염색에 강한 양성이었다. 이듀설파제 면역염색은 뇌척수막 근처 표면에 I층 안에 뉴런들로부터, 백색질 에 인접한 더 깊은 VI층 안에 뉴런들까지 뇌 뉴런들에서 주사된 이듀설파제의 넓은 분포를 드러냈다 (도 64, 65 및 66). 또한 현저한 뉴런들의 염색도 150 mg 용량 그룹의 경우 관찰되었다 (도 67). 모든 동물들에서 (30 -150 mg로부터 나온 용량 그룹), 뉴런성 이듀설파제 염색에서의 현저한 차이가 뇌의 전반부, 중간부, 및 후반부 절편들 사이에서 전혀 발견되지 않았다.
이듀설파제 염색은 요추 부위에서 최고의 염색 강도를 가지면서 모든 동물들의 척수들에서 양성이었다 (도 68 및 69). 이듀설파제 면역염색은 역시 용량 의존적이다. 뉴런들, 뇌척수막 세포들, 교아세포들, 혈관주위 세포들 및 신경 섬유들을 감싸는 신경외/주위 내막 (epi/peri/endoneurium) (연결 세포들)은 150 mg 그룹에서 이듀설파제에 강한 양성이었다 (도 70 및 71).
간에서, 이듀설파제의 양성 염색이 모든 동물들의 시누소이드 세포들 (컵퍼 (Kupffer) 세포들 및 내막세포들)에서 발견되었다. 그러나, 이듀설파제가 3 mg 치료 그룹의 경우 간세포들 (hepatocytes)에서 검출되지 않았던 한편 (도 72), 더 높은 용량 그룹들에서는 150 mg 치료 그룹에서 최고의 염색 강도를 가지면서 양성 이듀설파제 염색이 간세포들에서 발견되었다 (도 73, 74 및 75).
3 mg 치료 그룹으로부터 나온 동물들에서는 이듀설파제의 양성 염색이 없었다 (도 76). 대조적으로, 간질 세포들 (interstitial cells)은 30, 100 및 150 mg 그룹들에서 이듀설파제에 양성적으로 염색되었고, 현저한 염색은 150 mg 그룹에서 관찰되었다 - 양성 세포수 및 염색 강도 (도 77, 78 및 79).
신장
3 mg 용량 그룹으로부터 나온 동물들은 주사된 이듀설파제가 거의 또는 전혀 검출되지 않았다 (도 80). 그러나, 양성 이듀설파제 염색이 30 및 100 mg 그룹들에 있는 사구체 세포들 및 간질 세포들에서는 발견되지 않았다 (도 81 및 82). 150 mg 그룹에서, 추가적으로 이듀설파제 면역염색이 사구체 및 간질 세포들의 현저한 염색과 함께 인접뇨관 세포들의 이듀설파제 염색이 드러났다 (도 83).
논의
체중, 먹이 소비, 신체 검사 결과들 및 신경학적 검사 결과들에 미치는 테스트 항목-관련 임상적 징후들 또는 효과들은 전혀 없었다. 1일째, 그룹 4 (150 mg) 동물들은 투여 이후 3-12분 이내에 후반부로 경향을 최소로 나타내고 5-15분 지속되었다; 본 징후는 테스트 항목과 관련되는 것으로 판단되었다.
이듀설파제 투여는 다양한 뇌 부위들, 뿐만 아니라 뇌줄기 및 척수에서 이듀설파제 활성의 용량-의존적 증가들과 연관되었다. 척수에서 염색 강도의 최고 수준은 이듀설파제의 IT 투여가 일어나는 요추 부위에서 있었다. 이듀설파제의 IT 투여는 간, 신장 및 심장에서 용량-의존적 염색 강도를 가지고 전신적 노출도 가져왔다. 30 mg이상으로 테스트 항목 용량을 받은 동물들은 뇌척수막에서 염증성 반응이 더 현저한 호산구 성분을 가지는 경향이 있었다.
매월 간격으로 150 mg까지로 이듀설파제의 IT 투여는 전혀 역효과들을 가지지 않았다. 관찰된 역효과 수준 (NOAEL) 이 본 실시예에서 테스트된 최고 용량이 150 mg인 것으로 해석되지는 않았다. 이듀설파제 투여는 CNS에서 이듀설파제 활성의 용량-의존적 증가들과 연관되었고 간, 신장 및 심장에서 전신적 수준들을 가져왔다.
실시예 8. IT 전달된 I2S의 PK (혈청 및 CSF)
본 실시예는 테스트 항목 (TA) 농도에 대해 사이노몰 원숭이들에서 매월 볼루스 경막내 요추 주사들 및 매주 정맥내 주사들을 통해 투여된 이듀설파제의 6개월 독성 연구와 연관된 혈청 및 뇌척수액 (CSF) 분석을 제공한다.
실험 설계
본 발명의 목적은 6개월 기간 동안 독성학 및 안전성 약제학 전망으로부터 이듀설파제 (12s)의 반복 용량 경막내 (IT) 투여를 평가하는 것이었다. 본 연구 설계는 표 22에 나타나 있다. 하기 표 22는 연구 설계를 나타낸다. DC = 장치 대조군; 그룹 1의 동물들은 운반체 또는 테스트 항목으로 투여되지 않는다.
Figure 112021011816093-pat00045
테스트 항목
확인: 이듀설파제 IV 투여 - 로트 번호. FDC06-001 (2.0 mg/mL)
IT 투여 - 이듀설파제 (0 mg/mL)
이듀설파제 (3 mg/mL)
이듀설파제 (30 mg/ml)
이듀설파제 (100mg/ml)
검정 방법들:
분석들은 이듀설파제 농도를 결정하기 위한 ELlSA (효소 결합 면역흡착 검정법)를 사용하여 시행되었다. 희석 팩터에 의해 배가하기 이전에 검출의 한계 (LOD) = 1.25 ng/mL. 시료들은 1:50 희석에서 검색되었고, 따라서 검정 민감도는 62.5 ng/mL이다. 산정 곡선의 고점을 초과하는 시료들은 좀 더 희석되었고 곡선의 범위 이내의 수치가 되도록 적절한 희석으로 다시 테스트되었다. 선택된 시료들은 효소 활성 검정법을 사용하여 추가적으로 분석되었다. 본 검정의 LOD는 1:150의 최소 시료 희석에서 0.18 mU/mL이다.
식염수 또는 운반체로 각각 투여된 그룹 1 및 2에서의 동물들은 모두 IV 및 IT 투여 기간을 통하여 138 ng/mL 및 <62.5 ng/mL (또는 <LOD) 사이 범위인 혈청 이듀설파제 수준들을 가졌다. 그룹 1 및 2 동물들로부터 테스트된 200개 CSF 시료들 중에서, 62개가 LOD 검정을 초과하는 I2S 수준들을 나타냈다. 이들 중에서, 7개 수치들이 높았다 (>1,000 ng/mL). 상기 테스트된 IT 투여 이전 3번으로부터 수집된 또 다른 CSF 시료는 1,000 ng/mL 초과의 I2S로 테스트되었다. 다음으로 시료들은 이듀설파제 활성에 대해 테스트되었다. 각 경우에, 활성 결과들은 I2S의 존재를 가르켰고, I2S의 대략적 농도가 활성 수준들을 기초로 하여 계산될 때 결과들은 항체 ELISA에 의해 획득되는 것들의 20% 이내이었다 (표 23 참조). 항원 ELISA 결과들 <LOD를 가지는 추가적으로 무작위 선택된 CSF도 역시 비특이적 활성이라면 모두 배제하도록 효소 활성 검정을 사용하여 테스트되었다. 하기 표 23은 CSF 시료들로부터 나온 연구 결과들을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00046
본 연구에서, 혈청 및 CSF 시료들은 이듀설파제 농도에 대해 분석되었다. 혈청 시료들은 다음의 스케쥴에 따라 수집되었다:
IV 용량들: 투여이전 및 투여이후 2시간 1 내지 10, 투여이전 및 투여이후 4시간 11 내지 23, 또한 부검시.
IT 용량들: 투여이전 및 투여이후 2시간 1 내지 2, 투여이전 및 투여이후 4시간 3 내지 6, 또한 부검시.
CSF 시료들은 다음의 스케쥴에 따라 수집되었다:
*
*IV 용량들: 투여이전 및 투여이후 2시간 1, 또한 투여이후 4시간 3 내지 6.
IT 용량들: 투여이전 및 투여이후 2시간 1 및 2, 투여이전 및 투여이후 4시간 3 내지 6, 또한 부검시.
일반적으로, 혈청 이듀설파제는 CSF 이듀설파제. 혈청 이듀설파제보다 더 빠른 것 같았다. 각각 식염수 또는 운반체로 투여된 그룹 1 및 2 동물들에서 혈청 이듀설파제 수준들은 테스된 모든 시간대에서 138 ng/mL 이하이거나 이와 동등하였다. 일정 동물들은 검출의 검정 한계 (LOD) 미만의 수준들을 가졌다.
그룹 1 및 2로부터 나온 극히 적은 CSF 시료들이 높은 (>1,000 ng/mL) 수준들을 유도하는 주목가능한 7개는 예외로 하고 검정 LOD를 초과하였다. IT 투여 이전 3 동물로부터 수집한 하나의 CSF 시료도 역시 1,000 ng/mL 이듀설파제 초과로 테스트되었다.
이들 경향성을 벗어난 결과들을 주는 시료들은 다시 테스트되어 검증되었다. 또한, 이들 시료들은 이듀설파제 효소 활성에 대해 테스트되었다. 이들 활성 결과들도 역시 이듀설파제 질량 검정법에 의해 획득된 것들의 20% 이내의 높은 이듀설파제 수준들을 입증하였다 (표 23).
활성 검정의 특이도가 본 시료 집단 안에서 LOD 미만의 이듀설파제 질량 유닛으로 CSF 시료들을 무작위 테스트하여 확인되었고 이들 시료들에서 이듀설파제 수준들이 LOD인 것을 검증하였다 (결과 미도시).
실시예 9. IT 전달된 I2S의 생체분배
경막내 투여가 CNS 조직들에 I2S를 전달하는 효능있는 방식이라는 점을 성공적으로 보여주면서, 추가적인 연구들이 IT-투여된 I2S가 뇌의 깊은 조직들 내로 배분될 수 있는지 여부 및 IT-투여된 I2S의 세포내 정착이 존재하는지 여부를 결정하도록 시행되었다. 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S) 제형물이 제조되고 mM NaCl, 0.005% 폴리솔베이트20 의 운반체로 pH 6.0에서 제형화되었다.
비-인간 영장류들에게 매월을 기초로 3mg, 30mg, 또는 100mg의 I2S가 이식된 경막내 포트를 통해 연속 6개월 동안 투여되었다. 연구의 설계는 하기 표 24에 정리되어 있다. a달리 특정되지 않는 경우 이듀설파제. DC (장치 대조군); IT (경막내); IV (정맥내); NS (정상 식염수); PBS (포스페이트-완충 식염수, pH 7.2).
Figure 112021011816093-pat00047
비-인간 영장류에게 6개월 동안 I2S의 매월 반복 투여는 테스트된 최고 용량에서 잘 내성화되었고 유의한 독성의 역작용들이 연관되지 않았다. I2S의 6번 및 최종 용량의 투여에 이어서 24시간에, 비-인간 영장류들 개체가 희생되었고 이러한 비-인간 영장류의 CNS 조직들이 조사되었다.
면역조직화학 (IHC)에 의해 결정된 바와 같이, CNS의 세포들 및 조직들 전체를 통하여 I2S의 광범위한 세포 침전이 존재하였다. I2S 단백질은 IHC에 의해 대뇌 피질로부터 뇌실 백색질까지 침전 구배를가지면서, 뇌의 모든 조직들에서 검출되었다. 회색질에서는, I2S 가 모든 그룹들의 대뇌, 소뇌, 뇌줄기, 및 척수의 뉴런들에서 용량-의존적 방식으로 검출되었다. 더 높은 용량 그룹들의 표면 회색질에서는, 많은 뇌 뉴런들이 표면 피질에서 I2S 염색에 양성이었다 (도 84A). I2S는 역시 시상 (도 84B), 해마 (도 84C), 미상엽핵 (도 84D) 및 척수 (도 84E) 에 있는 뉴런들에서도 검출되었다. 뇌척수막 및 혈관주위 세포들도 또한 I2S 염색에 양성이었다 (도 84F).
도 85 및 도 86에서 나타난 바와 같이, IT-투여된 I2S의 CNS 의 조직들 내로 배분, 상세하게는 비-인간 영장류들 개체의 회색질, 시상 및 뇌 피질에서 침전은 분명하다. 또한, 도 86 및 도 87는 IT-투여된 I2S가 비-인간 영장류들 개체의 나타난 CNS 조직들에서 용량 의존적 방식으로 축적되는 점을 도시하고 있다. 공동-정착 염색 (co-localization staining)도 역시 I2S의 IT 투여가 뉴런들 및 희소돌기아교세포들과 연관되는 점을 드러냈다. IT-투여된 I2S도 역시 도 88에서 입증된 바와 같이 비-인간 영장류들 개체 전체를 통하여 분포하고 정착하는 점을 드러냈다. 상세하게, 도 89A-D는 필라멘트 염색에 의해 보여지는 바와 같이 비-인간 영장류들에게 IT-투여에 이어서 뉴런 흡수 및 I2S의 축삭 결합을 도시하고 있다. 또한 특히 흥미롭게도, 본 연구들은 I2S가 뉴런성 세포들에 선택적이고 이러한 뉴런성 세포들은 뇌의 깊은 조직들 내로 경막내-투여된 I2S의 배분을 용이하게 하고, I2S의 축삭 전달을 가리키며 축삭 구조들과 연관되는 것으로 보이는 점을 도시하고 있다.
하기 표 25는 개별적 동물 연구를 위한 다양한 투여 경로들 및 용량들의 약물역학적 데이타를 표현하고 있다.
Figure 112021011816093-pat00048
124I-표지된 I2S는 하기 표 26에 나타난 바와 같이 테스트 동물들에게 투여되었고 PET 스캔 결과들이 도 106에 나타나 있다.
Figure 112021011816093-pat00049
또한 본 연구들은 IT 투여에 이어서 비-인간 영장류들 개체의 뇌실 근처 백색질 뇌 조직에서 IT-투여된 I2S의 세포존재 확인 (identification)을 보여주었다. 백색질에서 I2S 염색 강도가 일반적으로 회색질보다 더 낮은 한편, I2S는 희소돌기아교세포들 내에서 검출되었다 (도 90). 상세하게, 도 90은 백색질 뇌 조직들에서 I2S의 세포존재 확인을 도시하고 있고, 좀 더 나아가 I2S가 미엘린과 연관되는 것으로 보이지 않는 점을 나타내었다.
뇌의 조직들 내로 깊은 IT-투여된 I2S의 배분을 보여주는 것에 추가하여, 본 연구들은 표적 소기관들 내로 I2S의 정착, 중요하게는 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병들에서 침범된 소기관들인 리소좀들 내로의 I2S의 정착을 입증하였다. 상세하게, I2S는 리소좀들 내에 위치하였고 또한 축삭들 내에서도 검출되었다. 도 90은 비-인간 영장류 인간의 희소돌기아교세포의 리소좀들 내로 IT-투여된 I2S의 정착을 도시하고 있고, 이에 의해 IT-투여된 I2S가 뇌의 깊은 조직들 내로 배분될 수 있고 세포성 정착을 할 수 있는 점을 입증하였다.
전달된 I2S가 생물학적 활성을 보유하는지 여부를 분간하기 위하여, 뇌에서 I2S의 수준들이 특이적 활성 검정을 사용하여 측정되었다. 마지막 투여 24시간 이후의 3 mg IT 그룹의 뇌에서 활성은 장치 대조군 및 운반체 대조군 동물들에서의 기저 수준들과 명백하게 서로 다르지는 않았다. 30 mg 및 100 mg IT투여된 동물들의 뇌에서의 효소 활성은 부검 시 기저선 초과이었다 (투여 이후 24시간).
뇌로의 I2S 전달의 정착위치를 분간하는 좀 더 나아간 동물 테스트들은 하기 도 104 및 표 27에 나타나 있다. 하기 표 27은 시료들의 위치를 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00050
실시예 10. 비글종 개들에서 IT 전달의 생체분배
상기 실시예에서 관찰된 I2S 배분 양상들이 단일 IC 또는 ICV 투여가 주어진 건강한 비글종 개들에서 역시 재현되었다. 수컷 비글종 개들은 컴퓨터-생성된 숫자들을 사용하여 두 가지 그룹들로 무작위화되었다 (그룹 1 (ICV), N=3; 그룹 2 (IT); N=4). 모두는 요추에 있는 거미막 하부 공간 또는 죄측 뇌실 (투여용) 및 대수공에 이식된 카테터들을 가졌다. 모든 카테터들은 피하의 티타늄 접근 포트에 종결되었다. 추가적인 개들이 미투여된 수술 대조군으로서 사용되었다.
I2S (20 mM 소듐 페스페이트, pH 6.0; 137 mM 염화나트륨; 0.02% 폴리솔베이트-20에서 30 mg/ml)의 단일 일시 주사가 IT 또는 ICV 투여되었고, 포스페이트 완충 식염수 (PBS; pH 7.2)의 3 ml 세척이 이어졌다. 임상적인 징후들이 감시되었고 투여에 이어서 24시간에 희생되었다. 뇌 및 척수 조직 시료들이 ELISA, I2S 효소 활성 및 IHC에 의해 결정된 바와 같이 정량적 I2S 분석들을 위해 수집되었고 연구 그룹 간 비교되었다.
I2S는 IHC에 의해 결정된 바와 같이 IT 및 ICV 그룹들 둘 다의 회색질 전체를 통하여 널리 분포되었다. 대뇌 피질에서, 도 91에 의해 도시된 바와 같이 뉴런들은 IT 및 ICV 그룹들 둘 다에서 표면 분자층으로부터 깊은 내부 층까지 모두 6개의 뉴런 층들에서 I2S에 양성이었다 (그림 a 및 c). IT 및 ICV 그룹들의 대뇌 피질에서, I2S가 도 91에 의해 도시된 바와 같이 퍼킨지 세포들을 포함하는 뉴런들에서 검출되었다 (그림 c 및 d). IT 및 ICV 그룹들 둘 다에서 해마에 있는 큰 집단의 뉴런들은 도 91에 의해 도시된 바와 같이, I2S에 양성이었다 (그림 e 및 f). 도 91에 의해 도시된 바와 같이, 둘 다의 그룹들에서 I2S 양성 뉴런들은 역시 시상 및 미상엽 핵에서도 발견되었다 (그림 g 및 h).
따라서, 본 연구들은 뇌의 깊은 세포들 및 조직들 내로 배분되는 IT-투여된 효소들의 능력을 입증하고 있고 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병들과 연관된 CNS 소견들의 치료를 위한 I2S와 같은 IT-투여된 효소들의 유용성을 지지한다.
실시예 11. IT 투여된 I2S의 생체내 효능
이듀로네이트-2-설파타제 결핍 마우스 모델
IT-투여된 I2S 는 뇌의 깊은 조직들 내로 배분될 수 있고 I2S의 세포성 정착을 설명하였고, 심화 연구들이 IT-투여된 I2S 의 치료적 효능을 결정하도록 시행되었다. 헌터 증후군의 유전적으로-조작된 이듀로네이트-2-설파타제 녹-아웃 (IKO) 마우스 모델이 질환 진행을 변경하는 IT-투여된 I2S 의 능력을 연구하도록 개발되었다. I2S 녹-아웃 마우스 모델이 조직들 및 기돤들에서 글리코사미노글리칸 (GAG)의 축적을 유도하는 I2S 좌위의 표적된 파괴를 사용하여 개발되었다. IKO 마우스 모델은 특유의 거친 특징들 및 골격 결함들을 포함하는, 인간들에서 관찰되는 헌터 증후군의 많은 신체적 특징들을 나타낸다. 또한 IKO 마우스 모델은 소변 및 신체 전체를 통한 조직들에서 올라간 글리코사미노글리칸 (GAG) 수준들, 뿐만 아니라 조직병리학적으로 관찰되는 광범위한 세포성 공포화를 보여주고 있다.
본 연구에서, 시판되는 I2S (Elaprase®)가 농축되어 포스페이트 완충 식염수 (PBS)에서 재현탁되었다. 8-12주령의 수컷 IKO 마우스의 6개 그룹들이 I2S (10ul; 26 mg/ml)로 처리되었다. 그룹들 A 및 B (N=3)는 각각 I2S의 260ug 용량 세 번 (1, 8, 및 15일) 또한 260ug 용량 두 번 (1 및 8일)이 경막내 투여되었다. 그룹 D도 역시 세 번의 경막내 투여된 260ug 용량들로 1, 8, 및 15일에 처리되었다. 그룹 C 및 E (N=3)는 미처리된 대조군 그룹들이었고, 그룹 F (N=3)는 미처리된 야생형 대조군이었다. 대조군 마우스는 I2S 없는 운반체로 투여되었다. 마우스는 최종 주사에 이어서 1시간 이후에 희생되었고, 면역조직화학 (IHC) 및 조직병리학적 분석을 위한 조직 준비가 이어졌다.
세 번째 주사에 이어서, 운반체-처리된 마우스와 대비하여 I2S-처리된 마우스에서는 표면 대뇌 피질, 미상엽 핵, 시강 및 소뇌에서 세포성 공포화의 광범위한 감소가 존재하였다. 세포성 공포화의 감소는 역시 IT 치료 이후에 백색질에서도 발견되었다. IKO 마우스의 뇌 조직들로 I2S의 배분은 IT-투여에 이어서 분명하였다.
IKO 마우스에서 I2S의 매주 세 번IT 투여는 또한 광학 및 전자현미경적 수준들에서 CNS 세포성 공포화에서 현저한 감소를 보여주었다. I2S의 IT 투여에 이어서, 세포성 공포화의 감소가 미처리된 IKO 마우스와 대비하여 분명하였고 IT-투여된 I2S 가 질환 진행을 변경할 수 있는 점을 제시하였다. 도 92에 도시된 바와 같이, I2S의 IT 투여에 이어서 세포성 공포화의 감소가 IKO 마우스의 뇌들보 (corpous callosum) 및 뇌활 (fornix)에서 분명하였다.
추가적으로, 전자현미경법은 회색질에 있는 뉴런들에서 축적 봉입들의 존재 감소 및 백색질에 있는 희소돌기교아세포들에서 공포화를 보여주었다. 상세하게, IT 투여된 I2S IKO 마우스는 소정의 리소좀 축적병들에 특징적인 라멜라체 (palisaded lamellar bodies) ("얼룩무늬체들") ("zebra bodies")에서 감소를 보여주었다. 상세하게, 도 57은 미처리된 IKO 마우스와 대비하여 I2S 투여된 IKO 마우스의 뉴런들에서 특징적인 얼룩무늬체들의 감소를 도시하는 전자현미경 스캔을 나타낸다. 유사하게, 도 57은 뇌들보에서 희소돌기교아세포들의 전자현미경 스캔을 도시하고 있다.
또한, IKO 마우스로 I2S의 IT 투여는 표면 대뇌 피질, 미상엽 핵, 시상, 소뇌 및 백색질에서 리소좀 활성 및 질환 상태의 표시인자로서 리소좀 질환 병리학적 바이오마커 리소좀-연관 막 단백질-1 (LAMP-1) 면역염색에서 현저한 감소를 보여주었다. 도 93A에 도시된 바와 같이, LAMP1 면역염색에서 현저한 감소는 도 93B에도시된 미처리된 IKO 대조군 마우스 표면 대뇌 피질 조직과 대비하여 처리된 IKO 마우스 표면 대뇌 피질 조직에서 분명하고, 질환 병리학의 향상을 반영하고 있다.
도 56은 뇌 조직의 um2 영역들에서 측정된 LAMP1의 농도를 도시하여 비교하고 있다. 다양한 뇌 부위들의 LAMP-1 면역염색의 형태측정 분석은 평가된 뇌의 모든 영역들에서 LAMP-1 양성 염색에서 유의한 감소가 존재하는 것을 입증하였다. 도 56에 나타난 바와 같이, 평가된 뇌 조직의 각 영역 (피질, 미상엽 핵 및 조가비핵 (CP), 시상 (TH), 소뇌 (CBL) 및 백색질 (WM))에서 LAMP-양성 영역이 미처리된 IKO 대조군 마우스와 대비하여 처리된 IKO 마우스에서 감소되었다. 상세하게, 분석된 뇌 조직의 각 영역에서 LAMP-양성 영역들은 계속된 치료 기간으로 좀 더 감소되었던 점은 명백하다.
비정상적으로 높은 리소좀 활성의 감소는 뇌의 모든 영역들에서 극적인 형태학적 향상들과 상호관련되었다. 이들 결과들은 IT-투여된 I2S가 유전적으로-조작된 IKO 마우스 모델에서 리소좀 축적병들의 진행을 변경시킬 수 있는 점을 입증하고 있고, 좀 더 나아가 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병들과 연관된 CNS 소견들을 치료하는 I2S와 같은 IT-투여된 효소의 능력을 입증한다.
실시예 12. 헌터병 환자들의 치료
예로, IT 전달을 통한 직접 CNS 투여는 헌터병 환자들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예는 만기 소아 헌터병을 가진 환자들에게 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 통해 투여된 I2S의 전부 40주 동안 격주로 (EOW) 3번 용량 수준들까지의 안전성을 평가하도록 설계된 다중심 용량 점증 (multicenter dose escalation) 연구를 설명하고 있다. 인간 치료에 적합한 다양한 대표적인 경막내 약물 전달 장치들이 도 89 - 도 92에 나타나 있다.
20명까지의 환자들이 참가할 것이다:
집단 1: 5명 환자들 (최저 용량)
집단 2: 5 명 환자들 (중간 용량)
집단 3: 5 명 환자들 (최고 용량)
5명 환자들이 무작위로 미치료될 것이다.
환자들은 다음의 판단기준의 포함을 기초로 하여 연구를 위해 선택된다: (1) 연령 30개월 이전에 첫 번째 증상들의 출현; (2) 검색 시 보행가능 (혼자 서고 한 손을 잡고 10걸음 앞으로 걷는 능력으로서 정의됨); (3) 검색 시 신경학적 징후들의 존재. 전형적으로, 조혈줄기세포 이식 이력의 환자는 배제된다.
만기 소아 헌터병을 가진 어린이에서 40주 동안 IT 주사에 의해 투여된 I2S의 상승 용량들의 안전성이 결정된다. 추가적으로, 총 운동 기능 및 혈청에서 단일, 반복-용량 약물역학에 미치는 I2S의 임상적 활성 또한 뇌척수액 (CSF)에서 농도들이 평가된다.
rhASA 단백질의 IT 전달
실시예 13. IT-전달된 재조합 ASA의 독성학 연구
CNS 의 세포들 및 조직들 내로 배분되는 다른 경막-투여된 재조합 효소들의 능력을 평가하기 위하여, GLP 연구가 어린 사이노몰 원숭이들 (12개월 이하)에서 한 달 기간 동안 독성학 및 안전성 약물학 관점으로부터 재조합적으로-제조된 인간 아릴설파타제 (rhASA)의 반복 용량 경막내 (IT) 투여를 평가하도록 시행되었다. rhASA 의 제형물이 154 mM NaCl, 0.005% 폴리솔베이트 20의 운반체로 pH 6.0에서 제조되어 제형화되었다.
이것을 달성하기 위하여, 9마리 수컷 및 9마리 암컷 어린 사이노몰 원숭이들이 체중에 의해 다음의 표 28에 나타난 바와 같이 세 가지 치료 그룹들의 하나로 무작위 배정되었다. 동물들 (용량 1의 경우 1마리 수컷 동물을 제외함)은 0, 3 또는 31 mg/mL rhASA (전체 용량 0, 1.8 또는 18.6 mg)의 0.6 mL 단기 IT 주입을 격주로 동물마다 전부 세 번 용량들을 받았다. 체중들, 임상적 관찰들, 신경학적 및 신체 검사들, 임상적 병리학, 안과 검사들, 및 독성역학적 시료 채취가 감시되었다. 모든 동물들은 29, 30 또는 31일 (마지막 IT 용량 이후 ~24시간)에 부검되었다. 선택된 조직들은 수확되어 수집되었고 현미경적으로 조사되었다.
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사이노몰 원숭이들의 CNS 조직들에서 검출되는 rhASA 농도들은 ELISA에 의해 분석되었고 대략 2.5ng/mg 조직에 해당하는 정상적인 인간 rhASA 농도들의 10%의 치료적 표적과 비교되었다. 조직 시료들 또는 천자물들 (punches)은 사이노몰 원숭이들의 뇌들의 서로 다른 영역들로부터 추출되었고 좀 더 나아가 rhASA 존재에 대하여 분석되었다. 도 133 - 도 138는 천자물들이 추출된 조직들을 도시하고 있다. 천자된 조직 시료들은 대뇌 피질로부터 깊은 백색질 및 깊은 회색질까지의 침전 구배를 가지면서 rhASA의 농도들에서 증가를 반영하였다.
18.6 mg 용량의rhASA를 투여받은 6마리 원숭이들의 경우 IT 및 ICV 투여 경로들 둘 다로부터 동일한 천자를 사용하여 검출된 rhASA의 농도들이 도 140A-B에 도시되어 있다. rhASA가 경막내-(IT) 또는 뇌실내 (ICV) 투여된 어른 및 어린 사이노몰 원숭이들의 깊은 백색질 (도 140A) 및 깊은 회색질 (도 140B) 뇌 조직들에서 검출되는 rhASA의 농도들이 비교가능하였다.
다음으로 어른 및 어린 사이노몰 원숭이들의 뇌들로부터 추출된 천자된 조직 시료들은 추출된 조직 시료에 축적된 rhASA 의 농도들을 결정하도록, 또한 이러한 농도들을 mg 단백질 당 2.5ng rhASA(건강한 개체에서 rhASA 의 정상적인 농도 10%에 해당함)의 치료적 표적 농도들과 비교하도록 분석되었다. 도 141A에 도시된 바와 같이, 분석된 각 조직 시료 천자물에서18.6mg 용량의 IT-투여된rhASA는 표적 치료적 농도2.5ng/mg 단백질을 초과하는 rhASA 농도를 가져왔다. 유사하게, 1.8 mg 용량의 rhASA 가 어린 사이노몰 원숭이들에게 IT-투여되었을 때, 분석된 각 조직 시료 천자물은 2.5ng/mg 단백질의 치료적 농도 이내 또는 이를 초과하는 rhASA 농도 둘 중 하나를 보여주었고, 중앙값 rhASA 농도들은 테스트된 모든 조직 천자물들의 경우 치료적 표적을 초과하였다 (도 141B).
IT-투여된 rhASA가 적절한 세포들로 배분되는지 여부를 결정하도록 조직들이 도 142A 에 도시된 영역으로부터 1.8mg의 rhASA이 IT-투여된 사이노몰 원숭이의 깊은 백색질로부터 분석되었다. 도 142B 에 의해 도시된 바와 같이, 깊은 백색질의 면역염색은 사이노몰 원숭이에 있는 희소돌기아교세포들에서 rhASA의 분포를 드러냈다. 유사하게, 도 142C는 IT-투여된 rhASA가 사이노몰 원숭이의 깊은 백색질 조직들에서 공동-정착을 보여주었던 것을 도시하고 있다. 상세하게, 염색 하에 리소좀과 같은 표적 소기관들에서 공동-정착은 분명하고 (도 142C), IT-투여된 rhASA가 희소돌기아교세포들의 리소좀들을 포함하여, CNS의 적절한 세포들, 조직들 및 소기관들로 배분될 수 있다는 결론을 지지한다.
실시예 14. ICV- 대비 IT- 투여
양전자 방출자 124I로 표지된 rhASA가 준비되었고 pH 6.0에서 154 mM NaCl, 0.005% 폴리솔베이트 20의 운반체로 제형화되었다. 3mg rhASA (38mg/kg 의 뇌에 해당함)와 동등한 제형물의 부피가 뇌실내 (ICV) 및 경막내 (IT) 투여 경로들을 통해 어른 사이노몰 원숭이들에게 투여되었다. 사이노몰 원숭이들은 투여된 124I-표지된 rhASA 의 분포를 결정하도록 고-해상도 PET 스캔 영상화 연구들 (마이크로 PET P4)이 시행되었다.
PET 영상화 데이타 (도 143)는 ICV- 및 IT-투여된 124I-표지된 rhASA 가 CNS의 조직들로 효과적으로 배분되었고 상세하게는 124I-표지된 rhASA가 IT-요추 카테터를 통해 바로 투여되고 척수의 길이를 따라 뇌척수액 (CSF)에서 일정하게 분산되는 것을 도시하고 있다. 상세하게는 도 143에 도시된 바와 같이, ICV- 및 IT-투여에 이어서, 124I-표지된 rhASA 의 치료적 농도들이 뇌, 척수 및 CNS를 포함하는 사이노몰 개체의 CNS 조직들에서 검출되었다. 이러한 CNS 조직, 상세하게는 뇌의 조직들에서 검출되는 rhASA 농도들은 2.5ng/mg 단백질의 치료적 표적 농도를 초과하였다.
rhASA 단백질의 분포는 IT 및 ICV 투여 경로들 둘 다의 경우 비교가능한 한편, 도 143에 의해 입증된 바와 같이 ICV는 척수 기둥 내에 명백하게 더 적은 축적을 가져왔다.
제형물의 투여에 이어서 24시간째, ICV- 및 IT-투여된 124I-표지된 rhASA 둘 다는 CNS 조직들로 효과적으로 배분되었다. 상세하게는, 투여에 이어 24시간째, ICV-투여된 용량의 16.7%와 대비하여 투여된 용량의 12.4%는 두개골 부위에 있었다. 따라서, rhASA가 투여될 때 이러한 CNS 조직들, 상세하게 뇌의 조직들에서 검출되는 rhASA농도들은 동일한 용량의 ICV 투여에 이어서 검출되는 이들 농도들에 근접하였다.
124I-표지된 rhASA의 ICV 주사는 도 144에서 도시된 바와 같이 주사된 부피의 대수조, 교뇌수조 (cistern pontis), 각간 수조 (cistern interpeduncularis) 및 근위 척수 (proximal spine)로 즉각적인 전달을 유도하고 있다. 또한 도 144에 도시된 바와 같이, 124I-표지된 rhASA은 ICV 투여의 경우에 나타난 바와 같이 동일한 초기 구획들 (수조들 및 근위 척수)로 IT 투여 2-5시간 이내에 전달되었다. ICV- 및 IT-투여 둘 다를 이어서 24시간째, 124I-표지된 rhASA 의 분포는 도 145에 도시된 바와 같이 수조 및 근위 척수에서 비교가능하였다.
이들 결과들은 rhASA가 덜 침습적인 IT 투여 경로를 사용하여 개체로 전달될 수 있고, 이에 의해 표적 세포들 및 조직들에서 치료적 농도들을 달성할 수 있는 점을 입증하고 있다.
리소좀 축적병들은 비정상적인 기질 축적을 유도하는 효소의 상실 또는 결핍에 의해 초래되는 유전병들의 패밀리를 말한다. 여러 가지의 이들 질환들과 연관된 말초 증후군들은 재조합 효소들의 정맥내 투여에 의해 효과적으로 경감될 수 있는 한편, 이러한 재조합 효소들의 정맥내 투여는 대다수의 리소좀 축적병들과 연관된 CNS 소견들을 유의하게 영향을 주도록 기대되지 않는다. 예를 들어, 재조합 인간 이듀로네이트-2-설파타제 (이듀설파제, Elaprase® Shire Human Genetic Therapies, Inc. Lexington, MA)는 헌터 증후군의 신체적 증상들의 치료를 위해 승인되었지만, 지연된 발달 및 진행성 정신이상을 포함할 수 있는 헌터 증후군의 신경적 소견들의 치료를 위한 약물학적 요법은 전혀 없다. 이것은 부분적으로 대략 76kD의 분자량을 가지는 크고 매우-당화된 효소이고 정맥내 투여를 이어서 혈액 뇌 장벽을 통과하지 못하는 I2S의 본성으로 인한다.
따라서 본 발명자들은, 예를 들어 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S), 아릴설파타제 A (rhASA) 및 알파-N-아세틸글루코사미다제 (Naglu)와 같은 재조합 인간 효소들의 경막내 제형물들의 경막내 (IT) 전달을 연구하는 프로그램에 착수하였다. 본 명세서에서 설명된 이들 결과들은 재조합 리소좀 단백질들의 IT-요추 투여가 투여된 단백질의 유의한 부분의 전달을 유도하고, 상세하게는 사이노몰 원숭이들 및 개들 둘 다에 있는 뇌 및 척수의 뉴런들에서 이러한 단백질의 광범위한 축적을 유도하는 점을 처음으로 보여주도록 기술하고 있다. CNS 조직들의 면역조직화학적 분석들은 단백질이 리소좀 축적 장애들에서 병리적 글리코사미노글리칸 축적의 부위인 리소좀으로 표적되는 점을 보여주었다. 또한, 헌터 증후군의 IKO 마우스 모델, 산필리포 증후군 B형의 Naglu-결핍 마우스 모델, 이염색성 백잭질 장애 (MLD)의 ASA 녹아웃 마우스 모델에서 나타난 형태적 향상들은 IT-투여된 효소가 적절한 조직들로 배분되고 적절한 세포 구획들 및 소기관들로 운반되는 점의 관찰을 강조하고 있다.
I2S의 IT-요추 및 ICV 투여 이후 검출되는 뇌 분포 양상에서 관찰되는 유사성들은 CSF의 대량 (bulk) 유동 및 능동적 재혼합을 제시하고 있다. 따라서 임상적 설정에서, IT 및 ICV 투여 경로들 둘 다는 잠재적으로 실행가능하지만, IT 투여에 이어서 척수에서 I2S의 관찰된 축적은 척추 휴유증들 및 헌터 증후군과 같은 리소좀 축적병들의 성분들을 설명하는데 분명한 유익을 제공한다. 더구나, 척수 주사 포트들은 덜 침습적이고 특히 소아과 환자들에서 만성적 사용에 더 적합할 것으로 기대된다.
상기 PET 영상화 연구들에 의해 관찰되는 혈관주위 세포 염색 및 단백질 전위 역학으로부터 나온 증거는 효소가 혈관주위 공간 내에서, 아마도 박동성 전도 기작들 에 의해 이동하는 것을 가르킨다. 전달의 추가적인 기작은 관찰된 I2S의 능동적 축삭 전달을 표시하는 신경필라멘트들과 연관성에 의해 제시된다. 후자는 아마도 척수 및 뇌의 세포들 위에 널리 발현되고 뇌 실질로의 직접 투여 시 I2S 효소가 표적 세포들에 의해 바로 흡수되도록 유도할 수 있는 신경성 만노스-6-포스페이트 (M6P) 수용체들과의 단백질 상호작용으로 시작한다 (Begley, et al., Curr Pharm Des (2008) 14: 1566-1580).
리소좀 효소들의 축삭 전달은 이전에 시험관내 간접 방법들에 의해 또한 시험관내 영상화에 의해 설명되었던 한편, 최신의 연구들은 CSF를 통해 전달된 비-바이러스성 또는 발현된 효소들의 축산 전달의 직접적인 증거를 처음 제공하고 있다. 따라서, CSF로부터 뇌 표면 및 뇌 조직들 내로 더 깊이까지 단백질의 전달은, 이전에 뇌의 세포들, 조직들 및 소기관들로 단백질 또는 효소 전달에 대해 기술되거나 밝혀진 적이 아무 것도 없었던 능동적 운반 공정들에 의존하는 것 같다.
기질 (parenchyma), 간질 (interstitium) 및 CSF의 유동 역학이 뇌의 백색질로 IT-요추 투여된 단백질들의 배분을 막을 수 있다는 널리 퍼진 관점과는 대조적으로, 일시적 연구들은 리소좀 효소의 IT 전달이 모든 뇌 조직들에서 단백질 배분 및 축적 또한 병리적 글리코사미노글리칸의 축적 부위인 표적 세포들의 리소좀 구획에서 침전을 가져오는 점을 분명하게 보여준다 (예로, Fenstermacher et al., Ann N Y Acad Sci (1988) 531:29-39 및 DiChiro et al., Neurology (1976) 26:1-8 참조). IT-요추 전달의 덜 침습적인 본성과 함께, 본 경로는 특히 어린이들에서 뇌로 생물적 치료제들을 전달하는 임상적으로 적절한 수단을 제공한다.
실시예 15. 독성학
본 실시예는 6개월 동안 독성학 및 안정성 약물학 관점으로부터 rhASA 의 반복 용량 경막내 (IT) 투여를 기술하고 있다. 본 연구를 위한 IT 테스트 항목은 rhASA 이었다. 36마리 수컷 및 36마리 암컷 사이노몰 원숭이들이 5개의 치료 그룹들로 무작위 배정되었다. 그룹 1에서 동물들은 미치료된 이식 장치 대조군 (포트 및 카테터)이었고 운반체 또는 테스트 항목으로 투여되지 않았지만; 이들 동물들은 테스트 항목 투여 스케쥴과 맞춘 스케쥴로 0.6 mL의 PBS가 투여되었다. 그룹들 2-5에서 동물은 0, 3, 10 또는31 mg/mL의 rhASA의 0.6 mL IT 주입 (전체 용량 0, 1.8, 6.0, 또는18.6 mg)을 격주로 (예로, 전부 12 번 용량)을 받았다. 동물들은 6개월 (마지막 IT 투여 이후 24시간)에 부검되었고, 남아있는 4마리 동물들/성별/그룹이 4주의 회복 기간의 말에 부검되었다. 선택된 조직들은 수확되어 수집되었고 현미경적으로 조사되었다.
일반적으로, 테스트 항목 관련 변화들은 두 가지 주요한 유형들로 분류될 수 있었고 모든 용량 수준들에서 존재하였다 (1.8, 6.0 및 18.6 mg/용량). 뇌척수막, 뇌 실질, 척수 실질, 삼차 신경절, 및 때로는 척수 신경근들/신경절 (또는 이들 구조들을 감싸는 신경외막)에서 (일반적으로 두드러진 호산구 성분을 가진 백혈구 세포들의) 침윤물들의 증가가 있었다. 본 증가는 경막내 공간에서 또한 신경계 조직들에서 테스트 항목 (단백질) 존재로 인한 것으로 해석되었다. 우연한 동물들 (신경아교증 (microgliosis))에 있는 척수 및 뇌에서 미세교아 세포들의 약간의 국소적 증가는 고용량 동물들이라면 모두에서 관찰되지 않았다. 형태적 변화들의 분류들 둘 다는 테스트 항목의 존재에 대한 반응인 것으로 해석되었다. 어느 동물에서도 신경적 괴사의 증거는 없었다. 테스트 항목 관련 변화들은 뇌, 척수, 척수 신경근들 또는 신경절에서 생물학적 역반응들과는 전혀 관련이 없었다. 상세하게는, 신경적 괴사 또는 생물학적으로 중요한 신경교 반응의 증거는 전혀 없었다. 비-신경계 조직들에서 테스트 항목 관련 병변들은 전혀 없었다.
1개월 회복 기간에 이어서 (무투여 기간), 테스트 항목 관련된 변화들은 전부 해결되었거나, 이전의 테스트 항목의 존재와 연관된 염증 반응에서 예전 증가의 잔재에 제한되었다. 회복 동물들에서 형태적 역효과들은 전혀 없었다. 반-정량적인 염색 점수들을 배정하는 가려진 (blinded) 현미경적 조사를 기초로 한 바와 같이, 아릴설파타제 A (rhASA; 테스트 항목)에 대한 면역조직화학적 염색은 테스트 항목 처리된 그룹들 모두의 경우 최종 희생시 뉴런들을 제외하고 다양한 세포 유형들로 뇌 및 척수에서 증가되었다. 본 증가는 간의 컵퍼 세포들 (Kupffer cells)에서도 역시 명백하였다. 1개월 회복 기간에 이어서, 테스트 항목 처리된 동물들 (모든 용량 동물들)에서 rhASA 염색은 대조군 (장치 및/또는 운반체 대조군) 수준들로 돌아왔다. 1마리의 저용량 회복 수컷에서, 별아교세포증의 다중 국소들 및 신경 소실이 있었고, 대뇌 피질에서 과거 허혈의 다중 영역들을 가르켰다. 본 동물에서 이들 병변들의 정확한 발병기전 (pathogenesis)은 명확하지 않았더라도, 10배의 용량을 받은 고용량 동물들을 포함하여 다른 테스트 항목 치료된 동물들에서 유사한 병변들의 결여는 테스트 항목과 관련이 없는 것을 가르켰다.
본 연구를 위한 테스트 항목은 rhASA이었다. 36마리 수컷 및 36마리 암컷 사이노몰 원숭이들이 5가지의 치료 그룹들로 무작위 배정되었다. 그룹 1의 동물들은 미치료된 이식 장치 대조군 (포트 및 카테터)이었고 운반체 또는 테스트 항목이 투여되지 않았지만; 이들 동물들은 테스트 항목 투여 스케쥴과 맞춘 스케쥴로 0.6 mL의 PBS가 투여되었다. 그룹들 2-5에서 동물은 0, 3, 10 또는 31 mg/mL의 rhASA의 0.6 mL IT 주입 (전체 용량 0, 1.8, 6.0, 또는 18.6 mg)을 격주로 (예로, 전부 12 번 용량)을 받았다. 동물들은 6개월 (마지막 IT 투여 이후 24시간)에 부검되었고, 남아있는 4마리 동물들/성별/그룹이 4주의 회복 기간의 말에 부검되었다. 선택된 조직들은 수확되어 수집되었고 현미경적으로 조사되었다. 하기 표는 본 연구의 병리학 관점에 속하는 연구 설계를 반영하고 있다.
희생 시, 뇌는 대략 3 mm의 관상 슬라이스 두께로 뇌 매트릭스에서 절단되었다. 첫 번째 조각 및 이후 조각은 조직병리학적 평가 및 면역조직화학 분석을 위해 포르말린에 고정되었다. 뇌는 관상 절편들로서 전체가 처리되었다. 이들 절편들은 다음의 뇌 부위들을 최소로 포함하였다.
* 신생피질 (neocortex) (전두, 몸통, 일시적 및 후두 피질을 포함): 뇌 절편들 1 내 지 8 (또한 존재할 때 조각 9)
* 고피질 (paleocortex) (후각 망울들 및/또는 이상엽 (piriform lobe)): 뇌 절편들 1 내지 3
* 기저 신경절 (미상엽 및 조가비핵 포함): 뇌 절편들 3 및 4
* 번연계 (limbic system) (해마 및 대상회 (cingulate gyri)를 포함): 뇌 절편들 4 및 5
* 시상/해마 및 흑색질 (substantia nigra)을 포함하는 중간뇌: 뇌 절편들 4 및 5
* 소뇌, 교뇌 (pons) 및 연수 (medulla oblongata): 뇌 절편들 6 내지 8 (또한 존재할 때 조각 9).
뇌 절편들은 절편 1 내지 8/9 (절편 9는 일정 동물들의 경우 테스트 기기에 의해 제공됨)로서 데이타 표들에 나열되고 있다. 절편화는 동물들 사이에 약간 다양하였다. 상기에 제공된 뇌 절편들 (1부터 8/9까지)은 다양한 해부적 영역들의 예상된 위치이었다. 뇌 절편들은 (있을 수 있는) 잠재적인 미래의 추가적인 조각 검토를 용이하게 하도록 본 절편에 적절한 진단들을 가지고 개별적 절편들로서 데이타 표들에 나열되어 있다. 데이타 해석 동안, 개별적 뇌 해부 부위들 (상기에 나열된 바와 같음)은 독특한 (예로, 특정한 뇌 부위에 독특한) 테스트 항목 효과들 확인하기 위하여 비교되었다. TPS에서, 모든 동물들로부터 나온 모든 뇌 절편들은 파라핀에 포매되었고, 5마이크론으로 절단되어 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색되었으며 현미경적으로 조사되었다. 또한, 대조군 및 고용량 동물들로부터 나온 뇌들도 형광-제이드 B (Fluoro-Jade B) (뇌를 신경적 퇴화에 대해 평가하는 민감도를 증가시키는 염색) 및 비엘스코우스키 은 염색 (Bielschowsky's silver stain) (축삭들, 가지세포들 및 신경 필라멘트들의 직접 영상화를 허용하는 절차)으로 염색되었고 조사되었다.
척수 (경추, 흉추 및 요추)는 1센티미터 절편들로 절단되었다. 첫 번째 조각 및 이후 두 번째 조각은 조직병리학적 평가 및 면역조직화학 분석을 위해 포르말린에 고정되었다. 모든 동물들로부터 나온 척수 단편들 (경추, 흉추 (카테터 팁 포함) 및 요추)는 대략 5 마이크론으로 절편화되고 H&E로 염색되었으며 각 수준에서 얻은 대각선 및 사선 단편들을 사용하여 조사되었다. 대조군 및 고용량 그룹들로부터 나온 일련의 척수 절편들은 추가적으로 비엘코우스키 은 염색 및 항-GFAP (별아교세포들의 직접 영상화 및 그들의 공정들을 허용하는 면역조직화학적 염색)로 염색되었다.
등 척수 신경근들 및 신경절 (중-경부, 중-흉부, 및 중-요추에서 얻음)은 파라핀에 포매되었고 일련의 절편들은 H&E로 염색되었다. 또한, 대조군 및 고용량 그룹들로부터 나온 일련의 단편들은 비엘코우스키 은 염색으로 염색되었다.
모든 동물들로부터 나온 좌골, 전경골 및 비복 신경 절편들의 경우: 각 신경의 가로 절편은 파라핀에 포매되었고 대략 5마이크론으로 절편화되어 H&E로 염색되었다. 각 신경의 세로 절편은 오스뮴으로 후-고정되었고 스푸르 레진 (Spurr's resin)에 포매되었으며 대략 1 내지 2 마이크론으로 절편화되어 톨루이딘 블루로 염색되었다. 오스뮴 후-고정 및 레진 포매는 말초 신경들에서 미엘린의 월등한 보존 또한 신경의 더 자세한 조사를 제공한다.
모든 동물들로부터 수집된 모든 조직들 및 부검시 수확된 총 병변들도 역시 파라핀에 포매되어 H&E로 염색되었으며 현미경적으로 조사되었다. 조직병리학적 처리 및 평가들 또한 면역조직화학적 분석들은 TPS에 의해 수행되었다.
방법들: 아릴설파타제 A (rhASA) 염색
양성 대조군 슬라이드들은 연구 후원자에 의해 공급되었다. 슬라이드들은 rhASA로 주사된 마우스로부터 나온 간 절편들이었다. 양성 대조군 슬라이드들 모두는 간에 있는 컵퍼 세포들 (시누소이드 대식세포들)에서 rhASA의 충분한 증거를 보여주었다. 양성 대조군 슬라이드들은 본 연구로부터 나온 다른 슬라이드들과 함께 보관되었다. rhASA 염색된 절편들의 평가들 모두는 처음에 동물의 치료 그룹을 가리고 시행되었다. 이것은 병리학자가 (평가되는 실제 동물의 지식을 가진 조력자에 의해) 가려진 라벨 위의 동물 번호로 rhASA 염색된 슬라이드들을 읽도록 하고, 평가하는 동안 점수 (중증도 등급)를 구술하고, 동일한 조력자가 바로 염색 점수 (중증도 등급)를 데이타 표들 내에 기록하도록 하여 수행되었다. 다음으로, 동물 ID는 정확한 데이타 입력을 보장하도록 연구 신경병리학자 및 조력자 둘 다에 의해 확인되었다. 본 절차는 세포내 rhASA의 검출을 위한 면역조직화학적 염색으로 전반적인 염색 강도의 판단에 편견이 도입되지 않도록 시행되었다. 뉴런들, 뇌척수막 대식세포들, 혈관주위 대식세포들 및 교아세포들 (별아교세포들 및 미세교아세포들이지만 우세하게는 미세교아세포들)의 염색의 상대적 정도가 뇌 및 척수 절편들 모두에서 등급이 매겨졌다. 각 그룹의 경우 각 뇌 및 척수 수준에서 평균 중증도 점수들은 그룹으로 합산되었고 뇌, 일반, rhASA 염색 또한 척수, 일반, rhASA 염색으로 조직 하의 전체값으로서 기록되었다.
일반적으로, 뇌의 뉴런들에서 rhASA 염색은 대뇌 피질 및 뇌에 있는 다른 핵 영역들에서 뉴런들의 척도가 되었다. 뇌척수막 대식세포들에서 rhASA 염색은 뇌척수막 대식세포들 및/또는 뇌척수막 대식세포들에 있는 내인성 rhASA에 의한 테스트 항목의 흡수의 증거가 되었다. 혈관주위 대식세포들의 rhASA 염색은 뇌 및 척수에서 혈관주위 공간 (버코우-로빈스 공간)이 뇌척수막과 연속적이라는 점이 강조되어야 하더라도, 뇌/척수에서 대식세포들에 의한 rhASA (또는 내인성rhASA)의 흡수의 척도가 되었다. 일반적으로, 교아세포들에서 rhASA의 등급 매기기는 우세하게는 테스트 항목의 흡수/ 특히 대뇌 피질 (대뇌 부채살 (corona radiata)은 대뇌 피질 아래의 백색질임)의 회색 및/또는 백색질 내로 테스트 항목의 침투의 척도가 되었다. 백색질에서 rhASA 염색은 별아교세포들 및 미세교아세포들에 존재하는 것으로 보였다.
다음의 등급 매기기 계획은 다양한 세포 유형들에서rhASA 염색의 정도를 점수 매기는 데 사용되었다 (뉴런들, 교아세포들, 대식세포들).
등급 설명 (가능한 염색된 세포들의 %)
1 10% 이하
2 10 내지 25% 이상
3 25 내지 50% 이상
4 50 내지 75% 이상
5 75% 이상
*
*본 계획이 엄격하게 정량적이지 않은 점을 명심하라. 이것은 뇌 및 척수를 rhASA를 사용한 염색 정도로 접근하는 효과적인 반-정량적인 방법으로서 사용되었다. 연구 신경병리학자에 의해 모든 신경적 영역들이 동등한 rhASA 염색을 가지지는 않는 점을 언급되었다. 일정 대조군 동물들에서 내인성 신경 염색이 존재하고 맥락막총 (choroid plexus)의 세포들 및 배근 신경절의 뉴런들이 대조군 동물에서도 rhASA에 대해 강하게 염색시키는 경향이 있는 점도 역시 언급되었다. 맥락막총 및 배근 신경절의 염색은 등급이 매겨지지 않았지만 연구 신경병리학자에 의해 대조군 동물들에서도 두드러진 것이 언급되었다.
주석: 모든 용량 그룹들: 저용량 = 1.8 mg/dose; 중간 용량 = 6.0 mg/dose; 고용량 = 18.6 mg/dose. 모든 용량 그룹들 (수컷 및 암컷: 하기 참조)의 간에서 증가된 rhASA 염색을 제외하고 비-신경계 조직들에서 테스트 항목 관련 병변들이 없었다.
최종 희생 동물들 (6개월의 격주 투여): rhASA 염색된 절편들
다음의 조직들/세포 유형들에는 rhASA 염색의 증가가 있었다. 특정한 용량 그룹에 있는 특정한 세포 유형에서 rhASA 염색의 정도에 미치는 테스트 항목 효과를 고려할 때, 동시적인 운반체 대조군 및 장치 대조군 (회복 희생 동물들과 함께 희생됨)이 비교를 위해 고려되었다.
뇌, 뇌척수막들, 대식세포들 (모든 용량 그룹들, 수컷들 및 암컷들)
* 뇌, 혈관주위, 대식세포들 (모든 용량 그룹들, 수컷들 및 암컷들)
* 뇌, 교아세포들 (모든 용량 그룹들, 수컷들 및 암컷들)
* 척수, 뇌척수막들, 대식세포들 (모든 용량 그룹들, 수컷들 및 암컷들)
* 척수, 혈관주위, 대식세포들 (모든 용량 그룹들, 수컷들 및 암컷들)
* 척수, 교아세포들 (중간 및 고용량 수컷들 및 암컷들)
* 간, 컵퍼 세포들 (모든 용량 그룹들, 수컷들 및 암컷들)
내인성 염색 때문에, 뇌 및 척수의 뉴런들에서 ARSA 염색 수준들은 특이적으로 정의하는 것이 가장 어려웠다. rhASA 염색은 뇌척수막 및/또는 뇌/척수 혈관주위 대식세포들에서 또한 교아세포들 내에서도 지속적으로 증가된 수준들의 rhASA를 보여주었다. 뉴런들에서 rhASA 염색은 대조군 및 테스트 항목 치료된 동물들 간에 검출가능한 차이들이 없었다.
회복 희생 동물들 (6개월의 격주 투여에 이어서 1개월 무투여기간)
일반적으로, 테스트 항목 관련 변화들은 전적으로 해결되거나 부검 이전에 무투여 1개월 기간이 허용된 이들 동물들에서 명백하게 감소되었다. 다음의 현미경적 변화들이 테스트 항목과의 가능한 관련성을 가리키는 발병 및/또는 중증도에서 존재한다.
테스트 항목 관련 현미경적 변화들 (회복 동물들)
* 뇌, 뇌척수막들, 침윤물들 (중간 및 고용량 그룹들, 양쪽 성별) (도 111 및 도 112)
* 뇌, 뇌척수막들, 침윤물들, % 호산구들 (중간 용량 수컷들; 고용량 암컷들)
* 뇌, 혈관주위, 침윤물들 (중간 용량 수컷들; 고용량 암컷들) (도 113)
* 뇌, 혈관주위, 침윤물들, % 호산구들 (중간 용량 수컷들; 고용량 암컷들)
* 뇌, 회색질, 침윤물들 (모든 용량 그룹들, 양쪽 성별)
* 뇌, 회색질, 침윤물들, % 호산구들 (저용량 수컷들)
* 뇌, 회색질, 호산구들, 괴사 (저용량 수컷들)
* 척수, 뇌척수막들, 침윤물들 (중간 및 고용량 수컷들 또한 고용량 암컷들)
* 척수, 뇌척수막들, 침윤물들, % 호산구들 (중간 용량 수컷들; 저용량 암컷들)
* 척수, 회색질, 침윤물들 (저용량 암컷들)
* 척수, 회색질, 침윤물들, % 호산구들 (저용량 암컷들)
* 배근 신경절 및 신경근들, 신경외막, 침윤물들 (중간 용량 암컷들)
* 척수 신경근들 및 신경절, 침윤물들, 호산구들 (중간 및 고용량 수컷들; 모든 용량들, 암컷들)
* 삼차 신경절, 침윤물들, 호산구들 (중간 용량 수컷들 및 암컷들)
이들 모든 변화들은 최종 희생 동물들에서 관찰되는 증가된 염증 변화들의 잔재를 나타내는 것으로 해석되었다. 최종 희생 동물들에서와 같이, 일정 회복 동물들에서 여전히 존재하는 염증 세포 침윤물의 증가가 역효과들을 초래하는 형태적 변화들을 나타내는 증거는 전혀 없었다. 비-신경계 조직들에서는 테스트 항목 관련 병변들이 전혀 없었다.
회복 희생 동물들 (6개월의 격주 투여에 이어서 1개월 무투여기간): ARSA 염색
장치 및/또는 운반체 대조군들과 대비하여, 회복 수컷들 또는 암컷들에서 증가된 rhASA 염색의 표시는 전혀 없었다. 저, 중간 및 고용량 회복 수컷들의 뇌에서, 장치 및/또는 운반체 대조군들과 대비하여, 일정 세포 유형들 (이것은 치료 그룹들 중에 다양함)에서 감소된 rhASA 염색의 표시가 실제로 있었다. 이것이 실제적인 효과인지 여부를 포함하여 이것의 이유는 명확하지 않았다. 한 가지 가능한 설명은 rhASA의 투여가 내인성 rhASA 생산에서 일정 감소를 초래할 수 있다는 것이다. 유사한 발견이 수컷들의 척수에서는 존재하지 않았다. 회복 수컷들 및 암컷들에서, 간에서의 염색은 대조군들에서 언급된 것과 유사하였다.
일반적으로, 테스트 항목 관련 변화들은 두 가지 주요한 유형들로 분류될 수 있었고 모든 용량 수준들에서 존재하였다 (1.8, 6.0 및 18.6 mg/용량).
뇌척수막, 뇌 실질, 척수 실질, 삼차 신경절, 및 때로는 척수 신경근들/신경절 (또는 이들 구조들을 감싸는 신경외막)에서 (일반적으로 두드러진 호산구 성분을 가진 백혈구 세포들의) 침윤물들의 증가가 있었다. 본 증가는 경막내 공간에서 또한 신경계 조직들에서 테스트 항목 (단백질) 존재로 인한 것으로 해석되었다.
우연한 동물들 (신경아교증 (microgliosis))에 있는 척수 및 뇌에서 미세교아 세포들의 약간의 국소적 증가는 고용량 동물들이라면 모두에서 관찰되지 않았다. 형태적 변화들의 분류들 둘 다는 테스트 항목의 존재에 대한 반응인 것으로 해석되었다. 어느 동물에서도 신경적 괴사의 증거는 없었다. rhASA 염색된 절편들의 평가는 본 중간 보고서에서 유보된다. 테스트 항목 관련 변화들은 뇌, 척수, 척수 신경근들 또는 신경절에서 생물학적 역반응들과는 전혀 관련이 없었다. 상세하게는, 신경적 괴사 또는 생물학적으로 중요한 신경교 반응의 증거는 전혀 없었다. 비-신경계 조직들에서 테스트 항목 관련 병변들은 전혀 없었다. 1개월 회복 기간에 이어서 (무투여 기간), 테스트 항목 관련된 변화들은 전부 해결되었거나, 이전의 테스트 항목의 존재와 연관된 염증 반응에서 예전 증가의 잔재에 제한되었다. 회복 동물들에서 형태적 역효과들은 전혀 없었다.
반-정량적인 염색 점수들을 배정하는 가려진 현미경적 조사를 기초로 한 바와 같이, 아릴설파타제 A (rhASA; 테스트 항목)에 대한 면역조직화학적 염색은 테스트 항목 처리된 그룹들 모두의 경우 뉴런들을 제외하고 다양한 세포 유형들로 뇌 및 척수에서 증가되었다. 본 증가는 간의 컵퍼 세포들에서도 역시 명백하였다. 1개월 회복 기간에 이어서, 테스트 항목 처리된 동물들 (모든 용량 동물들)에서 rhASA 염색은 대조군 (장치 및/또는 운반체 대조군) 수준들로 돌아왔다. 1마리의 저용량 회복 수컷에서, 별아교세포증의 다중 국소들 및 신경 소실이 있었고, 대뇌 피질에서 이전 허혈의 다중 영역들을 가르켰다. 본 동물에서 이들 병변들의 정확한 발병기전은 명확하지 않았더라도, 10배의 용량을 받은 고용량 동물들을 포함하여 다른 테스트 항목 치료된 동물들에서 유사한 병변들의 결여는 테스트 항목과 관련이 없는 것을 가르켰다. 본 예비 보고서의 발표 시, 엄격하게 본 연구에서 전체 및 현미경적 발견들을 기초로 하여 (포매된 파라핀 위에 에마톡실린 및 에오신 염색된 절편들), 관찰된 역효과 수준 (NOAEL)은 18.6 mg이 아니었다.
실시예 16. 약물역학적 데이타
6개월 동물 데이타
본 실시예는 rhASA 의 혈청 및 CSF 농도들 또한 노던 바이오메디칼 리서치사 (Northern Biomedical Research, Inc.)로부터 얻은 항-rhASA 혈청 항체들에 관한 해석적 분석을 제공하고 있다.
본 실시예의 목적은 어린 사이노몰 원숭이들 (< 12개월)에서 독성학 및 안전성 약물학 관점으로부터 rhASA의 반복 용량 경막내 (IT) 투여를 평가하는 것이었다. 전체 12번 용량들이 6개월 기간에 주어졌다. 동물들은 마지막 용량 이후에 24시간 또는 1개월째 부검되었다. 연구 설계는 표 29에 나타나 있다. 하기 표 29는 047-021 (rhASA 1-09-015)의 연구 설계를 나타낸다. 이 때 DC = 장치 대조군; 그룹 1 동물은 운반체 또는 테스트 항목이 투여되지 않았다. 운반체 대조군 동물 번호 044는 누출 카테터로 인해 50일에 일찍 희생되었다.
Figure 112021011816093-pat00052
검정 방법들- 항체 분석
사이노몰 원숭이들로부터 얻은 혈청 및 CSF에서 항-rhASA 항체들의 정량이 유효한 방법을 사용하여 시행되었다. 간략하게, 검정은 MSD 스트렙트아비딘 코팅된 플레이트를 차단하여 시작하고, 바이오틴-표지된 rhASA과의 배양이 이어진다. 세척 단계 이후에, 희석된 시료들, 측정기들, 및 QC들이 플레이트에 첨가되고 배양된다. 추가적인 세척 단계 이후에, SULFO TAG-표지된 약물이 첨가되고 배양된다. 최종 세척 단계가 수행되고 MSD 리딩 완충액이 첨가된다. 플레이트들은 즉시 해독된다. 상대적인 발광 단위들 (RLU)로의 신호 데이타가 SOFTMax 프로 주형들을 사용하여 분석된다.
혈청 및 CSF 농도
사이노몰 원숭이들로부터 얻은 혈청 및 CSF에서 rhASA 의 정량이 유효한 방법을 사용하여 시행되었다. 본 방법은 효소-결합 면역흡착 검정 (ELISA) 기법을 기초로 한다. 간략하게, 마이크로플레이트는 재조합 인간 아릴설파타제 A (rhASA)에 대해 올라간 토끼 폴리클론 항체 (SH040)로 코팅된다. rhASA 참조 표준들 및 테스트 시료들과 배양 이후에, 결합된 rhASA 단백질은 호스래디쉬 퍼옥시다제 (HRP)-결합된 항-ASA 모노클론 항체 (클론 19-16-3)에 의해 검출된다. 다음으로, 플레이트는 HRP, TMB 퍼옥시다제에 대한 기질과 배양된다. 본 효소-기질 반응은 2N 황산 (H2SO4)의 첨가에 의해 정지되고 각 웰의 흡광도가 기준 파장 655 nm를 사용하여 흡광도 파장 450 nm에서 측정된다. 시료들에서 rhASA의 농도들이 동일한 플레이트에서의 rhASA 산정 곡선을 사용하여 계산된다.
rhASA 의 혈청 농도들의 요약이 표 30에 나타나 있다.
rhASA 의 CSF 농도들의 요약이 표 31에 나타나 있다.
항-rhASA 혈청 항체 농도들의 요약이 표 32에 나타나 있다.
항-rhASA CSF 항체 농도들의 요약이 표 33에 나타나 있다.
그룹 및 성별에 의한 항체들의 빈도가 표 36에 나타나 있다.
하기 표 30은 사이노몰 원숭이에서 rhASA의 혈청 농도의 요약을 나타낸다.
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Figure 112021011816093-pat00054
Figure 112021011816093-pat00055
표 31은 사이노몰 원숭이에서 CSF 농도의 요약을 나타낸다.
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Figure 112021011816093-pat00057
Figure 112021011816093-pat00058
표 32는 혈청에서 항- rhASA 항체 농도의 요약을 나타낸다.
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표 33은 CSF에서 항-rhASA 항체 농도의 요약을 나타낸다
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Figure 112021011816093-pat00064
표 34는 수컷 및 암컷을 조합한 rhASA의 혈청 및 CSF 농도 (ng/mL)를 나타낸다.
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Figure 112021011816093-pat00066
Figure 112021011816093-pat00067
Figure 112021011816093-pat00068
표 35는 수컷 및 암컷을 조합한 혈청 및 CSF 항- rhASA 항체 (ng/mL)를 나타낸다.
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표 36은 부검 시 항- rhASA 항체의 빈도를 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00072
사이노몰 원숭이 혈청에서 rhASA 에 대한 정량 한계는 39.1 ng/mL이고, 그룹 1 및 2로부터 나온 모든 혈청 시료들은 정량 한계 (BQL) 미만이고, 표 30을 참조하라. rhASA의 혈청 수준들이 미리 또한 용량들 2, 4, 6, 8, 10, 및 12 (6-개월 부검) 이후 24시간째 month necropsy), 회복 기간 동안의 중간, 또한 회복 부검 이전에 테스트되었다. RhASA 수준들은 그룹 3 (1.8　mg/용량), 그룹　4 (6.0　mg/용량), 및 그룹 5 (18.6 mg/용량)에서 미리 또한 용량들 2, 4, 6, 8, 10, 및 12 (6-개월 부검) 이후 24시간째, 회복 기간 동안의 중간, 또한 회복 부검 이전에 검출가능하지 않았다. 용량 2 이후에, rhASA의 혈청 수준들은 용량-관련되어 있었다. 용량 4 (그룹　3), 용량　6 (그룹들 3 및 4), 및 용량8 및 10 (그룹들 3 및 4 또한 그룹 5 수컷들) 이후에, rhASA 수준들은 검출가능하지 않았다. RhASA의 혈청 수준들은 용량 4 이후 그룹 4 (6.0 mg/용량)에서, 또한 수컷들의 경우 용량 4 및 6 또한 암컷들의 경우 용량들 4, 6, 8 및 10에서 강하되었다. 혈청 rhASA 수준들에서 본 분명한 강하는 항- rhASA 항체들의 증가하는 농도와 관련될 수 있다. RhASA의 혈청 수준에서 본 연구에서 주어진 시료 다양성 및 작은 그룹 수들로는 분명한 성별 차이들은 없었다.
사이노몰 원숭이CSF에서 rhASA의 정량 한계는 19.5 ng/mL이고 그룹 1 및 2로부터 나온 모든 CSF 시료들은 BQL이었으며, 표 31을 참조하라. RhASA는 CSF에서 모든 투여된 그룹들에서 미리 또한 용량들 2, 4, 6, 8, 10, 및 12 (6개월 부검) 이후에 검출가능하였다. CSF에서 수준들은 혈청에서 수준들보다 더 컸다. RhASA의 CSF 수준들에서 본 연구에서 주어진 시료 다양성 및 작은 그룹 수들로는 분명한 성별 차이들이 없었다. rhASA는 모든 용량 그룹들에서 회복 기간 동안의 중간 및 회복 부검 이전에 검출가능하지 않았다. rhASA 치료된 그룹들의 경우 용량 12 (부검) 수집물들에서 CSF 수준들은 투여 이후 8 및 11 수준들보다 더 낮았다. 부검시 더 낮은 rhASA 수준들에 대한 가능성 있는 이유들은 살아있을 때 투여 간격에서 취한 부피 (rhASA 의 농도를 위해 투여 이전 또는 이후 0.5 mL까지) 대비 부검시 취한 더 큰 부피 (세포수, 화학, rhASA 및 항 RHASA 항체를 위해 전체 ~2.25 mL)를 포함한다. 추가적으로, 일정 동물들은 부검시 특허 카테터들을 가지지 않았고, 시료들은 카테터를 통하기 보다는CM 탭을 사용하여 취하였다. 본 경로는 지속적으로 카테터를 통한 시료 채취와 대비하여 더 낮은 rhASA 농도들을 수득하였다. 이것은 원숭이들 및 사람과 같은 수직적-방향 동물들에서 일어나는 것으로 알려진 CSF 대량 유동 (bulk flow)의 입-꼬리 방향 (rostrocaudal direction)으로 인한 것 같다 (예로, CSF의 성분들은 개체들의 수명 전체를 통하여 현저한 입-꼬리 방향 구배들을 나타내는 것으로 잘 알려져 있음).
혈청에서 항- rhASA 항체들은 일정 시간대에 RHASA로 처리된 동물 모두에서 검출되었고, 표 32를 참조하라. 동물들은 항- rhASA 항체의 수준이 정량 한계 (78.1 ng/mL) 초과라면 항- rhASA에 양성으로 정의된다. 일단 혈청이 전환되면 동물들은 항- rhASA 항체에 양성으로 남아있었다. 동물들은 투여 이전 2 시간대에 항- rhASA 항체들에 양성이 전혀 아니었다. 수컷 번호 026(그룹 4; 6.0 mg/용량)를 제외한 모든 rhASA 동물들은 투여 이전 4 시간대에 혈청 항- rhASA 항체들에 양성이었다. 수컷 번호 026은 투여 이전 6시간대에 혈청 항체에 양성이었다. 그룹 5(18.6 mg/kg)에서, 부검 항체 시료들은 더 낮은 항체 수준들을 가졌다. 본 명백한 감소는 본 검정과 간섭하는 rhASA의 존재로 인할 수 있다. 일반적으로 역가는 저용량 동물들 (1.8 mg/용량)보다 중간- 및 고용량 그룹들 (6.0 및 18.6 mg/용량)에서 더 높았다. 항- rhASA 항체들의 존재는 재조합 인간 단백질로 사이노몰 원숭이들을 치료하는 것으로부터 기대되는 결과이다. 결과들에서 다양성이 주어지지만, 명백한 성별 차이들은 없었다.
CSF에서 검출가능한 항- rhASA 를 가지는 동물들 모두는 암컷 번호 049 (그룹 3; 1.8 mg/용량) 및 057 (그룹p 4; 6.0 mg/용량)를 제외하고는, 혈청에서도 검출가능한 rhASA 항체들을 가졌다. 항체 농도에서 다양성 및 빈도는 용량 반응의 결정을 가로막는다. 동물들은 항- rhASA 항체의 수준이 정량 한계 (78.1 ng/mL) 초과라면 항- rhASA에 양성으로 정의된다.
혈청 및 CSF RHASA 수준들 및 항-RHASA 항체들의 경우 수컷들 및 암컷들의 조합 수치들이 표 34 및 표 35에 나타나 있다. 조합된 수컷 및 암컷 결과들은 상기에 논의된 개별적 성별들과 유사하다.
실시예 17. 효능
본 실시예에서, 11마리의 야생형 대조군 (mASA +/+ hASA -/-) 마우스가 그룹 A로 배정되었고 전혀 치료를 받지 않았다. 34마리의 hASAC69S/ASA -/- 마우스가 5가지 용량 그룹들 각각에 배정되었고 운반체 (그룹 B) 또는 용량들 20　mg/kg (정맥내 [IV]; 그룹　C) 또는 0.04, 0.12, 및 0.21 mg (그룹들 D, E, 및 F, respectively)의 rhASA를 1, 9, 15/16, 및 22일에 수여받았다. 모든 IV 용량들이 꼬리 정맥을 통해 투여되었다. 모든 경막내 (IT) 용량들이 12　uL 부피로의 주입으로서 대략 2　uL/20초의 범위로 투여되었다 (표 37). 하기 표 37은 연구 설계를 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00073
NA = 미적용; IT = 경막내; IV = 정맥내.
a 마우스의 뇌 무게는 대략 0.0004 kg.
b 그룹들 C, D, 및 E는 15일에 투여; 그룹 B 및 E는 16일에 투여함.
ASA 녹아웃 마우스 hASAC69S/ASA(-/-)가 MLD의 허용된 모델이고, 본 질환의 가능성 있는 치료들을 테스트하는 데 사용되었다. 본 경막내 경로는 인간들에서 의도된 투여 경로이다. 정맥내 투여 경로는 MLD 마우스에서 본 화합물 및 유사한 화합물에 대해 테스트되어 왔다. 정맥내 대조군 그룹이 말초 기관들에서 기대되는 조직학적 변화들에 양성 대조군으로서 첨가되었다. 동물들은 rhASA 의 100, 300, 또는 520 mg/kg 뇌 무게 (각각 0.04, 0.12, 0.21 mg)을 수여받았다. 본 연구를 위해 선택된 뇌 무게로 정상화된 용량 수준들은 인간들에서 사용을 위해 계획되거나 독성학 연구들 및 이전의 리소좀 축적병들의 효능 모델들에서 사용되어 왔던 용량들에 해당한다. 이들은 독성을 가질 것으로 기대되지 않았다.
처방
동물종 마우스 (Mus musculus)
품종 hASAC69S/ASA (-/-) 마우스 및 야생형 대조군들
연령 도착 시 대략 14 내지 17개월
그룹 수들 6
동물 수들 34마리 ASA 녹아웃 마우스 + 11마리 야생형 대조군들
각 동물은 도착에 이어서 건강 상태를 평가하도록 조사되었다.
사육
동물들은 고온 폴리카보네이트 필터-천장 (polycarbonate filter-top) 사육상자들에서 케어프레쉬 종이 베딩 (CareFresh paper bedding) 및 물병들을 가지고 집단으로 사육되었다. 각 상자는 프로젝트, 그룹 및 동물 번호들, 및 성별을 표시하는 상자 카드로 명확하게 라벨되었다. 각 동물은 귀 천자 시스템을 사용하여 독특하게 확인되었다
동물실 환경 및 광주기를 위한 목표 조건들은 다음과 같았다:
온도 22℃± 3℃
습도 50% ± 20%
광주기 12　시간씩 명암
모든 사용가능한 야생형 동물들 (11마리)는 그룹 A로 배정되었고 35 내지 45번으로 번호가 매겨졌다. ASA (-/-) hASA (+/-) 동물들은 순응 기간 동안 그들의 상자들부터 분리되었고 무게를 달고, 귀 천자되면서 연속적 번호들 (1 내지 34번)을 배정받았다. 다음으로 동물들은 리서치 랜더마이저 (Research Randomizer, www.randomizer.org)를 사용하여 2011년 1월 3일에 치료 그룹들로 배정되었다. 첫 번째 9마리의 번호들이 그룹 B에, 다음 5마리의 번호들이 그룹 C에, 다음 5마리의 번호들이 그룹 D에, 다음 5마리의 번호들이 그룹 E에, 최종 10마리의 번호들이 그룹 F에 배정되었다.
동물들은 다음과 같이 배정되었다. 하기 표 38은 동물 배정을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00074
테스트 항목및 운반체
테스트 항목
특성 rhASA
명세 인간 재조합 아릴설파타제 A (ARSA)
보관 조건 대략 4℃
운반체
특성 rhASA 운반체 (154 mM NaCl, 0.005% 폴리솔베이트 20, pH ~6.0)
보관 조건 대략 4℃
운반체의 제조
운반체는 제공된 바와 같이 사용되었다. 운반체는 (상온) 벤치 탑에서 데워졌다. 일단 운반체가 데워지면, 재료가 가만히 회전 및 역전시키면서 혼합되었다. 병들은 볼텍스 또는 진탕되지 않았다. 병들은 재료를 첨가하기 이전에 건조되었다. 남아있는 운반체는 냉장고로 돌려보냈다 (1℃-8℃).
용량 제형물 제조
rhASA는 필요한 농도들을 달성하도록 운반체로 희석되었다. 테스트 항목은 (상온) 벤치 탑에서 데워졌다. 일단 테스트 항목이 데워지면, 재료가 가만히 회전 및 역전시키면서 혼합되었다. 병들은 볼텍스 또는 진탕되지 않았다.
주사들을 추적하는 염색약들:
적외선 염색약 (IRDye®, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE와 같음)이 주사들을 추적하는 데 사용되었다. 이것과 같은 염색약들이 경막내 투여 이후 생존 절차로서 경막내 주사들에 사용되었다. 염색약은 투여 이전 테스트 항목과 혼합되었고; 1 uL로 1 nmole의 염색약이 테스트 항목에 첨가되었다. 적외선 염색약에 추가하여, 1 uL의 FD&C blue #1 (0.25%)가 주사들을 추적하는 데 사용되었다. 본 청색 염색약은 공통적인 식품 첨가물이고 일반적으로 안전하고 비독성으로 고려된다.
rhASA 또는 운반체의 요천골 IT 주사
그룹들 B, D, E, 및 F의 동물들은 1, 9, 15 또는 16, 및 22일에 경막내 주사들을 맞았다.
어른 마우스는 200-300 uL/ 10 그램 체중 (250-350 mg/kg)으로 1.25% 2,2,2 트리브로모에탄올 (Avertin)을 사용한 복강내 주사에 의해 마취되었다. 등의 털은 꼬리 기저부 및 어깨 사이가 제거되었고 면도된 영역은 포비딘/베타딘 스크럽으로 소독되었고 이소프로필 알코올이 이어졌다. 작은 중앙선 피부 절개 (1 내지 2 cm)가 허리엉치 척수 위로 만들어졌고 등 중앙선 및 회장 (단일 회장) 날개들의 머리 면의 교차가 확인되었다. 장골와 (gluteus medius)에서의 근육은 심장 모양의 근육이고 "심장"의 첨단의 두 면들은 대략 회장의 날개들의 위치에 온다. 기체가 채워진 10-20 uL 유리 해밀턴 주사기에 부착된 32게이지 바늘은 내재하는 뼈로부터 저항이 느껴질 때까지 삽입되었다. 테스트 항목의 10 uL 주사가 2 uL/20초 (10 uL/2분)의 대략적인 속도로 수행되었다. 피부 절개는 적절한 상처 클립을 사용하여 닫혔다. 주상의 성공은 가시적인 청색 염색약뿐만 아니라 적외선 염색약이 CNS 전체를 통하여 분포하는지 여부를 결정하는 영상화에 의해 판단되었다. 영상화 이후에, 동물들은 회복실에서 회복하도록 허용되었다.
rhASA의 정맥내 주사
그룹 C의 동물들은 1, 9, 15, 및 22일에 정맥내 주사를 맞았다.
IV 주사를 위해, 동물들은 필요한 경우 이소플루란 (isoflurane)을 사용하여 마취되었고, 현상억제제 (restrainer)에 나두었다. 꼬리 정맥은 손가락으로 꼬리를 가만히 때려서 보온하는 것에 의해 확장되었다. 다음으로 주사 부위는 70% 에탄올로 소독하였다. 임의적으로, 동물은 항온실 (40℃)에 1-1.5분 동안 두었다. 28- 내지 30-게이지 바늘이 테스트 물질을 주사하는 데 사용되었다. 주사의 부피는 5-10 mL/kg이었다.
4번째 용량 이후 대략 24시간째, 그룹들 B-F의 동물들은 안락사되었다. 동물들은 하기에 상술된 바와 같이, 서로 다른 조직 수집 절차들로 처리되도록 하였다. 그룹 A의 동물들은 처리되지 않았지만; 2001년 1월 28일 또는 28일에 안락사되었고 조직 수집 절차들로 처리되었다.
혈청 (모든 동물들)
최종 혈액 시료 (대략0.5 mL)가 후방안와 천자를 통해 이소플루란 마취 하에서 모든 동물들 (그룹들 A-F)로부터 수집되었다. 유리 튜브는 안와에 두었고, 눈 뒤의 영역을 가만히 침투하여 눈 뒤에 위치한 정맥 유출을 파괴하였다. 혈액은 모세관 작용 및/또는 중력 유동에 의해 채취되었다. 혈액 채취에 이어서, 출혈을 정지하도록 안와에 압력이 적용되었다.
전혈 시료들은 혈청으로 분리되었고 <-80℃로 냉동되었다. 혈청은 -80℃에 보관되었고 항체들을 위해 분석되었다.
광학현미경 연구들을 위한 조직들 (그룹들 A 내지 F; 그룹당 5마리의 마우스)
혈액 채취 이후에, 동물들은 CO2 질식에 의해 안락사되었다. 자른 꼬리가 관류 이전에 수집되었고 가능한 유전형분석을 위해 냉동되었다. 심장주변 공동이 노출되었다. 그룹 당 세 마리 (3) 마우스가 얼음으로 식힌 헤파린화 식염수액 (무균-여과된 0.9% NaCl에 넣은 1 U/mL 소듐 헤파린)로 다음으로 대략 4℃에서 4% 파라포름알데하이드로 경심장 관류되었다. 뇌가 제거되었고, 복부는 내장 기관들이 좀 더 노출되도록 절개되었다. 뇌 및 시체는 얼려진 자른 꼬리를 제외하고는 파라포름알데하이드에 두었다.
지질 분석을 위한 조직들 (그룹들 A, B, 및 F; 각각 6, 4, 및 5 마리의 동물들)
혈액 채취 이후에, 동물들은 CO2 질식에 의해 안락사되었다. 자른 꼬리가 관류 이전에 수집되었고 가능한 유전형분석을 위해 냉동되었다. 심장주변 공동이 노출되었다. 지질 분석들을 위해, 4-6마리의 마우스가 얼음으로 식힌 헤파린화 식염수액 (무균-여과된0.9% NaCl에 넣은 1 U/mL 소듐 헤파린)로 경심장 관류되었다. 하기 표 39는 지질 분석을 위해 수집된 조직들을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00075
채취 시, 조직들은 무게를 달았고 다음으로 드라이아이스 상에 또는 -80℃ 냉동고에 두어서 냉동되었다. 뇌는 좌우 반구들로 분리되었다. 우반구는 Ms에 의한 지질 분석에 사용될 것이다. 좌반구는 가능한 N-아세틸-L-아스파테이트 (NAA) 분석으로 분석될 것이다. 조직들은 분석 시까지 -80℃에서 보관되었다. 하기 표 40은 시료 보관 조건들을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00076
rhASA는 MLD 마우스의 척수에서, 상세하게는 백색질에서 설파타이드 축적을 감소시켰다, 도 114. 척수의 형태측정 분석 (morphometry)는 알시안 블루 염색의 광학 밀도가 rhASA 투여 이후 통계적으로 유의하게 감소되는 것을 보여주었다, 도 115. rhASA 처리된 MLD 마우스도 역시 뇌에서 감소된 리소좀 활성을 나타냈다, 도 116. 본 감소는 운반체 처리된 동물들과 비교하여 고용량 그룹 (0.21 mg- 520 mg/kg 뇌 무게)에서 통계적으로 유의하였다, 도 117.
1년령의 면역내성 (Immunotolerant) MLD 마우스 (hASAC69S/ASA(-/-)) 가 매주 한 번 4주 동안 (전부 4번 용량들) rhASA 의 경막-요추 투여를 받았다. 용량은 운반체 (154 mM NaCl, 0.005% 폴리솔베이트 20, pH ~6.0)이었다. 최종 시간대, 효능은 뇌 및 척수 내에서 설파타이드 청소 (clearance) 및 리소좀 활성의 면역조직화학 접근에 의해 평가되었다. 척수 및 뇌 절편들은 조직들에서 설파타이드들을 표적하는 알시안 블루 염색을 사용하여 염색되었다. 뇌 절편들은 리소좀 프로세싱의 표시인자인 리소좀-연관 막 단백질 (LAMP)의 존재를 위해서도 역시 염색되었다. 추가적으로, 형태측정 분석이 알시안 블루 및 LAMP 염색된 척수 (경부, 흉부 및 요부) 및 뇌의 절편들 상에서 수행되었다.
이들 예비적 결과들은 rhASA 의 경막내 요추 투여의 효능을 보여주고 있다. 운반체 대조군 마우스와 대비하여, rhASA 처리된 MLD 마우스는 뇌에서 감소된 설파타이드 축적 (알시안 블루 염색에 의해 주목됨) 및 리소좀 활성과 같은 질환의 조직학적 마커들 내에서 향상의 증거를 나타내고 있다. 이들 조직병리적 변화들은 투여 부위(척수의 요추 부위) 근처, 말단 척수, 뿐만 아니라 뇌의 원위 부분들에서 관찰되었다.
실시예 8. 생체분배 2
개관
*본 연구에서, 36마리 수컷 및 36마리 암컷 청년 사이노몰 원숭이들 (개시 시 <　12개월)이 각 5가지 용량 그룹들에 배정되었고 rhASA를 용량들 0 (장치 대조군; 동물들은 0.6　mL의 PBS가 투여됨), 0 (운반체 대조군), 1.8, 6.0, 또는 18.6　mg (각각 그룹들 1, 2, 3, 4, 및 5)으로 격주로 6개월 동안 전부 12번 수여받았다. 모든 용량은 0.6 mL 부피의 주입으로서 투여되었고, 대략 10분 동안 주어진0.5 mL의 PBS로 세척이 이어졌다 (표 41). 하기 표 41은 연구 설계를 나타낸다. 이 때 DC = 장치 대조군; 그룹 1 동물은 운반체 또는 테스트 항목이 투여되지 않았다. a운반체 대조군 동물 번호 044는 누출 카테터로 인해 50일에 일찍 희생되었다.
Figure 112021011816093-pat00077
재료 및 방법들
조직 채취
뇌들은 대략 3mm 관상 슬라이스 두께로 뇌 매트릭스에서 절단되었다. 각 뇌는 신생피질 (neocortex) (전두, 몸통, 일시적 및 후두 피질을 포함), 고피질 (paleocortex) (후각 망울들 및/또는 이상엽 (piriform lobe)), 기저 신경절 (미상엽 및 조가비핵 포함), 번연계 (limbic system) (해마 및 대상회 (cingulate gyri)를 포함), 시상/해마 및 중간회 (흑색질 (substantia nigra)을 포함), 소뇌, 교뇌 (pons) 및 연수 (medulla oblongata):를 포함하는 관상 조각들로 절편화되었다. 개별적 조직 시료들이 획득되는 (4-mm 생검 천자에 의함) 위치들은 도 133-138에 나타난 바와 같다. 도 133-138의 그립들은 위스콘신 대학 및 미시건주 비교 포유동물 뇌 수집기관 (또한 국립 보건원 박물관)으로부터 나온다. 천자 번호 22는 본 구조가 부검 동안 존재하지 않아서 채취되지 못하였다. 모든 뇌 시료들은 냉동되었고 효소-결합 면역흡착 검정법을 사용하는 rhASA 분석 이전에 -60℃미만에서 보관되었다.
첫 번째 조각 및 이후 두 번째 조각은 조직병리학적 평가 및 면역조직화학 분석을 위해 포르말린에 고정되었다. 두 번째 뇌 조각 및 이후 두 번째 조각은 테스트 항목 농도 분석을 위해 냉동되었다. 냉동 이전에, 뇌 시료들은 생체분배 분석을 위해 짝수의 테스트 항목 분석 뇌 조각들의 오른쪽 부분으로부터 가져왔다. 뇌 시료들의 위치는 부검시 사진을 찍었고 뇌 조각 번호는 기록되었다. 시료들은 수집된 백색질의 양을 최적화하도록 4mm 원형 천자 또는 스카펠을 사용한 절단 둘 중 하나로 획득되었다. 모든 천자물들은 냉동되었고 -60℃ 미만에서 테스트 항목 분석을 위해 보관되었다. 뇌 조각들의 나머지는 냉동되었고 -60℃ 미만에서 가능한 테스트 항목 분석을 위해 보관되었다.
척수 (경부, 흉부 및 요부)는 1센티미터 단편들로 절단되었다. 첫 번째 조각 및 이후 두 번째 조각은 조직병리학적 평가 및 면역조직화학 분석을 위해 포르말린에 고정되었다. 두 번째 척수 조각 및 이후 두 번째 조각은 테스트 항목 농도 분석을 위해 냉동되었고, -60℃ 이하에서 테스트 항목 분석을 위해 보관된다. 조각들의 분포는 경막내 카테터의 팁으로 얻은 조각 (조각 0)이 포르말린에 고정되고 조직병리학으로 분석되도록 조정되었다.
뇌, 간, 및 척수 추출물들의 준비 또한 rhASA 농도의 결정
뇌 천자물들, 척수, 및 간 시료들은 미국 식품 및 의약품 관리부 (FDA) 바람직한 연구실 시행 (GLP) 규칙들 21 CFR, 파트 58 및을 사용하고 또한 적용가능한 중서부 생물연구 표준 작동 절차들로 분석되었다. 조직 시료들은 용해 완충액에서 균질화 되었고, 조직 잔여물라면 모두를 제거하도록 원심분리되었으며 검정될 때까지 -80℃에 보관되었다. 균질물들의 용해성 분획들에서 rhASA 농도는 포획 항체로서 폴리클론 토끼 항체 SH040 및 검출 항체로서 HRP (호스래디쉬 퍼옥시다제)-결합된 항-ASA 모노클론 항체 19-16-3 를 사용하는 ELISA에 의해 결정되었다. 미결합된 물질을 제거하는 세척 단계 이후에, 테트라메틸벤지딘 (TMB) 기질 용액은 초기 단계에서 항ASA 항체에 결합된 rhASA 양에 비례적인 비색 신호를 생산하도록 HRP-결합 항체의 존재 하에 퍼옥시다제와 반응시켰다. 각 조직 균질물에서 그 결과 얻은 rhASA양은 표준 곡선으로부터 외삽되었다.
또한 시료들은 비신코닌산 (BCA) 단백질 결정 검정법에 의해 시료에서의 단백질 농도를 획득하도록 분석되었다. 각 시료의 단백질 농도는 알부민 표준 곡선의 간입에 의해 결정되었다. 다음으로 rhASA 농도 결과들은 비신코닌산 검정법 (bicinchoninic acid assay)에 의해 결정된 바와 같이 조직 추출물에서 전체 단백질로 정상화되었다.
운반체, 1.8 mg/용량, 6.0 mg/용량, 및 18.6 mg/용량 그룹들에 대한 모든 천자물들의 rhASA 수준들은 도 118, 도 119, 도 120, 및 도 121에 각각 나타나있다. 장치 대조군, 운반체, 1.8 mg/용량,, 6.0 mg/용량, 및 18.6 mg/용량 그룹들에 대한 회복 동물들의 모든 천자물들의 rhASA 수준들은 도 122, 도 123, 도 124, 도 125, 및 도 126에 각각 나타나 있다.
뇌의 표면 (뇌척수막) 근처에서 가져온 선택된 천자물의 rhASA 수준들은 도 127에 나타나 있다. 깊은 뇌 백색질을 대부분 포함하는 것으로 고려되는 선택된 천자물의 rhASA 수준들은 도 128에 나타나있다. 백색질은 미엘린화된 신경세포 공정들 (또는 축삭들)의 묶음으로 구성된다. 깊은 뇌 회색질로부터 나온 물질을 대부분 포함하는 선택된 천자물들은 도 129에 나타나있다. 회색질은 백색질과는 대조적으로 신경세포체들을 포함한다. 표면, 깊은 백색 및 깊은 회색질로부터 나온 선택된 천자물에서 rhASA 수치들은 각 용량 그룹의 경우 도 130에 나타나 있다.
척수 농도 데이타는 도 131에 나타나 있다.
간 농도 데이타는 도 132에 나타나 있다.
*
*장치 및 운반체-투여된 대조군 그룹들의 간, 척수, 및 뇌에서의 rhASA 농도 수준들은 일정 경우들에서 측정가능하였다. 간 및 척수에서 수준들은 rhASA-처리된 그룹들보다 더 낮았다. 장치 대조군 및 운반체-투여된 동물들에서 측정되는 rhASA 수준은 자연 그대로의 사이노몰 원숭이 단백질과 ELISA에 사용되는 항-rhASA 항체 간 교차-반응성을 보여준다. 장치 대조군 및 운반체 조직들에서의 보고된 수치들은 항체 및 사이노몰구스 ASA간 교차 반응성의 정도가 미지이고 검정 표준들은 rhASA를 사용하는 사실 때문에, 조직들에서 사이노몰 원숭이rhASA에 대한 정량적 수치들을 보여주지 않고 있다. 그러나, 장치 대조군 및 운반체-투여된 조직들 사이에 검출되는 rhASA 수준들에서 다양성은 서로 다른 조직들 및 해부적 부위들에서 사이노몰구스 rhASA의 상대적 양들에서 나타나는 다양성으로서 해석될 수 있다.
척수 조각들에서의 rhASA 수준들은 1.8, 6.0, 및 18.6 mg/용량 그룹들의 경우 각각 수컷들에서 160-2352, 1081-6607, 및 1893-9252 ng/mg단백질 또한 암컷들에서 0-3151, 669-6637, 및 1404-16424 ng/mg 단백질의 범위이었다 (도 127). rhASA 수준들은 척수의 경추 부위보다는 요추 부위에서 더 높았다. 간에서 검출되는 rhASA 단백질의 수준들은 rhASA 처리된 그룹들에서 용량 반응성이었고 운반체 그룹에서는 매우 낮았다. 평균 rhASA 수준들은 1.8, 6.0, 및 18.6 mg/용량 그룹들의 경우 각각 수컷들에서 88, 674, 및 2424 또한 암컷에서 140, 462, 및 1996 ng/mg 단백질이었다 (도 128).
전반적으로, rASA 수준은 척수 조각들로부터 제조된 시료들 및 rhASA-투여된 그룹들의 간에서 용량-관련되는 것으로 보였다. 많은 테스트된 뇌 부위들은 rhASA 수준들 및 rhASA 투여 간에 분명한 용량 관련성을 보여주었던 한편 다른 것들은 더 애매하였다. 일반적으로, 뇌에서 rhASA 수준들은 rhASA 용량과 함께 증가하였다.
실시예 19. IT 대비 IV 투여된 rhASA의 약물역학 (PK) 및 생체분배
본 연구의 목적은 사이노몰 원숭이들에게 경막내 (IT) 및 정맥내 (IV) 투여 이후에 다양한 치료적 대체 효소들의 약물역학 (PK) 및 생체분배을 평가하는 것이다. 본 연구에서, 경막내-요추 (IT-L) 카테터들을 가지는 12마리의 수컷 및 12마리의 암컷 사이노몰 원숭이들이 체중에 의해 제 1a상 (I2S 투여) 및 제 1b상 (rhASA 투여)를 위해 네 가지의 치료 그룹들로 무작위 배정되었다.
혈액 및 CSF (IT-CM 카테터로부터 나옴)는 둘 다의 단계들 위한 투여 이후 특정된 간격들에서 채취되었다. 마지막 시료들이 제 1a상로부터 채취된 이후, 동물들은 제 1b상의 개시 이전 7일의 세척 기간이 허용되었다.
마지막 시료들이 제 1b상로부터 채취된 이후, 동물들은 제 2상의 개시 이전 7일의 세척 기간이 허용될 것이다. 제 1b상으로부터 나온 전부 12마리 수컷 및 암컷 사이노몰 원숭이들은 I2S (그룹들1a-6a) 및 rhASA (그룹들 1b-6b)의 12마리 치료 그룹들로 체중에 의해 무작위 배정되었다.
IT-L 투여에 이어서, 혈청에서 rhASA의 절대 생물유용성은 ~30 내지 40%이다. 대조적으로, CSF에서는 IV 투여의 0.5%만이 생물유용하다.
IT-L 투여에 이어서, 혈청에서 rhASA에 대한 노출은 비례적 방식 이상으로 증가한다.
IT-L 투여에 이어서, CSF에서 rhASA에 대한 노출은 투여가 증가하면서 비례적 방식 이하로 증가한다. 하기 표 42는 사이노몰 원숭이들의 혈청에서 rhASA의 PK 변수들 요약을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00078
하기 표 43은 사이노몰 원숭이들의 CSF에서 rhASA의 PK 변수들 요약을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00079
하기 표 44는 혈청 및 CSF에서 rhASA의 생물유용성을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00080
IT-L 투여에 이어서, 혈청에서 rhASA의 절대 생물유용성은 ~30 내지 40%이다. 대조적으로, CSF에서는 IV경로에 의해 투여된 용량의 0.5%만이 생물유용하다. 하기 표 45는 CSF:혈청 구분을 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00081
실시예 20. MLD 환자들의 치료
예로, IT 전달을 통한 직접 CNS 투여는 MLD 환자들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예는 만기 소아 MLD를 가진 환자들에게 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 통해 투여된 rhASA의 전부 40주 동안 격주로 (EOW) 3번 용량 수준들까지의 안전성을 평가하도록 설계된 다중심 용량 점증 연구를 설명하고 있다. 인간 치료에 적합한 다양한 대표적인 경막내 약물 전달 장치들이 도 94, 도 95, 도 96 및 도 97에 나타나있다.
20명까지의 환자들이 참가할 것이다:
집단 1: 5명 환자들 (최저 용량)
집단 2: 5 명 환자들 (중간 용량)
집단 3: 5 명 환자들 (최고 용량)
5명 환자들이 무작위로 미치료될 것이다.
환자들은 다음의 판단기준의 포함을 기초로 하여 연구를 위해 선택된다: (1) 연령 30개월 이전에 첫 번째 증상들의 출현; (2) 검색 시 보행가능 (혼자 서고 한 손을 잡고 10걸음 앞으로 걷는 능력으로서 정의됨); (3) 검색 시 신경학적 징후들의 존재. 전형적으로, 조혈줄기세포 이식의 환자 이력은 배제된다.
만기 소아 MLD를 가진 어린이에서 40주 동안 IT 주사에 의해 투여된 rhASA의 상승 용량들의 안전성이 결정된다. 추가적으로, 총 운동 기능 및 혈청에서 단일, 반복-용량 약물역학에 미치는 rhASA의 임상적 활성 또한 뇌척수액 (CSF)에서 농도들이 평가된다.
HNS의 IT 전달의 실시예들
*실시예 21. 헤파란 N-설파타제의 만성 경막내 투여
본 실시예는 경막내 투여가 점액다당류증 IIIA (MPS IIIA; 산필리포 증후군 A형)의 신경적 증상들, 본 장애의 명확한 임상적 특징의 치료를 위해 재조합 인간 헤파란 N-설파타제 (rhHNS)와 같은 리소좀 효소를 뇌 조직들 내로 효과적으로 전달하는 데 사용될 수 있는 점을 보여준다. 본 실시예에서 기술된 실험들은 rhHNS 의 만성적 IT 투여는 뇌, 척수 및 간에서 검출되는 용량-관련 효소 활성과 잘 내성화되었던 점을 보여주고 있다.
요약하면, 재조합 인간 헤파란 N-설파타제 (rhHNS)의 경막내 제형물이 점액다당류증 IIIA (MPS IIIA; 산필리포 증후군 A형)의 신경적 증상들, 본 장애의 명확한 임상적 특징의 치료를 위해 개발되었다. MPS IIIA 환자들의 평균 연령은 4.5세이기 때문에, HNS의 중추적인 독성학 연구들은 발달하는 뇌에 미치는 효과를 평가하도록 어린 사이노몰 원숭이들에서 시행되었다. 원숭이들은 경막내 (IT)-요추 약물 전달 장치로 이식 수술되었고 또한 장치 및 포스페이트-완충 식염수 또는 운반체를 수여받는 운반체 대조군들과 함께 격주로 단기간 (short-term) 주입 (6개월 동안 1.5, 4.5, 또는 8.3 mg/용량 HNS; 12번 용량들)에 의해 투여되었다. 그룹 당 8마리의 동물들 (4마리/성별)이 3 및 6개월 시 부검되었고 (장치-대조군 그룹은 3개월에 부검됨), 운반체 그룹 및 3가지 HNS 투여 그룹들로부터 나온 8마리 동물들이 최종 IT 투여 이후 1개월에 부검되었다. HNS-관련 임상적 징후들 또는 총 중추신경계 병변들은 전혀 관찰되지 않았다. 대조군들과 대비하여, 뇌/척수를 감싸는 뇌척수막/신경외막에서는 약간 내지 최소의 평균 중증도의 세포성 침윤물들이 있었고, 뇌척수액 (CSF) 백혈구들, 우세하게는 호산구들의 일시적 증가들과 상호관련되며, 이는 최종-투여 이후 1개월에 많이 해결되었다. 이들 변화들은 뇌 또는 척수에서 해로운 형태적 변화들과 연관이 없었다. 뇌, 척수 및 간에 있는 조직 HNS 활성 수준들에서는 더 높은 평균 CSF HNS 수준들로 향하는 용량 관련 경향이 있는 것으로 보인다. 역효과 무관찰 수준은 격주로 주어진 최고의 투여량인 8.3 mg/용량이었고, HNS가 8.3 mg/용량 이상의 농도들을 포함하여 다양한 농도에서 안전하게 경막내 투여될 수 있는 점을 가르킨다.
산필립포 증후군A형
점액다당류증 제 IIIA형 (MPS IIIA; 산필립포 증후군A형)은 전세계적으로 대략 10만명 당 1명이 걸린 희귀한 리소좀 축적병이고, 글리코사미노글리칸 (GAG) 의 리소좀 이화작용에 관여하는 엑소설파타제인 헤파란 N-설파타제 (HNS) 의 부재 또는 결함성 기능으로부터 유발된다 (Neufeld EF, et al. The Metabolic 및 Molecular Bases of Inherited Disease (2001) pp. 3421-3452). 본 효소의 부재 시, GAG 헤파란 설페이트가 뇌의 오부에는 더 적게 축적되면서 뉴런들 및 교아세포들의 리소좀들에 축적된다. 본 장애의 정의되는 임상적 특징은 중추신경계 (CNS) 퇴화이고, 이는 주요한 발달 지표들의 소실, 또는 이를 획득 부전이 유발된다. 진행성 인지 감소는 치매 및 조기 사망을 유발한다.
rhHNS의 IT 전달
MPS IIIA 환자들의 평균 연령은 4.5세이기 때문에, HNS의 중추적인 독성학 연구들은 발달하는 뇌에 미치는 효과를 평가하도록 어린 사이노몰 원숭이들 (인간들과 유전적 및 해부적 유사성을 기초로 한 종 선택)에서 시행되었다. 문헌에서 인용된 바와 같이 인간들과 원숭이들의 연령 동등성은 30 내지 40개월 된 어린이의 경우 7.6개월로부터 12.1개월의 (Hood RD, Developmental 및 Reproductive Toxicology: A practical approach (2006) p. 276). 본 노력의 일환으로서, 6개월 독성학 연구가 HNS 의 IT 요추 투여를 평가하도록 어린 사이노몰 원숭이들에서 시행되었다. 1개월 이전의 어린 사이노몰 원숭이 독성학 연구로부터 획득된 데이타는 용량 수준 선택 및 6개월 반복-용량 어린 원숭이 연구의 설계를 안내하였다. 우리의 지식으로, 이것은 어린 비인간 영장류들에서 ERT의 만성적 IT 투여를 다루는 첫 번째 연구이다.
대략 6 내지 9개월령이고 무게가 0.82 내지 1.81 kg 이 되는 56마리의 수컷 및 56마리 암컷의 어린 사이노몰 원숭이들이 본 연구에 사용되었다. 원숭이들은 PMI-인증된 영장류식 5048 (Richmond, IN)의 15개 비스켓을 매일 먹였다. 물은 여과된 자동 물 시스템을 통해 자유롭게 제공되었고 뇨 채취 기간들 동안은 유보되었다. 원숭이들은 도착 시 2 내지 4주 동안 스테인레스강 상자들에서 3개월 원숭이들을 제외하고는 집단으로 사육되었다 (상자 당 두 마리). 연구 기간 동안, 모든 원숭이들은 조절된 온도 및 습도를 가진 방들에 있는 개별적 스테인레스강 상자들 안에 12시간씩 명암 주기로 사육되었다.
연구 개시 이전에, 모든 원숭이들은 SC 포트들 및 IT 카테터들이 외과적으로 이식되었다. 수술 전에 프레드니졸론 소듐 숙시네이트 (IV, 30 mg/kg) 및 플루니진 메글루민 (flunixin meglumine) (근육내 [IM], 2 mg/kg)이 투여되었다. 원숭이들은 C 아트로핀 설페이트 (0.04 mg/kg)로 전처리되어 IM 케타민 HCl (8 mg/kg)으로 진정되었고, 후두에 관을 넣어 대략 1 L/분의 산소 및 2.0% 이소플루란 상에서 유지되었다. 요추의 등 공정 위로 절개가 만들어졌고 (L4, L5, 또는 L6), 또한 L3, L4, 또는 L5에 가는 폴리우레탄 카테터 (0.33 mm 직경의 6개 측공들을 가진 길이 25 cm, 0.9 mm 외부 직경 x 0.5 mm 내부 직경)의 삽입을 위해, 반층상해부법 (hemilaminectomy)이 시행되었다. 카테터는 작은 경뇌막 절개를 통해 삽입되었고 대략 10 cm 앞의 흉요추 연결 영역으로 진행되었다. 티타늄 SC 포트는 IT 카테터에 부착되었고 SC 조직에 이식되었다. 적절한 카테터 설치는 Isovue-300 (0.8 ml; Bracco Diagnostics, Inc., Princeton, NJ)를 사용하는 미엘로그램에 의해 검증되었다. 수술로부터 회복한 이후에, 원숭이들은 부토파놀 타르트레이트 (butorphanol tartrate, IM, 0.05 mg/kg) 및 세프티오퍼 소듐 (ceftiofur sodium, IM, 5.0 mg/kg 2일 동안 매일 두 번)를 수여받았다.
본 실시예에서, HNS는 5 mM 소듐 포스페이트, 145 mM 염화나트륨, 및 0.005% 폴리솔베이트 20 (pH 7.0)을 포함하는 IT 제형물 운반체로 제공되었다. HNS의 EOW 용량들이 대략 11분 동안 단기 주입으로서 투여되었고: 0.6 mL (4 분) 0.5 mL 포스페이트-완충 식염수 (PBS) (7분)이 이어졌다. 운반체-대조군 그룹의 원숭이들은 IT 제형물만 단독으로 수여받았고; DC 원숭이들은 PBS (pH 7.2) IT를 수여받았다.
유병율 및 치사율
HNS-관련 사망들 및 조기 희생은 전혀 없었다. 투여 시 또는 매일 관찰들 동안 주목되는 HNS-관련 임상적 징후들은 전혀 없었다. 투여 기간 동안 및 이후에 관찰되는 잘못 두기 (misplacement), 가려움 (pruritis), 흔들기 (tremors), 및 실조 (ataxia)는 투여의 수 분 내지 대략 4시간 이내에 해결되었고, HNS 또는 운반체라기 보다는 부피-관련 반응인 것으로 고려되었다. 투여 동안 및 직후에 관찰되는 임상적 징후들은 대조군에서 비교가능한 빈도로 관찰되었고 (DC 및/또는 운반체-투여 그룹); 용량 반응의 증거는 전혀 없었다. 일반적으로, 투여시 임상적 징후들의 빈도는 각 연속 용량과 함께 감소되었다. 체중, 음식 소비, 또한 신체적 및 신경적 발견들, 또는 ECG에서의 변경들 또는 안과적 검사들에서 HNS-관련 변화들은 전혀 없었다.
임상병리학
혈액, 혈청 화학, 응고, 또는 뇨분석 변수들에서 간격이라면 모두에 HNS와 관련되는 것으로 고려되는 변화들은 전혀 없었다.
CSF 세포 계수 및 화학
DC 및 0 mg/용량 그룹들, 투여 이후 24시간을 포함한 모든 그룹들에서 평균 CSF 백혈수 계수들에서 용량-관련 증가들이 있었다. 투여된 각 용량으로 백혈구 계수에서 일반적인 증가가 있었다. 투여 이전에 원숭이들의 대략 절반으로부터 CSF 채취는 이들 효과들이 이전의 용량 이래 2주에 감소된 것을 보여주었다. 5번 용량 이후, 백혈구들에서 증가에 추가하여, 더 높은 그룹 평균 CSF 전체 단백질 및 알부민이 투여 이전 평균과 비교하여 HNS-투여된 수컷들의 경우에 4.5 및 8.3 mg/용량 그룹들 (4 내지 5배까지)로 관찰되었고(P =0.05 대비 DC 및 0 mg/용량 그룹); 암컷 HNS-투여 그룹들에서는 덜한 경향성이 분명하였다,
HNS 농도들 및 항체 분석
전형적으로, 혈청에서 평균 HNS 수준들은 모든 테스트 그룹들의 경우 모든 시간대에 < 검출 한계 (LOD)이었다. DC- 및 운반체-투여 대조군 그룹에 있는 원숭이들로부터 나온 CSF의 HNS 농도는 일반적으로 정량 한계 (LOQ) 미만이었다. 통계적인 분석들이 수행되지는 않았더라도, 1.5, 4.5, 및 8.3 mg/용량 그룹에서 CSF의 더 높은 HNS 수준들을 향한 용량-관련 경향이 있는 것으로 보였다. 투여이전 CSF 평균 HNS 수준들은 투여이전 CSF 수준들보다 유의하게 더 낮았다. 연구 종결 시 (주요 및 회복 부검) 6개월 집단 (둘 다의 성별)의 평균 HNS 농도들은 표 46에 정리되어 있다. 주어진 용량 수준에서, CSF에서 HNS의 평균 농도들은 연구를 통하여 계속 올라갔던 혈청 및 CSF에서의 항-HNS 항체 수준들에도 불구하고 동일한 범위로 유지되는 것으로 보였다 (도 146A). 하기 표 46는 연구 종결 시CSF HNS 농도들 (주요 부검 및 회복 부검)을 나타낸다. 여기에서CSF, 뇌척수액; HNS, 인간 헤파란 N-설파타제; n = LOQ 초과 시료 수; IT, 경막내; SD, 표준 편차. a = 투여 후 24시간에 채취된 시료들. NA = 분석에 사용가능하지 않은 시료 또는 LOQ 미만의 시료들.
Figure 112021011816093-pat00082
6개월/회복 집단에서, 장치 대조군 그룹 (PBS만)의 원숭이들 또는 운반체 투여된 것들은 테스트된 시간대라면 모두에서 항-HNS 항체들을 혈청 또는 CSF에서 발생시켰다. 1.5, 4.5, 및 8.3 mg/용량 그룹들에서 모든 원숭이들은 연구 전 (CSF의 경우) 및 투여 이전 2번에서 채취된 혈청 및 CSF 시료들에서 항-HNS 항체들에 대해 음성으로 테스트되었다 (<LOD). 본 연구의 말에, 모든 원숭이들은 혈청에서 항-HNS 항체들에 대해 양성으로 테스트되었다.
1.5 mg/용량 및 8.3 mg/용량 그룹들에서 모든 원숭이들 또한 4.5 mg/용량 그룹에서 8마리 원숭이들 중 6마리가 하나 이상의 시간대에서 항-HNS 항체들에 대해 CSF에서 양성으로 테스트되었다. 4.5 mg 그룹에서 두 마리 원숭이들은 부검을 포함하는 시간대라면 모두에서 채취된 시료를 가지지 않기 때문에, 이들 결과들은 HNS로 투여된 모든 원숭이들은 항체 반응을 생성하는 점을 가리키도록 보일 것이다.
모두 세 가지의 용량 수준들에서, 혈청에서 항-HNS 항체 농도들은 용량 2번 이후에 검출되었고 수준들은 용량 4번 이후에 현저하게 증가되었다. 통계적인 분석들이 수행되지 않았더라도, 더 높은 혈청 항체 농도로 향한 용량-관련 경향이 있는 것으로 보였고; 연구의 말에, 수준들은 3가지 HNS 용량 그룹들을 거쳐서 비교가능하였다 (도 146B). 혈청에서 항-HNS 항체 수준들은 본 연구의 과정 동안 CSF에서보다 항상 더 높았고 (9로부터 236배까지 혈청/CSF 항체 농도들); 혈청/CSF 농도들의 최고 비율들 (98 및 236배)는 8.3 mg 용량 수준에서 투여 초기 과정 (6 및 10주)에서 관찰되었다.
혈청에서 항-HNS 항체 농도들은 초기 투여 시간에서 (6주부터 14주까지) 1.5 mg, 4.5 mg, 및 8.3 mg/용량 수준들에서 각각 9-, 16-, 및 16배로 증가되었다. 동일한 기간 동안, CSF 항체 농도들은 1.5 mg, 4.5 mg, 및 8.3 mg/용량 수준들에서 30-, 41-, 및 52-배로 각각 증가되었고 (도 146B); 실질적인 수준들은 1개월 무투여 회복 단계 이후에 그대로 남아있었다. 하기 표 47은 연구 종결 시 CSF 항-HNS 항체 농도들을 나타낸다 (주요 및 회복 부검). 여기에서CSF, 뇌척수액; HNS, 인간 헤파란 N-설파타제; IT, 경막내; n, 정량 한계 초과 시료 수; SD, 표준 편차. a투여전 대략 1주에 채취된 조직들.
Figure 112021011816093-pat00083
항-HNS 항체들은 이후에 혈청보다는 CSF에서 출현하였다 (도 146C). 혈청 또는 CSF에서 항체 농도들의 분명한 용량-관련 차이들은 관찰되지 않았고 (통계적 분석은 작은 시료 크기들로 인해 시행되지 않음); 항체 반응들에서 수컷들 및 암컷들 간 관찰가능한 차이는 없었다.
CSF에서 항-HNS 항체의 존재 시, CSF에서 HNS의 평균 농도는 유지되는 것으로 보였고, 혈청 및 CSF에서 항-HNS 항체들의 존재는 IT-투여된 HNS의 농도 수준을 변경시키지 않는 점을 제시하였다. HNS의 6개월 반복-용량 투여의 6개월/회복 집단 분석들은 3개월 중간 및 6개월 계획집단 희생 원숭이들의 경우 항-HNS 항체 농도들이 비교가능한 점을 가르켰다 (도 146C).
전체 및 조직병리적 발견들
모든 용량 수준들에서 (희생 간격들, 성별-특이적 또는 용량-관련 방식으로는 아니더라도), 호산구성 침윤물들 (도 147A)이 뇌 (우세하게는 회색질), 척수 (회색 및 백색질), 등 척수 신경근들/신경절 및 삼차 신경절 (중간-용량 수컷들만)의 실질에 존재하였다 (도 147B-D). 침윤물들은 조직의 실질 내에서 뇌척수막/신경외막 침윤물들 및/또는 HNS의 존재 (이에 의한 침투)에 대해 이차적인 것으로 해석되었다. 수많은 염증 유형의 변화들이 존재하더라도, 원숭이들은 HNS의 투여를 내성화하는 것으로 보였고 침윤물들은 신경계 실질과 관련되거나 해로운 형태적 변화들을 초래하지 않는 것으로 고려되었다. 상세하게는, 신경 괴사/퇴화 및 HNS 투여와 관련된 교아 반응의 증거는 전혀 없었다.
뇌 및 척수의 회색질에서, 우세하게는 호산구성 세포성 침윤물들과 연관되는 미세신경교아증 (micogliosis)은 이전에 수행된 1개월 어린 원숭이 독성 연구에서 비교적 공통적이었고; 이들 변화들은 6개월 연구에서 3개월 중간 희생에 의해서는 비교적 공통적이지 않지만, 이러한 반응의 남아있는 증거는 여전히 6개월 집단에서 관찰될 수 있었다 (도 147F). 미세교아 반응들은 일정 (전형적으로 단백질-기초) 중추 투여된 (또는 중추-반응성) 테스트 항목에 대한 반응에서 비교적 초기 사건인 경향이 있다. 호산구 침윤물들은 세포들이 역반응을 나타내도록 충분한 수로 존재하지는 않더라도, HNS-투여된 원숭이들의 CSF에서 호산구들의 증가된 수와는 상호관련이 없었다.
모든 용량 수준들에서, 호산구성 침윤물들이 대부분 HNS-투여 그룹들의 경우 성별에 상관없이 등 척수 신경근들/신경절에서 관찰되었다. 다양한 신경계 조직들에서 침윤물들은 조직의 실질 내에서 뇌척수막/신경외막 침윤물들 및/또는 HNS의 존재 (이에 의한 침투)에 대해 이차적인 것으로 해석되었다. 회복 희생 원숭이들에서, HNS-관련 효과들은 일반적으로 없거나 대조군 수준들로 감소되었다. 척수에서 미세교아신경증과 같은 일정 변화들은 회복 기간 이후에 완벽하게 해결되었다. HNS-관련 변화들은 뇌 또는 척수에서 해로운 구조적 현미경적 변화들이라면 모두와 연관이 없는 것으로 보였다. 뇌, 척수 또는 신경절에서 주목되는 신경 괴사는 전혀 없었다.
HNS 효소 활성
6개월/회복 집단들에서, 운반체-투여된 그룹　(0.0-0.154 nmol/hr/mg단백질) 의 척수 및 뇌에서 HNS 효소 활성은 3개월 중간 집단으로부터 나온 조직들에서 나타나는 수준들과 유사하였다 (0.0-0.0.154 nmol/hr/mg 단백질). 척수에서 효소 활성 수준들은 뇌 또는 간에서 측정된 수준들, 4.5 mg 및 8.3 mg/유사한 수준들을 가지는 용량 그룹들보다 더 높았다 (대략 요추에서 더 높은 순위의 규모). 척수 조각들에서 HNS 효소 활성은 1.5, 4.5, 및 8.3 mg/용량 그룹들의 경우 각각 수컷들에서 3.9-18.6, 13.1-67.1, 및 3.6-69.2 nmol/hr/mg 단백질 (도 148A) 또한 암컷들에서 1.8-16.2, 4.5-61.2, 및 21.1-66.0 nmol/hr/mg 단백질 (도 148B)의 범위였다. 1개월 회복 기간 이후 척수 조직에서, 효소 활성 수준들은 운반체 대조군 수치들과 일치하는 수준들로 돌아갔다.
뇌 조각들에서 HNS 효소 활성은 1.5, 4.5, 및 8.3 mg/용량 그룹들의 경우 각각 수컷들에서 0.03-16.0, 0.30-55.7, 및 0.15-21.2 nmol/hr/mg 단백질 (도 148C), 또한 암컷들에서 0.04-5.1, 0.0-14.4 및 0.9-33.2 nmol/hr/mg 단백질 (도 148D)의 범위이었다. 회복 이후 뇌 조직에서, 효소 활성 수준들은 대조군 수치들과 일치하는 수준들로 돌아갔다.
뇌의 서로 다른 영역들의 경우 내인성 수준들 (DC 그룹)과 비교하여 활성에서의 배수 변화는 도 149A에 나타나 있다. 증가된 배분으로의 경향이 표면 시료들에서 주목되더라도, 요추-IT 투여된 HNS는 뇌의 뇌실주위 영역들로 침투하는 것으로 관찰될 수 있다.
6개월 집단/회복 집단들에서, 간에서의 평균 활성은 1.5, 4.5, 및 8.3 mg/용량 그룹들의 경우 각각 수컷들에서 0.50, 2.41, 및 6.65 nmol/hr/mg 단백질 또한 암컷들에서 1.04, 4.15, 및 7.62 nmol/hr/mg 단백질이었다 (도 149B). 운반체 대조군 원숭이들에서 수준들은 수컷들의 경우 0.089 nmol/hr/mg 단백질 또한 암컷들의 경우 0.083 nmol/hr/mg 단백질이었다. 회복 기간을 이어서, 간에서의 HNS 활성 수준들은 모든 용량 그룹들의 경우 기저 대조군 수준들과 비교가능하다.
면역조직화학
3개월 중간 및 6개월/회복 집단들에서 IT 일시 주사에 의한 CNS로의 HNS 전달은 척수 및 뇌의 연질-거미막 조직들로 면역반응성 테스트 항목의 전달을 유도하였다. IT HNS를 수여받은 원숭이들에서, 면역반응성 물질이 뇌척수막 및 혈관주위 대식세포들 (뇌/척수)에 일정하게 존재하였고, 인접한 교아세포들 및 신경세포 집단들에 다양하게 존재하였다. 운반체-투여 대조군 원숭이들에서 염색의 결여는 (도 150A) 인간 HNS로의 항체 특이성을 보여주었다. 일반적으로, 면역반응성은 용량 관련되었다 (예로, 반-정량적인 등급화 척도를 사용하여, 증가된 면역조직화학 염색은 일반적인 용량-의존적 방식으로 언급되었다). IT 일시 주사에 의한 CNS로의 HNS 전달은 대뇌 피질 및 소뇌에서 양성 면역염색을 유도하였다 (도 150B-D); 그러나 면역반응성은 미상엽/조가비핵 부위, 중간뇌, 또는 교뇌 또는 연수의 더 깊은 부위들에서 지속적으로 명백하지는 않았다. 면역반응성은 HNS 투여된 모든 원숭이들의 간들에서 (간세포들이 아닌 컵퍼 세포들을 포함하는 시누소이드 내층 세포들) 명백하였다. 면역반응성은 조기에 희생된 한 마리 암컷에서는 복구될 수 없는 카테터의 누출 때문에 명백하지 않았다.
1.5 mg/용량 그룹에서, 필수적으로 완전 회복은 간 및 일정 잔여 면역반응성이 명백한 뇌 및 척수의 뇌척수막을 제외하고 명백하였다. 더 높은 용량들에서 (4.5 및 8.3 mg/용량), 면역반응성의 강도 및 빈도들은 투여의 종결 시보다 더 낮았다. 모든 용량 수준들에서, 척수, 뇌 및 간의 HNS 수준들은 1개월 회복 기간 이후에 운반체-투여 대조군들에서 관찰된 수준들과 대략 같았다.
본 연구에서, IT 투여된 HNS의 EOW 전달은 일반적으로 잘 내성화되었다. 체중, 임상적 상태, 안과/신경적/ 신체 검사들, ECGs, 기관 무게들, 또는 총 기관 외양에서 두드러진 변화들은 전혀 관찰되지 않았다. 발견들은 회복 기간에 이어서 최고 용량 그룹에서만 거의 완벽한 역전을 가지면서 약간 내지 적당한 뇌척수막 침윤물들 및 경막외 염증을 동반하는 CSF 임상 병리학에서 일시적인 변화들에 제한되었다. 뇌 및 척수 전체를 통하여 HNS의 광범위한 분포가 관찰되었다.
HNS EOW의 IT 투여는 잔여 백혈구 침윤 및 투여 이후 24시간째 및 부검 시 주목되는 알부민의 삼출을 특징으로 하는 염증성 반응을 나타내었다. 특정한 이론이라면 모두에 집착하려고 않더라도, 이것은 아마도 카테터 팀 근처 밀착 연접부 (tight junctions)에서의 변화들과 관련된 BBB의 일시적, 국소적 및 불완전 개방을 반영하고 있고, 백혈구들 및 혈장 단백질들의 CSF 내로의 도입을 유도한다 (Simard JM, et al. Lancet Neurol. (2007) 6, 258-268; Stamatovic SM, et al. Curr. Neuropharmacol. (2008) 6, 179-192). 이것은 두 가지 성분들의 결과일 수 있다: 용량 투여 절차들 또는 부피와 관련된 성분 및 단백질의 IT 투여와 관련된 다른 성분.
BBB 투과성에서 일시적 변화들은 (주요 부검시 투여 이후 24시간째 용량 그룹들 및 대조군들 사이에 유의한 차이들이 없음) 임상적 징후들이라면 모두가 동반되지 않았다.
더 높은 평균 CSF HNS 수준들의 경우 용량-관련된 경향이 존재하는 것으로 보였고; 주어진 용량 수준에서 CSF에서 HNS의 평균 농도들은 혈청 및 CSF에서 항-HNS 항체 수준들이 증가함에도 불구하고 동일한 범위로 유지되는 것으로 보였다.
약간 내지 최소의 평균 중증도의 뇌척수막 세포성 침윤이 HNS-투여 어린 원숭이들의 뇌들 및 척수들에서 관찰되었다. 본 현미경적 변화는 운반체-투여된 대조군들에서도 역시 주목되었고 일정 반응이 IT 카테터 장착, 뿐만 아니라 외래 단백질에 비특이적 염증 반응과 관련되는 점을 가르켰다. IT 공간 내로 생물학적 단백질, 특히 CNS를 침투하는 것의 도입은 거의 항상 일정 정도의 염증성 반응을 나타내고 (Hovland DN, et al. Toxicol. Pathol. (2007) 35, 1013-1029; Butt MT, Toxicol. Pathol. (2011) 39, 213-219), 인접 조직을 손상시키도록 많이 존재하는 경우 역효과를 나타낼 것이다. 그러나, 최신 연구에서 이들 세포들 (우세하게는 호산구들)은 조직 반응/침투의 마커를 나타내는 것으로 보였고 역효과로서 분석될 충분한 양으로 발견되지는 않았다. HNS-관련 변화들은 뇌 또는 척수에서 해로운 구조적 현미경적 변화들이라면 모두와 연관이 없는 것으로 보였다. 뇌, 척수 또는 신경절에서 주목되는 신경 괴사는 전혀 없었다.
항-테스트 항목 항체들은 테스트 항목의 청소 또는 생체분배에 미치는 중화 또는 결합 항체들의 잠재적인 영향 때문에 독성 연구들의 중요한 관점이다 (Ponce RP, et al. Regul. Toxicol. Pharmacol. (2009) 54, 164-182). 본 연구에서, HNS 효소 활성의 용량-관련 및 정량적으로 유사한 수준들이 3개월 중간 및 6개월 집단들의 뇌 및 척수에서 발견되기 때문에, CSF에서의 HNS의 평균 농도들은 혈청 및 CSF에서 항-HNS 항체 수준을 증가시킴에도 불구하고 무-중화 활성을 제시하면서 동일한 범위로 유지되는 것으로 보였다.
척수, 뇌 및 간에서의 HNS 효소 활성의 더 높은 수준들로 향한 용량-관련 경향, 척수의 요추 영역에 있는 주사 부위 근처에서 가장 높고 뇌에서 일정하며 입과 꼬리 및 좌우 반구들 간 유의한 차이가 없는 것이 존재하는 것으로 보였다. HNS 축적에 대한 증거는 3개월 중간 집단과 비교된 바와 같이 6개월 집단의 뇌 및 척수 조직에서 전혀 주목되지 않았다. 증가된 배분으로 향한 경향이 표면 시료들에서 주목되었더라도, 요추-IT 투여된 HNS는 뇌의 깊은 뇌실주위 영역들로 침투하였다. 간에서 HNS 효소 활성은 IT 전달 이후에 체계적으로 재분배되는 HNS를 제시하였고; HNS-관련 역효과들은 중추적 독성 연구들에서 임상적 및 해부적 병리학 변수들의 평가 이후에 간에서 전혀 관찰되지 않았다.
일반적으로, 면역조직화학 결과들은 조직 효소 활성과 협력하였고 용량-관련 면역반응성이 척수 및 뇌 연질-거미막 뇌척수막에서 또한 뇌척수막과 바로 인접한 신경 조직들 (뉴런들, 교아세포들)에서 관찰되었다. IT 일시 주사 또는 단기 IT 주입 이후에 대뇌 및 소뇌의 회색질 침투가 좋았다. 면역반응성이 기저 신경절 또는 시상/해마, 중뇌 또는 교뇌/연수와 같은 더 깊은 구조들에서 분명하지 않더라도, 효소 활성 결과들은 요추-IT 투여된 HNS가 뇌의 깊은 뇌실주위 영역들로 침투하는 것을 가르켰다. 따라서, 면역조직화학이 테스트 항목의 생체분배을 검출하는 덜 민감한 기법일 수 있다. 면역반응성은 간의 컵퍼 세포들 및 내피세포들 (대식작용 가능한 세포들)에서는 분명하지만, 실질세포들 (간세포들)에서는 그렇지 않다.
어린 원숭이들에서6개월 반복된-용량 IT 독성 연구의 6개월/회복 집단 분석들은 3개월 중간 및 6개월 희생 원숭이들에서 HNS-관련 변화들이 생명 변수들, 임상적 및 해부적 병리학, CSF및 혈청에서 HNS 및 항-HNS 항체들의 농도들 또한 척수, 뇌 및 간에서 HNS의 분포/세포하 위치를 포함하여 비교가능한 점을 가르켰다. 회복 희생 원숭이들에서, HNS 효과들은 부재하거나 유의하게 감소되었다. 따라서, 6개월 어린 원숭이 연구의 역효과 무관찰 수준은 최고의 투여량인 8.3 mg/용량이었다.
CSF 세포충실성 및 단백질 농도들에서 변화들을 감시하는 것이 조직병리적 평가 상에 주목되는 형태적 변화들의 믿을만한 상관 (correlate)인 것으로 보이고 HNS로 IT 치료된 환자들에서 유용할 수 있다; 이들 변화들은 IT-투여된 단백질에 대한 기대된 반응으로 고려되었고 회복 기간 이후 많이 해소되었다. 동물 모델들로부터 얻은 이들 데이타는 리소좀 축적병들의 신경학적 소견들을 위한 치료 전략으로서 IT 요법을 추구하는 데 확인을 준다. 본 어린 비인간 영장류 독성 연구는 소아 환자들에서 IT 요추 약물 전달 장치를 통한 HNS의 투여의 실용성 및 내성도를 보여주고 있다. 무해한 CNS 병리학 및 해로운 임상적 징후들의 결여는 최근 연구적 의학제품 서류 승인을 지지하였고 IT-투여된 HNS가 산필리포 증후군 A형의 CNS 증상들을 안전하고 효과적으로 치료할 수 있는 점을 가르켰다.
재료들 및 방법들
본 실시예에서 기술된 다양한 실험들에 사용되는 대표적인 재료들 및 방법들은 하기에 제공된다.
연구 설계 및 HNS 투여
원숭이들은 5가지 치료 그룹들로 무작위화 되었다; 그룹 1은 미치료되고 (이식 장치 대조군 [DC], 포트 및 카테터) 운반체 또는 테스트 항목이 투여되지 않았다. 그룹 2 내지 5는 0.6 mL의 0, 2.5, 7.5 또는 13.8 mg/mL HNS IT, (예로, 전체 용량 0, 1.5, 4.5, 또는 8.3 mg) EOW를 수여받았다. 네 마리의 원숭이들/성별/그룹이 3개월에 부검되었고 (중간 부검; 6번 용량 이후 24시간째), 네 마리의 원숭이들/성별/그룹 (3개월에 부검된 DC 그룹 제외)은 투여 6개월에 부검되었고 (주요 부검; 12번 용량 이후 24시간), 남아있는 네 마리의 원숭이들/성별/그룹이1개월 회복 기간말에 부검되었다. 검시, 선택된 조직들이 수확되어 처리되었고 현미경적으로 조사되었다.
HNS는 5 mM 소듐 포스페이트, 145 mM 염화나트륨, 0.005% 폴리솔베이트 20 (pH 7.0)으로 구성되는 IT 제형물 운반체에 넣어 제공되었다. HNS의 격주 용량들이 대략 11분 동안 단기 주입으로서 투여되었다: 0.6 mL (4분), 0.5 mL 포스페이트-완충 식염수 (PBS) (7분)의 세척이 이어졌다. 운반체-대조군 그룹의 원숭이들은 IT 제형물만 단독으로 수여받았고; DC 원숭이들은 PBS (pH 7.2) IT를 수여받았다.
임상적 평가
임상적 징후들, 유병율 및 치사율이 첫 번째 용량에서 시작하여 적어도 매일 두 번 기록되었다. 체중들은 수술 전, 수술일, 연구 동안 매주, 및 부검 시에 측정되었다. 식품 소비가 수술 전에 시작하여 매일 감시되었다. 신체적 (심장 속도, 호흡, 체온, 청진, 보행, 소질, 복부 촉진, 림프절, 및 일반적인 외양) 및 신경적 (의식 수준, 추적) 검사들이 연구가 개시되기 이전, 연구 동안 매월, 및 부검 전에 수행되었다. 운동 기능, 뇌 반사들 (동공, 눈깜박임 및 각막 반사), 및 척수 반사들 (발 감각, 무릎 반사, 피하, 고유 감각 (proprioceptive), 및 꼬리 반사)도 역시 평가되었다. 심전도 (ECG; leads I, II, 및 III) 및 안과적 검사들이 HNS의 첫 번 용량 이전, 중간부검 (3개월) 또는 최종 부검 (6개월) 전 주에 완료되었다. 안과적 검사들은 도상검안경에 의해 수행되었다. 원숭이들은 케타민 HCl (IM, 8 mg/kg)로 진정되었고 눈들은 및 1% 트로피카마이드 (tropicamide)로 확장되었다..
임상병리학
혈액 시료들은 혈액학 및 혈청 화학을 위해 연구 시작 이전, IT 투여 1, 3, 5, 7, 9 및 11이후, 중간-회복 및 부검시 절식 원숭이들로부터 채취되었다. 소변 시료들은 팬 캐치에 의해, 투여전, 투여 동안 매월, 회복 기간 및 부검 이전 채취되었다. CSF 시료들은 전체 세포 계수 및 화학 분석을 위해 수술 시, IT 투여 1, 3, 5, 7, 9 및 11에 이어서 24시간, 중간-회복 및 부검시 요추 카테터에 의해 채취되었다; 때로 시료들은 부분적 카테터 방해로 인해 채취되지 못하였다. 기대한 CSF 백혈구 계수 이상이 주목되었기 때문에, 3개월 용량 5 CSF 시료들이 투여 이전 각 그룹의 원숭이들 절반으로부터 또한 투여 이후 24시간째 남아있는 원숭이들로부터 채취되었다. 투여전 시료 채취는 투여 직전 CSF 부피를 유의하게 변경하지 않도록 투여 이전 적어도 1일에 이루어졌다. 6개월 및 회복 원숭이들의 경우 전체 세포 계수 및 화학을 위해 CSF가 투여 이전 각 그룹의 원숭이들 절반으로부터 또한 투여 이후 24시간째 남아있는 원숭이들로부터 채취되었다. 원숭이가 방해로 인해 무시료 카테터를 가지는 경우라면, 척수 탭 (대수공)이 부검시 수행되었다.
HNS 분석
HNS 분석을 위한 혈액 시료들은 IT 용량들 2, 4, 6, 8, 10, 12 이전 및 이후 24시간; 중간-회복, 및 부검시 말초 정맥으로부터 채취되었다. CSF 시료들은 IT 용량들 2, 4, 6, 8, 10, 12 이전 및 이후 24시간; 중간-회복, 및 부검시 요추 카테터에 의해 채취되었다. HNS 농도들은 효소-결합 면역흡착 검정법에 의해 결정되었다. 포획 항체는 폴리클론 토끼 항-HNS IgG이었고 검출 항체는 동일한 항-HNS IgG의 호스래디쉬 퍼옥시다제-결합체이었다. LOD 는 0.22 ng/mL이었고, 따라서 LOQ는 0.66 ng/mL로 계산되었다. 혈청 및 CSF 시료들은 1:100 및 1:5 희석들로 두 벌씩 검색되었다; 산정 곡선의 고점을 초과하는 시료들은 좀 더 희석되어 재시험되었다.
항-HNS 항체 분석
항체 분석을 위한 혈액은 IT 용량들 2, 4, 6, 8, 10, 12 이전 대략 1주; 중간-회복, 및 부검시 말초 정맥으로부터 채취되었다. 항체 분석을 위한 CSF 시료들은 수술 시, IT 용량들 2, 4, 6, 8, 10, 12 이전 대략 1주, 중간-회복, 및 부검시 요추 카테터에 의해 채취되었다. 메조 스케일 디스커버리 (Meso Scale Discovery (MSD®) 기법 전기화학발광 브리지 테스트가 항-HNS 항체들의 검출을 위해 사용되었다. 본 검정법은 일반적이지만 민감한, 종이라면 모두 및 면역글로불린 이소형들 모두로부터 얻은 항-HNS 항체들을 검색하는 방법이다. LOD 는 5 ng/mL이었고, 시료들은 1:20 희석으로 두 벌씩 검색되었고, 100 ng/mL의 효과적인 검정 민감도를 가져왔다; 산정 곡선의 고점을 초과하는 시료들은 좀 더 희석되어 재시험되었다.
부검 및 조직들의 준비
원숭이들은 최종 IT 용량들 이후 24시간 (최종 부검) 또는 1개월 회복 기간의 말 (회복 부검)에 전적으로 부검되었다. 모든 원숭이들은 케타민 HCl (IM, 8 mg/kg)으로 진정되었고 이소플루란/산소 혼합물 상에 유지되었으며, 헤파란 소듐 (200 IU/kg)의 IV 주사를 맞았다. 원숭이들은 좌심실을 통해 식염수에 넣은 상온 0.001% 소듐 나이트라이트를 200 ml/분의 속도로 12분 동안 (~2400 ml) 관류시켰다. 다음으로 채취 이후에, 조직 시료들은 조직병리학적 검사/면역조직화학적 분석을 위해 10% 중성 완충 포르말린에서 고정되었고, 드라이아이스 상에 냉동되어 -60℃ 이하에서 HNS 활성의 분석을 위해 보관되었다.
뇌는 3mm 관상 슬라이스 두께로 뇌 매트릭스에서 절단되었다 (MBM-2000C, ASI Instruments, Inc., Warren, MI). 조각들에는 가장 입쪽 조각이 조각 1로 지정되어 번호가 매겨졌다. 조각들 1, 4, 7, 10, 13, 및 16은 조직병리학을 위해 처리되었고 조각들 2, 5, 8, 11, 14, 및 17 은 (사용가능한 경우) 면역조직화학을 위해 처리되었다. 조각들 3, 6, 9, 12, 및 15은 HNS 활성의 분석을 위해 냉동되었다. 척수 (경추, 흉추 및 요추 부분들)은1-cm 절편들로 절단되었다. 첫 번째 조각 및 이후 세 번째 조각은 조직병리학적 평가를 위해 처리되었고, 두 번째 조각 및 이후 세 번째 조각은 면역조직화학적 분석을 위해 처리되었다. 세 번째 조각 및 이후 세 번째 조각은 HNS 분석을 위해 냉동되었다. 조각들의 배분은 경막내 카테터의 팁을 포함하는 조각 (조각 0)이 포르말린에 고정되고 조직병리학으로 분석되도록 조절되었다. 간의 ~5 g의 두 벌 시료들을 두 개의 분리된 엽들로부터 취하였고 HNS 분석을 위해 냉동되었으며, ~5 g의 추가적인 시료가 면역조직화학적 분석을 위해 고정되었다.
조직병리학
모든 원숭이들로부터 뇌들, 척수들, 등 척수 신경근들. 신경절, 좌골, 전경골 및 비복 신경들, 완전한 조직 리스트 (본 종에서 본 지속기간의 전임상 약물 안전성 연구들에 전형적임), 및 총 병변들이라면 모두가 부검시 수확되었다. 조직 절편들은 파라핀에 포매되었고 해석적 현미경적 평가를 위해 (하기에 기술된 특별한 염색/포매 절차들에 추가하여) 헤마톡실린 및 에오신으로 염색되었다.
장치 및 운반체-대조군 그룹들, 및 고용량 원숭이들로부터 준비된 파라핀 블록들로부터 얻은 뇌 절편들은 형광-제이드 B (뇌를 신경적 퇴화에 대해 평가하는 민감도를 증가시키는 염색) 및 비엘스코우스키 은 염색 (축삭들, 가지세포들 및 신경 필라멘트들의 직접 영상화를 허용하는 절차)으로 염색되었다. 형광-제이드 B 염색된 슬라이드들은 플루오레신 이소티오시아네이트 필터 큐브를 사용하여 형광 빛 하에서 조사되었다.
척수들은 카테터 팁에서 취한 절편들을 포함하여 경추, 흉추 및 요추 부위들에서 취한 (각 수준에서 조사되는 하나의 조각) 대각선 및 사선 절편들을 가지며 일련으로 절편화되었다; 추가적인 대각선 절편은 말총 (cauda equine) 부위로부터 가져왔다. 등 척수 신경근들 및 신경절 (중간경추, 중간흉추 및 중간요추)가 처리되어 조사되었다. 말초 신경들 (좌골, 전경골, 비복)은 가로로 절편화되었고 파라핀에 포매되어 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)으로 염색되었다. 교차 절편들은 오스뮴으로 후-고정되었고 스푸르 레진 (Spurr's resin)에 포매되었으며 (2 um) 절편화되어 톨루이딘 블루로 염색되었다. 장치 및 운반체 대조군 그룹들 및 고용량 그룹으로부터 일련의 척수 절편들 뿐만 아니라 등 척수 신경근들 및 신경절은 비엘스코우스키 은으로 염색되었다. 이들 그룹들로부터 얻은 척수 절편들도 별아교세포들 및 그들의 공정들의 직접 영상화를 허용하는 면역조직화학적 염색인 항-신경교 원섬유 산성 단백질로 역시 염색되었다.
정량적 분석을 위한 조직 추출물들의 제조
냉동 뇌 조각들 3, 6, 9, 12, 및 15은 좌우 반구들을 분리하여 절개되었다. 표면 조직은 표면으로부터 4 mm를 측정하여 취하였고, 각 반구에서 남아있는 조직은 깊은 조직으로 고려하였다. 존재하는 경우라면 (예로, 조각들 6 및 9), 추가적인 뇌실주위 시료가 관상 조각들로부터 절단되었다. 뇌의 절반만 (우측)이 가공되었기 때문에 (좌측은 냉동된 채로 남았음), 절편화는 조각 당 둘 내지 셋 시료들을 가져왔다: 우 표면, 우 심부 및 존재하는 경우 우 뇌실주위 (예로, 깊은 뇌실; Vdeep). 대뇌 및 뇌줄기 조직들은, 존재할 때 반구들을 분리하기 이전에 분리되었고 독립적으로 처리되었다. 척수 절편들은 유사하게 준비되었고 무게를 달아 균질화되었다.
조직 시료들은 TeenA 용해 매트릭스A 튜브들 또는 원추형 폴리프로필렌 튜브들을 사용하여 알파 완전 단백분해효소 저해제 미니정제 (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN)가 보충된 10 mM 트리스, 5 mM 에틸렌디아민테트라아세트산, 0.1% Igepal로 제형화된 용해 완충액 (1 ml/0.25 g 조직)에서 균질화되었다. 시료들은 Fastprep-24 자동화 균질화기기 (MP Biomedicals, Solon, OH) 또는 PowerGen 모델 125 강력 균질화기 (Omni International, Kennesaw, GA)로 40초 동안 처리되었다. 일단 균질화되면, 시료들은 에탄올/드라이아이스 수조 및 37℃ 물 수조를 사용하여 5회 냉동-해동 순환 과정을 시행하였고 다음으로 4℃에서 조직 펠렛 잔여물로 원심분리하였다; 상청액들은 검정될 때까지 -80℃에서 보관되었다. HNS 활성은 특이적 기질 (4-메틸엄벨리페릴-α-D-N-설포글루코사미니드 (4-methylumbelliferyl-a-D-N-sulphoglucosaminide)를 사용하여 2-단계 형광측정 검정법으로 결정되었다.
면역조직화학을 위한 조직 처리 및 염색
각 원숭이로부터 나온 3-mm 두께의 6개의 포르말린 고정된 관상 뇌 조각들 (조작 번호들 2, 5, 8, 11, 14, 및 17)은 입부터 꼬리까지 1 내지 6으로 번호 매겨졌다. 일반적으로, 조각 1 내지 4는 기저 핵/시상/중뇌 및 대뇌를 포함하였고, 꼬리쪽 2개 조각들은 소뇌 및 뇌줄기 (연수) 조직을 포함하였다. 뇌, 척수 및 간 절편들 (H&E 및 다양한 특별한 염색들에 사용되는 것과 동일한 파라핀 블록들로부터 나옴)은 면역조직화학적으로 HNS에 대해 염색되었다. 특이적 마우스 모노클론 항체 (클론 2C7; Maine Biotech, Portland, ME)이 IT-투여된 HNS의 세포내 흡수를 검출하는 데 사용되었다; 본 반응액은 내인성 사이노몰 원숭이HNS와 교차-반응성을 전혀 보이지 않았다. 음성 대조군들이 부적절한 마우스 IgG를 사용하여 수행되었다. 탈파라핀화된 슬라이드들이 일차 마우스 항-HNS항체와 2-8℃에서 밤샘 배양되었다. 이차 염소 항-마우스 바이오틴화된 면역글로불린 G가 첨가되었고 37℃에서 30분 동안 배양되었다. 아비딘-바이오틴 호스래디쉬 퍼옥시다제 복합체가 첨가되어 30분 동안 배양되었다. 슬라이드들은 퍼옥시다제 기질 디아미노벤지딘 용액에서 원하는 염색 강도가 형상될 때까지 배양되었다. 핵은 헤마톡실린으로 반대염색 되었다.
통계적 분석들
원-웨이 분산 분석 (one-way analysis of variance) 또한 듀넷 테스트 (Dunnett's test)에 의한 장치 및 운반체 대조군 그룹들 및 각 HNS-투여 그룹의 비교에 의해, 체중들, 체중 변화들, 음식 소비, 호흡율, 체온, 심장 속도, CSF 세포 계수, CSF 화학, 임상적 병리학 데이타, 소변 데이타, 또한 절대적 및 상대적 기관 무게들이 분석되었다. 또한, 통계적 분석은 두 가지 대조군 그룹들을 서로 비교하였다. 분석은 5% 및 1%의 유의성 수준들로 시행되었다. 모든 데이타는 평균 ℃± 표준 편차로서 표현된다.
실시예 22. 헤파란 N-설파타제 생체분배 및 약물역학적 연구들
본 실시예에서 실험들은HNS의 단일 정맥내 또는 경막내 (1 또는 10 mg/kg) 이후에 래트들에서 HNS의 조직 분포를 결정하도록 설계되었다. 예를 들어, 무엇보다도 이들 실험들의 목적은 양전자 방출 단층촬영법 (PET)을 사용하여 래트들에서 HNS의 생체분배 (BD) 특성을 분석하고; 서로 다른 경로들 (IV 또는 IT) 및 서로 다른 용량들 (1 또는 10 mg/kg)로 주어질 때 HNS의 배분 양상들을 비교하고; 또한 이들 투여 요법들에서 관심있는 기관들 각각의 HNS의 약물역학적 특성들을 결정하는 것이었다.
124I-설파미다제 (HNS)의 약물역학 (PK) 및 생체분배 (BD) 프로파일들이 1 또는 10 mg/kg의 124I-HNS의 단일 정맥내 (IV) 또는 경막내 (IT) 투여 이후에 래트들에서 조직 PET 영상화에 의해 연구되었다. 관심 있는 부위에서 방사능-시간 데이타가 처음 20분 내에 동적 영상들로부터 또한 IV 또는 IT 투여 이후 0.05 (IT 투여만), 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 및 192 시간에 정적 영상들로부터 획득되었다.
네 가지 그룹 각각에서 4마리 래트들이 (1 mg/kg IV, 1 mg/kg IT, 10 mg/kg IV 및 10 mg/kg IT)이 본 연구에 사용되었다. 방사능-시간 데이타가 머리, 뇌 (뇌척수액, CSF 포함), 척수 및 간 부위들에서 IT 투여 이후; 또한 혈액, 뇌 (CSF 포함), 간, 신장, 심장 (폐들을 포함) 및 피부에서 IV 투여 이후에 측정되었다. 데이타는 124-요오드의 붕괴 반감기 (100.2시간)에 의해 교정되었고, 관심있는 부위의 주사량의 백분율 (%ID) 또는 영상화된 조직들 그램 당 %ID (%ID/g)로서 표현되었으며, 다음으로 200 그램의 체중으로 정상화되었다. 관심있는 부위에 투여된 단백질의 전체량 (ug) 또는 농도들 (ug/g)은 해당하는 %ID 또는 %ID/g 결과로부터 계산되었다.
IT 투여 이후 처음 20분에, 머리 부위에서 HNS의 전체량은 0.002/분 내지 0.011/분 (λz)의 일정한 속도로 1 및 10 mg/kg로 감소되었다. 청소율들 및 배분 부피들은 본 보고서에서 두 가지 용량들 및 두 가지 투여 경로들 간 약물역학적 비교들에 사용되지 않았다 (추가 정보를 위해 결과 섹션을 참조하라). 뇌로부터 제거의 일정한 속도는 필수적으로 두 가지 테스트 용량들 (1 및 10 mg/kg 각각의 경우, 0.016/시간 대비 0.014/시간)에서 IT 투여 이후 192시간까지의 정적 영상에 의해 결정된 바와 같은 약 2일의 유사한 반감기와 동일하였다. Cmax 및 AUC (0-최종 또는 0-무한대)는 투여된 용량들과 비례적이었다. 선형 PK 행동은 이들 IT 단일 투여 요법들에서 주어진 1 내지 10 mg/kg의 용량 범위로 표시되었다. 농도 구배들은 용량 수준들 둘 다에서 척수의 전방으로부터 말단 절편들까지 관찰되었다.
IT 투여 이후, HNS 단백질은 간에서 HNS의 1 mg/kg에서 96시간까지 또한 10 mg/kg에서 192시간까지 측정가능하였다. 간에서 농도들은 1 mg/kg에서 2시간 및 10 mg/kg에서 7시간에 피크에 도달하였다. 제거는 1 mg/kg에서 0.030 ± 0.011/hr (평균 λz) 이었고, 해당하는 t1/2 (1 및 10 mg/kg의 용량들 각각에서 28시간 대비 48시간)를 가지면서 10 mg/kg (λz 0.017 ± 0/hr)에서와 유의하게 서로 다르지 않았다 (p=0.10).
IV투여 이후, 간, 신장, 심장 및 피부에서 제거 반감기들은 1 및 10 mg/kg에서 각각 간의 경우 47 ± 10 및 38 ± 13 시간, 신장의 경우 54 ± 25 및 29 ± 16 시간, 심장의 경우 36 ± 15 및 42 ± 19 시간 또한 피부의 경우 40 ± 21 및 31 ± 13 시간이었고; 한편 뇌에서의 반감기는 71 ± 23 및 60 ± 53 시간이었다. 간, 피부, 신장, 심장 및 뇌의 경우 평균 Cmax 수치들은 1 mg/kg에서 9.6, 0.30, 0.25, 0.22, 및 0.08 ug/g 또한 10 mg/kg에서 132, 7.9, 3.9, 3.7 및 1.8 ug/g이었다. 개별 동물로부터 얻은 Cmax 수치들을 용량으로 정상화한 이후에, 10 mg/kg에서 Cmax /용량 수치들은 이들 모든 기관들에서 1 mg/에서보다 유의하게 더 높았다 (간의 경우 대부분 p값 <0.05, p=0.06). 간, 피부, 신장, 심장 및 뇌의 경우 AUClast 수치들은 1 mg/kg에서 525, 16, 14, 9 및 7 hr.ug/g 또한 10 mg/kg에서 6747, 276, 183, 201 및 86 hr.ug/g이었다. 정상화 이후, 10 mg/kg에서 AUClast /용량 수치들은 피부에서 1 mg/kg에서보다 유의하게 더 높았고 (p<0.01), 심장에서 최저한 서로 달랐고 (p=0.06), 간, 뇌 및 신장에서는 유의하게 서로 다르지 않았다 (모두 p값>0.34).
동일량의 HNS가 주사될 때, 경막내 투여는 정맥내 투여보다 로그3 이상 뇌 노출을 가져왔다. 뇌에서 제거 반감기는 IT에 의해 2일 또한 IV 투여에 의해 3일이었다. 그러나, IT 투여 이후 간 노출들은 HNS의 동일량에서 IV 투여 이후에서와 유사하였다. 간의 경우 노출 (Cmax 및 AUClast)은 IT/IV에 의해 1 mg/kg 및 10 mg/kg에서 0.4 - 1.2의 범위이었다.
실험적 설계
중추신경계 (CNS)는 대부분의 리소좀 축적병들에 취약하고, 산필리포 증후군 A형 또는 B형 (점액다당류증 제 III형), 이염색성 백색질 장애 (MLD) 및 헌터 증후군과 같은 이들 질환들의 일정 유형들에서 심각하게 손상된다. 본 명세서에서 기술된 바와 같이, 말초적으로 투여될 때 혈액-뇌 장벽을 통한 약한 침투로 인해, CNS 내로 효소적 단백질의 적접 투여는 중추 신경 조직들에서 그들의 농도들을 증가시키고 좀 더 나아가 그들의 치료적 효과들을 증진시킬 수 있다. 본 연구에서는 서로 다른 용량 수준들에서 경막내 (IT 또는 대수공) 투여가 조사되었고 IV 투여와 비교되었다.
PET는 관심있는 기관에서 시간에 따른 약물 농도의 동적 변화를 제공하도록 비-침습적이고 반복가능하고 정량적인 기술이다. 표적 기관 (혈액 순환에서라기 보다는 활성 부위들)로부터 얻은 동적 농도-시간 데이타가 소중하고, 투여된 약물의 생물학적 활성과 직접 관련된다. 또한, 동물들에서 PET 연구로부터 나온 조직 노출들에 관한 정보가 인간에서 최초 용량의 선택을 안내하는 데 사용될 수 있다.
재료들 및 방법들
테스트 항목들
헤파란 N-설파타제 (HNS)는 145 mM 염화나트륨을 가지는 5 mM 소듐 포스페이트 완충액으로 pH 7.0에서 20 mg/mL의 HNS 농도로 제형화되었다. 재료는 RP-HPLC에 의해 정제되었고 98.7%의 헤파란 N-설파타제를 99.9%의 이량체로 포함하였다. HNS는 124요오드로 표지되었다.
시료 출처
방사능 영상들이 1 및 10 mg/kg으로 124I-H-N-설파타제 IV 및 IT 투여 이후에 래트들로부터 나왔다.
동물들
16마리 수컷 스프라그-달리 래트들은 챨스 리버 연구실사 (Charles River Laboratories)로부터 구입하였고 (190 ± 60 g, n = 16), 네 가지 그룹들로 분리되었다 (n = 4). 서로 다른 두 가지 용량들로 (1 mg/kg 및 10 mg/kg) 단일 IV 또는 IT 주사가 이들 래트들의 각 그룹에 주어졌다 (전부 4 그룹들). 용량 및 주사 부피는 각 동물의 체중을 기초로 하여 개별화되었다. 두 가지 IV-처리 그룹들에서, 35 mg/kg으로 소듐 펜토바비탈 (sodium pentobarbital)의 IV 주사에 의해 진정되었다. 정맥내 용량들은 꼬리 정맥을 통해 일시 주사되었다. 두 가지 IT-처리된 그룹들에서는, 동물들이 50 mg/kg 용량으로 소듐 펜토바비탈의 복강내 투여에 의해 마취되었다. 경막내 용량들은 1분 동안 대수공 수준으로 환추-후두막 (atlanto-occipital membrane)을 통해 투여되었다. 실제 투여된 방사능은 PET에 의해 측정되었고 주사된 용량으로서 제공된다.
실험적 및/또는 검정 방법(들)
동적 영상들 (매 2분)이 용량들 둘 다의 IV 투여 이후 처음 20분에 심장 (폐들 포함), 간 및 신장들의 부위들에서; 또한 IT 투여 이후에 머리 부위에서 획득되었다. 정적 영상화는IV-처리된 그룹에서 뇌 (뇌척수액, CSF 포함), 간, 신장, 심장 (폐들 포함), 근육, 피부 및 뼈를 포함하는 부위들에서; 또한 투여 이후 0.05 (IT 그룹들에만 사용가능함), 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 및 192 시간에 IT-처리된 동물들의 머리, 뇌 (CSF 포함) 및 간의 부위에서 획득되었다. 영상들은 재구성되었고 세 가지의 신체 절편들이 하나의 영상으로 융합되었다.
데이타 분석들
PET 결과는 mL 당 (체액의 경우) 또는 그램 당 (조직의 경우) 나노큐리 (nCi)로 표현되었다. 상대적 활성이 뇌, 간, 신장들, 골격근, 위, 심장 (폐들 포함) 및 피부 부위들의 경우 정적 영상들로 획득되었다. 전체 머리 또는 뇌 부위들에서 절대적 활성은 IT 주사들을 맞은 동물들의 경우에 획득되었다. 척수 컬럼의 밀리미터 당 방사능이 IT 주사된 동물들에서 세 가지 선택된 절편들로 결정되었다: 전방 (목), 중간 (간의 상부 모서리 기준), 및 말단 (구획을 포함하는 단백질의 말단으로부터 1cm) 척수.
모든 데이타는 124I 붕괴 반감기 (100.2시간)에 의해 교정되었고, 외부적으로 측정된 활성을 가진 124I 출처의 산정을 기초로 하여 등록된 효능을 위해 정상화되었다. 데이타는 전체 부위 (머리 및 뇌)의 주사량의 백분율 (%ID) 또는 조직 그램 당 %ID (%ID/g)로서 표현되었으며, 다음으로 200 그램의 체중으로 정상화되었다 [데이타 정상화: (%ID or %ID/g) / 동물의 체중 x 200]. 정상화는 단지 네 마리 동물들이 각 그룹에 사용되었기 때문에 데이타의 다양성을 줄이도록 채택되었다.
본 실시예에서, HNS 단백질 농도들 또는 양은 각 동물에 주사된 단백질 용량을 사용하여 계산되었다: 단백질 농도 (ug/g) = (%ID/g) x (mg/kg 주사된 용량 x1000 x 0.2); 관심있는 부위에서 투여된 단백질의 전체량 (ug) = %ID x (mg/kg 주사된 용량 x 1000 x 0.2), 여기에서 주사된 용량은 1 mg/kg 또는 10 mg/kg이었고, 0.2는 체중의 경우 정상화 팩터이다. 각 PK 변수의 그룹 평균 및 표준 편차는 네 그룹들의 각각에서 개별적 비구획 데이타를 기초로 하여 계산되었다. 스튜던트 t-테스트가 두 가지 테스트 용량들 및 두 가지 투여 경로들 간에 λz, t1/2, Cmax 및 AUC 수치들을 비교하도록 수행되었다. 통계적 유의성은 0.05 (p<0.05) 이하의 p-값으로서 정의되었다.
결과들
다음의 표들, 도면들, 및 PK 분석들에서 HNS의 양들 (ug) 또는 농도들 (ug/g) 이 주사된 단백질 용량을 (1 mg/kg 또는 10 mg/kg) 해당하는 of %ID 또는 %ID/g 수치들로 배가하여 계산되었다.
1 및 10 mg/kg 용량의 124 I-HNS로 경막내 치료
동적 영상들로부터 머리 부위에 투여된 단백질 (ug)의 양이 시간의 함수로서 도 151에 좌표 표시되었다. 정적 영상들로부터 뇌 부위들에서의 농도 (ug/g)가 시간의 함수로서 도 152에 좌표 표시되었다. 정적 영상들로부터 뇌 및 머리 부위들에서 주사된 단백질의 전체량 (ug)은 시간으로 각각 도 153 및 도 154에 좌표 표시되었다. 전방, 중간 및 말단 척수에서 농도-시간 곡선 (ug/mm)은 도 155 내지 도 157에 나타나 있다. 도 158 은 간에서 1 및 10 mg/kg으로 124I-HNS의 IT 투여 이후 시간으로 HNS 농도 (ug/g)의 변화들을 나타낸다.
전체량-시간 (ug) 또는 농도-시간 (ug/g) 결과는 비구획 모델들에 의해 (WinNonlin 5.2, Pharsight, Mountain View, CA) 분석되었다. 제거의 일정한 속도 (λz), 피크 농도 (Cmax), 최종 반감기 (t1/2), 곡선 아래 영역 (AUClast 및 AUC0-inf) 등과 같은 PK 변수들이 각 개별 동물의 결과들로부터 추정되었다.
청소율들 및 배분 부피들이 추정되지만, 그들은 본 보고서에서 두 가지 이유 (1) 본 연구가 혈액 PK보다는 고형 조직들에서 HNS의 생체분배에 초점을 맞추었고; (2) 뇌 부위에서 방사능은 본 연구에서 분리될 수 없는 뇌 조직 (고체) 및 CSF (액체)로부터 얻은 것들의 합계이기 때문에, 두 가지 용량들 및 두 가지 투여 경로들 간 PK 비교들에 사용되지 않았다. λz가 단위 시간 당 제거되는 주사된 용량의 백분율을 표시하기 때문에 평가되었고 비교에 사용되었다.
그룹 평균들 및 표준 편차들 (SD)이 계산되었고 두 가지 테스트 용량들 간에 비교되었다. 이들 PK 변수들은 하기 표 48에 도표화된다.
Figure 112021011816093-pat00084
투여 이후 처음 20분에, 머리 부위에서 HNS의 전체량 (ug)은 1 mg/kg에서 분당 0.002 - 0.011 (λz, 0.005 ± 0.004/분) 또한 1 mg/kg에서 분당 0.003 - 0.010 (0.007 ± 0.003/분)의 일정한 속도로 감소되었다. 이들 제거의 일정한 속도는 이들 두 가지 용량 수준들에서 유의하게 서로 다르지 않았다 (p=0.57, 도 151).
뇌의 경우 농도-시간 곡선 (0.05로부터 192까지의 시간 ug/g)은 이단계 (bi-phasic) 프로파일을 가르켰다 (도 152). 초기 단계는 약 두 시간 지속된다. 말기 단계는 일차 역학을 따른다. 뇌로부터 제거의 일정한 속도들은 두 가지의 테스트된 용량들에서 약 2일의 유사한 반감기와 함께 (1 및 10 mg/kg에서 각각 45 ± 7 및 49 ± 4 시간) 매우 유사하였다 (시간 당 0.0016 ± 0.003 및 0.014 ± 0.001). 피크 농도들 (257 ± 90 및 2628 ± 265 ug/g) 및 AUClast (1 및 10 mg/kg에서 각각 8393 ± 2457 및 83962 ± ±10083 hr.ug/g)의 수치들은 용량이 1로부터 10 mg/kg까지 증가될 때 대략 10배 증가한다. 이들 관찰은 이들 IT 단일 투여 요법들에서 주어진 1 내지 10 mg/kg의 용량 범위에서 선형의 PK 행동을 가르켰다. IT 투여 이후에 뇌에서 피크 농도는 3분 (Tmax)으로 나타났다.
뇌 및 머리 부위들에서 전체량 - 시간 곡선 (0.05로부터 192시간까지 ug)은 뇌에서의 농도-시간 곡선들 (ug/g)에서 보여지는 바와 동일한 이단계 양식을 따랐다 (도 153 및 도 154). 뇌 부위에서 Cmax 수치들은 머리 부위에서보다 유의하게 더 낮았다 (각각 1 mg/kg에서 69 ± 8 대비 200 ± 0, p<0.01; 10 mg/kg에서 836 ± 117 대비 1844 ± 314 ug, p<0.01). 제거의 일정한 속도들은 1 및 10 mg/kg에서 각각 뇌의 경우 0.017 ± 0.002/hr 및 0.014 ± 0.001/hr, 또한 머리 부위의 경우 0.016 ± 0.002 및 0.010 ± 0.001/hr이었다. 평균 잔류 시간의 수치들은 1 및 10 mg/kg에서 각각 뇌의 경우 42 ± 5 대비 51 ± 5 시간 (p=0.048), 또한 머리 부위의 경우 45 ± 7 대비 70 ± 9 시간 (p<0.01)이었다. 이들 관찰들은 투여된 단백질이 고용량들보다 저용량에서 더욱 신속하게 제거된 점을 제시하였다. 평균 반감기들은 1 및 10 mg/kg의 HNS를 IT 투여한 이후 이들 부위들에서 42 내지 70 시간의 범위이었다.
농도 구배가 용량 수준들 둘 다에서 척수의 전방으로부터 중간 및 말단 절편들까지 관찰되었다 (결과 미도시). IT 투여 이후, 피크 농도 (ug/mm 척수 컬럼)는 전방에서 30분 주변 (0 내지 1시간), 중간에서 1 내지 4시간 (한 마리 래트만 24시간), 또한 말단 절편들에서 1 내지 8시간이었다. 이들 절편들에서 반감기들은 다양하였다 (평균 t1/2: 1 mg/kg 및 10 mg/kg 각각에서 척수의 전방의 경우 32 ±13 및 45 ± 18시간, 중간의 경우 39 ± 16 및 약 50시간 또한 말단의 경우 30 ± 12 및 약 123시간). 피크 농도들의 평균 수치들은 124I-HNS의 1 mg/kg 및 10 mg/kg에서 이들 세 가지 절편들에서 용량들에 거의 비례적이었다 (척수의 전방, 중간 및 말단 절편들에서 각각 0.5 대비 6.0, 0.2 대비 0.9 및 0.1 대비 0.5 ug/mm). AUClast의 평균 수치들은 피크 농도에서 관찰되는 바와 동일한 비례적 양상을 따랐다 (전방, 중간 및 말단 절편들에서 각각 9.5 대비 83, 6.8 대비 35, 및 2 대비 38 hr.ug/mm).
HNS가 대부분의 말초 기관들에서 검출가능하지 않더라도, IT 투여 이후 간에서는 1 mg/kg에서 1시간 정도 (투여 이후 첫 영상 시간대)로부터 96시간 (네 마리 동물의 세 마리)까지 또한 10 mg/kg에서 192시간까지로 측정가능하였다 (도 158). 간에서 농도들은 1 mg/kg의 IT투여 이후 2시간 또한 10 mg/kg의 IT투여 이후 7시간의 피크에 도달하였고, 이는 일차 역학을 가진 제거 단계로 이어졌다. 제거의 일정한 속도는 해당하는 더 짧은 t1/2를 가지고 (1 및 10 mg/kg의 용량들 각각에서 28 ± 16 대비 42 ± 1, p=0.76), 1 mg/kg에서는 (λz 0.030 ± 0.011/hr) 10 mg/kg보다 (λz 0.017 ± 0/hr) 더 빨랐다 (p=0.10). AUClast 수치는 10 mg/kg에서와 비교하여 약 40배 감소하였다 (각각 204 ± 50 대비 7987 ± 3276 ug/g).
1 및 10 mg/kg의 용량들에서 124 I-HNS로 정맥내 치료
도 159 내지 도 163에 각각 나타난 바와 같이, 1 및 10 mg/kg의 HNS를 IV 투여한 이후, 뇌, 간, 신장, 심장 (폐 조직 포함) 및 피부에서 농도가 시간의 함수로서 좌표 표시되었다. 이들 기관들의 경우 첫 정적 영상 시간대가 투여 이후 1시간이기 때문에, 이들 농도-시간 곡선들의 초기 단계는 본 연구에서 관찰될 수 없었다. 간, 신장, 심장 및 피부의 경우 농도-시간 곡선들이 IV 투여 이후 1으로부터 8시간까지 일정한 단계를 보여주었다. 본 일정한 단계는 투여 이후 뇌에서 24시간 동안 지속되었고, 뇌가 IV 투여된 단백질을 말초 기관들에 의한 것보다 느리게 흡수하는 점을 제시하였다. 나머지 결과는 대략 일차 역학으로 최종 제거 단계를 표시하였다.
간, 신장, 심장 및 피부에서 제거 반감기들은 1 및 10 mg/kg에서 각각 간의 경우 47 ± 10 및 38 ± 13 시간, 신장의 경우 54 ± 25 및 29 ± 16 시간, 심장의 경우 36 ± 15 및 42 ± 19 시간, 피부의 경우 40 ± 21 및 31 ± 13 시간인 한편; 뇌에서의 반감기는 1 및 10 mg/kg에서 각각 71 ± 23 및 60 ± 53 시간 (10 mg/kg 그룹에서 래트 3은 t1/2을 결정하는 데 불충분한 데이타로 배제됨)이었다. 통계적 차이들은 이들 기관들에서 신장의 경우 p 수치 < 0.03를 제외하고 1 및 10 mg/kg에서의 반감기들 간에 관찰되지 않았다.
간, 피부, 심장, 심장 및 뇌의 경우 Cmax의 평균 수치들은 1 mg/kg에서 9.6, 0.3, 0.25, 0.22, 및 0.08 ug/g 또한 10 mg/kg에서 132, 7.9, 3.9, 3.7 및 1.8 ug/g이었다. 10 mg/kg에서 Cmax 와 1 mg/kg에서 해당하는 수치들의 비율들은 이들 기관들의 경우 14, 26, 16, 17 및 23이었다. 개별 동물로부터 얻은 Cmax 수치들은 용량으로 정상화된 이후, Cmax/용량 수치들은 모든 이들 기관들에서10 mg/kg에서는 1 mg/kg 에서보다 유의하게 더 높았다 (간의 경우 대부분의 p 수치들 <0.05, p=0.06). 간, 피부,신장, 심장 및 뇌의 경우 AUClast의 수치들은 1 mg/kg에서 525, 16, 14, 9.3 및 7 hr.ug/g; 또한 10 mg/kg에서 6747, 276, 183, 201 및 86 hr.ug/g이었다. 10 mg/kg에서 AUClast 와 1 mg/kg에서 해당하는 수치들의 비율들은 이들 기관들의 경우 각각 13, 17, 13, 22 및 12 이었다. 정상화 이후, AUClast/용량 수치들은 10 mg/kg에서는 피부에서 1 mg/kg에서보다 유의하게 더 높았고 (p<0.01), 심장에서 최저한 서로 달랐고 (p=0.06), 간, 뇌 및 신장에서는 유의하게 서로 다르지 않았다 (모두 p 값 >0.34).
이들 관찰들은 (1) 대부분 기관들에서 반감기들이 뇌를 제외하고 (3일) 약 2일이었고; (2) 간에서 그램 당 노출이 뇌의 노출보다 더 큰 피부, 심장 및 신장보다 더 컸고; (3) 용량에서 10배 증가로 (10 / 1 mg/kg), 10 mg/kg에서 모든 테스트된 기관들로부터 얻은 Cmax가 1 mg/kg에서의 것보다 10배 이상 증가된 점을 제시하였다.
IV 투여 이후에, 뇌에서 피크 농도는 1- 24 시간 (Tmax)에 달하였다.
IV 대비 IT 치료들
1 및 10 mg/kg으로 IV 및 IT 투여 이후, 뇌 및 간에서 농도-시간 곡선들은 각각 도 164 및 도 165에서 비교되었다. 1 및 10 mg/kg으로 IV 및 IT 투여에 의해 뇌에서 Cmax의 비율들은 각각 3212 및 150이었다. AUC0-192시간의 이들 비율들은 1136 및 978이었다. 이들 관찰들은 HNS의 동일한 용량이 투여될 때, 경막내 투여가 정맥내 투여의 결과보다 대략 3-로그 이상 뇌의 노출을 가져오는 점을 가르켰다. 뇌에서 제거 반감기는 둘 다의 용량 수준들에서 IT에 의해 2일 (1 및 10 mg/kg에서 45 및 49시간) 또한 IV 투여에 의해 3일 (1 및 10 mg/kg에서 71 및 60시간)이었다.
그러나, IT 투여 이후 간 노출들은 HNS의 동일한 용량에서 IV 투여 이후의 노출과 유사하였다. 간에서 1 mg/kg 및 10 mg/kg에서 IT/IV에 의한 Cmax의 비율들은 각각 0.5 및 0.8이었고 AUClast의 비율들은 0.4 및 1.2이었다.
결론들
124I-설파미다제 (HNS)의 약물역학 및 생체분배 프로파일들은 단일 1 또는 10 mg/kg의 124I-설파미다제의 정맥내 또는 경막내 투여 이후에 래트들에서의 조직 PET 영상들에 의해 연구되었다. 농도-시간 데이타는 투여 이후 0.05, 1, 2, 4, 8, 24, 48, 96 및 192시간에 관심있는 부위들에서 동적 (처음 20분) 및 정적 둘 다로 획득되었다. IT 투여 이후 동적인 영상화에 의해, 머리 부위에서 HNS의 전체량은 처음 20분에 0.005/분 - 0.007/분 (평균 λz)의 유사한 일정한 속도로 감소되었다. 정적인 영상화에 의해 뇌로부터 제거율들은 필수적으로 두 테스트된 용량들에서 약 2일의 유사한 반감기를 가지면서 동일하였다 (λz: 1 및 10 mg/kg 각각의 경우 0.016/시간 대비 0.014/시간).
Cmax 및 AUClast의 수치들은 투여된 용량들과 비례적이었다. 선형 PK 행동은 이들 IT 단일 투여 요법들에서 주어진 1 내지 10 mg/kg의 용량 범위로 표시되었다.
농도 구배들은 용량 수준들 둘 다에서 척수의 전방으로부터 말단까지 관찰되었다.
IT 투여 이후, 피크 농도는 전방에서 20분 주변, 중간에서 1 내지 4시간, 또한 말단 절편들에서 1 내지 8시간이었다. 선형의 PK 행동은 척수의 서로 다른 절편들에서도 역시 표시되었다.
IT 투여 이후에, HNS 단백질은 1 mg/kg에서 매우 초기 시간대로부터 96시간 또한 10 mg/kg에서는 192시간까지 측정가능하였다. 제거의 속도는 더 낮은 용량에서 해당하는 더 짧은 t1/2를 가지고 (1 및 10 mg/kg의 용량들 각각에서 28 ± 16 대비 42 ± 1시간), 1 mg/kg에서는 (λz 0.030 ± 0.011/hr) 10 mg/kg보다 (λz 0.017/hr) 더 빨랐다.
IV 투여 이후에, 간, 신장, 심장 및 피부에서 제거 반감기들은 1 및 10 mg/kg에서 각각 간의 경우 47 ± 10 및 38 ± 13 시간, 신장의 경우 54 ± 25 및 29 ± 16 시간, 심장의 경우 36 ± 15 및 42 ± 19 시간, 피부의 경우 40 ± 21 및 31 ± 13 시간인 한편; 뇌에서의 반감기는 71 ± 23 및 60 ± 53 시간이었다. 간, 피부, 심장, 심장 및 뇌의 경우 Cmax의 평균 수치들은 1 mg/kg에서 9.6, 0.3, 0.25, 0.22, 및 0.08 ug/g 또한 10 mg/kg에서 132, 7.9, 3.9, 3.7 및 1.8 ug/g이었다. 개별 동물로부터 얻은 Cmax 수치들은 용량으로 정상화된 이후, Cmax/용량 수치들은 모든 이들 기관들에서 10 mg/kg는 1 mg/kg 에서보다 유의하게 더 높았다 (간의 경우 대부분의 p 수치들 <0.05, p=0.06). 간, 피부, 신장, 심장 및 뇌의 경우 AUClast의 수치들은 1 mg/kg에서 525, 16, 14, 9.3 및 7 hr.ug/g; 또한 10 mg/kg에서 6747, 276, 183, 201 및 86 hr.ug/g이었다. 정상화 이후, AUClast/용량 수치들은 10 mg/kg에서는 피부에서 1 mg/kg에서보다 유의하게 더 높았고 (p<0.01), 심장에서 최저한 서로 달랐고 (p=0.06), 간, 뇌 및 신장에서는 유의하게 서로 다르지 않았다 (모두 p값>0.34).
실시예 23. HNS로 산필리포 증후군 A형 (산필리포 A형) 환자들의 치료
예로, IT 전달을 통한 직접 CNS 투여는 산필리포 A형 환자들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예는 산필리포 A형을 가진 환자들에게 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 통해 투여된 rhHNS의 전부 40주 동안 격주로 (EOW) 3번 용량 수준들까지의 안전성을 평가하도록 설계된 다중심 용량 점증 연구를 설명하고 있다. 인간 치료에 적합한 다양한 대표적인 경막내 약물 전달 장치들이 도 94-97에 나타나있다.
20명까지의 환자들이 참가할 것이다:
집단 1: 5명 환자들 (최저 용량)
집단 2: 5 명 환자들 (중간 용량)
집단 3: 5 명 환자들 (최고 용량)
5명 환자들이 무작위로 미치료될 것이다.
환자들은 다음의 판단기준의 포함을 기초로 하여 연구를 위해 선택된다.
±산필리포 A형을 가진 환자들에서 40주 동안 IT 주사에 의해 투여된 rhHNS의 상승 용량들의 안전성이 결정된다. 추가적으로, 총 운동 기능 및 혈청에서 단일, 반복-용량 약물역학에 미치는 rhHNS의 임상적 활성 또한 뇌척수액 (CSF)에서 농도들이 평가된다.
NAGLU-IGFII의 IT 전달의 실시예들
실시예 24. rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 시험관내 연구
Naglu 변형체들 각각에 의한 세포성 흡수의 기작은 산필리포 B형 환자 섬유모세포들의 두 가지 세포주들 GM02391 (P359L) 및 GM 01426 (E153K), 또한 정상적 인간 섬유모세포 세포주를 사용하여 연구되었다. 세포주 상의 M6P 수용체의 발현 덕분에, 섬유모세포들은 통상적으로 리소좀 효소들의 세포성 흡수의 연구를 위하여 연구자들이 사용하고 있다.
세포성 흡수 연구들은 rhNaglu 또는 Naglu-IGFII를 가지는 섬유모세포들을 37?C에서 4시간 동안 배양하여 시행되었다. 세포들은 배양 이후에 세척되었고 용해되었으며, 세포 용출물들에서 Naglu 효소적 활성이 측정되었다. 섬유모세포들을 사용한 rhNaglu의 배양은 세포내에서 효소의 검출가능한 양을 유도하지 못했다. 대조적으로, 섬유모세포들를 사용한 Naglu-IGFII의 배양은 세포내에서 효소의 현저한 수준을 유도하였다 (도 166). 내재화된 Naglu-IGFII의 양은 배양에 사용되는 효소의 양이 증가하면서 포화 상태에 도달하였다. 용량 의존적 포화 흡수가 수용체 매개된 세포성 흡수에 관한 전형적인 발견이다. 또한, Naglu-IGFII의 내재화는 외인성 M6P에 의해 저해되지 않지만, 외인성 IGFII에 의해서는 완벽하게 저해되었다 (도 166). 본 결과는 섬유모세포 내로 Naglu-IGFII 내재화가 당화 비의존적 방식으로 M6P/IGFII 수용체에 의존하는 점을 가르켰다.
또한 실험은 rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 리소좀들로의 이동 (trafficking)을 연구하도록 시행되었다. 산필리포 B형 환자 섬유모세포들 (GM01426)이 본 연구를 위해 사용되었다. rhNaglu 및 Naglu-IGFII의 검출은 세포들로 단백질들의 초기 배양 이후에 세포들을 항-인간 Naglu 폴리클론 항체로 염색하여 조사되었다. LAMP-1 (리소좀 연관된 막 단백질 1)의 면역형광 염색이 리소좀들의 검출에 사용되었다. 리소좀들과 rhNaglu 및 Naglu-IGFII 의 공동-정착은 공초점 현미경관찰에 의해 영상화되었다 (도 167).
Naglu-IGFII의 강한 내재화는 세포들을 사용한 단백질의 배양 4시간 이후에 관찰되었고, 리소좀들과 Naglu-IGFII의 공동-정착이 나타났다. 반대로, rhNaglu는 동일한 시간대에서 내재화를 보여주는 데 실패했고 리소좀들과의 공동-정착도 전혀 관찰되지 않았다. 본 결과는 좀 더 나아가 Naglu-IGFII가 세포들 내로 내재화되고 정확한 세포성 구획인 리소좀들로 운반되는 증거를 제공하였다. 산필리포 B형 환자 섬유모세포들에서 내재화된 Naglu-IGFII의 반감기는 1.5일인 것으로 결정되었다 (결과 미도시).
실시예 25: 마우스 모델들에서 생체내 연구들
야생형 (wt)관삽입 래트
산필리포 B형 마우스 모델과 추가하여, 비결함 동물 모델인 wt 관삽입 (cannulated) 래트가 생체내 분자 검색에 역시 사용되었다. wt 관삽입 래트들은 척수의 상부 요추 및 하부 흉추에 외과적으로 이식된 삽입관 (cannula)을 가지고, CSF로 35ul의 단일 주사가 삽입관을 통해 시행되었다. 본 동물 모델을 사용한 분자 검색을 위해 접근하는 판단기준은 Naglu 활성 검정법 또한 뇌 및 척수의 면역조직화학이다.
산필리포 증후군 B형 마우스 모델
산필리포 증후군 B형의 마우스 모델 (Naglu-/- 마우스, 산필리포 B형 마우스)은 뉴펠드 (E. Neufeld) 등에 의해 생성되었다 (Li HH, et al., PNAS 96(25):14505-14510; 1999). 마우스 Naglu 유전자의 6번 엑손이 선별 마커인 네오마이신 저항성 유전자의 삽입에 의해 파괴된다. 그 결과 나온 동형접합체 Naglu-/- 마우스는 완벽하게 Naglu 결함성이고 (도 168), 간 및 신장에서 GAG 축적 전부를 가진다. Naglu의 완전한 결함에도 불구하고, 이들 마우스는 일반적으로 건강하고, 8-12개월의 수명을 가진다. 다른 리소좀 효소들의 발현 변화들은 5개월령 주변에서 일어나고, 이들 발현들은 간에서 β-갈락토시다제, β-글루코시다제, β-글루쿠로니다제 (β-glucuronidase), 및 β-헥소아미다제 (β-hexosaminidase)의 보상적 증가를 포함하고, 뇌를 제외한 간에서 β-L-이듀로니다제 (β-L-iduronidase)의 상승 또한 간 및 뇌에서 뉴라미다제 (neuraminidase)의 감소를 포함한다. 때로는 사망이 소변 정체 및 요로 감염의 결과로서 발생한다. 산필리포 B형 마우스 모델이 산필리포 B형의 병리학적 변화들을 나타내도록 문헌에서 광범위하게 연구되어 있다. Naglu-/- 마우스의 CNS 병리학과 관련된 표현형은 4.5개월령에서 과소-활동성이라고 보고되어 있지만, 다른 연령들에서는 과다 활동성도 역시 관찰되어 왔다.
Naglu-/- 마우스에서 신경-병리학적 변화들은 EM (전자현미경)에 의해 관찰된 바와 같이 뉴런들, 대식세포들 및 표피세포들에서 공포들 (vacuoles) 및 봉입체들로서 기술된다. 이들 병리학적 변화들은 33일령에 시작하고, 동물들이 나이가 들면서 점차 악화된다. 활성화된 별아교세포 및 미세교아세포들도 역시 조직-병리학적 분석에 의해 나타난다. 두 가지의 갱글리오사이드들 GM2 및 GM3의 생화학적 분석은 뇌에서 5배 및 9배 증가를 보여주었다. (GM2 및 GM3가 Naglu의 직접적 기질들이 아니기 때문에, ERT 이후 짧은 시간 동안 유의한 감소를 보여주는 것이 문제가 될 수 있고, 그들은 POC에 대한 최종 생물마커로서는 사용될 수 없다.
생화학적 분석은 Naglu 효소 활성들 및GAG 수준들의 측정에 의해 시행되었다. 조직학적 분석은 항-인간 Naglu 항체, 항-LAMP-1 항체, 항-Iba-1 항체 및 항-GFAP 항체 면역조직화학에 의해 시행되었다. 본 연구에 사용되는 항-인간 Naglu 항체는 wt 마우스에서 내인성 마우스 Naglu 또는 산필리포 B 형 마우스에서 돌연변이 Naglu와 결합하지 않는 마우스 모노클론 항체이었다. LAMP-1 면역염색은 리소좀 막 단백질, 리소좀 연관된 막 단백질-1과 결합하는 항체를 사용하였다. Iba-1 염색은 미세교아세포들 및 대식세포들에 특이적인 이온화된 칼슘-결합 어댑터 단백질과 결합하는 항체를 사용하였다. GFAP 염색은 별아교세포에 특이적인 신경교 원섬유 산성 단백질 (glial fibrillary acidic protein)과 결합하는 항체를 사용하였다.
산필리포 B형 마우스 내 경막내 (IC) 주사에 의해 생체내 생물학적 활성 검색
본 연구의 목적은 생체내 Naglu 효소들의 생물학적 활성을 평가하는 것이었다. 본 연구에서, 단백질들은 산필리포 B형 마우스의 뇌 내 IC 주사를 통해 투여되었다. 본 연구를 위한 산필리포 B형 마우스의 연령은 8주령이 되도록 잘 맞추었다. IC 주사 경로는 분자들의 효능을 평가하는 데 최고의 사례 시나리오를 제공하였다. Naglu 단백질들은 리소좀 축적을 감소시키도록 신경세포들 내로 흡수되는 능력에 의해 평가되었다. 면역조직화학이 생체분배을 평가하는 데 사용되었다. 또한 리소좀 축적은 LAMP-1 면역염색을 사용하여 양성 염색의 숫자 및 크기로 특성분석되었다.
IC 주사는 산필립포 B형 마우스의 두개골을 통하여 우대뇌 피질 내로 직접 주사에 의해 시행되었다. 2마이크로리터, 또는 35 ug의 Naglu 단백질이 각 동물 내로 주사되었다. 동물들의 희생은 주사 이후 7일에 일어났다. 희생 시간은 동물의 희생들이 주사 이후 3, 7, 및 14일에 일어나는 파일럿 연구에서 선-결정되었다. 파일럿 연구로부터, 주사 이후 7일이 면역조직학적 연구를 위해 최적 시간인 점이 결정되었다. 뇌 절편들은 대각선으로 절단되었고 (도 169), Naglu 및 Lamp-1 면역염색이 수행되었다. rhNaglu 및 Naglu-IGFII 처리된 산필리포 B형 마우스에서 뉴런들 및 교아세포들 둘 다 내로 세포성 흡수가 항-인간 Naglu 항체를 사용하는 면역조직화학에 의해 나타났다 (도 170 및 도 171). 세포성 흡수에 관하여 rhNaglu 및 Naglu-IGFII 처리된 산필리포 B형 마우스 간 유의한 차이가 전혀 없었다. 추가적으로, rhNaglu 및 Naglu-IGFII 처리된 마우스 둘 다의 뇌 조직의 LAMP-1 면역염색은 리소좀 축적의 유의한 감소 수준을 가리키고 있다. rhNaglu 및 Naglu-IGFII 처리된 그룹들 둘 다에서 리소좀 축적 감소의 수준은 정상 wt 마우스의 수준과 거의 동일하였다.
리소좀 축적의 감소는IC 주사 이후에 Naglu-TAT, Naglu-Kif 및 PerT-Naglu 테스트된 산필리포 B형 마우스에서도 역시 관찰되었다 (결과 미도시). 본 연구는 Naglu의 변형체들 모두의 생체내 생물학적 활성을 보여주었다.
별도의 연구에서, Naglu-결함성 마우스는 운반체 또는 임의적으로 PBS에 넣은 재조합 Naglu-IgF-II 융합 단백질 제작물 (Naglu)의 매주 1, 2 또는 3번 용량들이 IT 투여되었다. 미치료된 야생형 마우스 그룹이 미치료 야생형 대조군으로서 제공되었고 Naglu 없이 운반체가 투여되었다. 마우스는 최종 주사에 이어서24시간에 희생되었고 면역조직화학 (IHC) 및 조직병리학적 분석을 위해 조직 준비가 이어졌다.
Naglu-결함성 마우스의 뇌 조직들로 Naglu의 배분은 재조합 Naglu의 IT 투여에 이어서 명백하였다. 도 172A에 도시된 바와 같이, Naglu-결함성 마우스로 재조합 Naglu의 IT-투여는 운반체를 IT-투여한 Naglu-결함성 마우스와 대비하여 백색질에서 세포성 공포화의 광범위한 감소를 가져왔다. 유사하게, 또한 도 172B에 도시된 바와 같이 형태측정 분석은 미치료된 Naglu-결함성 마우스와 대비하여 치료된 마우스의 백색질 조직들에서 LAMP1 면역염색의 현저한 감소를 보여주었고, 질환 병리학에서 향상을 반영하였다.
도 173A-B에서 도시된 바와 같이, 평가된 뇌 조직의 각 영역에서 (피질, 미상엽 및 조가비핵 (CP), 시상 (TH), 소뇌 (CBL) 및 백색질 (WM)) LAMP-양성 영역은 미치료된 Naglu-결함성 마우스와 대비하여 Naglu-치료된 마우스에서 감소되었고, 야생형 마우스의 LAMP-양성 영역과 근접하였다. 상세하게, 분석된 뇌 조직의 각 영역에서 LAMP-양성 영역들이 Naglu 의 단일 용량과 대비하여 (도 173A) 두 번 또는 세 번 용량의 IT 투여 (도 173B)에 이어서 좀 더 감소되었던 점이 주목가능하다.
이들 결과들은 IT-투여된 Naglu가 Naglu-결함성 마우스 모델에서 산필립포 증후군 B형과 같은 리소좀 축적병들의 진행을 변경시킬 수 있는 점을 입증하고 좀 더 나아가 산필립포 증후군 B형과 같은 리소좀 축적병들과 연관된 CNS 소견들을 치료하는 Naglu와 같은 IT-투여된 효소들의 능력을 입증하고 있다.
야생형 (wt)관삽입 래트 내 경막내 (IT) 주사에 의한 분자 검색
본 연구는 약물 투여를 위한 포트-매개 접근법을 직접적으로 모방하고 있다.
Naglu 단백질은 뇌의 실질 내로 생체분배를 결정하도록 wt 관삽입 래트들 내 IT 주사들을 통해 투여되었다.
*이들 동물들에서 삽입관은 척수의 상부요추 및 하부 흉부에 두었다 (도 174). 동물들은 35 ul, 또는 385 ul의 rhNaglu, Naglu-TAT, Naglu-IGFII 및 PerT-Naglu로 삽입관을 통해 주사되었다 (용해도 제한으로 인해, Naglu Kif는 나머지 Naglu 보다 10배 이하인 단지 38.5 ug만 주사되었다). 희생들은 주사들 이후 4시간 및 24시간에 시행되었다.
뇌 및 척수 조직들이 수집되었고 Naglu 활성 검정법에 의해 측정되었다. 치료된 동물들의 뇌에서, Naglu-TAT 및 Naglu-IGFII 치료된 동물들은 rhNaglu 및 다른 모든 Naglu 변형체들 치료된 동물들보다 높은 활성을 나타냈다 (도 175). 일반적인 경향으로서, Naglu 활성은 모든 치료된 동물들의 경우 뇌에서보다 척수에서 유의하게 더 높았다 (결과 미도시). 본 현상은 단백질들이 IT 주사에 가까운 부위에서 더 많이 흡수되는 점을 가리킬 수 있다.
면역조직화학 분석은 IT 주사들 이후 24시간에 Naglu-IGFII 치료된 그룹의 생체분배이 뇌에서 다른 모든 Naglu 변형체들 치료된 그룹보다 더욱 광범위한 점을 가르켰다 (도 176 및 도 177). rhNaglu 치료된 동물들에서, 단백질은 뇌의 척수막에서만 관찰되었다. 척수 절편에서는, IHC가 회색질의 뉴런들에서 rhNaglu의 세포성 흡수를 가리켰지만, 척수의 뉴런들에서 Naglu-IGFII 흡수보다 훨씬 더 적은 정도이었다 (결과 미도시).
Naglu-TAT IT 주사된 그룹에서, 최고의 Naglu 활성이 생화학적 분석에 의해 뇌 조직에서 관찰되었더라도, IHC는 뇌척수막 상에 남아있는 것이 아닌 뇌의 실질 내로 Naglu-TAT침투를 가르키는 데는 실패하였다. Naglu-IGFII이외에 기타 다른 Naglu 변형체들 모두는 뇌척수막을 초과하는 생체분배를 보여주는 데 실패하였고, 이는 IT 주사 이후 뇌에서 Naglu의 세포성 흡수를 위해 M6P/IGFII 수용체들 의존성의 강한 증거이다. 본 연구는 산필리포 B형에 대한 약물 개발을 위한 선도적 분자로서 Naglu-IGFII를 지적하였다.
실시예 26. Naglu-IGFII를 사용한 개념 연구의 증거
실험적 설계
개념 연구의 증거는 산필리포 B형 마우스에서 Naglu-IGFII의 IT 투여 이후에 생체분배 및 리소좀 축적의 역전 둘 다를 보여주도록 설계되었다. 본 연구를 위해, 8주령의 산필리포 B형 마우스의 세 가지 그룹들이 Naglu-IGFII의 IT 주사로 치료되었다. 각 IT 주사는 Naglu-IGFII의 10ul 부피 또는 260 ug으로 구성되었다. 세 가지의 치료된 그룹들, 1x 주사, 2x 주사, 및 3x 주사 그룹이 있었다. 1x 주사 그룹의 경우, 단백질의 단일 용량이 0일에 투여되었다. 주사 이후 24시간에 동물들은 희생되었다. 2x 주사 그룹의 경우, 두 번의 IT 주사들이 0일 및 7일에 투여되었고, 마지막 주사 이후 24시간에 동물들은 희생되었다. 3x 주사 그룹의 경우, 세 번의 IT 주사들이 0일, 7일 및 14일에 투여되었고, 마지막 주사 이후 24시간에 동물들은 희생되었다. 운반체 처리된 마우스의 세 가지 그룹들도 역시 포함되었다. 운반체 대조군 그룹들의 경우, 산필리포 B형 마우스는 치료된 그룹들과 동일한 시간 간격으로 주사되었고 치료된 그룹과 동일한 방식으로 희생되었다.
생화학적 및 조직학적 분석들 둘 다가 본 연구의 성과를 평가하는 데 적용되었다. 생화학적 분석은 조직에서 효소들의 양을 측정하는 Naglu 활성 검정법 및 리소좀 축적의 감소를 평가하는 전체 GAG 검정법을 포함한다. 간 및 뇌는 생화학적 분석들을 위한 두 가지의 조직이었다 (도 178 및 도 179). 조직학적 분석들은 형태학적 평가를 위한 조직들의 H&E 염색 (결과 미도시), 또한 항-인간 Naglu 항체, LAMP, Iba 및 GFAP로의 면역조직화학적 염색을 포함한다 (Iba 및 GFAP 염색 결과는 미도시).
본 연구에 사용되는 항-인간 Naglu 항체는 wt 마우스에서 내인성 마우스 Naglu 또는 산필리포 B 형 마우스에서 돌연변이 Naglu와 결합하지 않는 마우스 모노클론 항체이었다. LAMP-1 면역염색은 리소좀 막 단백질, 리소좀 연관된 막 단백질-1과 결합하는 항체를 사용하였다. Iba-1 염색은 미세교아세포들 및 대식세포들에 특이적인 이온화된 칼슘-결합 어댑터 단백질과 결합하는 항체를 사용하였다. GFAP 염색은 별아교세포에 특이적인 신경교 원섬유 산성 단백질과 결합하는 항체를 사용하였다.
Naglu 면역형광의 대표적인 현미경적 도면들은 도 180에 나타낸다. 도 181는 뇌의 대표적인 절편 도면을 나타낸다. Naglu-IGFII가 뇌척수막에 가까운 대뇌 피질 내에 검출되더라도, 미상엽핵, 시상, 및 백색질과 같은 피질하 부위에서 발견되지 않았다 (결과 미도시). 동일한 피질하 영역들의 LAMP-1, Iba-1 및 GFAP 면역염색이 리소좀 축적의 역전을 보여주기 때문에, 깊은 뇌 영역들에서 Naglu의 음성 면역염색은 아마도 Naglu 면역형광의 민감도로 인한 것이라고 여겨졌다.
Lamp-1 면역염색의 대표적인 현미경적 도면들은 도182 내지 도186에 나타낸다. 단백질 분포 및 효능의 정도를 기술하기 위하여, 미상엽핵, 시상 및 백색질과 같은 대뇌 피질 및 피질하 부위들 또한 소뇌 피질이 면역조직학적 분석을 위해 선택되었다. Iba-1 및 GFAP 면역염색으로부터 나온 결과 (결과 미도시)는 LAMP-1 면역염색에서 관찰되는 것이 뉴런들에 추가하여 산필리포 B형 마우스 모델 (Li 2002, Ohmi 2002)에서 영향받는 것으로 보고된 두 가지 세포 유형들인 미세교아세포들 및 별아교세포들의 변화들의 조합된 효과인 점을 가르켰다. 기술적인 한계들로 인해, LAMP-1 면역염색은 뉴런들에서 리소좀 축적을 드러낼 수 없었다. 뉴런들에서 공포들 및 봉입들과 같은 리소좀 축적을 가장 잘 관찰하기 위하여, 전자현미경법이 보통 사용된다 (EM은 현 연구에는 포함되지 않았다).
세포 유형들의 동정이 뉴런들 및 교아세포들에 제한되는 점을 이해할 것이다. 전형적으로 뉴런들은 진하게 염색된 하나 이상의 핵인을 포함하는 비교적 크고 창백한 핵, 및 빈번하게 검출가능한 세포질에 의해 확인되었다. 일반적으로 교아세포들은 작고 진한 핵 및 불명확한 세포질에 의해 확인되었다. 별아교세포들, 미세교아세포들, 뇌실막 세포들 및 희소돌기아교세포들과 같은 교아세포들의 서로 다른 유형들 간 구별은 전형적으로 세포 유형 특이적 마커들을 가진 염색에 의해 최고로 잘 시행된다.
LAMP-1 면역염색에 의해 나타나는 리소좀 축적의 감소에 추가하여, Iba-1 면역염색은 Naglu-IGFII 의 IT 주사들 이후에 교아세포들에서 세포 크기 및 공정들 (processes)의 수의 감소를 가리켰고, 또한 GFAP 면역염색은 별아교세포들, 대뇌 피질, 미상엽핵, 시강, 백색질 및 소뇌에서 세포 크기 및 공정들의 길이/수의 감소를 가르켰다. (결과 미도시). 또한 면역조직화학의 경우 조사된 것과 동일한 영역들로부터 나온 뇌 조직의 H&E 염색 (헤마톡실린 및 에오신)에 의한 조직병리학적 분석은 Naglu-IGFII의 3x IT 주사 이후 교아세포들에서 공포들의 감소를 보여주었다. 상기 언급된 모든 결과는 Naglu-IGFII IT 주사들의 용량-관련 효과도 역시 제시하였다.
Naglu-IGFII 의 IT 주사 이후에 산필리포 B형 마우스의 생화학적 분석들은 뇌 및 간에서 Naglu 활성을 검출하였다. Naglu-IGFII 의 효능은 뇌 및 간에서 전체 GAG 감소에 의해 나타났다. 면역조직화학은 뇌의 실질에서 Naglu-IGFII의 생체분배을 보여주었다. LAMP-1, Iba-1, GFAP의 면역염색 및 H&E 염색에 의한 조직병리학적 분석은 뇌의 대뇌 피질 영역뿐만 아니라 피질하 영역들, 백색질 및 뇌의 소뇌 피질에서 리소좀 축적의 감소, 미세교아세포들 및 별아교세포들에 의한 크기 및 공정의 감소를 나타냈다.
결론들
무엇보다도, 융합 단백질인 Naglu-IGFII는 Naglu의 원래 기질과 유사한 구조를 가지는 기질에 대한 시험관내 효소적 활성을 나타냈다. 시험관내 세포성 흡수 연구는 분자가 M6P 당화에 비의존적인 방식으로 M6P/IGFII 수용체에 의해 세포들로 흡수되는 점을 보여주었다. 내재화된 Naglu-IGFII는 리소좀들과 공동-정착하는 것으로 관찰되었다. Naglu-IGFII는 산필리포 B형 마우스 내로 IC 주사 이후에 생체내에서 리소좀 축적을 감소시키는 것으로 관찰되었다. rhNaglu 및 기타 다른 Naglu 융합들 및 변형들과 비교하여, Naglu-IGFII는 IT 투여 이후에 wt 관삽입된 래트의 뇌 실질 내로 침투하는 데 그들을 모두 능가하였다. 마지막으로, 산필리포 B형 마우스 내로 Naglu-IGFII의 IT 주사는 뇌척수막을 넘어 광범위한 배분 또한 대뇌 피질 뿐만 아니라 피질하 부위들에서 리소좀 축적의 관찰된 역전을 잘 보여주었다. 종합하면, 이들 결과는 Naglu-IGFII가 산필리포 B형 질환의 치료를 위한 후보 약물인 점을 가르킨다.
실시예 27. IT 전달된 Naglu-IGFII의 독성, 약물역학 (PK) 및 조직 생체분배 연구들
마우스에서 개념 연구들의 증거
Naglu (-/-) 마우스의 세 가지 그룹들 (n=3)은 단일 IT 요추 일시 주사로서 주어진 260 ug의 Naglu-IGFII를 포함하는 1uL로 주사되었다. 260 ug 용량은 520 mg/kg 노 무게 용량으로 변환된다 (마우스 뇌 = 0.0005 kg). 한 그룹은 0일에 주사되었고 주사 이후 24시간에 희생되었다. 두 번째 그룹은 0및 7일에 주사되었고 마지막 주사 이후 24시간에 희생되었다. 세 번째 그룹은 0, 7, 및 17일에 주사되었고 마지막 주사 이후 24시간에 희생되었다. 각 Naglu-IGFII-투여 그룹은 연령/질환 중등도를 조절하도록 운반체 대조군 그룹과 쌍이 되었다.
뇌 및 간에서 Naglu 효소 활성은 세 가지의 Naglu-IGFII-투여 그룹들의 경우 유사하였다. 간 및 뇌에서 rhNaglu 효소 활성을 비교하면, 간에서 10배 이상의 rhNaglu 효소 활성이 확인되었다. rhHNS 효소 활성의 수준들이 래트들 및 어린 원숭이들에서의 중추적 독성 연구들에서 1-, 3-, 및 6-개월 투여 이후 뇌 및 간에서 비교가능하기 때문에, Naglu (-/-) 마우스에게 주어진 rhNaglu 용량의 일정 부분이 IT로 전달되지 않았을 수 있고 오히려 전신적으로 전달된 것으로 파악된다. 그럼에도 불구하고, 뇌에서 GAG 수준은 3번 IT 주사들 이후 통계적으로-유의한 감소 (p < 0.05)를 나타냈다. 전체 GAG 수준의 용량-관련 경향은 간들에서 관찰되고, 이는 2번 또는 3번 용량들을 받은 그룹들에서 통계적으로 유의하였다 (p < 0.05).
IT 주사 이후 Naglu-IGFII의 생체분배은 뇌척수막을 넘어 뇌의 실질 내에서 잘 관찰되었지만, 깊은 피질하 부위들은 항-Naglu 항체 면역염색에 대해 음성이었다. 리소좀-연관 막 단백질 (LAMP) 면역염색에 의해 리소좀 활성의 감소가 2 또는 3번 용량들만을 준 그룹들에서 관찰되었다. 리소좀 활성 감소의 영역들로는 대뇌 피질 및 미상엽핵, 시상, 및 백색질의 깊은 피질하 부위들을 포함하였다. 따라서, Naglu-IGFII-투여된 동물들에서 다양한 면역염색 변수들의 감소는 NAGLU의 치료적 수준들이 항-NAGLU 면역염색의 부재에도 불구하고 존재할 수 있는 점을 제시하였다. 약화된 염증 반응은 별아교세포들의 신경교 원섬유 산성 단백질 (GFAP) 면역염색 또한 미세교아세포/대식세포들의 이온화 칼슘-결합 어댑터 분자 (Iba) 염색의 감소에 의해 2 또는 3번 용량만이 주어진 그룹들에서 입증되었다. 분석의 영역들은 대뇌 피질 및 미상엽핵, 시상, 및 백색질의 깊은 피질하 부위들을 포함하였다. 래트에서 연구들
S-D 래트는 IT-투여된 Naglu-IGFII의 독성학적 평가를 위한 설치류 종으로서 선택되었다. 그 결과, 16마리 래트들 (성별 당 8마리)이 재조합 Naglu-IGFII 을 최대 실행가능한 용량 (MFD), 및 대략 1/4 및 1/2 MFD (각각 저- 및 중간-용량 수준들)으로 전부 8번 용량을 4일마다 투여받았다.
S-D 래트들에서 단일-용량 PK/생체분배 연구가 수컷 및 암컷 동물들에게 IT-L 투여를 이어서 CSF 및 혈청 농도, 또는 조직 배분을 각각 결정하도록 수행되었다.
독성학 연구들은 수컷 및 암컷 동물들에서 독성학 및 안전성 약물학 (신경학적, 호흡, 및 심혈관 안전성) 관점으로부터 Naglu-IGFII의 IT-L 투여를 평가하도록 설계된다. 이들 연구들에서 독성학적 평가는 임상적 관찰들, 체중들, 음식 소비, 임상적 병리학, 적정한 안전성 약물학 접근법들 (신체 검사 또는 심전도에 의함), 총 조직 및 현미경적 평가를 포함한다. 제한된 수의 CSF 및 혈청 시료들이 채취되었고 Naglu-IGFII 및 테스트 항목에 대한 항체들에 대해 분석되었다. Naglu-IGFII 조직 배분 및 세포하 정착은 효소 활성 검정법 및 면역조직화학에 의해 각각 정량된다. 추가적으로, 선택된 연구들은 주목된 유의한 독성학적 결과들이라면 모두의 전환 능력을 획득하는 회복 기간 또는 가능성있는 지연된 출현 (appearance)을 포함한다.
원숭이들에서 연구들
사이노몰 원숭이는 인간들과 유전적 및 해부학적 유사성으로 인해 IT-투여된 Naglu-IGFII의 독성학적 평가들을 위한 비설치류 종으로서 선택되었고 따라서 더욱 적절한 종이라고 생각된다. 산필리포 증후군 B형 임상시험들을 위한 계획된 환자 집단은 소아 환자가 주어졌기 때문에, Naglu-IGFII의 경막내 약물 전달 장치 (IDDD) 투여를 특징으로 하는 어린 사이노몰 원숭이들에서 만성적 6개월 동성학 연구가 수행된다. 어린 사이노몰 원숭이들은 일반적으로 연구 시작 시 1년 이하의 연령이고 (대략 7-9개월) 무게는 연구 시작 시 900 g 내지 1,500 g이다. 1개월 반복-용량 어린 사이노몰 원숭이 독성 연구로부터 획득된 데이타는 용량 수준 선택 및 6개월 어린 원숭이 연구의 설계를 안내한다. 반복-용량 독성학 연구들은 1 내지 6개월의 기간 동안 기대된 임상적 경로 (IT-L 볼루스) 및 투여의 빈도 (격주; EOW)를 모방하도록 설계된다.
상기에 기술된 바와 같이, 독성학 연구들은 수컷 및 암컷 동물들에서 독성학 및 안전성 약물학 (신경학적, 호흡, 및 심혈관 안전성) 관점으로부터 Naglu-IGFII의 IT-L 투여를 평가하도록 설계된다. 이들 연구들에서 독성학적 평가는 임상적 관찰들, 체중들, 음식 소비, 임상적 병리학, 적정한 안전성 약물학 접근법들 (신체 검사 또는 심전도에 의함), 총 조직 및 현미경적 평가를 포함한다. 제한된 수의 CSF 및 혈청 시료들이 채취되었고 Naglu-IGFII 및 테스트 항목에 대한 항체들에 대해 분석되었다. Naglu-IGFII 조직 배분 및 세포하 정착은 효소 활성 검정법 및 면역조직화학에 의해 각각 정량된다. 추가적으로, 선택된 연구들은 주목된 유의한 독성학적 결과들이라면 모두의 전환 능력을 획득하는 회복 기간 또는 가능성있는 지연된 출현을 포함한다.
실시예 28. Naglu-IGFII 의 EOW 경막내 투여
본 실시예는 Naglu -/- 마우스 모델에서 IT-요추 투여EOW의 실행가능성을 6번 주사들 동안 (3개월 연구) 결정하도록 설계되었다. 본 투여 요법은 매주 투여와 대비하여 임상적으로 더욱 적절할 수 있다.
다음의 실험적 설계를 따라서 8주령의 Naglu -/- 수컷 및 암컷 마우스가 연구되었다: 하기 표 49는 Naglu-IGFI의 EOW IT 전달을 위한 실험적 설계를 나타낸다.
Figure 112021011816093-pat00085
간, 뇌 및 혈청 상의 Naglu 활성 검정, 혈청 상의 항-Naglu 항체 검정, 또한 간 및 뇌 상의 BCA 검정을 포함하는 생리학적 연구들이 수행되었다. 뇌, 척수 및 간 상의 Naglu IHC 또한 뇌 및 척수 상의 Lamp 염색을 포함하는 조직학적 연구들이 수행되었다.
뇌, 척수 및 간이 수집되었고 10% NBF로 고정되었다. 5 um 파라핀 절편들이 조직학적 염색을 위해 준비되었다. Naglu의 면역조직화학적 (IHC) 염색이 주사된 단백질의 세포성 흡수를 검출하는 데 사용되었다. H&E 염색이 형태학적 변화들을 관찰하는 데 사용되었다. 리소좀 활성 및 질환 상태의 표시인자인 LAMP, 활성화된 별아교세포들 및 미세교아세포들에 대한 두 가지 CNS 병리학적 마커들인 GFAP 및 Iba-1는 조직병리학적 개선 평가에 사용되었다.
운반체 및 Naglu-IGFII 치료된 마우스의 뇌, 척수 및 간의 Naglu 면역염색은 뇌 및 척수에서 주사된 Naglu가 IHC에 의해서만 뇌척수막 (M)에서 검출되고, Naglu 양성 염색이 기타 다른 부위들에서는 전혀 검출되지 않는 점을 보여주었다 (도 187). 간에서, 시누소이드 세포들 (S)은 Naglu 양성이었고 Naglu 흡수가 간세포들 (H)에서는 전혀 확인되지 않았다.
운반체 및 Naglu-IGFII 치료된 마우스의 뇌, 척수 및 간의 LAMP 면역염색 및 H & E 염색은 운반체 동물들과 비교하여, LAMP 염색이 Naglu로 치료된 간들 및 척수들 둘 다에서 전체적으로 감소되는 점을 보여주었다. H&E 염색은 간세포들에서의 세포성 공포화가 운반체 처리된 동물들과 비교하여 치료된 그룹에서 명백하게 감소되는 점을 나타냈다 (도 188 및 도 189).
운반체 및 Naglu-IGFII 치료된 마우스의 뇌의 H & E 염색은 3개월 동안 격주로 6번 Naglu-IGFII의 IT 주사 이후에 뇌에서 형태적 향상을 보여주었다. 치료된 뇌에서는, 모든 조사된 부위들에서 세포성 공포화 (화살표)가 운반체 그룹과 비교하여 감소되었다 (도 190)
3개월 동안 6번 Naglu-IGFII IT 주사들 이후에, 다양한 뇌 부위들에서 LAMP IHC는 운반체 처리된 그룹과 비교하여, SFB 마우스에게 Naglu IT 투여가 LAMP 면역염색에 의해 드러나는 모든 조사된 부위들에서 리소좀 활성의 감소를 유도하는 점을 보여주었다 (도 190). 본 감소는 LAMP 양성 세포들의 수의 감소, 더 작은 세포 크기 및 더 옅은 염색을 특징으로 한다. 현저한 감소가 다른 뇌 부위들과 비교하여 척수에 가까운 뇌의 미상엽핵 부분에 위치하는 소뇌 및 뇌줄기에서 확인되었다. 또한 명백한 감소가 백색질, 해마 및 시상을 포함하는 깊은 뇌 부위들에서도 확인되었다.
3개월 동안 6번 Naglu-IGFII IT 주사들 이후에, 다양한 뇌 부위들에서 Iba IHC는 미세교아세포들의 활성화를 드러냈다 (도 191). 운반체 처리된 그룹과 비교하여, 양성 세포들의 수 및 염색 강도에서 감소는 Naglu 치료된 그룹에서 전혀 관찰되지 않았다. 그러나, 양성 미세교아세포들의 세포 형태는 모든 조사된 뇌 부위들에서 운반체 그룹에서 크고 공포화된 것과 대비하여 (삽입) 감소된 세포 크기를 가지면서 변화하였다.
3개월 동안 6번 Naglu-IGFII IT 주사들 이후에, 다양한 뇌 부위들에서 GFAP IHC는 별아교세포 활성화를 드러냈다 (도 192). 운반체 처리된 그룹과 비교하여, GFAP 양성 염색은 소뇌 및 뇌줄기에서 감소되었고, 다른 조사된 부위들에서는 약간 감소되었다.
세포성 흡수에 관하여, 이들 데이타는 뇌 및 척수에서 Naglu가 3개월 동안 격주로 6번 Naglu-IGFII IT 주사 이후에 뇌척수막 세포들에서 검출되었다. Naglu는 뇌 및 척수의 기타 다른 부위들에서는 IHC에 의해 미검출되었다. 간에서, Naglu 양성 염색이 시누소이드 세포들에서 발견되었다.
뇌 및 척수에서 3개월 동안 격주로 6번 Naglu-IGFII의 IT 주사 이후에, 조직병리학적 향상이 주사된 Naglu가 IHC에 의해 미검출 가능하더라도 뇌 및 척수를 전체를 통하여 관찰되었다. H&E 염색은 모든 조사된 뇌 부위들에서 세포성 공포화 감소를 보여주었다. LAMP 염색은 처리된 척수들 전체를 통하여 또한 깊은 뇌 영역들인 백색질, 해마 및 시강을 포함하는 모든 평가된 조직 부위들에서, Naglu-IGFII 치료된 그룹에서 소뇌 및 뇌줄기에서 현저한 감소를 보이면서 감소되었다. 별아교세포들의 경우 GFAP 염색의 감소된 염색 양상은 LAMP 염색과 일치한 한편 LAMP와 같이 극적으로 감소되지는 않았다. Iba-1 염색은 모든 조사된 뇌 부위들에서 미세교아세포들의 세포 크기의 감소를 나타냈다. 간에서, H&E 염색은 Naglu 치료된 그룹에서 LAMP 염색에서 현저한 감소와 함께 세포성 공포화 감소를 보여주었다.
실시예 29. 산필리포 B형 환자들의 치료
예로, IT 전달을 통한 직접 CNS 투여는 산필리포 증후군 B형 (산필리포 B형) 환자들을 효과적으로 치료하는 데 사용될 수 있다. 본 실시예는 산필리포 B형을 가진 환자들에게 경막내 약물 전달 장치 (IDDD)를 통해 투여된 Naglu-IGFII의 전부 40주 동안 격주로 (EOW) 3번 용량 수준들까지의 안전성을 평가하도록 설계된 다중심 용량 점증 연구를 설명하고 있다. 인간 치료에 적합한 다양한 대표적인 경막내 약물 전달 장치들이 도 94-97에 나타나있다.
20명까지의 환자들이 참가할 것이다:
집단 1: 5명 환자들 (최저 용량)
집단 2: 5 명 환자들 (중간 용량)
집단 3: 5 명 환자들 (최고 용량)
5명 환자들이 무작위로 미치료될 것이다.
환자들은 다음의 판단기준의 포함을 기초로 하여 연구를 위해 선택된다.
산필리포 B형을 가진 환자들에서 40주 동안 IT 주사에 의해 투여된 Naglu-IGFII의 상승 용량들의 안전성이 결정된다. 추가적으로, 총 운동 기능 및 혈청에서 단일, 반복-용량 약물역학에 미치는 Naglu-IGFII의 임상적 활성 또한 뇌척수액 (CSF)에서 농도들이 평가된다.
전형적으로, Naglu-IGFII 및/또는 rhNaglu의 치료적 유효량은 질환의 효과들의 본성, 및 정도에 의존하여 또한 기존의 방식을 기초로 하여 규칙적인 간격들로 경막내 투여된다. 본 명세서에서 사용되는 바, "간격"으로 투여는 치료적 유효량이 정규적으로 투여되는 것을 (한 번 용량과는 구별됨) 가르킨다. 간격은 표준 임상 기법들에 의해 결정될 수 있다. 일정 구현예들에서, Naglu-IGFII 및/또는 rhNaglu은 경막내로 격월, 매월, 매월 두 번, 3주마다 한 번, 격주, 매주, 매주 두 번, 매주 세 번, 또는 매일 투여된다. 단일한 개인을 위한 투여 간격은 고정된 간격일 필요는 없지만, 개인의 필요들에 의존하여 기간에 따라 변화될 수 있다. 예를 들어, 신체적 질병 또는 스트레스를 겪는 시기에는, 항-Naglu 항체들이 존재하거나 증가하는 경우, 또는 질환 증상들이 악화되는 경우라면, 용량들 간 간격이 감소될 수 있다.
본 명세서에서 기술된 소정의 화합물들, 조성물들 및 방법들이 소정의 구현예들에 따른 특이성을 가지고 기술되어 왔으며, 다음의 실시예들은 본 발명의 화합물을 단지 기술하기 위해서만 제공되고 이들을 제한하려고 의도하지 않는다.
여기에서 사용되는 바, 용어 표현들 "하나 (a)" 및 "하나 (an)"는 본 명세서에서, 및 청구항들에서 복수의 형태들을 포함하도록 분명하게 반대로 가리키지 않는 경우라면 이해되어야 한다. 그룹의 하나 이상의 구성원들 간 "또는"을 포함하는 청구항들 또는 기술내용들은, 하나, 하나 이상, 또는 모두가 존재하거나 적용되는 경우, 또는 달리 정반대로 표시되지 않는다면 주어진 산물 또는 방법에 적절한 경우, 또는 달리 문맥으로부터 명백한 경우라면 만족되는 것으로 고려된다. 본 발명은 정확히 그룹의 한 구성원이 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 방법에 적절한 구현예들을 포함한다. 또한 본 발명은 그룹의 하나 이상 또는 구성원 전부가 존재하거나 적용되거나, 달리 주어진 산물 또는 방법에 적절한 구현예들도 포함한다. 또한, 본 발명은 달리 표시되지 않는 경우 또는 반박이나 불일치가 나올 수 있는 기술분야의 당업자에게 자명한 경우라면 나열된 청구항들로부터 나온 하나 이상의 제한들, 요소들, 조항들, 기술적 용어들 등이 동일한 기초 청구항 (또는 적절한 다른 청구항)에 의존하는 또 다른 청구항 내로 도입되는 모든 변형들, 조합들, 및 순열들을 포괄하는 것으로 이해된다. 요소들이 리스트로서 표현되는 곳에서는 (예로, 마쿠쉬 (Markush) 그룹 또는 유사한 형식), 요소들의 각 소그룹도 역시 기재되고 또한 요소(들)이라면 모두가 그룹으로부터 삭제될 수 있는 것으로 이해된다. 일반적으로, 본 발명, 또는 본 발명의 관점은 특정한 요소들, 특징들 등을 포함하는 것으로서 언급되는 곳에서는, 본 발명의 소정의 구현예들 또는 본 발명의 관점들은 이러한 요소들, 특징들 등으로 구성되거나 이들로 필수적으로 구성되는 것으로 이해되어야 한다. 간략하게 기술하기 위해, 이들 구현예들은 모든 경우에 본 명세서에서 매우 많은 단어들로 상세하게 설명되지 않았다. 또한 본 발명의 구현예 또는 관점이라면 모두는 상세한 배제가 본 명세서에 재인용되는지 여부와는 상관없이, 청구항들로부터 명확하게 배제될 수 있는 것으로 이해되어야 한다. 본 발명의 배경기술을 기술하고 그의 실행에 관한 추가적인 자세한 사항을 제공하도록 본 명세서에서 참조된 출판물들, 웹사이트들, 및 기타 다른 참고물들은 참고문헌으로 본 명세서에 통합된다.

Claims (19)

  1. 5 mg/ml 초과하는 농도의 리소좀 대체 효소를 포함하는, 리소좀 축적 질환 치료에 유용한 약학 조성물로서, 상기 조성물은 0 초과 20 mM의 인산염을 포함하는, 약학 조성물.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 대체 효소는 10 mg/ml 초과의 농도인, 약학 조성물.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 대체 효소는 30 mg/ml 초과의 농도인, 약학 조성물.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 대체 효소는 10-50 mg/ml 범위의 농도로 존재하는, 약학 조성물.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 인산염은 0 초과 최대 5 nM의 농도로 존재하는, 약학 조성물.
  6. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 조성물은 (i) 표면활성제, 및 (ii) 긴장화제 중 하나 이상을 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  7. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 pH 5.5 내지 7.0을 가지는, 약학 조성물.
  8. 제 1항에 있어서, 경막내 투여용으로 제형화된, 약학 조성물.
  9. 제 1항에 있어서, 뇌실내 투여용으로 제형화된, 약학 조성물.
  10. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 5 mL 미만 부피의 단일 용량 투여용으로 제형화된, 약학 조성물.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 3 mL 미만 부피의 단일 용량 투여용으로 제형화된, 약학 조성물.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 대체 효소는 합성 뇌척수 유체(cerebrospinal fluid: CSF)가 아닌 제형물로 존재하는, 약학 조성물.
  13. 제 1항에 있어서, 동시 면역억제 요법 부재시의 투여용으로 제형화된, 약학 조성물.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 대체 효소는 재조합 이듀로네이트-2-설파타제 (I2S), 아릴설파타제 A (ASA), 헤파란 N-설파타제 (HNS), 알파-N-아세틸글루코스아미니다제 (Naglu) 및 β-갈락토시다제 (GLC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약학 조성물.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 대체 효소는 만노스-6-포스페이트 (M6P) 잔기들을 포함하는, 약학 조성물.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 대체 효소는 융합 단백질인, 약학 조성물.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 대체 효소는 리소좀 표적화 모이어티를 포함하는, 약학 조성물.
  18. 5 mg/ml 초과 농도의 리소좀 대체 효소를 포함하는, 리소좀 축적 질환 치료에 유용한 약학 조성물로서,
    상기 조성물은 0 초과 20 mM의 인산염을 포함하고;
    상기 대체 효소는 합성 뇌척수 유체(cerebrospinal fluid: CSF)가 아닌 제형물로 존재하고; 그리고
    상기 조성물은 경막내 투여용으로 제형화된,
    약학 조성물.
  19. 5 mg/ml 초과 농도의 리소좀 대체 효소를 포함하는, 리소좀 축적 질환 치료에 유용한 약학 조성물로서,
    상기 조성물은 0 초과 20 mM의 인산염을 포함하고;
    상기 대체 효소는 합성 뇌척수 유체(cerebrospinal fluid: CSF)가 아닌 제형물로 존재하고; 그리고
    상기 조성물은 뇌실내 투여용으로 제형화된,
    약학 조성물.
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