CN103091273A - 快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，将直链淀粉和支链淀粉标准品溶液进行波长扫描，分别找出直链淀粉和支链淀粉标准品溶液的吸收峰波长；根据Lambert-Beer定律，通过绘制标准曲线的方式得到两种淀粉组分在吸收峰位置的摩尔吸光系数，联立方程组求解两种淀粉浓度的计算公式，用于快速批量测定。本发明采用比色法可同时测定直链淀粉、支链淀粉和总淀粉的含量，而且准确度高，方便快捷。解决了传统的淀粉测定方法每次只能测定直链淀粉含量或者总淀粉含量，而不能同时测定直链淀粉和支链淀粉含量问题；而且本发明建立的方法不使用浓硫酸、浓盐酸和有毒试剂，使之更加绿色环保、安全性高，成本低廉，使用效果理想。
Description
技术领域
本发明涉及作物淀粉分析技术领域，尤其是一种快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法。
背景技术
高粱[Sorghum bicolor (L.) Moench]是世界上最古老的谷类作物之一，属禾本科（Gramineae）高粱族（Andropogoneae）高粱属（sorghum）。高粱除作为粮食、饲料和能源作物外，也是酿酒工业的主要原料之一。高粱有粳性和糯性之分，不同高粱品种的直链淀粉、支链淀粉及总淀粉含量变异幅度较大，其籽粒淀粉含量及其直链淀粉和支链淀粉的比率与酿酒品质、产量有重要关系。同时，直链、支链淀粉的含量和比例也影响煮饭特性及食味，优良的酿酒型和食用品种选育在粮食生产及酿酒产业上均有重要意义。因此，选择一种快速、准确的淀粉测定方法十分必要。
传统的淀粉含量测定方法有费林试剂滴定法，但其操作繁琐，不易掌握。Rose等对酸水解淀粉的方法和六种比色法测定糖的方法进行比较研究，认为酸解法结合蒽酮比色法是比较理想的方法；翁忠岚对酸水解法进行改进，发明了DNS比色法来测定酿酒高粱中的淀粉含量，并认为具有准确性高、实用性强的特点。然而，上述方法只能测定总淀粉含量，而不能将直链淀粉与支链淀粉的测定区分开来，而且测定过程中需要浓酸和有毒试剂，存在安全隐患。目前最常用的淀粉含量测定方法是旋光法测定粗淀粉含量，结合碘染色法（GB7648-87）测定直链淀粉含量，用两者之差间接得到支链淀粉含量，该方法需要配制不同的反应体系，工作量较大。范明顺等采用双波长分光光度法对高粱直链淀粉和支链淀粉含量测定方法进行了探讨，但两种淀粉在可见光范围内的吸收曲线随着浓度梯度的不同而变化，这就使得参比波长和测定波长处的吸光度不相等，造成较大偏差，并且作图法查找参比波长和测定波长也会产生较大误差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，它测定高粱籽粒中直链淀粉、支链淀粉和总淀粉的含量，而且准确度高，操作方便快捷，并且安全环保，以克服现有技术的不足。
本发明是这样实现的：快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，将直链淀粉和支链淀粉标准品溶液进行波长扫描，分别找出直链淀粉和支链淀粉标准品溶液的吸收峰波长；根据Lambert-Beer定律，通过绘制标准曲线的方式得到两种淀粉组分在吸收峰位置的摩尔吸光系数，联立方程组求解两种淀粉浓度的计算公式，用于快速批量测定；具体步骤如下：
（1）配制终浓度为0.001～0.1 mg/mL碘-淀粉显色反应体系，调节pH 3.0～5.0，显色10～30 min，以双光束可见-紫外分光光度计进行可见光范围内的波长扫描，根据两种淀粉溶液的吸收曲线，找出它们的吸收峰波长λ1（500～560 nm）、λ2（580～700 nm）；
（2）按步骤（1）配置显色反应体系的方式，分别配制终浓度为0～0.04 mg/L的直链淀粉溶液的显色反应体系与终浓度为0～0.1 mg/L的支链淀粉溶液的显色反应体系，在波长λ1、λ2处测定吸光度，以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，其斜率即为摩尔吸光系数ka1、ka2、kb1、kb2，根据Lambert-Beer定律，联立二元一次方程组，求解得两种淀粉的C与A之间的计算公式为：
（3）选取待测定的高粱籽粒磨碎，过40～80目筛，称取50～150 mg过筛的高粱粉配制成浓度为0.5～1.5 mg/mL的高粱粉分散液，取分散液20～40 mL，并加入5～20 mL沸程为30～60℃的石油醚，间歇摇匀5～20 min，静置10～30 min，重复脱脂2～3次，获得脱脂分散液；
（4）取上述的脱脂分散液3～10 mL，按步骤（1）配制显色反应体系，按步骤（2）与步骤（3）计算直链淀粉和支链淀粉的浓度，并根据稀释倍数和样品质量计算其百分含量，总淀粉含量为直链淀粉与支链淀粉含量之和。
所述的步骤（1）中，反应体系的pH为3.5～4.0，显色时间15～25 min，吸收峰波长λ1=530 nm，λ2=622 nm。
所述的步骤（2）中，摩尔吸光系数ka1=15.5770，ka2=30.1570，kb1=3.4924，kb2=2.0369，两种淀粉的C与A之间的关系式为：
所述的步骤（3）中，磨碎的高粱粉过60目筛，称取质量为90～110 mg高粱粉，高粱分散液浓度为0.9～1.1 mg/mL，取分散液体积为25～30 mL，加入的石油醚体积为10～15 mL，脱脂2次。
所述的步骤（4）中，取脱脂分散液的体积为5 mL，直链淀粉含量（%）=C 直/m × 100%，支链淀粉含量=C 支/m × 100%，总淀粉含量（%）=直链淀粉含量（%）+ 支链淀粉含量（%），其中C 直、C 支分别为直链淀粉和支链淀粉的测定浓度（mg/mL），m为样品质量（g）。
由于采用了上述的技术方案，与现有技术相比，本发明根据直链淀粉、支链淀粉与碘形成碘-淀粉复合物而具有特殊颜色反应的原理，直链淀粉与碘作用呈纯蓝色，支链淀粉与碘作用呈紫红色；利用两种淀粉标准品溶液进行波长扫描，找出各自的吸收峰波长，并把吸收峰波长设定为测定波长，以作标准曲线的方式得到两种淀粉在吸收峰波长下的摩尔吸光系数，根据不同组分吸光度的加和性，联立方程组，求解得到两种淀粉浓度与吸光度的关系式，进而快速测定各淀粉组分的含量。本发明采用比色法可同时测定直链淀粉、支链淀粉和总淀粉的含量，而且准确度高，方便快捷，解决了传统的淀粉测定方法每次只能测定直链淀粉含量或者总淀粉含量，而不能同时测定直链淀粉和支链淀粉含量问题；而且本发明建立的方法不使用浓硫酸、浓盐酸和有毒试剂，使之更加绿色环保、安全性高，成本低廉，使用效果理想。
附图说明
图1为不同浓度的直链淀粉400～960 nm波长范围内的吸收曲线；
图2为不同浓度的支链淀粉溶液在400～960 nm波长范围内的吸收曲线；
图3为直链淀粉溶液在530 nm下的标准曲线；
图4为直链淀粉溶液在622 nm下的标准曲线；
图5为支链淀粉溶液在530 nm下的标准曲线；
图6为支链淀粉溶液在622 nm下的标准曲线。
具体实施方式
本发明的实施例1：快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，将直链淀粉和支链淀粉标准品溶液进行波长扫描，分别找出直链淀粉和支链淀粉标准品溶液的吸收峰波长；根据Lambert-Beer定律，通过绘制标准曲线的方式得到两种淀粉组分在吸收峰位置的摩尔吸光系数，联立方程组求解两种淀粉浓度的计算公式，用于快速批量测定；具体步骤如下：
1、直链淀粉、支链淀粉样品吸收峰波长的确定
（1）分别称取100 mg直链淀粉和支链淀粉标准品，加入到50 mL小烧杯中，用1 mL无水乙醇湿润后，加1 mol/L NaOH溶液9 mL，沸水浴分散10 min，转入到100 mL容量瓶中，清洗烧杯3次，清洗液转入到容量瓶中，定容至100 mL，摇匀，最终配制成1 mg/mL的直链淀粉和支链淀粉标准液；
（2）分别吸取直链淀粉标准液0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.5 mL和支链淀粉标准液2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，加入到50 mL容量瓶中，然后加入30 mL蒸馏水，调节pH至3.5；然后加入0.5 mL碘试剂，定容至50 mL，显色10 min，上机进行波长扫描；
（3）根据两种淀粉在400～960 nm范围内的吸收曲线，如图1和图2所示，确定直链淀粉、支链淀粉的吸收峰波长分别为530 nm、622 nm。
、直链淀粉、支链淀粉在吸收峰波长处摩尔吸光系数的确定
（1）分别吸取直链淀粉标准液0 mL、0.25 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL和支链淀粉标准液0 mL、1.0mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，配成直链淀粉反应体系的浓度梯度为0 mg/mL、0.005 mg/mL、0.01 mg/mL、0.02 mg/mL、0.03 mg/mL、0.04 mg/mL，支链淀粉反应体系的浓度梯度为0.02 mg/mL、0.04 mg/mL、0.06 mg/mL、0.08 mg/mL、0.1 mg/mL；
（2）分别在530 nm和622 nm下测定吸光度，绘制标准曲线，如图3、图4、图5及图6所示，直链淀粉溶液在530 nm和622 nm下的标准曲线分别为：Y=15.5770 x 0.0128（R 2 =0.9990）和Y=30.1570 x 
0.0088（R 2 =0.9998）；支链淀粉溶液在530 nm和622 nm下的标准曲线分别为：Y=3.4924 x 
0.0063（R 2 =0.9980）和Y=2.0369 x 
0.0004（R 2 =0.9989），式中R 2 为复相关系数（决定系数）；
（3）通过标准曲线得到直链淀粉在530 nm和622 nm处的摩尔吸光系数分别为15.5770、30.1570；支链淀粉在530 nm和622 nm处的摩尔吸光系数分别为3.4924、2.0369；
（4）根据Lambert-Beer定律联立方程组，确立两种淀粉的C与A之间的关系式为：
3、高粱籽粒淀粉含量测定的重复性试验
（1）随机选取高粱籽粒3 g，磨碎至粉末，过60目筛；
（2）称取过筛的高粱粉100 mg四份，精确至1 mg，分别加入到50 mL小烧杯中，再加入1 mL无水乙醇湿润；
（3）每个烧杯中加入1mol/L NaOH溶液9 mL，沸水浴分散10 min；
（4）冷却至室温，将烧杯内的液体全部转入到100 mL容量中，清洗烧杯3次，清洗后的液体全部转入到容量瓶中，定容至100 mL，摇匀；
（5）取上述分散液30 mL于50 mL具塞试管中，加入石油醚10 mL，间歇震荡摇匀10 min，静置15 min，然后吸出上层的脂相，按上述操作重复2次；
（6）分别取5 mL上述脱脂分散液于50 mL容量瓶中，加蒸馏水30 mL，调节pH至3.5，加碘试剂0.5 mL，定容至50 mL。显色10 min，上机测定吸光度；
（7）根据实施例2中步骤（4）的公式计算直链淀粉和支链淀粉的浓度，并计算各自的百分含量，总淀粉含量为直链淀粉含量和支链淀粉含量之和；
（8）实验结果与分析：对同一样品进行淀粉含量重复测定结果如表1，根据表1得知，本发明的重复性较好，相对标准差（RSD）在0.64%～0.74%之间。
表1 重复性试验结果
4、回收率测定实验
（1）空白加标回收率：分别按下表2组合配制不同比例的直链淀粉和支链淀粉的混合溶液，每个组合重复3次，按实施例3的方法测定直链淀粉和支链淀粉含量，并根据如下公式计算回收率：
回收率（%）= 加标试样测定值（mg）/ 加标量（mg）× 100%；
表2 直链淀粉和直链淀粉不同比例配合表
（2）样品加标回收率：取同一高粱样品，按步骤3高粱籽粒淀粉含量测定的重复性试验的方法制备淀粉分散液，取编号1～5的5个50 mL容量瓶，分别加入2.5 mL分散液，再向1、2号容量瓶中对应加入1.0 mL和1.5 mL直链淀粉标准液（直链淀粉加标量分别为1.0 mg和1.5 mg），向3、4号容量瓶中对应加入2.0 mL和2.5 mL支链淀粉标准液（支链淀粉加标量分别为2.0 mg和2.5 mg），5号容量瓶作对照（不加标准液）；按步骤3高粱籽粒淀粉含量测定的重复性试验的方法测定两种淀粉含量，其中对照组测得含量为对照试样测定值，加标组测得含量为加标试样测定值，重复上述实验3次，并根据如下公式计算回收率：
回收率（%）=（加标试样测定值
对照试样测定值）/加标量×100%；
（3）实验结果与分析：加标回收率实验是验证实验方法准确度的有效方式之一，本发明通过不同比例直链淀粉与支链淀粉的混合溶液进行空白加标回收率测定及同一样本的加标回收率测定，结果见表3和表4，根据表3和表4的结果可以看出，直链淀粉的回收率范围为83.59%～117.16%，支链淀粉的回收率范围为85.34%～106.69%，即本发明中直链淀粉和支链淀粉的比例、显色pH和加样误差等均使回收率在100%上下浮动，说明本发明具有较高的准确度，适用于批量分析。
表3 空白加标回收率实验结果
表4 样品加标回收率实验结果
Claims (5)
1.一种快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，其特征在于：将直链淀粉和支链淀粉标准品溶液进行波长扫描，分别找出直链淀粉和支链淀粉标准品溶液的吸收峰波长；根据Lambert-Beer定律，通过绘制标准曲线的方式得到两种淀粉组分在吸收峰位置的摩尔吸光系数，联立方程组求解两种淀粉浓度的计算公式，用于快速批量测定；具体步骤如下：
（1）配制终浓度为0.001～0.1 mg/mL碘-淀粉显色反应体系，调节pH 3.0～5.0，显色10～30 min，以双光束可见-紫外分光光度计进行可见光范围内的波长扫描，根据两种淀粉溶液的吸收曲线，找出它们的吸收峰波长λ1（500～560 nm）、λ2（580～700 nm）；
（2）按步骤（1）配置显色反应体系的方式，分别配制终浓度为0～0.04 mg/L的直链淀粉溶液的显色反应体系与终浓度为0～0.1 mg/L的支链淀粉溶液的显色反应体系，在波长λ1、λ2处测定吸光度，以浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标绘制标准曲线，其斜率即为摩尔吸光系数ka1、ka2、kb1、kb2，根据Lambert-Beer定律，联立二元一次方程组，求解得两种淀粉的C与A之间的计算公式为：
（3）选取待测定的高粱籽粒磨碎，过40～80目筛，称取50～150 mg过筛的高粱粉配制成浓度为0.5～1.5 mg/mL的高粱粉分散液，取分散液20～40 mL，并加入5～20 mL沸程为30～60℃的石油醚，间歇摇匀5～20 min，静置10～30 min，重复脱脂2～3次，获得脱脂分散液；
（4）取上述的脱脂分散液3～10 mL，按步骤（1）配制显色反应体系，按步骤（2）与步骤（3）计算直链淀粉和支链淀粉的浓度，并根据稀释倍数和样品质量计算其百分含量，总淀粉含量为直链淀粉与支链淀粉含量之和。
2.根据权利要求1所述的快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，其特征在于：所述的步骤（1）中，反应体系的pH为3.5～4.0，显色时间15～25 min，吸收峰波长λ1=530 nm，λ2=622 nm。
3.根据权利要求1所述的快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，其特征在于：所述的步骤（2）中，摩尔吸光系数ka1=15.5770，ka2=30.1570，kb1=3.4924，kb2=2.0369，两种淀粉的C与A之间的关系式为：
。
4.根据权利要求1所述的快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，其特征在于：所述的步骤（3）中，磨碎的高粱粉过60目筛，称取质量为90～110 mg高粱粉，高粱分散液浓度为0.9～1.1 mg/mL，取分散液体积为25～30 mL，加入的石油醚体积为10～15 mL，脱脂2次。
5.根据权利要求1所述的快速测定高粱籽粒淀粉含量的方法，其特征在于：所述的步骤（4）中，取脱脂分散液的体积为5 mL，直链淀粉含量（%）=C 直/m × 100%，支链淀粉含量=C 支/m × 100%，总淀粉含量（%）=直链淀粉含量（%）+ 支链淀粉含量（%），其中C 直、C 支分别为直链淀粉和支链淀粉的测定浓度（mg/mL），m为样品质量（g）。
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