CN102854162A - 一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于：分别建立可溶性糖626nm处光吸收量的标准曲线和淀粉580nm处光吸收量的标准曲线；从橡胶树树皮和木质部中取样后，分别提取树皮和木质部样品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；取100μl可溶性糖提取液加入3ml蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后在626nm处测定光吸收量，对照可溶性糖的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μlI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收量，对照淀粉的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的淀粉含量。
Description
技术领域：
本发明涉及一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，针对可溶性糖和淀粉的检测。
背景技术：
天然橡胶（顺式多聚异戊二烯）是重要的商业、国防和交通工业原料（Ko J H et al.,2003）。目前全球所需天然橡胶的90%左右来自巴西橡胶树。淀粉的动员对于胶乳再生和补偿持续割胶伤害有不可忽略的作用。木质部中淀粉可以看做一种长效储存源，而树皮中淀粉只是作为即时的缓冲。木质部中的可溶性糖作为一个转运库，树皮中的可溶性糖可以被看做一种中间的、随时准备被使用的储藏。对树皮和木质部中淀粉消长规律进行研究对于我们分析不同胶树产胶潜力和调整割胶强度有重要意义，在此条件下掌握橡胶树树皮和木质部的可溶性糖和淀粉提取和测定方法是解决这项工作的前提。
目前，人们对于树木淀粉提取的研究较少，在我国，80年代初期梁尚朴对橡胶树树木的淀粉含量进行过测定（割胶制度改革论文集一，p148-153），由于条件限制，当时使用割胶后的树皮直接染色后按照颜色深浅分级，肉眼分辨淀粉的等级，该方法没有将淀粉含量定量，也没有测定木质部淀粉含量。在国外，加拿大研究人员对于杨树和松树的叶子和根的淀粉进行提取和测定，采用的是酶解的方法（Pak S C and Simon M L， 2004），由于该方法操作过程步骤较多，花费时间长，需要的样品量较多，对于橡胶树而言，树皮是割胶的保证，尽量保护试验用树也是保障后续试验能顺利进行的基础，因此，所述方法并不适合于橡胶树的树木淀粉检测。
如何建立橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物提取及含量测定方法，成为本领域需要解决的技术问题，目前，关于这方面的技术成果，并未见诸报道。
发明内容
本发明的目的在于，鉴于目前本领域对于分析不同胶树产胶潜力和调整割胶时间和强度没有一种较为理想的检测方法，提供一种利用橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物提取及含量测定方法。
本发明的目的是这样实现的：一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于：分别建立可溶性糖626nm处光吸收量的标准曲线和淀粉580nm处光吸收量的标准曲线；从橡胶树树皮和木质部中取样后，分别提取树皮和木质部样品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；定容100μl可溶性糖提取液加入3ml蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后在626nm处测定光吸收量，对照可溶性糖的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μlI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收量，对照淀粉的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的淀粉含量。
在本发明的技术方案中：
可溶性糖标准曲线是这样建立的：
首先确定用硫酸-蒽酮法测定可溶性糖含量的最高光吸收峰：用80%乙醇溶液分别配制浓度为1mg/ml的葡萄糖溶液和蔗糖溶液，将它们分别按照1:4、3:7、1:1、7:3和4:1体积比混合形成100μl的可溶性糖混合液，在可溶性糖混合液加入3ml硫酸-蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后在300nm-900nm范围内扫描光吸收，确定可溶性糖混合液扫描最高吸收峰为626nm处；
再利用硫酸-蒽酮法测定不同浓度梯度可溶性糖在626nm光吸收下的标准曲线，选取的可溶性糖浓度分别为：0μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml，取100μl加入3ml硫酸-蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后626nm处测定光吸收；以光吸收测定值为横坐标，可溶性糖浓度为纵坐标绘制标准曲线；
硫酸-蒽酮试剂是用150mg蒽酮溶于100ml稀硫酸配制成的，其中，100ml稀硫酸采用70ml浓硫酸与30ml水混合；
淀粉的标准曲线是这样建立的：
首先配制以下溶液：80%Ca(NO3)2溶液的配制：80gCa(NO3)2.2H2O溶于水中，定容至100ml；I2-KI溶液的配制：1.3gI2加上3.5gKI，溶解后容量瓶定容至100ml；用1mg/ml淀粉母液按比例用80%Ca(NO3)2溶液分别稀释成50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml淀粉溶液；
取不同浓度淀粉母液2ml，加入100μlI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收，以光吸收测定值为横坐标，淀粉溶液浓度为纵坐标绘制标准曲线。
在本发明的技术方案中：树皮和木质部样品中的可溶性糖提取液和淀粉提取液是这样获得的：
a) 用直径0.5cm小型打孔器，直接用手将打孔器戳进树皮内，从树皮中取出相应树皮，作为树皮样品；再在树皮取样口用小型电钻在木质部打孔部位钻孔取出木屑，作为木质部样品，钻孔深度为3.0cm，取样后用大小合适的铁钉堵住树皮和木质部取样口；
b) 分别对树皮和木质部样品液氮研磨，磨碎后烘箱40℃过夜烘干，取10-200mg，在0.5ml-4ml的80%乙醇80℃浸提40min，中间斡旋搅拌， 12000rpm×10min离心，收集上清，残渣加80%乙醇重提一次，合并上清，上清中加入活性炭10mg，80℃脱色30min，离心后取清液定容至10ml，分别获得树皮和木质部的可溶性糖提取液；
c) 将提取可溶性糖后的树皮和木质部沉淀残渣分别用2ml80%Ca(NO3)2溶液沸水浴5min浸提，4000rpm离心5min，收集上清，残渣用2ml80%Ca(NO3)2冲洗一次，离心收集上清，合并提取液，分别获得树皮和木质部淀粉提取液。
在本发明的技术方案中：
可溶性糖标准曲线的曲线方程为：Y=427.00X ，R2=0.9942；
样品中可溶性糖含量的计算公式为：
样品中可溶性糖含量=427.00×A×定容体积/样品质量；
式中：A为测得的光吸收，427.00×A计算为与光吸收对应的糖浓度；可溶性糖含量的单位为μg/mg，糖浓度的单位为μg/ml, 定容体积的单位为ml，样品质量的单位为mg；
淀粉标准曲线的曲线方程为：y=177.84x，r2=0.993；
样品中淀粉的计算公式为：
样品中淀粉含量（μg/mg）=177.84×A×定容体积/样品质量；
式中：A为测得的光吸收，177.84×A计算为与光吸收对应的淀粉浓度;淀粉含量的单位为μg/mg，淀粉浓度的单位为μg/ml, 定容体积的单位为ml，样品质量的单位为mg。
本发明的优点在于：本发明只需要取少量树皮和木质部（最低取样量为10mg）就能进行可溶性糖和淀粉含量测定，对橡胶树的树皮和木质部伤害较小，而橡胶树的树皮是橡胶树稳产高产的保证，节约橡胶树的树皮消耗量可以延长割胶时间，提高橡胶树经济价值；木质部中淀粉可以看做是一种长效储存源，而树皮中淀粉只是作为即时的缓冲，木质部中的可溶性糖作为一个转运库，树皮中的可溶性糖可以被看做一种中间的、随时准备被使用的储藏，通过本发明能够快速获得树皮和木质部中蔗糖和淀粉的含量，为每年开割初期准确确定橡胶树开割时间、制定不同无性系橡胶树在植胶区不同物候下的含量标准、评价橡胶树割胶潜力提供技术支持，它与淀粉酶解法相比，不仅步骤简单，耗时短，而且对橡胶树伤害小，实际应用时具有明显的技术优势。
附图说明
图1是可溶性糖在626nm处测定光吸收的标准曲线。
图2是淀粉在580nm处测定光吸的标准曲线。
图3是无性系PR107的树皮和木质部不同高度处测定的可溶性糖及淀粉在树干结果，其中a为树皮中可溶性糖含量曲线，b为树皮中淀粉含量曲线；c为木质部中可溶性糖含量曲线，d为木质部中淀粉含量曲线。
具体实施方式
实施例1
建立可溶性糖的标准曲线
用80%乙醇溶液分别配制浓度为1mg/ml的葡萄糖（还原性糖）和蔗糖（非还原性糖）溶液；将它们分别按照1:4、3:7、1:1、7:3和4:1体积比混合形成100μl的可溶性糖混合液，用150mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（70ml浓硫酸加30ml水）配制成蒽酮试剂。蔗糖与葡萄糖溶液按比例混合（混合比例如下表），混合液100μl加入3ml蒽酮试剂，90℃保温15min，扫描光吸收最大值：
表1 可溶性糖光吸收峰测定
| 蔗糖体积(μl) | 20 | 30 | 50 | 70 | 80 |
| 葡萄糖体积(μl) | 80 | 70 | 50 | 30 | 20 |
| 扫描最高吸收峰(nm) | 627 | 626 | 627 | 626 | 626 |
从上表中可以看出，采用硫酸蒽酮法测定可溶性糖含量光吸收的扫描吸收峰应该选择在626nm。
用80%乙醇配制浓度为10mg/ml的标准蔗糖溶液，150mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（70ml浓硫酸加30ml水）配制蒽酮试剂，100μl标准蔗糖溶液加入3ml蒽酮试剂，90℃保温15min，按照下表测定不同浓度下626nm处光吸收，绘制标准曲线，曲线方程为：Y=427.00X（R2=0.9942）（见表2和图1）。
表2 可溶性糖标准曲线配比及光吸收测定
| 蔗糖浓度（μg/ml） | 0 | 200 | 300 | 400 | 600 | 800 | 1000 |
| 蔗糖母液量（μl）+80%乙醇（μl） | 0+100 | 20+80 | 30+70 | 40+60 | 60+40 | 80+20 | 100+0 |
| 光吸收 | 0 | 0.500 | 0.772 | 1.017 | 1.398 | 1.770 | 2.357 |
实施例2
建立淀粉的标准曲线
80%Ca(NO3)2配制：
80gCa(NO3)2.2H2O溶于水中，定容至100ml。
I2-KI溶液的配制：
1.3gI2加上3.5gKI，溶解后容量瓶定容至100ml。
将1mg/ml淀粉母液分别按比例用80%Ca(NO3)2稀释成50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml淀粉溶液。
取不同浓度淀粉溶液2ml，加入100μlI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收，绘制标准曲线，曲线方程为：y=177.84.00x（r2=0.9942）（见图2）。
实施例3
从树皮和木质部样品中分别获得树皮和木质部可溶性糖提取液和淀粉提取液
a) 样品
取样橡胶树树皮用直径0.5cm小型打孔器，直接用手将打孔器戳进树皮内，从树皮中取出相应树皮，作为树皮样本；由于橡胶树木质部坚硬，用取样器无法提取木质部样本，因此，在树皮取样口用小型电钻在木质部打孔部位钻孔取样木屑，作为木质部样本，钻孔深度为3.0cm，取样后用大小合适的铁钉堵住树皮和木质部取样口。
b)分别对树皮和木质部样品液氮研磨，40℃烘箱烘干后取10-200mg，0.5ml-4ml80%乙醇80℃浸提40min，中间斡旋搅拌，离心12000rpm×10min，收集上清，残渣加80%乙醇重提一次，合并上清，上清中加入活性炭10mg，80℃脱色30min，离心后取清液定容至10ml，分别获得树皮和木质部的可溶性糖提取液。
c)将提取可溶性糖后的树皮和木质部沉淀残渣分别用2ml80%Ca(NO3)2溶液沸水浴5min浸提，4000rpm离心5min，收集上清，残渣用2ml80%Ca(NO3)2冲洗一次，离心收集上清，合并提取液，分别获得树皮和木质部淀粉提取液。
实施例4
对树皮和木质部样品中可溶性糖和淀粉含量测定
a)对树皮和木质部样品中可溶性糖含量测定
分别取树皮和木质部100μl提取液，分别加入3ml蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后分别在626nm处测定它们的光吸收量。
通过以下公式分别计算：
样品中可溶性糖含量（μg/mg）=427.00×A×定容体积/样品质量；
式中：A为测得的光吸收量，427.00×A为在标准曲线上查找到的糖浓度，单位为μg/ml, 定容体积的单位为ml，样品质量的单位为mg；
b)对树皮和木质部样品中淀粉含量测定
分别取树皮和木质部取淀粉提取液2ml，加入100μlI2-KI溶液，在580nm处分别测定它们的光吸收量。
通过以下公式分别计算：
样品中淀粉含量（μg/mg）=177.84×A×定容体积/样品质量；
式中：A为测得的光吸收，177.84×A计算为与光吸收对应的淀粉浓度，单位为μg/ml, 定容体积的单位为ml，样品质量的单位为mg。
实施例5
根据实施例1~4方法，2012年7月10日对中国热带农业科学院试验场七队定植于1982年的一棵无性系PR107取样，选择离地面高度处分别为0m、0.5m、1m、1.5m、2m、2.5m一侧取树皮和木质部，并对取样的树皮和木质部非结构性碳水化合物含量进行测定。
根据图3的一棵无性系PR107样品的可溶性糖和淀粉浓度含量进行比较分析，当割线位于地上1m左右，无论是树皮还是木质部，割线处可溶性糖含量显著高于非割线处，说明在割线处产胶潜力最大，也间接说明割胶引起了可溶性糖向割线处聚集；其次，被测胶树的树皮中淀粉含量显著低于木质部中淀粉含量，说明木质部内淀粉作为长效储存源含有较多的淀粉，而树皮中淀粉只是作为即时的缓冲；实验结果表明，该取样树虽然已经割胶二十年，已进入老龄，但是对比淀粉和可溶性糖含量，该树在现阶段的常规割胶制度下仍有产胶潜力，可以持续割胶。
以上各实施例不是对本发明的具体限制。
Claims (4)
1.一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于：分别建立可溶性糖626nm处光吸收量的标准曲线和淀粉580nm处光吸收量的标准曲线；从橡胶树树皮和木质部中取样后，分别提取树皮和木质部样品中可溶性糖提取液和淀粉提取液；定容100μl可溶性糖提取液加入3ml蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后在626nm处测定光吸收量，对照可溶性糖的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的可溶性糖含量；取2ml淀粉提取液加入100μlI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收量，对照淀粉的标准曲线，分别计算树皮和木质部样品的淀粉含量。
2.根据权利要求1所述的橡胶树非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于：
可溶性糖标准曲线是这样建立的：
首先确定用硫酸-蒽酮法测定可溶性糖含量的最高光吸收峰：用80%乙醇溶液分别配制浓度为1mg/ml的葡萄糖溶液和蔗糖溶液，将它们分别按照1:4、3:7、1:1、7:3和4:1体积比混合形成100μl的可溶性糖混合液，在可溶性糖混合液加入3ml硫酸-蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后在300nm-900nm范围内扫描光吸收，确定可溶性糖混合液扫描最高吸收峰为626nm处；
再利用硫酸-蒽酮法测定不同浓度梯度可溶性糖在626nm光吸收下的标准曲线，选取的可溶性糖浓度分别为：0μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml、600μg/ml、800μg/ml、1000μg/ml，取100μl加入3ml硫酸-蒽酮试剂，90℃保温15min，冷却至室温后626nm处测定光吸收；以光吸收测定值为横坐标，可溶性糖浓度为纵坐标绘制标准曲线；
硫酸-蒽酮试剂是用150mg蒽酮溶于100ml稀硫酸配制成的，其中，100ml稀硫酸采用70ml浓硫酸与30ml水混合；
淀粉的标准曲线是这样建立的：
首先配制以下溶液：80%Ca(NO3)2溶液的配制：80gCa(NO3)2.2H2O溶于水中，定容至100ml；I2-KI溶液的配制：1.3gI2加上3.5gKI，溶解后容量瓶定容至100ml；用1mg/ml淀粉母液按比例用80%Ca(NO3)2溶液分别稀释成50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml、300μg/ml、400μg/ml淀粉溶液；
取不同浓度淀粉母液2ml，加入100μlI2-KI溶液，在580nm处测定光吸收，以光吸收测定值为横坐标，淀粉溶液浓度为纵坐标绘制标准曲线。
3.根据权利要求1所述的一种橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于：
树皮和木质部样品中的可溶性糖提取液和淀粉提取液是这样获得的：
a) 用直径0.5cm小型打孔器，直接用手将打孔器戳进树皮内，从树皮中取出相应树皮，作为树皮样品；再在树皮取样口用小型电钻在木质部打孔部位钻孔取出木屑，作为木质部样品，钻孔深度为3.0cm，取样后用大小合适的铁钉堵住树皮和木质部取样口；
b) 分别对树皮和木质部样品液氮研磨，磨碎后烘箱40℃过夜烘干，取10-200mg，在0.5ml-4ml的80%乙醇80℃浸提40min，中间斡旋搅拌， 12000rpm×10min离心，收集上清，残渣加80%乙醇重提一次，合并上清，上清中加入活性炭10mg，80℃脱色30min，离心后取清液定容至10ml，分别获得树皮和木质部的可溶性糖提取液；
c) 将提取可溶性糖后的树皮和木质部沉淀残渣分别用2ml80%Ca(NO3)2溶液沸水浴5min浸提，4000rpm离心5min，收集上清，残渣用2ml80%Ca(NO3)2冲洗一次，离心收集上清，合并提取液，分别获得树皮和木质部淀粉提取液。
4.根据权利要求1~3之一所述的橡胶树树皮和木质部非结构性碳水化合物含量测定方法，其特征在于：
可溶性糖标准曲线的曲线方程为：
Y=427.00X ，R2=0.9942；
样品中可溶性糖含量的计算公式为：
样品中可溶性糖含量=427.00×A×定容体积/样品质量；
式中：A为测得的光吸收，427.00×A计算为与光吸收对应的糖浓度；可溶性糖含量的单位为μg/mg，糖浓度的单位为μg/ml, 定容体积的单位为ml，样品质量的单位为mg；
淀粉标准曲线的曲线方程为：
y=177.84x，r2=0.993；
样品中淀粉的计算公式为：
样品中淀粉含量（μg/mg）=177.84×A×定容体积/样品质量；
式中：A为测得的光吸收，177.84×A计算为与光吸收对应的淀粉浓度;淀粉含量的单位为μg/mg，淀粉浓度的单位为μg/ml, 定容体积的单位为ml，样品质量的单位为mg。
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