CN107478592A - 一种快速检测马铃薯抗寒能力的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种快速检测马铃薯抗寒能力的方法，步骤包括先对检测的马铃薯叶片进行冷冻处理，然后进行匀浆粉碎、沸水浴搅拌抽提、上清液离心、活性炭脱色、过滤获得提取液，之后在提取液中直接加入浓硫酸酸化处理，后加入蒽酮乙酸乙酯，重复振荡混匀后，放入沸水浴中保温反应，之后取出快速放入冰浴中，终止反应，最后用紫外分光光度计在639nm处测定吸光度，换算出马铃薯叶片中可溶性糖含量，通过比较不同品种不同处理时间马铃薯叶片中可溶性糖含量，进而得出不同品种马铃薯抗寒能力。本发明为测定马铃薯抗寒能力提供了一种分析结果正确、分析速度较快、操作简单、灵敏度高、重现性好的分析方法。
Description
技术领域
本发明涉及了一种快速检测马铃薯抗寒能力的方法。
背景技术
安徽省等马铃薯中原二作区利用水稻冬闲田种植马铃薯，该区生长的马铃薯经常会遇到倒春寒等低温霜冻气候，低温对马铃薯的危害及其严重。不同品种马铃薯抗寒能力并不相同，其抗寒能力强弱与马铃薯叶片中可溶性糖响应低温诱导的变化成正相关。因此，需要一种可以周年开展快速、简便、准确的方法来检测马铃薯叶片中可溶性糖相应低温诱导变化的试验方法。
目前马铃薯抗寒能力的检测主要以低温霜冻后观测田间栽培马铃薯叶片冻伤情况和检测马铃薯中抗寒基因表达量的两种方法为主。前一种方法只能在马铃薯种植季节进行试验，无法周年开展，而且获得结果的前提是低温霜冻已经对马铃薯生产造成不利影响。后一种方法对实验室科研水平要求很高，实验过程复杂、实验周期较长、实验成本较高。并且，目前马铃薯叶片中可溶性糖含量测定方法主要是采用用于测定高糖含量的水果、甜菜等材料的传统分析方法，由于马铃薯叶片中可溶性糖含量相对较低，并且马铃薯叶片中一些色素含量较多，该方法用于马铃薯叶片中可溶性糖含量分析往往造成较大误差，不适合直接用于马铃薯叶片中可溶性糖含量的分析测定。
发明内容
本发明的目的是提供一种适合于马铃薯的快速检测马铃薯抗寒能力的分析方法，有助于马铃薯科研工作者和农业生产者快速准确的测定分析不同马铃薯品种抗寒能力的强弱。
本发明解决技术问题采用如何下方案：
一种快速检测马铃薯抗寒能力的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)将马铃薯脱毒试管苗移栽到基质中，栽培25天～30天；
(2)将栽培后的马铃薯幼苗放入20℃～25℃人工气候培养箱内均一化处理5天～7天；(3)将均一化处理后的马铃薯幼苗放入0℃人工气候培养箱中低温处理，于0h,4h,12h分别收集马铃薯幼苗叶片；
(4)比较步骤(3)中不同品种不同处理时间马铃薯叶片中可溶性糖含量，进而得出不同品种马铃薯抗寒能力。
进一步，所述步骤(4)可溶性糖含量的检测步骤包括：
(A将步骤(3)待检测的叶片在-20℃下进行冷冻处理；
(B)取步骤(A)中的冷冻叶，经匀浆处理，得到马铃薯叶片组织匀浆液；
(C)将步骤(B)中马铃薯叶片组织匀浆液中加入蒸馏水，于沸水浴中抽提；
(D)离心步骤(C)中的提取液并加入活性炭，静置后过滤提取液；
(E)取步骤(D)中滤液，加入浓H2SO4后放入冰浴中冷却，再加入蒽酮乙酸乙酯溶液，充分振荡后，将试管放入沸水浴中，进行显色反应，然后快速放入冰水浴中冷却至常温；
(F)用紫外分光光度计在630nm下对步骤(E)中待测溶液进行吸光度测定，以蒸馏水作为空白对照，以吸光率的平均值作为标准吸光率，计算马铃薯叶片中可溶性糖含量，可溶性糖含量计算公式的线性回归方程为：y＝0.0125x+0.1281，R2＝0.989；式中X为吸光度值，Y为由标准曲线所得可溶性糖含量。
进一步，所述步骤(B)中，匀浆处理是指：将冷冻叶片用高速匀浆机在18000-20000r/min的转速下匀浆处理1-2min。
进一步，所述步骤(C)中抽提是指将步骤(B)中的匀浆液按质量体积比1g：300ml加入蒸馏水，然后放入沸水浴中抽提30min。
进一步，所述步骤(D)是将提取液先于10000-12000r/min下离心3-5min，然后再向离心后的离心液中加入活性炭，静置5-10min后过滤，所得滤液按1:10体积定容；所述中活性炭的用量为所取叶片质量的10％-50％
进一步，所述步骤(E)中，滤液、浓H2SO4、蒽酮乙酸乙酯体积比为：2:4-6:0.5。可溶性糖含量计算公式为：可溶性糖含{量＝(MX*V*D)/(V}1*W*103)*100
MX：标准方程求得糖含量(ug)
V：样品总体积(ml)
D：稀释倍数
V1：测定时取用体积(ml)
W：取样量(g)
103：样品由mg转化成ug倍数。
与已有技术相比，本发明有益效果具体体现在：
1、本发明利用组培脱毒试管苗进行实验，保证了实验可以周年开展。
2、本发明在实验开始前，将基质中栽培25～30天的马铃薯幼苗放入20℃～25℃人工气候培养箱内均一化处理5～7天，保证了后期实验材料处于同一生理状态和生长水平。
3、本发明将均一化处理后的马铃薯幼苗放入0℃人工气候培养箱中低温处理，0℃是马铃薯发生低温冷害和冻害的临界点，可以显著诱导马铃薯抗寒性生理代谢的开展。
4、本发明对马铃薯幼苗进行0小时、4小时和12小时的不同时间长度低温处理，可以很好的区分开不同抗寒能力品种响应低温诱导的反应强度。
5、本发明在取样分析前需将马铃薯叶片进行冷冻处理，由于冷冻后，叶片细胞组织更容易彻底破碎，使后一步匀浆效果更好。
6、本发明利用高速匀浆机在18000-20000r/min的转速下匀浆叶片组织，能保证叶片细胞组织中的液泡破碎，是液泡中的可溶性糖完全进入提取液中。
7、本发明利用活性炭0.01g-0.05g吸附处理离心后提取液，很好的除去了提取液中的各种色素，保证了下面紫外分光光度计测定蒽酮显色反应吸光度的准确性。
8、传统的蒽酮显色反应都是先配置浓H2SO4酸化的蒽酮乙酸乙酯，但酸化的蒽酮乙酸乙酯很不稳定，必须现配现用，并且只能保存24h，大大增加了每次实验的成本和前期准备工作的工作量，本发明步骤(5)中，将浓H2SO4和蒽酮乙酸乙酯分开，并且先将浓H2SO4加入提取液中，使的提取液中的可溶性糖充分脱水成醛类物质，之后加入蒽酮，使得显色反应进行的更加彻底，实验结果也更加准确。
9、在显色反应结束后快速将试管放入冰水浴中终止反应，很好的解决了大量样品测定过程，各个样品显色反应进行的时间不一致，导致结果出现误差的情况。
10、本发明为快速检测马铃薯抗寒能力提供了一种分析结果正确、分析速度快、操作简单、灵敏度高、重现性好的分析方法。
附图说明
图1是不同品种马铃薯低温(0℃)处理后叶片可溶性糖含量变化。
图2是不同品种马铃薯低温(0℃)处理12h后马铃薯植株冻害情况。
图2中(a)是品种费乌瑞它；(b)是品种中薯20。
具体实施方式
下面结合具体实例对本发明作进一步详细的说明
实施例1：
取培养20天的马铃薯品种‘费乌瑞它’脱毒试管苗移栽到基质中(栽培基质为1:1的营养土和泥炭土)栽培30天；将栽培30天的马铃薯幼苗放入25℃人工气候培养箱内均一化处理7天；均一化处理后的马铃薯幼苗放入0℃人工气候培养箱中低温处理，于0h,4h,12h分别收集马铃薯幼苗倒3片叶片；每个处理时间取3份0.1g待测叶片，在-20℃下进行冷冻处理1-2小时，取出叶片用高速匀浆机在18000r/min的转速下匀浆处理2min，得到马铃薯叶片组织匀浆液；在组织匀浆液中加入蒸馏水至总体积30ml，放入沸水浴中抽提30min，抽提过程中每隔10min取出摇晃提取液，使料液充分混合；将提取液转入10ml离心管中12000r/min离心5min，离心后在上清液中加入0.02g活性炭，摇晃混匀后静置10min，用滤纸过滤提取液，蒸馏水定溶至100ml；取提取液2ml，在冰浴中加入5ml浓H2SO4，后加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯溶液，充分振荡后，将试管放入沸水浴中保温10min，取出后放入冰水浴中冷却至常温；用紫外分光光度计在630nm下对待测溶液进行吸光度测定，测定的吸光度值分别为0.069、0.083、0.076、0.104、0.076、0.091、0.086、0.086、0.132，然后根据公式分别计算9组可溶性糖含量，见表1。实施例2：
取培养20天的马铃薯品种‘中薯20’脱毒试管苗移栽到基质中(栽培基质为1:1的营养土和泥炭土)栽培30天；将栽培30天的马铃薯幼苗放入25℃人工气候培养箱内均一化处理7天；均一化处理后的马铃薯幼苗放入0℃人工气候培养箱中低温处理，于0h,4h,12h分别收集马铃薯幼苗倒3片叶片；每个处理时间取3份0.1g待测叶片，在-20℃下进行冷冻处理1-2小时，取出叶片用高速匀浆机在18000r/min的转速下匀浆处理2min，得到马铃薯叶片组织匀浆液；在组织匀浆液中加入蒸馏水至总体积30ml，放入沸水浴中抽提30min，抽提过程中每隔10min取出摇晃提取液，使料液充分混合；将提取液转入10ml离心管中12000r/min离心5min，离心后在上清液中加入0.02g活性炭，摇晃混匀后静置10min，用滤纸过滤提取液，蒸馏水定溶至100ml；取提取液2ml，在冰浴中加入5ml浓H2SO4，后加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯溶液，充分振荡后，将试管放入沸水浴中保温10min，取出后放入冰水浴中冷却至常温；用紫外分光光度计在630nm下对待测溶液进行吸光度测定，测定的吸光度值分别为0.086、0.087、0.074、0.21、0.09、0.1、0.098、0.098、0.161，然后根据公式分别计算9组可溶性糖含量，见表1。
实验选取抗寒能力不同的两个品种，中薯20和费乌瑞它，其中中薯20抗寒能力强于费乌瑞它(图2)。由表1和图1可知，抗寒能力不同的两个品种在低温处理前其叶片可溶性糖含量基本一致，随着低温处理，抗寒能力相对较强的中薯20其叶片可溶性糖含量增加幅度显著大于抗寒能力较弱的费乌瑞它。正是由于中薯20可以快速响应低温诱导，提高叶片中可溶性糖含量，从而提高马铃薯幼苗的抗寒能力。因此，根据低温处理马铃薯叶片中可溶性糖含量的变化，可以知道不同品种马铃薯抗寒能力大小。
表1不同品种马铃薯低温处理后叶片可溶性糖含量
| 处理1(mg/g) | 处理2(mg/g) | 处理3(mg/g) | 平均数(mg/g) | 方差 | |
| 费乌瑞它0h | 6.448 | 6.449 | 6.453 | 6.450 | 0.0023 |
| 费乌瑞它4h | 6.470 | 6.464 | 6.462 | 6.465 | 0.0042 |
| 费乌瑞它12h | 6.475 | 6.484 | 6.488 | 6.482 | 0.0064 |
| 中薯200h | 6.450 | 6.451 | 6.447 | 6.449 | 0.0019 |
| 中薯204h | 6.536 | 6.525 | 6.534 | 6.532 | 0.0060 |
| 中薯2012h | 6.551 | 6.565 | 6.585 | 6.567 | 0.0173 |
Claims (6)
1.一种快速检测马铃薯抗寒能力的方法，其特征在于包括以下步骤
(1)将马铃薯脱毒试管苗移栽到基质中，栽培25天～30天；
(2)将栽培后的马铃薯幼苗放入20℃～25℃人工气候培养箱内均一化处理5天～7天；
(3)将均一化处理后的马铃薯幼苗放入0℃人工气候培养箱中低温处理，于0h,4h,12h分别收集马铃薯幼苗叶片；
(4)比较步骤(3)中不同品种不同处理时间马铃薯叶片中可溶性糖含量，进而得出不同品种马铃薯抗寒能力。
2.根据权利要求1所述的一种快速检测马铃薯抗寒能力检测方法，其特征在于，所述步骤(4)可溶性糖含量的检测步骤包括：
(A将步骤(3)待检测的叶片在-20℃下进行冷冻处理；
(B)取步骤(A)中的冷冻叶，经匀浆处理，得到马铃薯叶片组织匀浆液；
(C)将步骤(B)中马铃薯叶片组织匀浆液中加入蒸馏水，于沸水浴中抽提；
(D)离心步骤(C)中的提取液并加入活性炭，静置后过滤提取液；
(E)取步骤(D)中滤液，加入浓H2SO4后放入冰浴中冷却，再加入蒽酮乙酸乙酯溶液，充分振荡后，将试管放入沸水浴中，进行显色反应，然后快速放入冰水浴中冷却至常温；
(F)用紫外分光光度计在630nm下对步骤(E)中待测溶液进行吸光度测定，以蒸馏水作为空白对照，以吸光率的平均值作为标准吸光率，计算马铃薯叶片中可溶性糖含量，可溶性糖含量计算公式的线性回归方程为：y＝0.0125x+0.1281，R2＝0.989；式中，X为吸光度值，Y为由标准曲线所得可溶性糖含量。
3.根据权利要求2所述的一种快速检测马铃薯抗寒能力检测方法，其特征在于，所述步骤(B)中，匀浆处理是指：将冷冻叶片用高速匀浆机在18000-20000r/min的转速下匀浆处理1-2min。
4.根据权利要求2所述的一种快速检测马铃薯抗寒能力检测方法，其特征在于，所述步骤(C)中抽提是指将步骤(B)中的匀浆液按质量体积比1g：300ml加入蒸馏水，然后放入沸水浴中抽提30min。
5.根据权利要求2所述的一种快速检测马铃薯抗寒能力检测方法，其特征在于，所述步骤(D)是将提取液先于10000-12000r/min下离心3-5min，然后再向离心后的离心液中加入活性炭，静置5-10min后过滤，所得滤液按1:10体积定容；所述中活性炭的用量为所取叶片质量的10％-50％。
6.根据权利要求2所述的一种快速检测马铃薯抗寒能力检测方法，其特征在于，所述步骤(E)中，滤液、浓H2SO4、蒽酮乙酸乙酯体积比为：2:4-6:0.5。
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Citations (4)
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| CN102498873A (zh) * | 2011-11-01 | 2012-06-20 | 青岛农业大学 | 一种茶树种质资源苗期抗寒性的鉴定方法 |
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| Title |
|---|
| 刘婷婷等: "低温胁迫对极度濒危植物中华水韭生理特性的影响", 《西北植物学报》 * |
| 张万明等: "马铃薯淀粉深加工废液可溶性糖含量的测定", 《安徽农业科学》 * |
| 李飞: "野生马铃薯植株苗期耐冻性鉴定及耐冻机理研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库农业科技辑》 * |
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