CN103086888A - 一种红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法，以红腺忍冬叶片为原料，获取了绿原酸的超声提取方法和工艺参数，为今后红腺忍冬叶资源的开发利用和绿原酸工业化生产提供了一定的参考借鉴的作用；据实验结果分析可知：红腺忍冬叶中绿原酸的超声提取最佳工艺条件是最佳工艺条件为A₂B₂C₃D₁，即提取温度为50℃，乙醇浓度为60％。提取次数为3次，提取料液比为8倍。根据文献报道，用其他方法提取红腺忍冬叶中的绿原酸，得率在1％-2％之间，超声波提取法的提取率为可达1.7％以上，由此可见超声提取法较传统方法收率高，而且提取时间短，条件温和，是一种较好的提取方法。

Description

一种红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法

技术领域

本发明属于红腺忍冬叶绿原酸提取领域，尤其涉及一种红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法。

背景技术

红腺忍冬花[1，2]是忍冬科植物红腺忍冬Lonicera hypoglauca Miq.的干燥花蕾或带初开的花，列在2005年版中国药典“山银花”项下，红腺忍冬资源丰富，主产于河南、山东、云南及广西等地，是山银花药材商品的主要来源之一。红腺忍冬为临床常用中药，其味甘、性寒，用于痈肿疗疮、喉痹、丹毒、热血毒痢、风热感冒、瘟病发热等症，属清热解毒之要药，山银花对多种致病菌均有抑制作用，是一种广谱抗菌中药，有“中药之中的青霉素”之美称。化学和药理研究证实其主要化学成分有挥发油类、有机酸类、黄酮类和苷类，绿原酸是其主要有效成分，药理作用主要有抗菌、抗病毒、解热和抗氧化，其抗菌作用的主要活性成分为绿原酸，但品种与产地不同而不同，因此金银花山及山银花中绿原酸含量的高低，是其质量优劣的重要标志。

长期以来提取绿原酸以金银花为工业原料，但价格昂贵，对同属其它植物开发利用不够，尤其是对红腺忍冬植物叶的重视和研究程度不够，红腺忍冬各部位中都有一定的绿原酸，但含量高低不同，依次为花＞叶＞茎＞根，且叶中的绿原酸含量较高，是花的69.63％，大大超过了根茎，而忍冬茎，叶的药源远比红腺忍冬丰富，采集容易，价格便宜，应该充分利用。因此研究红腺忍冬叶片绿原酸的提取，为充分利用红腺忍冬资源提供一定的理论和应用基础。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法，旨在解决长期以来提取绿原酸以金银花为工业原料，但价格昂贵，对同属其它植物开发利用不够，尤其是对红腺忍冬植物叶的重视和研究程度不够，红腺忍冬各部位中都有一定的绿原酸，但含量高低不同，依次为花＞叶＞茎＞根，且叶中的绿原酸含量较高，是花的69.63％，大大超过了根茎，而忍冬茎，叶的药源远比红腺忍冬丰富，采集容易，价格便宜，应该充分利用的问题。

本发明实施例是这样实现的，一种红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法，该超声提取方法包括以下步骤：

步骤1，进行绿原酸含量测定，主要包括：

(1)最大吸收波长的确定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液适量，置10mL量瓶中，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，在分光光度计上于200-400nm扫描；对照品溶液与供试品溶液在328nm处均有最大吸收，故将328nm作为测定波长；

(2)对照品溶液的制备

精密称取对照品10mg，加适量70％乙醇，置水浴上微热使溶解，放冷后定容至50ml，摇匀，即得，每1ml含红腺忍冬叶0.2mg；

(3)标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液2、4、6、8、10、12mL，分别置于50mL量瓶中，加水适量，摇匀.再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白.在328nm波长处测定吸光度。以绿原酸标品的浓度为横坐标，以在328nm下测得不同浓度的绿原酸标准品的吸光值为纵坐标，做标准曲线，得回归方程；

步骤2，进行红腺忍冬叶中绿原酸超声提取的单因素试验，主要包括：

药材与一定量的溶剂于烧杯中，放入超声波清洗器一定时间，过滤，再将溶液放入烧瓶，用旋转蒸发仪进行浓缩提取，干燥得到提取粗品，在紫外分光光度计下测定吸光值，并计算绿原酸的提取率；

分别对影响超声提取的每一因素，设计5个水平进行试验，通过比较提取率确定对提取率影响较大的4个因数进行正交试验；

(1)溶剂乙醇浓度

按乙醇浓度40％，50％，60％，70％，80％，其它提取条件为提取1次、提取时间10分钟、溶剂体积为药材重量8倍和提取温度60℃的情况下进行超声提取。比较提取率，得出最佳溶剂乙醇浓度；

(2)溶剂体积(药材重量倍数)

按溶剂体积为6倍、8倍、10倍、12倍、14倍，其它提取条件为提取1次、提取时间10分钟、最佳乙醇浓度和提取温度60℃情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳溶剂体积；

(3)提取温度

按提取温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，其它提取条件：提取1次、提取时间10分钟、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳提取温度；

(4)提取时间(分钟)

按提取时间15min、20min、25min、30min、35min，其它提取条件为提取1次、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积和最佳提取温度的情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳提取时间；

(5)提取次数

按提取次数1次、2次、3次、4次、5次，其它提取条件为最佳提取时间、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积和最佳提取温度的情况下，进行加热回流提取，比较提取率，得出最提取次数。

进一步，该提取方法进一步包括红腺忍冬叶中提取物的TCL检测方法：

步骤1，硅胶G薄层的制备

将3.5g羧甲基纤维素钠用100ml加热溶解，在研钵中将硅胶碾匀，均匀铺在玻片上，自然风干，待用；在108℃烘箱内活化半个小时待用；

步骤2，TCL检测

用毛细管吸取红腺忍冬叶提取物的乙醇溶解液和对照品乙醇溶解液，在距硅胶薄层板下边缘8mm的位置进行点样，点样斑点的直径为1-2mm。以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂展开。待展开8cm时，自然晾干，放于紫外灯下观察，记录显色荧光点的颜色，并计算比移值(Rf)。

进一步，该提取方法得到的红腺忍冬叶中绿原酸提取的最佳工艺条件为：乙醇的体积为红腺忍冬叶质量的8倍，提取次数3次，乙醇浓度为60％，提取温度为50℃。

本发明以红腺忍冬叶片为原料，获取了绿原酸的超声提取方法和工艺参数。为今后红腺忍冬叶资源的开发利用和绿原酸工业化生产提供了一定的参考借鉴的作用，对推动我国红腺忍冬叶的产业化发展有着积极的意义。此实验只对红腺忍冬叶粗产品作了一些研究，至于其纯化还有待进一步研究。据实验结果分析可知：红腺忍冬叶中绿原酸的超声提取最佳工艺条件是最佳工艺条件为A₂B₂C₃D₁，即提取温度为50℃，乙醇浓度为60％，，提取次数为3次，提取料液比为8倍。根据文献报道，用其他方法提取红腺忍冬叶中的绿原酸，得率在1％-2％之间，超声波提取法的提取率为可达1.7％以上，由此可见超声提取法较传统方法收率高，而且提取时间短，条件温和，是一种较好的提取方法。

附图说明

图1是本发明实施例提供的绿原酸的标准曲线；

图2是本发明实施例提供的溶剂浓度对提取率的影响曲线；

图3是本发明实施例提供的溶剂体积对提取率的影响曲线；

图4是本发明实施例提供的提取温度对提取率的影响曲线；

图5是本发明实施例提供的提取次数对提取率的影响曲线；

图6是本发明实施例提供的TCL结果色斑图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供了一种红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法，具体步骤如下：

1材料的选取

1.1实验材料

红腺忍冬叶，产自河南，经过粉碎处理。

1.2实验仪器

98-II-B磁力搅拌电热套(天津市泰斯特仪器有限公司)；KQ2200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；HH数显恒温水浴锅(金坛市金城国胜实验仪器厂)；WFJ 7200型可见分光光度计(尤尼柯(上海)仪器有限公司)；AY220电子天平(SHIMADZU CORPORATION JAPAN)。

1.3实验试剂

乙醇(均为分析醇、95％的工业乙醇)，冰醋酸，正丁醇，硅胶。

2实验方法

2.1.绿原酸含量测定方法

2.1.1最大吸收波长的确定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液适量，置10mL量瓶中，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，在分光光度计上于200-400nm扫描。对照品溶液与供试品溶液在328nm处均有最大吸收。故将328nm作为测定波长。

2.1.2对照品溶液的制备

精密称取对照品10mg，加适量70％乙醇，置水浴上微热使溶解，放冷后定容至50ml，摇匀，即得。(每1ml含红腺忍冬叶0.2mg)

2.1.3标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液2、4、6、8、10、12mL，分别置于50mL量瓶中，加水适量，摇匀.再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白.在328nm波长处测定吸光度。以绿原酸标品的浓度为横坐标，以在328nm下测得不同浓度的绿原酸标准品的吸光值为纵坐标，做标准曲线，得回归方程。

2.2红腺忍冬叶中绿原酸超声提取的单因素试验

药材与一定量的溶剂于烧杯中，放入超声波清洗器一定时间，过滤，再将溶液放入烧瓶，用旋转蒸发仪进行浓缩提取，干燥得到提取粗品，在紫外分光光度计下测定吸光值，并计算绿原酸的提取率。

分别对影响超声提取的每一因素(提取温度、提取时间、提取次数、溶剂体积、溶剂乙醇浓度，由于此次实验条件所限，无法控制超声功率，故忽略此单因素)设计5个水平进行试验，通过比较提取率确定对提取率影响较大的4个因数进行正交试验。

2.2.1溶剂乙醇浓度

按乙醇浓度40％，50％，60％，70％，80％，其它提取条件为提取1次、提取时间10分钟、溶剂体积为药材重量8倍和提取温度60℃的情况下进行超声提取。比较提取率，得出最佳溶剂乙醇浓度。

2.2.2溶剂体积(药材重量倍数)

按溶剂体积为6倍、8倍、10倍、12倍、14倍，其它提取条件为提取1次、提取时间10分钟、最佳乙醇浓度和提取温度60℃情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳溶剂体积。

2.2.3提取温度

按提取温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，其它提取条件：提取1次、提取时间10分钟、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳提取温度。

2.2.4提取时间(分钟)

按提取时间15min、20min、25min、30min、35min，其它提取条件为提取1次、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积和最佳提取温度的情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳提取时间。

2.2.5提取次数

按提取次数1次、2次、3次、4次、5次，其它提取条件为最佳提取时间、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积和最佳提取温度的情况下，进行加热回流提取，比较提取率，得出最提取次数。

2.3红腺忍冬叶中绿原酸超声提取的正交试验

依据上述单因数实验结果，确定4个主要因数进行正交试验(4因数3水平)，根据绿原酸提取率通过实验获取最佳提取条件。

因素水平表

正交实验设计表

2.4红腺忍冬叶中提取物的TCL检测

2.4.1硅胶G薄层的制备

将3.5g羧甲基纤维素钠用100ml加热溶解，在研钵中将硅胶碾匀，均匀铺在玻片上，自然风干，待用。在108℃烘箱内活化半个小时待用。

2.4.2TCL检测

用毛细管吸取红腺忍冬叶提取物的乙醇溶解液和对照品乙醇溶解液，在距硅胶薄层板下边缘8mm的位置进行点样，点样斑点的直径为1-2mm。以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂展开。待展开8cm时，自然晾干，放于紫外灯下观察，记录显色荧光点的颜色，并计算比移值(Rf)。

3实验结果与分析

3.1标准曲线的绘制

以绿原酸样品的浓度为横坐标，以在328nm下测得不同浓度的标准品的吸光值为纵坐标，做标准曲线，得到回归方程为：Y＝0.0446x+0.0893，r＝0.9950。结果表明，绿原酸在2-16μg/mL范围内线性关系良好。

3.2红腺忍冬叶中绿原酸加热回流提取的单因素试验

3.2.1溶剂乙醇浓度

其它提取条件为提取1次、提取时间30分钟、溶剂体积为药材重量8倍和提取温度60℃。

表溶剂浓度的实验结果

由图表可以看出，当乙醇浓度达到60％时，随着乙醇浓度的增大比较提取率反而减小，可以得出最佳溶剂乙醇浓度为60％。

3.2.2溶剂体积(药材重量倍数)

其它提取条件为提取1次、提取时间30分钟、最佳乙醇浓度和提取温度60℃。

表溶剂体积实验结果

由图表可以看出当溶剂体积倍数达到8倍后，随着溶液体积的增大，提取率基本不再增大，且会给后续浓缩工序带来困难，所以从经济方面考虑，得出最佳溶剂体积为8倍体积。

3.2.3提取温度

其它提取条件：提取1次、提取时间10分钟、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积。

表提取温度实验结果

由表和图可以看出，随着温度的不断提高，绿原酸的提取率也跟着上升，在50℃时达到最高点，温度再提高得率可是下降了，所以最佳提取温度为50℃。

3.2.4提取时间(分钟)

其它提取条件：提取1次、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积和最佳提取温度℃。

表提取时间实验结果

由表和图可以比较看出，绿原酸提取率随时间增加不断增长，在30分钟时达到最大，说明此时绿原酸容易完全提取，若继续提取，首先是对资源的浪费，其次是提取时间过长可能会造成绿原酸分解或得到杂质，从而降低了得率，因此最佳提取时间为30分钟。

3.2.5提取次数

其它提取条件：提取时间10分钟、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积和最佳提取温度

表提取次数实验结果

由表和图可以比较得出，当提取次数为3次时，提取率达到一个最大值，但当提取次数为5次时，提取率反而变大，这是因为提取次数多了，加热回流的时间变长，提取出了类绿原酸物质，提取率变大，但是绿原酸含量却变低。综合考虑，最佳提取次数为3次。

3.3红腺忍冬叶中绿原酸加热回流提取的正交试验

依据上述单因数实验结果，可以得出，因素影响大小为：乙醇浓度＞提取次数＞容积体积＞温度＞加热时间，因此可以确定乙醇浓度、提取次数、容积体积、温度4个为主要因数，来进行正交试验(4因数3水平)，根据绿原酸提取率通过实验获取最佳提取条件。

表因数水平表

表绿原酸提取正交实验表

由表4-2直观分析可得：因素影响的显著性依次为D＞C＞B＞A，即提取因子中料液比对红腺忍冬叶中绿原酸的提取得率的影响最大，提取温度对绿原酸提取得率的影响最小。

综合考虑以上的分析结果与实际运用中的效率，优选出的最佳工艺条件为A₂B₂C₃D₁，即提取温度为50℃，乙醇浓度为60％，，提取次数为3次，提取料液比为8倍。

3.4红腺忍冬叶中提取物的TLC检测

3.4.1TLC捡测的结果与分析

本试验以正丁醇∶冰醋酸∶水(7∶1∶2)为展开剂，对红腺忍冬叶提取物进行TLC检测，在紫外灯照射下观察其色斑情况，并测定其Rf值在0.4-0.5之间，与纯品绿原酸的文献报道一致。(Rf＝B/A)

表TCL检测结果

	1板	2板	3板	平均值
					A	3.6	3.7	3.6	3.6

B	7.6	7.8	7.8	7.7
					Rf	0.473	0.474	0.462	0.469

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法，其特征在于，该超声提取方法包括以下步骤：

步骤1，进行绿原酸含量测定，主要包括：

(1)最大吸收波长的确定

分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液适量，置10mL量瓶中，再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白，在分光光度计上于200-400nm扫描；对照品溶液与供试品溶液在328nm处均有最大吸收，故将328nm作为测定波长；

(2)对照品溶液的制备

精密称取对照品10mg，加适量70％乙醇，置水浴上微热使溶解，放冷后定容至50ml，摇匀，即得，每1ml含红腺忍冬叶0.2mg；

(3)标准曲线的绘制

精密量取对照品溶液2、4、6、8、10、12mL，分别置于50mL量瓶中，加水适量，摇匀.再加水至刻度，摇匀，放置15min，以相应试剂为空白.在328nm波长处测定吸光度。以绿原酸标品的浓度为横坐标，以在328nm下测得不同浓度的绿原酸标准品的吸光值为纵坐标，做标准曲线，得回归方程；

步骤2，进行红腺忍冬叶中绿原酸超声提取的单因素试验，主要包括：

药材红腺忍冬叶片经60℃烘干，再粉碎过60目筛，称取一定量粉碎的红腺忍冬叶与一定量的溶剂于烧杯中，放入超声波清洗器一定时间，过滤，再将溶液放入烧瓶，用旋转蒸发仪进行浓缩提取，干燥得到提取粗品，在紫外分光光度计下测定吸光值，并计算绿原酸的提取率；

分别对影响超声提取的每一因素，设计5个水平进行试验，通过比较提取率确定对提取率影响较大的4个因数进行正交试验；

(1)溶剂乙醇浓度

按乙醇浓度40％，50％，60％，70％，80％，其它提取条件为提取1次、提取时间10分钟、溶剂体积为药材重量8倍和提取温度60℃的情况下进行超声提取。比较提取率，得出最佳溶剂乙醇浓度；

(2)溶剂体积(药材重量倍数)

按溶剂体积为6倍、8倍、10倍、12倍、14倍，其它提取条件为提取1次、提取时间10分钟、最佳乙醇浓度和提取温度60℃情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳溶剂体积；

(3)提取温度

按提取温度40℃、50℃、60℃、70℃、80℃，其它提取条件：提取1次、提取时间10分钟、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳提取温度；

(4)提取时间(分钟)

按提取时间15min、20min、25min、30min、35min，其它提取条件为提取1次、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积和最佳提取温度的情况下，进行超声提取，比较提取率，得出最佳提取时间；

(5)提取次数

按提取次数1次、2次、3次、4次、5次，其它提取条件为最佳提取时间、最佳乙醇浓度、最佳溶剂体积和最佳提取温度的情况下，进行加热回流提取，比较提取率，得出最提取次数。

2.如权利要求1所述的红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法，其特征在于，该提取方法进一步包括红腺忍冬叶中提取物的TCL检测方法：

步骤1，硅胶G薄层的制备

将3.5g羧甲基纤维素钠用100ml加热溶解，在研钵中将硅胶碾匀，均匀铺在玻片上，自然风干，待用；在108℃烘箱内活化半个小时待用；

步骤2，TCL检测

用毛细管吸取红腺忍冬叶提取物的乙醇溶解液和对照品乙醇溶解液，在距硅胶薄层板下边缘8mm的位置进行点样，点样斑点的直径为1-2mm。以正丁醇-冰醋酸-水(7∶1∶2)为展开剂展开。待展开8cm时，自然晾干，放于紫外灯下观察，记录显色荧光点的颜色，并计算比移值(Rf)。

3.如权利要求1所述的红腺忍冬叶绿原酸的超声提取方法，其特征在于，该提取方法得到的红腺忍冬叶中绿原酸提取的最佳工艺条件为：乙醇的体积为红腺忍冬叶质量的8倍，提取次数3次，乙醇浓度为60％，提取温度为50℃。

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