CN103074305A - 重组水痘－带状疱疹病毒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供重组水痘－带状疱疹病毒及其制备方法，和包含重组水痘－带状疱疹病毒的药物组合物；还提供包含所述水痘－带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体、包含这种载体的细胞以及能与水痘－带状疱疹病毒进行同源重组的片段、包含所述的BAC载体序列的核酸盒。为此，本发明通过开发利用BAC载体序列制备重组水痘－带状疱疹病毒的方法，解决了上述课题。

Description

重组水痘-带状疱疹病毒
本申请是申请日为2005年3月3日，申请号为200580014523.0的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及重组水痘－带状疱疹病毒，特别是利用BAC（大肠杆菌人工染色体）制备的重组水痘－带状疱疹病毒，以及包含此种病毒的药物组合物。此外，本发明还涉及包含水痘－带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体，以及包含此种载体的细胞。本发明还涉及制备重组水痘－带状疱疹病毒的方法。再有，本发明涉及包含能与水痘－带状疱疹病毒基因组进行同源重组的片段以及BAC载体序列的核酸盒。
背景技术
水痘－带状疱疹病毒（varicella－zoster virus；VZV）是属于人疱疹病毒科（Herpesviridae）的病毒，是表现出两种不同临床表象疾病（水痘和带状疱疹）的病因。这种病毒的初期感染引起水痘（水疱疮）。其后，此种病毒潜伏感染神经节，经年累月后由于某种诱因重新活化引发带状疱疹（形成病毒颗粒，通过神经传导，达到表皮细胞，在神经分布的区域形成水痘症状）。
VZV基因组是双链DNA，包含约125000个碱基。全部的碱基序列已由Davison等人确定，已知该基因组中至少存在着72个基因。
VZV疫苗的研发困难重重。VZV疫苗Oka株是由高桥等人开发的（特公昭53－41202号），是世界上唯一针对水痘－带状疱疹病毒的疫苗。现有的减毒活水痘疫苗是利用以来源于减毒水痘病毒Oka株的病毒作为种子制备的，目前在世界各国广泛应用（Requirements forVaricella（Live）Adopted 1984；Revised 1993：WHO Technical ReportSeries，No.848，pp.22－38，1994）。这一Oka株是由如下方式获得的，即将从表现典型的水痘症状的患儿分离的病毒（Oka原株），利用人胎儿肺细胞在34℃下传代12代，再利用豚鼠胚胎细胞传代11代，然后利用人二倍体细胞传代数代来获得。所述的Oka原株虽然具有强病源性，但Oka疫苗株（Oka株）即使对正常的儿童接种也几乎没有发现副作用。因此，Oka株作为几乎没有病源性的疫苗株是有用的。
病毒疫苗在进行传代培养时有可能改变其基因型。另外，由在Oka株自身的制备过程中经过多次传代培养，Oka株自身也可能具备遗传多样性。实践中，为了确保疫苗的安全性和有效性，考虑到在制备疫苗过程中，由于传代培养所导致的疫苗遗传改变，制定了种子批次系统作为对认可进行生产的水痘种子病毒的传代数的限制，即以确认种子时的传代数为0代，并把从0代开始总传代数在10代以内的病毒用作疫苗。
另一方面，通过水痘疫苗的效果追踪，以及售后调查（PMS：post－marketing Surveillance），从流行病学的观点，有必要对从自然感染的水痘患者分离的水痘病毒的新鲜野生株与来自上述Oka株的疫苗株之间的病毒学差异进行分析，故已进行了应用免疫学和遗传工程学进行分析的多种尝试。例如，已有基于下述文献进行的试验报道，即水痘病毒株间基因结构、DNA碱基序列之间的差异（Journal of GeneralVirology，59，660－668，1986；同前67，1759－1816，1986），限制酶Pst I酶切位点的有无（Japanese Journal of Experimental Medicine，59，233－237，1989），根据应用PCR（聚合酶链式反应）进行的RFLP（限制性片段长度多态性）判定（Journal of Virology，66，1016－1020，1992），以及将上述Pst I酶切位点的有无与RFLP分析相结合（Journalof Clinical Microbiology，33，658－660，1995）。尽管通过这些试验提出了为鉴别新鲜的野生型菌株与来自Oka株的疫苗株的条件，但考虑到Oka株自身的遗传多样性的问题，仍缺乏可信性，且不具备确定性，故而仍然存在疫苗的品质管理问题。再有，已知有利用水痘病毒的基因14区域鉴定水痘病毒Oka株的方法（US Patent No.6,093,535），利用基因62区域鉴定减毒活水痘疫苗病毒株的方法（WO 00/50603），这些方法中的任意一种技术均可以用于鉴定水痘病毒Oka株（强毒亲株），由亲株衍生的疫苗株（减毒的Oka株），以及Oka株之外的水痘病毒株之间的差异。但是以用于减毒活水痘疫苗的品质管理和品质保证的制剂标准尚不完备。
目前，用于评定和确认疫苗品质的方法，还没有进行例如，通过对种子病毒和疫苗病毒的基因组DNA以直接的或定量的遗传分析进行品质管理，因此用作活疫苗的减毒株的品质管理和品质保证的准确度无法计算，故而含混不清。因此，提高品质管理和品质保证的准确度对于确保减毒活水痘疫苗的有效性。安全性·均质性至关重要。然而，如上所述，由于尚未确立其方法，使其成为亟待解决的课题。
此外，为了研制出一种优于Oka株的、经改变的水痘－带状疱疹病毒疫苗，也需要开发经诱变的重组水痘－带状疱疹病毒及其制备方法。
专利文献1：特公昭53－41202号
专利文献2：米国特许第6,093,535号
专利文献3：国际公开番号WO 00/50603
非专利文献1：Requirements for Varicella Vaccine(Live)Adopted 1984；Revised 1993：WHO Technical Report Series，No.848，pp.22-38，1994
非专利文献2：Journal of General Virology，59，660-668，1986
非专利文献3：Journal of General Virology，67，1759-1816，1986
非专利文献4：Japanese Journal of Experimental Medicine，59，233-237，1989
非专利文献5：Journal of Virology，66，1016-1020，1992
非专利文献6：Journal of Clinical Microbiology，33，658-660，1995
发明内容
本发明的一个目的在于提高水痘带状疱疹疫苗的品质控制和品质保证的精度，以确保、保证减毒活水痘疫苗的有效性，安全性和均质性。此外，本发明的课题还在于为了研制一种优于Oka株的，经改变的水痘－带状疱疹病毒疫苗，建立通过诱变生产重组水痘－带状疱疹病毒的方法，并提供此种病毒。
为实现上述目的，本发明提供了重组水痘－带状疱疹病毒，及其生产方法，例如利用BAC（大肠杆菌人工染色体）由单一病毒株生产重组水痘－带状疱疹病毒的方法。
发明概述
本发明人通过开发利用BAC载体序列制造重组水痘－带状疱疹病毒的方法，完成了本发明。本发明提供了下述内容。
1.重组水痘－带状疱疹病毒。
2.1项中所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，包含BAC载体序列。
3.如2项中所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，至少部分BAC载体序列插入到水痘－带状疱疹病毒基因组的非必需区域之中。
4.如3项中所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的非必需区域选自下述区域：基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。
5.如4项中所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。
6.如2项所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，至少部分BAC载体序列插入到水痘－带状疱疹病毒基因组的基因62的ORF区域。
7.如2项中的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
8.如2项中所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
9.如8项中所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
10.如2项中的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
11.如2项中的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自野生株。
12.如2项中的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
13.如2项中的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
14.如2项中的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组在基因62和基因6中带有突变。
15.如14项中的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的基因62在SEQ ID NO.5中至少包含下述（a）－（d）中的碱基取代：
（a）第2110位的G取代；
（b）第3100位的G取代；
（c）第3818位的C取代；和
（d）第4006位的G取代，
以及前述基因6在SEQ ID NO.8的碱基序列中至少具有第5745位碱基是G的碱基取代。
16.如2项中的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列是具有SEQ ID NO.：7中所示序列的载体。
17.包含1项中所述病毒的药物组合物。
18.如17项所述的药物组合物，其中，组合物是疫苗的形式。
19.载体，其包含除基因62之外的水痘－带状疱疹病毒基因组必需基因和BAC载体序列。
20.如19项所述的载体，其进一步包含基因62。
21.如19项所述的载体，其中，当所述载体插入哺乳动物细胞时，哺乳动物细胞产生水痘－带状疱疹病毒。
22.如19项所述的载体，其中，来自前述水痘－带状疱疹病毒基因组的序列与BAC载体序列相连的部分位于该水痘－带状疱疹病毒基因组非-必需区域内。
23.如22项所述的载体，其中，所述的非必需区域选自下述区域：基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。
24.如23项所述的载体，其中，所述的连接部分是基因11的ORF侧翼区域或基因12的ORF侧翼区域。
25.如19项所述的载体，其中，所述的来自水痘－带状疱疹病毒基因组的序列与前述BAC载体序列相连的部分位于水痘－带状疱疹病毒基因组中基因62的ORF中的区域内。
26.如19项所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
27.如19项所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
28.如27项所述的载体，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
29.如27项所述的载体，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
30.如19项所述的载体，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自野生株。
31.如19项所述的载体，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
32.如19项所述的载体，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
33.如19项所述的载体，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组带有在基因62和基因6中的突变。
34.如33项中的载体，其中，所述的基因62在SEQ ID NO.5中至少包含下述（a）－（d）中的碱基取代：
（a）第2110位的G取代；
（b）第3100位的G取代；
（c）第3818位的C取代；和
（d）第4006位的G取代，
此外，基因6在SEQ ID NO.8的碱基序列中至少包含第5745位碱基是G的碱基取代。
35.如19项所述的载体，其中，是所述的BAC载体序列包含SEQID NO.：7所示的序列的载体。
36.包含19项所述载体的细胞。
37.如36项所述的细胞，其中，所述的细胞是细菌细胞。
38.如37项所述的细胞，其中，所述的细菌细胞是大肠杆菌细胞。
39.如36项所述的细胞，其中所述的细胞是哺乳动物细胞。
40.如39项所述的哺乳动物细胞，其中，所述的哺乳动物细胞是来自人的细胞。
41.由如39项所述的哺乳动物细胞产生的病毒。
42.包含如41项所述病毒的药物组合物。
43.如42项所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗形式。
44.生产重组水痘－带状疱疹病毒的方法，它是重组水痘－带状疱疹病毒的生产方法，该方法包含以下步骤：
将含有除基因62之外的水痘－带状疱疹病毒基因组必需基因与BAC载体序列的载体导入哺乳动物宿主细胞的步骤；和
培养该哺乳动物宿主细胞，产生重组水痘－带状疱疹病毒的步骤。
45.如44项所述的方法，其中，所述的载体还包含基因62。
46.如44项所述的方法，其中，所述的哺乳动物宿主细胞来源于人。
47.如44项所述的方法，其中，所述的BAC载体序列至少包含两种重组蛋白依赖的重组序列。
48.如47项所述的方法，其中，进一步包含引起上述两个重组蛋白依赖的重组序列之间重组的步骤。
49.如44项所述的方法，其中，来自前述水痘－带状疱疹病毒基因组的序列与BAC载体序列相连的部位位于该水痘－带状疱疹病毒基因组的非必需区域内。
50.如49项所述的方法，其中，所述的非必需区域选自下述区域：
基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。
51.如50项所述的载体，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF侧翼区域或基因12的ORF侧翼区域。
52.如44项所述的方法，其中，所述的来自水痘－带状疱疹病毒基因组的序列与BAC载体序列相连接的部分位于水痘－带状疱疹病毒基因组的基因62的ORF区域内。
53.如44项所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
54.如44项所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
55.如第54项所述的方法，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
56.如第54项所述的方法，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
57.如44项所述的方法，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自野生株。
58.如44项所述的方法，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
59.如44项所述的方法，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
60.如44项所述的方法，其中，前述水痘－带状疱疹病毒基因组具有基因62和基因6中的突变。
61.如第60项所述的方法，其中，所述的基因62在SEQ ID NO.5中至少包含下述（a）－（d）中的碱基取代：
（a）第2110位的G取代；
（b）第3100位的G取代；
（c）第3818位的C取代；和
（d）第4006位的G取代，
此外，基因6包含在SEQ ID NO.8的碱基序列中至少第5745位碱基是G的碱基取代。
62.如44项所述的方法，其中，是所述的BAC载体序列包含SEQID NO.：7所示的序列的载体。
63.如第44项所述方法所生产的病毒。
64.药物组合物，其包含如第63项所述的病毒。
65.如第64项所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗的形式。
66.向如第19项所述的载体中导入突变的方法，包括以下步骤：
将所述载体导入细菌宿主细胞的步骤；
将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成的片段的质粒载体导入该细菌宿主细胞的步骤，其中，所述片段至少具有一个突变；
培养所述的细菌宿主细胞的步骤；
由经培养的细菌宿主细胞分离具有BAC序列的载体的步骤。
67.向如第19项所述的载体中导入突变的方法，包括以下步骤：
将所述载体导入细菌宿主细胞的步骤；
将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成的第一片段的第一质粒载体导入所述细菌宿主细胞的步骤，其中，所述的第一片段至少具有一个变异；
将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成的第二片段的第二质粒载体导入所述细菌宿主细胞中的步骤，其中，所述的第二片段至少具有一个变异，所述的第二片段与第一片段不同；
培养所述细菌宿主细胞的步骤；
从所培养的细菌宿主细胞分离具有BAC载体序列的载体的步骤。
68.核酸盒，其包含在细菌细胞内可以与水痘－带状疱疹病毒基因组同源重组的第一片段，BAC载体序列，和在细菌细胞内可以与水痘－带状疱疹病毒基因组同源重组的第二片段的核酸，其中，所述的BAC序列两端分别与第一片段和第二片段相连。
69.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少为1kb。
70.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少为1.5kb。
71.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少为2kb。
72.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段与水痘－带状疱疹病毒基因组序列至少80％同一。
73.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段与水痘－带状疱疹病毒基因组序列至少85％同一。
74.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段与水痘－带状疱疹病毒基因组序列至少90％同一。
75.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段与水痘－带状疱疹病毒基因组序列至少95％同一。
76.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地来自选自下述的水痘－带状疱疹病毒基因组的区域：
基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域，基因70的ORF的侧翼区域。
77.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地与选自下述的水痘－带状疱疹病毒基因组的区域至少80%同一，所述的区域为：
基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。
78.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地与选自下述的水痘－带状疱疹病毒基因组的区域至少85%同一，所述的区域为：
基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。
79.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地与选自下述的水痘－带状疱疹病毒基因组的区域至少90%同一，所述的区域为：
基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。
80.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地与选自下述的水痘－带状疱疹病毒基因组的区域至少95%同一，所述的区域为：
基因7的ORF中的区域，基因8的ORF中的区域，基因9的ORF中的区域，基因10的ORF中的区域，基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因7的ORF的侧翼区域，基因8的ORF的侧翼区域，基因9的ORF的侧翼区域，基因10的ORF的侧翼区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。
81.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段来自不同的区域。
82.如第72项所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段分别独立地来自于基因11的ORF的侧翼序列和基因12的ORF的侧翼序列。
83.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
84.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
85.如第84项所述的核酸盒，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
86.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
87.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自野生株。
88.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
89.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
90.如第68项所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含SEQ ID NO.：7所示的序列。
91.如第68项所述的核酸盒，其具有SEQ ID NO.：2所示的核酸序列。
本发明提供重组水痘－带状疱疹病毒及其生产方法。例如，本发明提供利用BAC（大肠杆菌人工染色体）由单个的病毒株生产重组水痘－带状疱疹病毒的方法，以及由该方法生产的重组水痘－带状疱疹病毒。此外，本发明还提供包含所述重组水痘－带状疱疹病毒的药物组合物。
本发明还提供包含水痘－带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体，包含所述载体的细胞，以及包含能与水痘－带状疱疹病毒基因组同源重组的片段以及BAC载体序列的核酸盒。
附图说明
图1是显示水痘－带状疱疹病毒Oka株基因组和重组水痘－带状疱疹病毒的结构的模式图。
图2是水痘－带状疱疹病毒Oka株（亲株）基因组与重组水痘－带状疱疹病毒（rV02）的体外增殖比较图。
优选实施方案的描述
以下，对本发明进行说明。在整个说明书中，只要没有特别说明，单数表达形式应当理解为也包含其复数形式的概念范畴。只要没有特别说明，本说明书中所使用的术语应理解为本领域通常所指的含义。因而在没有其它定义的情况下，本说明书中所使用的全部专业术语和科技用语，应理解为本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的含义。当发生矛盾时，首先依照本说明书（包括定义）。
以下对本发明进行说明。在本说明书中，只要没有特别说明，单数表达形式应当理解为包含其复数形式的概念范畴。因此，单数形式的冠词（例如英语中的“a”，“an”，“the”）在没有特别说明的情况下也包含其复数形式的概念范畴。在没有特别说明的情况下，本说明书中所使用的术语应理解为本领域通常所指的含义。因而在没有其它定义的情况下，本说明书中所使用的全部专业术语和科技用语，应理解为与本发明所属技术领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。发生矛盾时，优先依照本说明书中（包括定义）。
术语的定义
以下列举的是本说明书中特别使用的术语的定义。
在本说明书中使用时，水痘－带状疱疹病毒的“必需基因”是指水痘－带状疱疹病毒增殖所必需的基因。水痘－带状疱疹病毒的“非必需基因”指对于非水痘－带状疱疹病毒增殖所必需的基因，即使缺失了这些“非必需基因”，水痘－带状疱疹病毒仍然可以增殖的基因。作为水痘－带状疱疹病毒的非必需基因，例如包括但不限于：基因7，基因8，基因9，基因10，基因11，基因12，基因13，基因14，基因15，基因17，基因18，基因19，基因38，基因39，基因46，基因47，基因48，基因49，基因50，基因56，基因57，基因58，基因59，基因61，基因63，基因64，基因65，基因66，基因67，基因68，基因69和基因70。
当病毒基因组中的基因为必需基因时，由于该基因被破坏，病毒将不能增殖。因此，当病毒基因组中的任意基因被破坏后，通过检测病毒的增殖情况即可判断被破坏的基因是必需基因还是非必需基因。
本说明书中所述的水痘－带状疱疹病毒的“野生株”指未经人工修饰，从自然界中分离的水痘－带状疱疹病毒株。作为野生株例如，包括但不限于Davison，A.J.and Scott，J.E.（J.Gen.Virol.67（Pt 9），1759－1816（1986）鉴定的Dumas株。Dumas株的核酸序列如SEQ IDNO.：5所示。该Dumas株的ORF的编号及其位置如下：
Figure BDA00002667455200191
Figure BDA00002667455200201
Figure BDA00002667455200211
上表中“5’→3’方向”指ORF具有与SEQ ID NO.：5所示核酸序列相同的方向。“3’→5’方向”指ORF具有与SEQ ID NO.：5所示核酸序列相反的方向。通过鉴定与上述ORF的核酸序列和/或氨基酸序列同源的序列，本领域的技术人员可以容易地鉴定出来自Dumas株之外的基因组中的ORF。
本说明书中的“突变株”是指对野生株的病毒株经过诱发突变，多次传代培养等诱发突变的水痘－带状疱疹病毒株。在对水痘－带状疱疹病毒株诱发突变时，所述的诱发突变既可以是随机导入突变，也可以是导入位点特异性突变。
在本说明书中使用时，“减毒病毒”是病毒突变株的一种，其毒性比野生株有所减弱。关于确定病毒突变株的毒性是否比野生株减弱的方法，即试验水痘－带状疱疹病毒病源性的方法，已确立了两种方法。
作为应用动物模型的方法，已知有制备移植了人皮肤的重度联合免疫缺损（SCID）小鼠，使其感染水痘－带状疱疹病毒来对病源性进行评价的方法（J.Viro 1.1998Feb；72（2）：965－74）。
与此相反，作为在试管中对病源性进行评价的方法，已知有分别在经孔径3μm的trans－well分隔的双层孔的下层接入单层培养的人黑素瘤细胞，上层接入经水痘－带状疱疹病毒感染的脐带血单核细胞（CBMC），培养7－8天后，观察黑素瘤细胞的CPE（细胞变性效果）程度的方法（J.Virol.2000Feb；74（4）：1864－70）。
虽然不是直接确定病源性的方法，从本发明者等人迄今为止的研究结果（J Virol.2002Nov；76（22）：11447－59）可以理解的是病毒的病源性与增殖性密切相关，所以通过感染中心分析（infectious centerassay）研究细胞－细胞（cell－to－cell）的增殖性也可以间接地评价病源性。
通过人工的方式对病毒进行减毒的方法是公知的。例如可以把具有SEQ ID NO.5所示的基因62中至少以下（a）～（d）的碱基取代以及在SEQ ID NO.8中所示的基因6中，至少5745位碱基为G的碱基取代的水痘－带状疱疹病毒作为减毒的病毒使用：
（a）第2110位的G取代；
（b）第3100位的G取代；
（c）第3818位的C取代；和
（d）第4006位的G取代。
作为应用上述水痘－带状疱疹病毒的替代，除了（a）～（d）的碱基取代之外，还可以使用具有以下（e）～（g）中至少一个或一个以上碱基取代的减毒水痘病毒株：
（e）第1251位的G取代；
（f）第2226位的G取代；和
（g）第3657位的G取代。
本发明中，作为应用上述的水痘－带状疱疹病毒的替代，除了（a）～（g）的至少一个或一个以上之外，还可以使用具有下述（h）～（o）的至少一个或一个以上的减毒水痘病毒株：
（h）第162位的C取代；
（i）第225位的C取代；
（j）第523位的C取代；
（k）第1565位的C取代；
（l）第1763位的C取代；
（m）第2652位的C取代；
（n）第4052位的C取代；和
（o）第4193位的C取代。
或作为“减毒病毒”，例如可以使用在基因62中具有选自下述的至少一种碱基取代的病毒：
（a）第2110位的G取代；
（b）第3100位的G取代；
（c）第3818位的C取代；
（d）第4006位的G取代，
（e）第1251位的G取代；
（f）第2226位的G取代；
（g）第3657位的G取代；
（h）第162位的C取代；
（i）第225位的C取代；
（j）第523位的C取代；
（k）第1565位的C取代；
（l）第1763位的C取代；
（m）第2652位的C取代；
（n）第4052位的C取代；
（o）第4193位的C取代。
本说明书中使用的术语“蛋白质”“多肽”“寡肽”和“肽”具有相同的含义，均指具有任意长度的氨基酸聚合物。
本发明书中所用的术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”在本说明书中，表示相同含义，指任意长度的核苷酸。除非特别说明，特定的核酸序列与所示的序列一样包含其经保守修饰的突变体（例如简并密码子取代）及其互补序列。具体而言，简并密码子取代可以通过制备一个或多个（或全部）所选择密码子的第三位由混合碱基和/或脱氧次黄嘌呤核苷残基取代的序列而完成（Batzer等人，Nucleic AcidRes.19：5081（1991）；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605－2608（1985）；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8：91－98（1994））。
本说明书中所述的术语“基因”是指确定遗传性状的因子。通常在染色体上以一定的顺序排列。把确定蛋白质一级结构的基因称为结构基因。调节结构基因表达的基因称为调节基因。本说明书中所用的“基因”指“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”、和/或“蛋白质”“多肽”“寡肽”和“肽”。本说明书中基因的“开放阅读框”或“ORF”指将基因的碱基序列以每3个碱基为一组进行分割时所得的三种读框中的一个，其具有起始密码子，内部没有终止密码子且具有一定的长度，实际上有可能编码蛋白质的读框。水痘－带状疱疹病毒基因组，其全序列已经得到鉴定，其中至少鉴定了71个基因，已知各基因分别具有开放阅读框（ORF）。
本说明书中，水痘－带状疱疹病毒基因组中基因的“ORF中的区域”是指位于水痘－带状疱疹病毒基因组内的基因中形成ORF的碱基所在的区域。
本说明书中，水痘－带状疱疹病毒基因组中基因的“ORF侧翼区域”是指位于水痘－带状疱疹病毒基因组内基因中，位于ORF附近的碱基所在的区域，其不代表该基因或其它基因的ORF中的区域。
本说明书中所用的术语基因的“同源性”指两个或两个以上的基因序列之间的同一性程度。某因此，两序列的同源性越高，则其序列的同一性或相似性越高。两种基因是否具有同源性可以通过将两个序列进行直接比较来判断，当所述序列是核酸时也可以通过在严格条件下的杂交方法进行判定。将两个基因直接进行比较时，所述基因的DNA序列，典型地具有至少50%的同一性，优选具有至少70%的同一性，更优选具有至少80%，90%，95%，96%，97%，98%，或99%同一性时，认为它们的基因具有同源性。
本说明书中所述的碱基序列同一性的比较和同源性的计算可以利用作为序列分析用工具的BLAST以其缺省参数进行计算。
本说明书中基因、多核苷酸，多肽等的“表达”指其基因等在体内受到某种作用而形成另外的形态。优选指基因，多核苷酸等经转录和翻译成为多肽，也可以是将基因转录为mRNA并表达。更优选地，所述的多肽可以经翻译后加工。
本说明书中氨基酸可以通过一般已知的三字符形式表示，也可以IUPAC－IUB生物化学命名委员会所推荐的单字符形式表示。类似地，对于核苷酸以其为公众所接受的单字符编码形式表示。
本说明书中所述的“片段”是相对于全长的多核苷酸或多肽（其长度为n），具有1到n－1序列长度的多肽或多核苷酸。片段的长度，根据目的不同可以适当地变化，例如作为片段长度的下限，当用于多肽时，可以列举3，4，5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50或其以上个氨基酸。用这里没有列举的整数表示的长度（例如，11等）作为下限，也是适宜的。当指多核苷酸时，可以列举5，6，7，8，9，10，15，20，25，30，40，50，75，100，200，300，400，500，600，600，700，800，900，1000或其以上个核苷酸，用这里没有具体列举的整数表示的长度（例如，11等）作为下限，也是适宜的。
BAC载体内的基因所编码的多肽只要其具有与天然的多肽基本上同一的作用即可既可以是在其氨基酸序列中包含1个或以上（例如1个或几个）氨基酸的取代，添加和/或缺失，也可以是糖链的取代，添加和/或缺失。
本说明书中所用的“糖链”指连接1个或1个以上单元糖（单糖和/或其衍生物）的化合物。当连接两个或以上的单元糖时，各单元糖与单元糖之间，可以通过糖苷键脱水缩合连接。作为这种糖链，例如其包括但不限于，生物体中所含的多糖（葡萄糖、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、木糖、Ｎ－乙酰葡糖胺、乙酰半乳糖胺、唾液酸及其复合物或衍生物），以及降解的多糖，糖蛋白，蛋白聚糖，粘多糖，糖脂等由复合生物分子分解或诱导产生的糖链等广义的糖。因此，本说明书中“糖链”可以与“多糖”，“含糖物质”和“碳水化合物”互换使用。除非特别说明，本说明书中所述的“糖链”包含“糖链”和“含有糖链的物质”两方面的含义。
用具有同样疏水性指数的其它氨基酸取代某氨基酸可以生成仍然具有相同生物学功能的蛋白质（例如具有等价的酶活性的蛋白质），在本领域是众所周知的。在这种氨基酸取代中优选疏水性指数在±2以内，进一步优选在±1以内，更优选在±0.5以内。基于疏水性的这种氨基酸取代是有效的，这在本领域中，是可以理解的。在制备变异体时还要考虑亲水性指标。如US4,554,101所示，对氨基酸残基分配了如下的亲水性指数：精氨酸（+3.0）；赖氨酸（+3.0）；天冬氨酸（+3.0±1）；谷氨酸（+3.0±1）；丝氨酸（+0.3）；天冬酰胺（+0.2）；谷氨酰胺（+0.2）；甘氨酸（0）；苏氨酸（－0.4）；脯氨酸（－0.5±1）；丙氨酸（－0.5）；组氨酸（－0.5）；半胱氨酸（－1.0）；甲硫氨酸（－1.3）；缬氨酸（－1.5）；亮氨酸（－1.8）；异亮氨酸（－1.8）；酪氨酸（－2.3）；苯丙氨酸（－2.5）；和色氨酸（－3.4）。可以理解的是某种氨基酸可以被具有相同亲水性指数的其它氨基酸取代而提供生物学等价体。在这种氨基酸取代中，优选亲水性指数在±2以内，更优选在±1以内，进一步优选在±0.5以内。
本发明中的“保守取代”是指在氨基酸取代中，原来的氨基酸和被取代氨基酸的亲水性指数和/或疏水性指数类似的取代。例如，保守取代的例子是本领域已知的，如的下列各组内的取代：精氨酸和赖氨酸；谷氨酸和天冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；缬氨酸，亮氨酸和异亮氨酸。
本说明书中所述的“变体”是指针对原来的多肽或多核苷酸等物质，使其一部分发生改变所得的物质。作为这样的变体可以列举：取代变体，添加变体，缺失变体，截短变体，等位基因变体等。等位基因（allele）是指属于同一基因座但相互之间存在差异的基因变体。因此，所谓的“等位基因变异体”指与某基因具有等位基因关系的变体。所述的“种同源物”或“同系物”指某种中具有在某基因和氨基酸水平或核苷酸水平上同源性（优选至少60%或以上同源，更优选至少80%或以上，85%或以上，90%或以上，95%或以上的同源性）的物质。本说明书中记载了这种种同源物的制备方法。所谓“直向同源物”也称作直向同源基因是指经过种分化，由共同的祖先分化形成的基因。例如，以具有多种基因结构的血红蛋白基因家族为例，人和小鼠的α－血红蛋白基因是直向同源物。人的α－血红蛋白基因和β－血红蛋白基因是种内同源物（由于基因发生重复所产生的基因）。直向同源物对于分子系统树的推定是有用的。本发明的直向同源物在本发明中也是有用的。
“保守性（保守性改变）变体”在氨基酸序列和核酸序列两方面均适用。对于特定的核酸序列，所谓经保守性改变所得的变体是可以编码同一或基本上同一的氨基酸序列的核酸。当核酸不编码氨基酸序列时，称为实质上同一的序列。由于遗传密码子的简并性，许多功能同一的核酸编码任意给定的蛋白质。例如密码子GCA，GCC，GCG和GCU都编码丙氨酸。因而在所有通过所述密码子表示丙氨酸的位置，在所编码的多肽不发生改变的情况下，该密码子可被上述对应的任意密码子所替换。这种核酸变化是保守性变异的一种，即“沉默改变（变异）”。本说明书中记录了编码多肽的所有核酸序列，以及该核酸的所有沉默变异。本领域中，核酸中的各密码子（通常唯一编码甲硫氨酸的AUG，通常为编码色氨酸的TGG除外）均可能为产生同样功能的分子而被改变。因此，所述的各序列也暗含了编码多肽的核酸的各沉默变异。优选地这样的改变要避免对多肽高级结构产生较大影响的氨基酸即半胱氨酸的替代。
在本说明书中为了制备包含编码功能等价多肽基因的BAC载体，除氨基酸的取代之外，也可以进行氨基酸的添加，缺失或修饰。所谓氨基酸替代，是指对原始的肽进行一个以上，例如1－10个，优选1－5个，更优选1－3个氨基酸的替代。所谓氨基酸的添加是指对原始的肽进行一个以上，例如1－10个，优选1－5个，更优选1－3个氨基酸的添加。所谓氨基酸的缺失，是指使原始肽进行一个或一个以上，例如1－10个，优选1－5个，更优选1－3个氨基酸的缺失。氨基酸的修饰包括但不限于酰胺化、羧基化、硫酸化、卤化、烷基化、糖基化作用、磷酸化作用、羟基化作用、酰化作用（例如、乙酰化）等等。替代或添加的氨基酸可以是天然氨基酸，也可以是非天然的氨基酸或氨基酸的类似物。优选天然氨基酸。
本说明书中使用的多肽的核酸的形式指能表达其多肽的蛋白质形式的核酸分子。对于所述的核酸分子，只要其表达的多肽具有与天然的多肽基本上同一的活性，则如上所述核酸分子中的一部分序列可以缺失，也可以被其它碱基所替代，也可以部分插入其它的核酸序列。也可以在5’端和/或3’端添加其它的核酸。还可以是对编码多肽的基因在严格条件下杂交、并且编码与这种多肽具有基本上相同功能多肽的核酸分子。这些基因是本领域所公知的，可以应用于本发明。
这样的核酸可以利用已知的PCR方法获得，也可以通过化学合成来获得。这些方法还可以与定点诱变，杂交等结合使用。
本说明书中所谓的多肽或多核苷酸的“替代，添加或缺失”是指相对于原始的多肽或多核苷酸各氨基酸或其替代物，或者各核苷酸或其替代物分别被替代、添加或缺失。这样的替代、添加或缺失的技术，在本领域是已知的，作为这种技术的例子，可以列举定点诱变技术等。替代，添加或缺失只要是一个或一个以上则可以是任意数量，所述的数量可以是任意多个，只要经替代，添加或缺失后所得的变体能够保持目的功能即可。例如，所述的数量可以是一个或几个，优选是全长的20％以内、10％以内，或100各以下，50个以下，25个以下等。
高分子的结构（例如多肽的结构）可以在各种水平结构上进行描述。对于该结构的一般性论述可以参照例如Alberts等人，MolecularBiology of the Cell（3rd Ed.，1994），和Cantor and Schimmel，BiophysicalChemistry Part I：The Conformation of Biological Macromolecules（1980）。本说明书中所应用的一般分子生物学技术，可以参照AusubelF.A.等人编著的（1988），Current Protocols in Molecular Biology，Wiley，New York，NY；Sambrook J.等人，（1987）Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY，等等只要是本行业的从业者，就很容易实施。
在本说明书中，当涉及基因时，所谓“载体”指可以将目的核苷酸序列递送到目的细胞中的物质。作为这样的载体可以利用能够在原核生物细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体和植物个体等的宿主细胞中自我复制的，或者可以整合到染色体中，并且在适合本发明的多核苷酸转录的位置包含启动子。
“BAC载体”是以大肠杆菌的F质粒为基础制备的质粒，其是可以在大肠杆菌等细菌中稳定保持并增殖300kb以上的巨大DNA片段的载体。BAC载体至少包含BAC载体复制所必需的区域。作为所述的复制所必需的区域，例如可以列举F质粒复制起点的oriS，或其变体。
本说明书中所谓“BAC载体序列”是指包含作为BAC载体功能所必需序列的序列。需要时，BAC载体序列还可以进一步包含“重组蛋白依赖的重组序列”和/或“选择标记”。
本说明书中，所谓核酸的“重组”可以与术语“同源重组”互换使用。由两个不同的核酸分子的结合开始，发生交换，产生核酸的新组合。在本说明书中使用时，同源重组包含“重组蛋白－依赖的重组”与“重组蛋白－非依赖性重组”两方面的含义。所谓“重组蛋白－依赖性重组”是指在重组蛋白存在下发生，在重组蛋白不存在下不发生的同源重组。而所谓“重组蛋白非依赖性重组”是指与重组蛋白存在与否无关的同源重组。本说明书中的所谓“重组蛋白依赖的重组序列”是指产生重组蛋白－依赖性重组的序列。而所谓“重组蛋白－非依赖性重组序列”是产生重组蛋白－非依赖性重组的序列。重组蛋白依赖的重组序列在重组蛋白存在下产生重组，在重组蛋白不存在时不产生重组。优选重组蛋白与重组蛋白依赖的重组序列特异性作用，而对重组蛋白依赖的重组序列之外的序列不发生作用。
作为典型的重组蛋白依赖重组序列和重组蛋白包括但不限于：来自P1噬菌体的loxP（P1交换位点）序列和Cre（环化重组）蛋白的组合，Flp蛋白和FRT位点的组合，
Figure BDA00002667455200291
和attB或attP的组合（Thorpe，HelenaM.；Wilson，Stuart E.；Smith，Margaret C.M.，Control of directionalityin the site－specific recombination system of the Streptomyces phage
Figure BDA00002667455200292
Molecular Microbiology（2000），38（2），232－241.）解离酶和res位点的组合（Sadowski P.，Site－specific recombinases：changingpartners and doing the twist，J.Bacteriol.，February 1986；165（2）341－7)(一般参照Sauer B.，Site－specific recombination：developmentsand applications.，Curr.Opin.Biotechnol.，1994Oct；5（5）：521－7）。
本说明书中使用时，所谓“选择标记”是指作为筛选含有BAC载体的宿主细胞指标的功能性基因。作为选择标记，例如但不限于荧光标记，发光标记和药物选择标记。作为“荧光标记”例如编码绿荧光蛋白（GFP）样的荧光蛋白的基因。作为“发光基因”例如，但不限于，编码虫荧光蛋白样荧光蛋白的基因。作为“药物选择标记”包括但不限于编码选自下述蛋白质的基因：二氢叶酸还原酶基因，谷氨酰胺合酶基因、天冬氨酸转氨酶、金属硫蛋白（MT）、腺苷脱氨酶（ADA）、腺苷脱氨酶（AMPD1、2）、黄嘌呤－鸟嘌呤－磷酸核糖基转移酶、UMP合酶、P－糖蛋白、天冬酰胺合酶，以及鸟氨酸脱羧酶。药物筛选标记与所用药物的组合包括例如下述的：二氢叶酸还原酶基因（DHFR）和氨甲蝶呤（MTX）的组合，谷氨酰胺合酶（GS）基因与甲硫氨酸磺基肟（Msx）的组合，天冬氨酸转氨酶（CAD）基因与N－磷酸乙酰－L－天冬氨酸（PALA）的组合，MT基因和镉的组合，腺苷脱氨酶（ADA）基因和腺苷、亚硝基羟基丙氨酸、或2'脱氧柯福霉素的组合，腺苷脱氨酶（AMPD1、2）基因和腺嘌呤、重氮乙酰丝氨酸、或助间型霉素的组合，黄嘌呤－鸟嘌呤－磷酸核糖转移酶基因和霉酚酸的组合，UMP合酶基因和6－azaulysine或吡唑呋喃菌素的组合，P－糖蛋白（P－gp，MDR）基因和多种药物的组合，天冬酰胺合酶（AS）基因和β－天冬氨酰异羟肟酸或合欢氨酸的组合，以及鸟氨酸脱羧酶（ODC）基因和－α－二氟甲基－鸟氨酸（DFMO）的组合。
本说明书中使用时，“表达载体”指调节结构基因和其表达的启动子，加上各种调节元件以在宿主细胞中可以操纵的状态而连接的核酸序列。调节元件优选包含终止子、耐药性基因（例如卡那霉素抗性基因、潮霉素抗性基因）之类的选择标记，以及增强子等。生物（例如，植物）的表达载体的类型和所使用的调节元件的种类根据宿主细胞的不同而不同，这是本领域技术人员已知的。对于植物，本发明所使用的植物表达载体进一步含有T－DNA区域。在利用土壤杆菌转化植物时，T－DNA可以提高基因的导入效率。
本说明书中使用时，所谓“重组载体”指可以将目的多核苷酸序列导入目的细胞的载体。作为这种载体，例如能够在原核生物细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞、动物个体和植物个体等的宿主细胞中自我复制的，或者可以整合到染色体中的载体，并且在适合本发明的多核酸转录的位置包含启动子的载体。
“终止子”是位于基因中编码蛋白质的区域的下游，DNA转录为mRNA时的转录终点，与附加poly A序列相关的序列。已知终止子与mRNA的稳定性相关，并影响基因的表达量。作为终止子，例如但不限于CaMV35S终止子、胭脂氨酸合成酶基因的终止子（Tnos）、烟草PR1a基因的终止子等。
所谓本说明书中所用的“启动子”指确定基因转录的起始部位、并在DNA的ORF中直接调节转录频率的区域、与RNA聚合酶结合起始转录的碱基序列。启动子区域通常大多推定为编码蛋白质的区域的第一个外显子上游2kbp以内的区域，因此假如用DNA分析软件预测基因组碱基序列中编码蛋白质的区域，则可由此推定启动子区域。推定的启动子区域随每个结构基因变化，通常位于结构基因的上游，但并不局限于此，启动子有时候也位于结构基因的下游。优选推定启动子区域位于第一外显子翻译起始点上游约2kbp以内。
本说明书中，所谓本发明的启动子表达是“组成型”的，是指在生物的所有组织中，在生物发育的任意阶段启动子均以大致一定量表达的性质。具体而言，在与本说明书实施例同样的条件下，利用Northern印迹分析时，例如在任意时间点（例如两个或两个以上的时间点（例如第5天和第15天））在同一或对应部位均可以观察到几乎相同的表达量时则在本发明意义上，表达是组成型表达。一般认为组成型表达的启动子对通常位于发育环境下维持生物的恒定性起作用。这些特性可以通过下述方式确定，由生物的任意部位提取RNA，利用Northern印迹分析表达量，或者利用Western印迹分析定量所表达的蛋白质。
“增强子”可以用于提高目的基因的表达效率。在动物细胞中使用时，作为增强子优选包含SV40启动子内上游侧序列的增强子区域。增强子，可以使用多个，也可以使用1个，还可以不使用。
在本说明书中使用时，“有效连接”指将目的序列的表达（起作用）设置于某些转录翻译调节序列（例如启动子，终止子等）或翻译调节序列的控制之下。为了使启动子作用于基因的有效连接通常是在该基因的上游设置启动子，但启动子无需紧邻该基因。
在本说明书中使用时，所述的“转化”，“转导”和“转染”，在没有特别说明的情况下可以互换使用，指向宿主细胞中导入核酸。作为转化方法，只要是可以向宿主细胞中导入DNA的方法均可以使用，例如可以例举电穿孔法，粒子枪（基因枪）法，磷酸钙法等各种已知的方法。
所谓“转化体”指通过转化所制备的细胞等生物体的全部或一部分。作为转化体，例如原核细胞、酵母、动物细胞、植物细胞、昆虫细胞等。转化体根据对象的不同，可以指转化细胞、转化组织、转化宿主等。本说明书中包含上述所有的转化形态，但在具体的上下文中可能指某种特定形态。
作为原核生物细胞的例子，可以列举属于大肠杆菌属、沙雷氏菌属（Serratia）、芽胞杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Brevibacterium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、微杆菌属（Microbacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）等的原核细胞，例如大肠杆菌XL1－Blue，大肠杆菌XL2－Blue，大肠杆菌DH1，大肠杆菌MC1000，大肠杆菌KY3276，大肠杆菌W1485，大肠杆菌JM109，大肠杆菌HB101，大肠杆菌No.49，大肠杆菌W3110，大肠杆菌NY49，大肠杆菌BL21（DE3），大肠杆菌BL21（DE3）pLysS，大肠杆菌HMS174（DE3），大肠杆菌HMS174（DE3）pLysS，无花果沙雷氏菌（Serratia ficaria），居泉沙雷氏菌（Serratia fonticola），液化沙雷氏菌（Serratia liquefaciens），粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens），枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis），解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens），Brevibacteriumammmoniagenes，Brevibacterium immariophilum ATCC14068，解糖短杆菌（Brevibacterium saccharolyticum）ATCC 14066，谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）ATCC13032，谷氨酸棒杆菌ATCC14067，谷氨酸棒杆菌ATCC13869，嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophilum）ATCC13870，嗜氨微杆菌（Microbacterium ammoniaphilum）ATCC 15354，假单胞菌某种（Pseudomonas sp.）D－0110，等等。
作为动物细胞，例如人MRC－5细胞，人HEL细胞，人WI－38细胞，小鼠骨髓瘤细胞，大鼠骨髓瘤细胞，人骨髓瘤细胞，小鼠杂交瘤细胞，中国仓鼠CHO细胞，BHK细胞，非洲绿猴肾细胞，人白血病细胞，HBT5637（特公昭63－299），人结肠癌细胞株等。作为小鼠骨髓瘤细胞包括ps20，NSO等。作为大鼠骨髓瘤细胞包括YB2/0等。作为人胎儿肾细胞例如HEK293（ATCC：CRL－1573）等。作为人白血病细胞包括BALL－1等。作为非洲绿猴肾细胞包括COS－1，COS－7，Vero细胞等。人结肠癌细胞株包括HCT－15等。
本说明书中的“动物”指本领域中最广义的意义，包含脊椎动物和无脊椎动物。作为动物例如但不限于哺乳动物纲、鸟纲、爬行纲、两栖纲、鱼纲、昆虫纲、蠕虫纲等。
本说明书中，所谓生物“组织”是细胞的集团，该集团中指具有一定的相同作用的细胞。组织可以是脏器（器官）的一部分。脏器（器官）中大多数细胞具有相同的功能，但其中也可以混有功能上具有微妙差异的细胞，本说明书中的组织，只要共同具有一定特性，也可以混有各种不同的细胞。
本说明书中的“器官（脏器）”指具有一种独立的形态，包含一种或一种以上的组织配合形成的行使特定功能的结构体。对于植物，例如但不限于愈伤组织、根、茎、植干、叶、花、种子、胚芽、胚、果实等。对于动物例如但不局限于胃、肝脏、肠、胰腺、肺、气管、鼻、心脏、动脉、静脉、淋巴结（淋巴系统）、胸腺、卵巢、眼、耳、舌、皮肤等等。
本说明书中，所谓“转基因”指将特定基因整合到某生物中或整合了这类基因的生物（例如，包括植物或动物（小鼠等））。
本发明的生物，指动物时，转基因生物可以利用微注射法（微量注射法），病毒载体法，干细胞（ES）法（胚胎干细胞法），精子载体法，染色体片段导入法（transsomic法），附加体法等转基因动物的制备技术来制备。这些转基因动物的制备技术在本领域中是已知的。
本说明书中使用时，所谓“筛选”指通过特定的操作和/或评价方法从众多的候选物中选择具有某种所需特定性质的物质或宿主细胞或病毒等。可以理解的是，本发明还包含通过筛选所获得的具有所需活性的病毒。
本说明书中的“芯片”或“微芯片”可以互换使用，指具有多种功能的、构成系统的一部分的微型集成电路。作为芯片例如但不限于DNA芯片，蛋白质芯片等。
本说明书中所谓的“阵列”是指含一个或一个以上（例如1000个或以上）目的物的组合物（例如DNA，蛋白质或细胞）的组合物阵列设置的模式或具有模式的基板（如芯片）。阵列中，小基板（例如10×10mm等）上模式化的阵列称为微阵列，在本说明书中微阵列和阵列可以互换使用。因此，即使在比上述基板大的物质上模式化的阵列也可称为微阵列。例如，阵列可由固定在其自身的固相表面或固定在膜表面的目的细胞组构成。阵列优选包括含有相同或不同病毒的至少102个，更优选至少103，更优选至少104，更优选至少105个细胞。这些细胞优选设置在125×80mm，更优选10×10mm的表面上。阵列的形式，从96－孔微滴定板，384－孔微滴定板等微型滴定板的尺寸考虑，最好是载玻片大小的板。含所固定的目的物质的组合物，既可以是一种，而可以是数种。这样的种类数量可以是达到一个斑点的任意数量。例如，可以固定为含约10种，约100种，约500种，和约1,000种目的物质的组合物。
基板的固相表面或膜上可以设置上述任意数量的目的物（如细胞的生物分子），一般每个基板上可以设置不多于108个生物分子，在另外的实施例中不多于107个生物分子，不多于106个生物分子，不多于105个生物分子，不多于104个生物分子，不多于103个生物分子，或不多于102个生物分子。也可以设置含有超过108个生物分子目的物质的组合物。这种情况下，优选基板的尺寸更小。特别地，含目的物质的组合物（如细胞等）的斑点尺寸可以与单一生物分子的尺寸一样小（例如1－2nm的数量级）。某些情况下，基板面积的下限在某些情况下取决于基板上生物分子的数量。
阵列上可以设置生物分子“斑点”。本说明书中的所谓“斑点”指含目的物质组合物的一定集合。本说明书中的“点斑点”指在某基板或板上制备含某种目的物质组合物的斑点。点斑点可以利用任意的方法进行，例如利用移液管等制备或利用自动装置制备。这些方法是本领域所公知的。
作为本说明书中所用的术语“地址（address）”指基板上独特的位置，其可与其它独特的位置相区别。地址适合于与带有该地址的斑点建立联系，地址可以采用任意的形状以使得在各地址中所存在的物质与其它地址中所存在的物质相区别识别（例如，光学的方式）。可将地址定义为例如但不限于，圆形，椭圆形，正方形，长方形或不规则的形状。因此，“地址”表示的是一种抽象的概念，而“斑点”是表示一种具体化的概念。当不必要区分二者时本说明书中“斑点”和“地址”可以互换使用。
预定各地址的尺寸依赖于基板的尺寸，特定基板上的地址数，含目的物质的组合物的数量和/或可利用的试剂、微粒的大小，以及为该阵列的任意方法所必需的分辨率程度。其大小例如可以在众1－2nm到数厘米的范围，可以是与应用该阵列一致的任意大小。
设定地址的空间配置和形状可设计成使该微阵列适用于特定的应用。地址可以设置得密集也可以设置得分散，或者可以为适合于特定型式分析物所需要的模式或亚组。
本说明书使用时，“支持物”指可以承载细胞，细菌，病毒，多核苷酸或多肽的物质。作为支持物的材料可以是具有与本发明中所使用的细胞等小共价键或非共价键地结合的特性的，或能衍生具有上述特性的任何固体材料。
作支持物所用的材料可以使用能够形成固体表面的任意物质，例如但不限于，玻璃、氧化硅、硅、陶瓷、二氧化硅、塑料、金属（包括合金），天然存在的以及合成的聚合体（例如聚苯乙烯、纤维素、脱乙酰壳多糖、右旋糖酐和尼龙）等等。优选支持物包含形成疏水键的部分。支持物可以由多层不同材料层构成。例如，可以使用如玻璃、石英玻璃、矾土、蓝宝石、镁橄榄石、金刚砂、二氧化硅、氮化硅等等无机材料。还可以使用聚乙烯、乙烯、聚丙烯、聚异丁烯、聚对苯二甲酸乙二醇酯、不饱和聚酯、含氟树脂、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚醋酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇缩醛、丙烯酸树脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、缩醛树脂、聚碳酸酯、聚酰胺、酚醛树脂、尿素树脂、环氧树脂、三聚氰胺树脂、苯乙烯－丙烯腈共聚物、丙烯腈－丁二烯－苯乙烯共聚物、硅酮树脂、聚苯撑氧化物、聚砜等等有机材料。另外，还可以使用用于印迹的硝化纤维素膜、聚偏二氟乙烯膜等等。
本发明的水痘－带状疱疹病毒可以作为用于处置，预防和/或治疗感染症的药物组合物成分使用。
本说明书中所谓药物的“有效量”指所述药剂能够发挥目的药效的量。本说明书中，对于所述的有效量中，将最小浓度称为最小有效量。这种最小有效量是本领域所公知的。通常药剂的最小有效量由本领域的技术人员确定，或可由本领域的技术人员适宜地确定。要确定有效量除了实际施用以外，还可以使用动物模型来确定。在本发明中在确定此种有效量时是有用的。
本说明书中“药学上可接受的载体”是指制造医药或如动物药的农药时所使用的物质，并对有效成分不产生不良影响的物质。作为这种药学上可接受的载体例如但不限于下述的：抗氧化剂、防腐剂、着色剂、调味剂、稀释剂、乳化剂、悬浮剂、溶剂、填料、填充剂、缓冲液、运载工具、赋形剂、和/或农业的或药学的佐剂。
本发明的处置方法中所使用的药剂的种类和用量，本领域的技术人员可以根据通过本发明方法所获得的信息（例如与疾病相关的信息）为依据，考虑使用目的，对象疾病（种类，严重程度等），患者的年龄，体重，性别，既往病史，施用被检部位的形态或种类等容易地确定。本行业从业人员考虑对被检体（或患者）施用的频率以及使用目的，对象疾病（种类，严重程度等），患者的年龄，体重，性别，既往病史和治疗过程等，可以很容易决定本发明的监测方法。作为监测疾病状态的频率例如每日到数月一次（例如一周一次到1个月一次）的频率。优选一边观察施用过程一边实施每周一次到每月一次的监测。
本说明书中所用的“指导说明书”针对实施本发明方法的医生，患者等而记述的材料。该指导说明书记载了在放射性治疗之前或之后（例如24小时之内等）施用本发明的药物的指示性文字说明。所述的说明书按照实施本发明的国家监督管理部门（例如，日本的厚生劳动省，美国的食品药品局（FDA）等）所规定的样式编写，并标明已得到所述监督管理部门的认可。本说明书即所谓的包装说明书，通常以纸为介质提供，但也并不局限于此，也可以通过例如电子媒体（例如通过互联网提供的主页或电子邮件）的形式提供。
必要时，本发明的治疗中，可以使用两种或两种以上的药剂。在使用两种以上的药剂时，可以使用由类似性质或来源的物质，也可以使用不同性质或来源的药剂。可以通过本发明的方法获得有关使用两种以上药剂的方法中疾病水平的相关信息。
当本发明中对于类似种类（例如相对人而言，小鼠）的生物、培养细胞、组织等，一旦确定了某种特定的糖链结构的分析结果与疾病水平的关系，就能够确定对应的糖链结构的分析结果与疾病水平的关系，本待业从业人员很容易理解这一点。这种情况可以得到例如下述文献的支持“Doubutsu Baiyosaibo Manual（Animal Culture CellManual），Seno等人编，Kyoritsu shuppan，1993，所述文献全文引入本说明书作为参考。
（本说明书中所用的一般技术）
本说明书中所使用的技术在没有特别说明的情况下属于该领域的技术范围内的糖链科学，微射流学、显微加工、有机化学、生物化学、遗传工程、分子生物学、微生物学、遗传学及其相关领域中的已知常用技术，这些技术例如在下述文献及本说明书中其它部分的引用文献中也进行了详细说明。
有关显微加工在例如Campbell，S.A.（1996），The Science andEngineering of Microelectronic Fabrication，Oxford University Press；Zaut，P.V.（1996），Micromicroarray Fabrication：a Practical Guideto Semiconductor Processing，Semiconductor Services；Madou，M.J.（1997），Fundamentals of Microfabrication，CRC15Press；Rai－Choudhury，P.（1997），Handbook of Microlithography，Micromachining&Microfabrication：Microlithography；等文献中均有所记载，所述文献相关部分引入本说明书作为参考。
本说明书中所用的分子生物学方法，生物化学方法，微生物学方法，糖链科学方法是该领域所公知的惯用方法，可参见，例如Molecularbiology techniques，biochemistry techniques，and microbiologytechniques used herein are well known and commonly used in the art，and are described in，for example，Maniatis，T.等人（1989），MolecularCloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor and及其3rd Ed.（2001）；Ausubel，F.M.等人eds，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons Inc.，NY，10158（2000）；Innis，M.A.（1990），PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications，Academic Press；Innis，M.A.等人（1995），PCR Strategies，AcademicPress；Sninsky，J.J.等人（1999），PCR Applications：Protocols forFunctional Genomics，Academic Press；Gait，M.J.（1985），Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRL Press；Gait，M.J.（1990），Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，IRLPress；Eckstein，F.（1991），Oligonucleotides and Analogues：A PracticalApproach，IRL Press；Adams，R.L.等人（1992），The Biochemistryof the Nucleic Acids，Chapman&Hall；Shabarova，Z.等人（1994），Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids，Weinheim；Blackburn，G.M.等人（1996），Nucleic Acids in Chemistry and Biology，OxfordUniversity Press；Hermanson，G.T.（1996），Bioconjugate Techniques，Academic Press；Method in Enzymology 230，242，247，Academic Press，1994；Specialissue，Jikken Igaku（Experimental Medicine）“IdenshiDonyu&Hatsugenkaiseki Jikkenho（Experimental Method for Geneintroduction&Expression Analysis）”，Yodo－sha，1997；等文献中均有所记载，本说明书中作为参考引用其相关部分（也可以是全部）。
优选实施方案的描述
下面对本发明的优选实施方案进行描述。这些实施方案仅作为对本发明示例，而不应理解为对本发明范围的限定。本领域的技术人员应该理解参照下述优选的实施例，在本发明的范围内可以很容易地对本发明进行适当更改和变动。
本发明的一个方面在于提供重组水痘－带状疱疹病毒。优选地，所述水痘－带状疱疹病毒在其基因组序列中包含BAC载体序列。通过构建含有BAC载体序列的水痘－带状疱疹病毒基因组，可以在细菌内将水痘－带状疱疹病毒基因组作为BAC分子来操作。使用的BAC载体序列优选包含来自于F质粒的复制起点，也可以是来自F质粒复制起点之外的序列，只要具备300kb或以上的序列并能在细菌细胞中作为细菌人工染色保持并复制即可。本发明的BAC载体可以在细菌宿主细胞，优选大肠杆菌中保持和/或扩增。优选地，所述BAC载体的一部分插入到水痘－带状疱疹病毒基因组的非必需区域中，可以作为包含水痘－带状疱疹病毒基因组的BAC进行操作。当将含有水痘－带状疱疹病毒基因组的BAC引入到哺乳动物细胞中时，所述的重组水痘－带状疱疹病毒即可产生并增殖。作为重组水痘－带状疱疹病毒的宿主细胞，可以使用野生型水痘－带状疱疹病毒株能够增殖的任意哺乳动物细胞。优选该宿主细胞来源于人，但不限定于此，例如：人MRC－5细胞，人HEL细胞，和人WI－38细胞。
制备包含水痘－带状疱疹病毒基因组的BAC载体的方法
要利用水痘－带状疱疹病毒和BAC载体制备包含水痘－带状疱疹病毒基因组的BAC载体，可以使用同源重组方法等各种已知的方法。
作为使用同源重组的方法，例如应用下述核酸分子的方法，所述核酸分子具有与水痘－带状疱疹病毒基因组的同源碱基序列相连的环状BAC载体序列。
利用含有与水痘－带状疱疹病毒基因组的同源序列相连的环状BAC载体序列的核酸，制备包含水痘－带状疱疹病毒基因组的BAC载体的制备方法，该方法包括代表性步骤：（1）将所述核酸与水痘－带状疱疹病毒基因组一起导入宿主（例如，人株化细胞）内；（2）培养所述的宿主细胞，使与环状BAC载体序列连接的同源序列与水痘－带状疱疹病毒基因组序列之间进行同源重组；（3）筛选通过同源重组产生的，含有整合了BAC载体序列的水痘－带状疱疹病毒基因组序列的宿主细胞；（4）培养所述的宿主细胞，抽提环状病毒DNA的步骤。
另外，为了利用水痘－带状疱疹病毒基因组和BAC序列制备含水痘－带状疱疹病毒基因组的BAC，除利用同源重组之外，还可以利用核酸的限制酶片段等其它公知的方法。
水痘－带状疱疹病毒基因组中用于导入BAC载体序列的非必需区域选自以下区域：基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因70的ORF的侧翼区域。
优选地，所述的非必需区域是基因11的ORF侧翼区域或基因12的ORF侧翼区域。这是由于基因11和基因12是水痘－带状疱疹病毒基因组中连续的非必需基因，因此进行同源重组的核酸。或者也可以将BAC载体序列的一部分插入到水痘－带状疱疹病毒基因组中基因62的ORF内的区域中。
本发明使用的BAC载体序列优选包括重组蛋白依赖的重组序列和/或选择标记。优选地，所述选择标记序列是药物选择标记和/或编码绿荧光蛋白的基因。这是因为可以简便地确认所需基因的存在。
作为本发明的起始物质使用的水痘－带状疱疹病毒既可以来源于野生株也可以来源于突变株。优选作为本发明的起始物质的水痘－带状疱疹病毒是经减毒的病毒，例如Oka疫苗株或在基因62中带有变异的水痘－带状疱疹病毒。作为“经减毒的水痘－带状疱疹病毒”，可以列举具有一个，或2个或以上选自下述基因62的变异的组合的病毒：
（a）第2110位的G取代；
（b）第3100位的G取代；
（c）第3818位的C取代；
（d）第4006位的G取代，
（e）第1251位的G取代；
（f）第2226位的G取代；
（g）第3657位的G取代；
（h）第162位的C取代；
（i）第225位的C取代；
（j）第523位的C取代；
（k）第1565位的C取代；
（l）第1763位的C取代；
（m）第2652位的C取代；
（n）第4052位的C取代；和
（o）第4193位的C取代。
本发明的又一方面提供用于制备上述病毒的载体和用于制备上述病毒的方法。本发明的再一方面提供含有上述病毒的药物组合物以及疫苗形式的药物组合物。
本发明的重组水痘－带状疱疹病毒可用作疫苗。这是由于其包含大量的具有与野生型病毒相同结构的蛋白。
本发明的另一方面在于提供向为产生本发明疫苗的载体中引入突变的方法。该方法包括以下步骤：将该载体导入细菌宿主细胞的步骤；将包含由一部分水痘－带状疱疹病毒基因组组成的片段质粒载体导入到该细菌宿主细胞中的步骤，其中该片段至少包含一个变异的步骤；培养该细菌宿主细胞的步骤；从所培养的细菌宿主细胞中分离具有BAC载体序列的载体的步骤。在上述方法中，细菌宿主细胞内，为产生本发明疫苗的载体与包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分所组成的片段载体间发生同源重组，结果使为产生本发明疫苗的载体在含有一部分水痘－带状疱疹病毒基因组的片段上具有变异。
在上述的方法中，作为将载体导入细菌宿主细胞中的步骤，可以使用电穿孔等公知的方法。同样可以将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分所组成的片段载体导入到细菌宿主细胞中。作为向该片段中导入变异的方法，使用PCR的变异导入方法是众所周知的，例如在四种核苷酸中有一种数量较少的条件下，使用不具备校正功能的耐热性聚合酶，就可以随机地导入变异。此外，使用带有变异碱基序列的引物进行PCR也可以在所需要的位置引入所需要的突变。通过培养该细菌细胞在为产生本发明疫苗的载体与包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分所组成的片段的载体之间发生同源重组，结果使用于生产本发明的疫苗的载体在由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成的片段上的具有变异。为了用细菌宿主细胞制备BAC载体序列可以使用多种已知的方法，例如碱法等，也可以使用市售的试剂盒。
本发明的另一方面在于提供为产生本发明疫苗的载体中引入突变的另一种方法。该方法包括以下步骤：将该载体导入到宿主细胞的步骤；将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成的第一片段的第一质粒载体导入到该宿主细胞中并且其中该第一片段至少包含一个变异的步骤；将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成第二片段的第二质粒载体导入该细菌宿主细胞的步骤，其中该第二片段至少包含一个变异，且第二片段和第一片段不同；培养该细菌宿主细胞的步骤；从所培养的细菌宿主细胞中分离具有BAC载体序列的载体的步骤。
本发明的另一方面在于提供用于生产本发明的疫苗的核酸盒。所述的核酸盒优选是包含在细菌细胞内可与水痘－带状疱疹病毒基因组发生同源重组的第一片段、BAC载体序列、在细菌细胞内可与水痘－带状疱疹病毒基因组发生同源重组的第二片段的核酸盒，其中，该BAC序列的两端分别与第一片段和第二片段相连。其中，第一片段和第二片段优选至少为1kb，至少1.5kb，或至少2kb的长度。该第一片段和第二片段与水痘－带状疱疹病毒基因组序列，优选具有至少80%同一，至少85%同一，至少90%同一，或至少95%同一。
优选地，所述第一片段和所述第二片段是各自独立的，来源于选自下述水痘－带状疱疹病毒基因组中的区域，或与选自下述区域的区域至少80%，85%，90%，或95%同一：基因11的ORF中的区域，基因12的ORF中的区域，基因13的ORF中的区域，基因14的ORF中的区域，基因15的ORF中的区域，基因17的ORF中的区域，基因18的ORF中的区域，基因19的ORF中的区域，基因38的ORF中的区域，基因39的ORF中的区域，基因46的ORF中的区域，基因47的ORF中的区域，基因48的ORF中的区域，基因49的ORF中的区域，基因50的ORF中的区域，基因56的ORF中的区域，基因57的ORF中的区域，基因58的ORF中的区域，基因59的ORF中的区域，基因61的ORF中的区域，基因62的ORF中的区域，基因63的ORF中的区域，基因64的ORF中的区域，基因65的ORF中的区域，基因66的ORF中的区域，基因67的ORF中的区域，基因68的ORF中的区域，基因69的ORF中的区域，基因70的ORF中的区域，基因11的ORF的侧翼区域，基因12的ORF的侧翼区域，基因13的ORF的侧翼区域，基因14的ORF的侧翼区域，基因15的ORF的侧翼区域，基因17的ORF的侧翼区域，基因18的ORF的侧翼区域，基因19的ORF的侧翼区域，基因38的ORF的侧翼区域，基因39的ORF的侧翼区域，基因46的ORF的侧翼区域，基因47的ORF的侧翼区域，基因48的ORF的侧翼区域，基因49的ORF的侧翼区域，基因50的ORF的侧翼区域，基因56的ORF的侧翼区域，基因57的ORF的侧翼区域，基因58的ORF的侧翼区域，基因59的ORF的侧翼区域，基因61的ORF的侧翼区域，基因62的ORF的侧翼区域，基因63的ORF的侧翼区域，基因64的ORF的侧翼区域，基因65的ORF的侧翼区域，基因66的ORF的侧翼区域，基因67的ORF的侧翼区域，基因68的ORF的侧翼区域，基因69的ORF的侧翼区域和基因69的ORF的侧翼区域。
优选地，所述的第一片段和第二片段来自水痘－带状疱疹病毒基因组的不同区域。所述的第一片段和第二片段是各自独立的，既可以来源于基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF侧翼区域。优选地，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列和/或选择标记以控制同源重组并易于检测目的基因。所述的选择标记既可以是药物选择标记，也可以是编码绿荧光蛋白样的荧光蛋白的基因。代表性地，所述的BAC载体序列具有如SEQ ID NO.：2中所示的核酸序列，所述的核酸盒具有SEQ ID No.：2中所述的核酸序列。
（变异型重组水痘－带状疱疹病毒的制备）
利用本发明的方法，可以简便地制备具有导入了变异的水痘－带状疱疹病毒基因组的变异性水痘－带状疱疹病毒。
所述变异的导入可以利用下述公知的方法进行。
向大肠杆菌中导入（a）VZV－BAC－DNA质粒和（b）作为变异核酸的、具有包含任意变异的水痘－带状疱疹病毒基因组部分序列的穿梭载体或PCR产物。通过VZV－BAC－DNA质粒与所述变异核酸之间发生同源重组，可以向VZV－BAC－DNA质粒中导入变异。另外也可以利用转座子随机导入突变。导入了变异的VZV－BAC－DNA质粒可以容易地在大肠杆菌中选择并扩增。通过由具有变异的VZV－BAC－DNA产生病毒，可以获得重组水痘－带状疱疹病毒（MarkusWagner，TRENDS in Microbilogy，Vol.10，No.7，July 2002）。以下列举具体例。
（1）利用包含变异的水痘－带状疱疹病毒基因的温度敏感型穿梭载体作为变异核酸的情况：
首先，对穿梭载体和VZV－BAC－DNA质粒通过第一同源区域重组，生成穿梭载体和VZV－BAC－DNA质粒相连的共整合体。接下来，由于穿梭载体的复制起点是温度敏感型的，所以去除了穿梭质粒。在第二个重组事件中去除了共整合的部分。当第二个重组事件通过第一同源区域介导发生时，生成用于重组的、具有与VZV－BAC－DNA相同序列的质粒。相反，当第二重组现象通过不同于第一同源区域的第二同源区域介导发生时，得到具有穿梭载体上变异的变异型VZV－BAC－DNA质粒。当第一同源区域和第二同源区域长度大致相同时，第二重组事件由第二同源区域介导发生的几率与第二重组事件在第一同源区域介导发生的几率几乎相同。由此，所得的约二分之一的VZV－BAC－DNA质粒是具有与用于重组的序列相同序列的质粒，另外约二分之一是具有导入到穿梭载体中的具有变异的质粒。
（2）利用线性DNA片段的情况：
该方法中，例如，利用来自原噬菌体recET的重组功能，或利用来自细菌噬菌体λ的redαβ的重组功能，由线性DNA片段向环状VZV－BAC－DNA分子导入变异。具体说来，将与靶序列相连的选择标记和含有同源序列的线性DNA片段，连同VZV－BAC－DNA一起导入能够进行同源重组的大肠杆菌中。为了避免线性DNA在大肠杆菌中的分解，要使用缺失了外切核酸酶的大肠杆菌，或使来自细菌噬菌体的外切核酸酶抑制剂redγ（gam）表达。线性DNA在其两端具有与VZV－BAC－DNA质粒同源的区域。通过该同源区域介导同源重组的发生，由此可以将线性DNA中的目的序列导入VZV－BAC－DNA中。当利用recET或redαβ的重组功能时，这些重组功能可以通过约25到50个核苷酸长度的同源序列发生同源重组。比recA介导的同源重组使用起来更简便。
（3）使用转座子的情况：
利用转座子元件可随机插入大肠杆菌内核酸的功能。例如，将转座子元件和VZV－BAC－DNA导入大肠杆菌，通过向VZV－BAC－DNA内随机插入转座子元件产生插入变异。
另外，例如利用诱变剂（例如亚硝基胍）对具有VZV－BAC－DNA样的重组水痘－带状疱疹病毒的宿主细胞本身进行处理，可以在重组水痘－带状疱疹病毒基因组内随机地导入变异。
（配方）
本发明提供利用将有效量的治疗剂、预防剂施用、接种于受试者，对疾病或障碍（例如感染性疾病）进行处置的方法。治疗剂、预防剂意味着与药学上可接受的载体形式（例如灭菌载体）组合形成的本发明组合物。
对于预防剂和治疗剂，应考虑到不同患者的临床状态（特别是预防剂和治疗剂单独使用时的副作用）、送达部位、施用方法、施用计划以及本领域技术人员所知的其它因素，根据符合医疗实施基准（GMP）的方式开处方以及用药。作为本说明书的目的的“有效量”是在进行过上述考虑后进行确定。
作为一般的方案，非经口施用的治疗剂/预防剂的药学总有效量，单位用量为患者体重的约1μg/kg/day到10mg/kg/day，但这也要根据上述的治疗判断进行。关于本发明的细胞生理活性物质，更优选其用量至少为0.01mg/kg/day，更优选对于人为约0.01－1mg/kg/day之间。连续施用时，典型的是以约1μg/kg/hour－约50μg/kg/hour的给药速度一天1－4次注射或连续皮下注入（例如应用迷你泵）的任意一种方式施用治疗剂/预防剂。也可以利用静脉内袋溶液（bag solution）。观察变化所必需的处置时间和产生反应处置后的间隔，根据所需效果的不同而变化。
所述的治疗剂/预防剂可以作为经口、直肠内、非经口的、intracistemal、阴道内、腹腔内、局部的（作为通过粉剂、软膏、凝胶剂、滴剂或经皮贴剂等）口内，或经口或鼻腔喷入法来施用。所谓“药学上可接受的载体”指非毒性的固体，半固体或液体的填充剂、稀释剂、包被材料或任意形式的制剂辅剂。本说明书中所述的“非经口的”包含静脉内、肌内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和注入的施用方式。
本发明的治疗剂/预防剂可通过缓释性装置适当施用。缓释性治疗剂/预防剂可适宜地通过经口、直肠内、非经口的、intracistemal、阴道内的、腹腔内的、局部的（粉剂、软膏、凝胶剂、滴或经皮贴剂）的口内或经口或鼻腔喷入来施用。所谓“药学上可接受的载体”指非毒性的固体，半固体或液体的填充剂、稀释剂、包被材料或任意形式的制剂辅剂。本说明书中所述的“非经口的”包含静脉内、肌内、腹腔内、胸骨内、皮下和关节内注射和注入的施用方式。
对于肠胃外施用，在一个实施方案中治疗剂/预防剂以所需的纯度与药学上可接受的载体以单位给药量的可能注射形态（溶液、悬浊液或乳浊液）混合配置，其中，所述药学上可接受的载体在所使用的给药量和浓度条件下对受体没有毒性且与配方中的其它成分相匹配。例如，所述的配置物优选不含氧化剂和已知对治疗剂/预防剂有害的其它化合物。
通常，所述的配置物通过使治疗与剂/预防剂与液体载体或精细分割固体载体或这两者均一且紧密接触进行配置。然后，需要时，将所得产物制成所需配置物。优选载体是非经口的载体，更优选是与受体血液等渗的溶液。这种载体工具例如，水、生理盐水、Ringer’s溶液和蔗糖溶液。不挥发性油和油酸乙酯等非水性运载工具，或脂质体两样也可应用于本说明书中。
载体可适当含有微量添加剂，如等渗性和化学稳定性高的物质。这些物质在所用的给药量和浓度下对受体无毒性，这种物质如：磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸，及其他有机酸或其盐的缓冲剂；抗氧化剂比如抗坏血酸，低分子量（少于10个残基）的多肽、例如、聚精氨酸或三肽；蛋白、如血清白蛋白、明胶，或免疫球蛋白；亲水聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸、如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸，或精氨酸；单糖、二糖，及其他碳水化合物包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖，或糊精；螯合剂如乙二胺四乙酸；糖醇如甘露醇或山梨糖醇；平衡离子如钠；和/或非离子型表面活性剂如聚山梨酸酯、泊洛沙姆、或PEG。
治疗上可施用的任何药剂可以是不含作为有效成分病毒之外的生物或病毒的状态，即无菌状态。通过灭菌过滤膜（例如0.2micron的膜）过滤可以容易地实现无菌状态。一般而言，治疗剂/预防剂均置于具有无菌入口的容器中，例如，可以用皮下注射针刺穿的带有瓶塞的静脉内用溶液袋，或带有瓶塞的小瓶中。
治疗剂/预防剂通常储存于单位用量或多用量容器，例如密封的安瓿瓶或小瓶中，作为水溶液或需要再构建的冷冻干燥制剂储存。作为冷冻干燥配置物的例子，如10－ml的小瓶中填充5ml经灭菌过滤的1%（w/v）治疗剂/预防剂水溶液，将所得的混合物冷冻干燥。冷冻干燥的治疗剂/预防剂用注射用无菌水再构建可以制备注入的溶液。
本发明提供具有充满本发明治疗剂/预防剂的一种或以上成分的一个或多个容器制药包装或试剂盒。上述容器还附有规范药物或生物制品的制备、使用或销售的政府机关所规定形式的通知，所述通知标明有关政府机关对于施用于人的制造、使用或销售予以认可。另外，所述的治疗剂/预防剂可于其它治疗用化合物组合使用。
本发明的治疗剂/预防剂可以单独施用，也可以与其它治疗剂/预防剂组合施用。作为可与本发明的治疗剂/预防剂组合施用的治疗剂/预防剂例如但不限于：化学治疗剂，抗生素，固醇或非固醇类抗炎药，现有的免疫治疗剂/预防剂，其它细胞因子和/或增殖因子等。所谓组合，例如作为组合物同时施用，分别地但同时或并行施用，或经时顺序施用。所谓的组合的药剂作为治疗用混合物共同施用包含所述组合药剂分别但同时施用的次序，例如对于同一个体通过不同位置的静脉内给药。所述的“组合”施用进一步包含分别施用第一个、接下来施用第二个所述化合物或药剂。
在特定的实施方案中，本发明的治疗剂/预防剂可以与抗反转录病毒剂，核苷酸反转录酶抑制剂，非核苷酸反转录酶抑制剂和/或蛋白酶抑制剂组合施用。
在另一种实施方案中本发明的治疗剂/预防剂与抗生素组合施用。作为可以使用的抗生素包括但不限于氨基糖苷类抗生素、多烯类抗菌素、青霉素类抗生素、头孢烯类抗生素、肽类抗生素、大环内酯类抗生素，和四环素类抗生素。
在另外的实施方案中，本发明的治疗剂/预防剂可单独地、或与抗炎症剂一起施用。可与本发明的治疗剂/预防剂一起施用的抗炎症剂例如但不限于：糖皮质激素和非固醇类抗炎症剂、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸衍生物、芳基丙酸衍生物、吡唑、吡唑啉酮、水杨酸衍生物、噻嗪酰胺、乙酰氨基己酸、S－腺苷甲硫氨酸、3－氨基－4－羟丁酸、阿米曲林、苄达酸、消炎灵、丁基环已基巴比妥、联苯吡胺、双苯唑醇、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、肝蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗沙唑和替尼达普。
在进一步的实施方案中本发明的治疗剂/预防剂与其它的治疗剂/预防剂（例如放射性治疗）结合施用。
以下通过实施例等对本发明进行详细说明，但下述实施例并不作为对本发明的限制。
实施例1
（重组水痘－带状疱疹病毒的制备）
（1：BAC质粒的制备）
质粒PHA－2使用由Markus Wagner和Ulrich H.Koszinowski（Adler等人，（2000），J.Virol.74：6964－74）获得。为了制备重组病毒，选择水痘－带状疱疹病毒基因11的ORF和基因12的ORF之间的区域作为BAC载体的插入位点。这是基于将外源基因插入所述非必需区域不会对水痘－带状疱疹病毒的增殖产生不良影响的设想。
以水痘－带状疱疹病毒Oka亲株的基因组DNA为模板，分别以引物VZ11F（SEQ ID NO.：1）、VZ11R（SEQ ID NO.：2）、引物－VZ12F（SEQ ID NO.：3）和VZ12R（SEQ ID NO.：4）对水痘－带状疱疹病毒Oka株基因11的ORF和基因12的ORF的片段进行扩增。（2：用于制备重组质粒的引物的制备）
[表1]
用于制备重组质粒的引物
Figure BDA00002667455200481
表中，寡核苷酸序列中的限制酶位点用下划线标出，以斜体标示的序列是在VZV序列中不存在的另外的碱基。
分别用SpeI/SexAI和NotI/SexAI消化PCR产物的基因11ORF和基因12ORF的片段。将两个PCR片段克隆到经SpeI和NotI消化的pBluescript SK－（Stratagene）中。把得到的质粒作为SK/VZ11－12。
用Pacl消化质粒pHA－2，然后利用T4DNA聚合酶将该位点处理成平末端。将所得质粒克隆到SK/VZ11－12的平末端化的SexAI位点。把所得的质粒作为pHA－2/VZ11－12（图1C）。
如图1所示，VZV基因组（A）长约125kbp，包含末端重复（TR）DNA结构域，特有的长（UR）DNA结构域，中间重复（IR）DNA结构域，和特有的短（US）DNA结构域。为了构建重组质粒PHA－2/VZV11－12（C），如上所述，利用适宜的引物，通过PCR扩增VZV基因组中的ORF 11片段和ORF 12片段。所得的重组质粒pHA－2/VZ11－12包含比邻loxP位点（L）的约2.0kbp的侧翼同源序列，以及BAC载体。
（3：通过同源重组制备重组病毒）
制备的质粒pHA－2/VZ11－12包含作为选择标记的contains a鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（gpt）基因。还含有夹在两个loxP序列之间的BAC载体序列。因此，通过使Cre重组酶的作用，夹在loxP序列之间的BAC载体序列可被高效地去除。另外通过绿荧光蛋白（GFP）的荧光可以很容易地确认出导入含有BAC载体序列质粒的细胞。
该质粒通过NotI消化线性化。利用Nucleofection unit（Amaxa）通过点穿孔将0.2μg线性化的pHA－2/VZ11－12转染在75－cm2塑料瓶中生长至铺满的HEL细胞。转染后一天，再用水痘－带状疱疹病毒Oka株感染经转染的细胞。
利用50μM的霉酚酸和200μM的黄嘌呤进行利用gpt基因的重组病毒筛选。在HEL细胞中可观察到由水痘－带状疱疹病毒引起的典型的细胞变性效果（CPE）。其中一些细胞可以在荧光显微镜下确认GFP表达。这一结果表明BAC载体已插入到水痘－带状疱疹病毒基因组中，并且使BAC载体中所含的GFP基因得以表达。
（4：重组病毒的富集并向大肠杆菌中导入）
利用gpt基因通过霉酚酸和黄嘌呤的药物筛选以及96孔板有限稀释法富集重组病毒。通过Hirt’s法（Hirt，（1967），J.M.Biol，26：365－9）从感染细胞中提取环状DNA。使用脉冲发生器（Bio－Rad），通过电穿孔的方法（0.2－cm杯，2.5kV）把提取的DNA导入到大肠杆菌中进行转化。利用含17μg/ml氯霉素的琼脂平板对此进行筛选得到含VZV－BAC－DNA的大肠杆菌。
（5：大肠杆菌中VZV－BAC－DNA质粒的稳定性）
将包含BAC载体（VZV－BAC－DNA）的大肠杆菌在LB培养基上培养22－24小时，所述的BAC载体含有水痘－带状疱疹病毒基因组，用该方法传代3次，最后利用含氯霉素的琼脂平板进行选择。从传代大肠杆菌中获得5个克隆，将其分别在LB培养基上以相同的方法大量培养，提取DNA。根据试剂盒所附的说明书，使用Nucleobond PC100试剂盒（Macherey－Nagel）从菌体中提取VZV－BAC－DNA。将所得的5个克隆和原来的VZV－BAC－DNA分别用限制酶BamHI消化。通过琼脂糖凝胶电泳确认限制酶谱（结果未示出）。将所有5个克隆与原本的VZV BAC质粒相比较。结果琼脂糖凝胶上给出相同的限制酶谱。由此说明大肠杆菌中的VZV质粒具有高度的稳定性。
这些图中，原本的VZV－BAC－DNA和经传代3次的VZV－BAC－DNA给出相同的电泳图谱。这标明大肠杆菌中VZV－BAC－DNA质粒是稳定的。
（6：由VZV－BAC－DNA产生病毒）
通过重组质粒PHA－2/VZV11－12和VZV病毒的同源重组在HEL细胞中制备BAC克隆化的VZV rV01（图1D）。具体说来，用1μg VZV－BAC－DNA通过Nucleofector unit（Amaxa）转染在75－cm2的塑料烧瓶中培养至铺满的HEL细胞。2天后传代培养在75－cm2的塑料瓶中对培养至铺满的HEL细胞。2～3天后观察到水痘－带状疱疹病毒产生的典型CPE。在荧光显微镜下确认观察到CPE的细胞中GFP基因的表达。由此确认了可以利用VZV－BAC－DNA生产重组水痘－的带状疱疹病毒。把所产生的重组水痘－带状疱疹病毒命名为rV01（图1D）。通过将环状的BAC克隆化的基因组导入大肠杆菌中制备了VZVBAC质粒。
（7：切出BAC载体序列）
能表达Cre重组酶的重组腺病毒（AxCANCre）是由Nagoya大学的Yasushi Kawaguchi先生惠赠（Kanegae等人，（1995）Nucleic AcidsRes 23：3816－21）。利用该重组腺病毒通过BAC克隆化的VZV rV01和重组腺病毒（AxCANCre）的重复感染，制备VZV rV02（图1E；L表示loxP位点）。具体说来，以MOI（感染复数）100对HEL细胞感染重组腺病毒。吸附病毒2小时后，用PBS（－）清洗细胞，然后用含5%FCS的DMEM培养基培养。在重组腺病毒感染24小时后，用重组水痘－带状疱疹病毒rV01重复感染HEL细胞。通过使用对照的实验确认了通过重组腺病毒表达Cre重组酶，可以有效地从rV01基因组中切出BAC载体序列。把所得的水痘病毒称为rV02（图1，E）。DNA测序结果确认rV02是从rV01切除了BAC载体序列后的产物。
用限制酶BamHI消化从水痘－带状疱疹病毒Oka株的感染细胞中提取的DNA和来自大肠杆菌的VZV－BAC－DNA。由于残留片段一侧的loxP序列的缘故，来自重组水痘－带状疱疹病毒rV02DNA的片段比水痘－带状疱疹病毒Oka株的DNA大。
从VZV－BAC－DNA电泳图谱看，由于插入了BAC序列，与亲株相比约8.1kbp的BamHI片段消失了，同时增加了约7.8kbp和约9.2kbp的BamHI片段。从重组水痘病毒rV02感染细胞提取的DNA的约8.2kbp的BamHI片段，因BAC载体序列切出时残留片段一侧的loxP序列的缘故，与水痘病毒亲株的约8.1kbp的BamHI片段相比，大小稍稍增大。
（实施例2）
（具有重组水痘－带状疱疹病毒的特征）
（1：重组病毒增殖性的比较）
利用感染中心分析方法比较水痘－带状疱疹病毒Oka株和所获得的重组水痘－带状疱疹病毒rV02在HEL细胞中的增殖性（Gomi等人，（2002）J.Virol 76：11447－59）。以0.01PFU/细胞的MOI感染35mm平皿中的HEL细胞，接着洗涤所感染的细胞。培养感染HEL细胞的水痘－带状疱疹病毒Oka株和rV02株0到5天，用胰蛋白酶收集后，用以感染新的HEL细胞，从而比较其增殖性。将感染细胞的数量规范为初期病毒滴度/皿。倍数增加，表示第0天从1个感染细胞开始传播的感染细胞数。结果如图2所示。由图2可知所获得的重组水痘病毒rV02在体外与水痘病毒Oka株（亲株）表现同等的增殖能力。
（实施例3）
（弱致病性的变异型重组水痘－带状疱疹病毒的制备）
根据本发明，利用以下的方法可以制备变异型重组水痘－带状疱疹病毒，并且从变异病毒中获得致病性减弱的变异水痘－带状疱疹病毒株。
（1：变异型重组水痘－带状疱疹病毒的制备）
作为变异型重组水痘－带状疱疹病毒的制备方法，例如可以列举通过在包含变异基因的核酸与VZV－BAC－DNA质粒之间引起同源重组，制备变异型重组水痘－带状疱疹病毒的方法。为了与VZV－BAC－DNA质粒进行同源重组的变异基因既可以具有随机变异，也可以具有位点特异性变异。分别使用这些基因可以获得具有随机变异的变异型重组水痘－带状疱疹病毒集团和具有位点特异性变异的变异型重组水痘－带状疱疹病毒集团。下面分别进行详细描述。
（1.1：具有随机变异的重组水痘－带状疱疹病毒的制备）
已知有几种在水痘－带状疱疹病毒基因组的基因62中包含变异的病毒是减毒病毒。由此，在本实施例中通过PCR向基因62中导入随机变异。利用PCR导入变异的方法是已知的，例如，在四种核苷酸中的一种数量较少的条件下利用没有校正功能的耐热性聚合酶可以导入随机变异。必要时，基因62中可以与耐药基因之类的标记基因相连。
按照实施例1（4：重组病毒的富集并将其导入大肠杆菌）将这样制备的变异型基因62与VZV－BAC－DNA质粒一起导入到大肠杆菌中。并且在变异型基因62与VZV－BAC－DNA之间发生同源重组。然后根据实施例1中所述的方法分离产生同源重组的水痘－带状疱疹病毒DNA，将其导入至大肠杆菌中获得引起同源重组的VZV－BAC－DNA。
所获得的多个大肠杆菌包含VZV－BAC－DNA，所述的VZV－BAC－DNA包含携带不同变异的基因62。通过下述的（2：检测水痘－带状疱疹病毒致病性的方法）对各大肠杆菌中所含的变异型VZV－BAC－DNA所产生的水痘－带状疱疹病毒的致病性程度进行筛选。
（1.2：具有位点特异性变异的变异型重组水痘－带状疱疹病毒的制备）
导入所需的位点特异性变异的方法也是本领域已知的。例如，用含有所需变异的引物通过PCR制备包含所需变异的基因片段，然后用该变异的基因片段，通过进一步的PCR，或通过限制酶等的酶处理，制备具有所需变异的全长基因。
有关这样制备的变异基因，按照上述（1.1.）中所述的顺序，制备具有位点特异性变异的变异型重组水痘－带状疱疹病毒。
（2：水痘－带状疱疹病毒致病性的试验方法）
对于试验水痘－带状疱疹病毒致病性的方法，已确立了两种方法。
作为使用动物模型的方法，制备移植了人皮肤的重症复合免疫缺陷（SCID）小鼠，使其感染水痘－带状疱疹病毒，来评价其致病性的方法是已知的（J.Viro 1.1998Feb；72（2）：965－74）。
与此相反，对于在试管内进行致病性评价的方法，在由孔径3μm的通孔（trans－well）分隔开的双层孔的下层接入单层培养的人黑素瘤细胞，在上层接入经水痘－带状疱疹病毒感染的脐带血单核细胞（CBMC）培养7－8后观察黑素瘤细胞的CPE程度（细胞变性效果）的方法（J.Virol.2000Feb；74（4）：1864－70）也是公知的。
尽管不是直接确定致病性的方法，根据本发明人等目前所得到的结果（J.Virol.2002Nov；76（22）：11447－59），可以理解病毒的致病性与增殖性密切相关，通过感染中心试验研究细胞－对细胞的增殖性可以间接地评价致病性。
（实施例4）
（疫苗的制备）
将由实施例1获得的重组水痘－带状疱疹病毒接种到20个培养面积210cm2的Roux瓶中后进行培养。培养完毕后，弃去培养液，各Roux瓶内的感染细胞用200ml的PBS（－）洗2次。接下来，将20ml 0.03%（w/v）EDTA－3Na叠覆于各Roux瓶的感染细胞，以使细胞从Roux瓶内壁剥离并悬浮。汇集各瓶中的感染细胞悬液，在4℃以2,000rpm离心10min收集感染细胞颗粒。再用100ml的PBS（－）重悬细胞后，冻结融解一次。然后在冰水浴中超声波处理（20KHz，150mA，0.3sec/ml）后，再在4℃下以3,000rpm离心20min。采集含有由细胞释放病毒的悬液作为活疫苗原液。从该原液中取30ml作为鉴定用样品，向剩余的70ml原液中添加混合作为疫苗稳定剂的、溶解于PBS（－）蔗糖和明胶水解物并使其最终浓度分别达到50%（w/v）和2.5%（w/v），制备140ml最终散装的活疫苗。从所述最终散装中取30ml作为鉴定用样品，将所余的以每瓶0.5ml的量分注到3ml容量的小瓶中，0.5ml每瓶，冷冻干燥后填充氮气，用胶塞将小瓶气密闭。将所得的活疫苗分装品在4℃下保存，使用前添加0.5ml注射用蒸馏水使干燥的内容物完全溶解使用。另一方面，作为样品的上述疫苗原液和最终散装品，以及20个小分装品用于鉴定试验。通过所述鉴定试验确认安全性、有效性和均质性。作为活疫苗的合格性根据Guidelines for BiologicalFormulations defined under Notice No.195of Ministry of Health andWelfare（1989），以及“重组沉淀乙型肝炎疫苗（来自酵母）”实施。根据试验结果，上述小分装品品病毒含量为2×104PFU（噬菌斑形成单位）/0.5ml，并且当上述标准的各种试验合格时，提供具备合格性的活疫苗以备今后使用。
实施例5
（重组水痘－带状疱疹病毒疫苗免疫原性的确定）
利用豚鼠测定实施例4中制备的重组水痘－带状疱疹病毒疫苗的免疫原性。用Oka株活疫苗作为对照。将这些疫苗分别皮下接种到3只3周龄、平均体重250克的豚鼠上。疫苗接种，用PBS（－）稀释调整各疫苗并使得重组株和Oka活疫苗的接种量达到3,000PFU/豚鼠或2,000PFU/豚鼠。接种后第4、6、8周，从各接种豚鼠的大腿部静脉采血，测定其血液中抗体的效价。对于抗体效价的测定采用中和法（Journal of General Virology，61，255－269，1982）。确认重组水痘－带状疱疹病毒疫苗与Oka株同等程度地诱导抗－VZV抗体。根据这些结果选择免疫原性良好的重组水痘－带状疱疹病毒疫苗。
以上通过本发明的优选实施方案对本发明进行了示例性的说明，但应当理解只有权利要求范围可以用来解释本发明的范围。应该理解，本说明书中所引用的专利、专利申请和文献，其内容本身如本说明书说明的一样，其内容是作为对本说明书的参考而引用的。
产业上的实用性
本发明提供利用BAC（大肠杆菌人工染色体）由单一的病毒株生产重组水痘－带状疱疹病毒的方法，以及由该方法生产的重组水痘－带状疱疹病毒。此外，本发明还提供包含重组水痘－带状疱疹病毒的药物组合物。
此外，本发明还提供包含水痘－带状疱疹病毒基因组基因和BAC载体序列的载体，包含所述载体的细胞，以及包含能与水痘－带状疱疹病毒基因组进行同源重组的片段以及BAC载体序列的核酸盒。
（序列表文本）
SEQ ID NO.：1，VZ11F引物
SEQ ID NO.：2，VZ11R引物
SEQ ID NO.：3，VZ12F引物
SEQ ID NO.：4，VZ12R引物
SEQ ID NO.：5，基因62的序列
SEQ ID NO.：6，基因62的序列
SEQ ID NO.：7，质粒PHA－2的序列
SEQ ID NO.：8，水痘－带状疱疹病毒Dumas株
SEQ ID NO.：9，SEQ ID NO.：8的1134到1850位中以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因2）
SEQ ID NO.：10，SEQ ID NO.：8的8607到9386位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因7）
SEQ ID NO.：11，SEQ ID NO.：8的10642到10902位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因9A）
SEQ ID NO.：12，SEQ ID NO.：8的11009到11917位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因9）
SEQ ID NO.：13，SEQ ID NO.：8的12160到13392位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因10）
SEQ ID NO.：14，SEQ ID NO.：8的13590到16049位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因11）
SEQ ID NO.：15，SEQ ID NO.：8的16214到18199位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因12）
SEQ ID NO.：16，SEQ ID NO.：8的18441到19346位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因13）
SEQ ID NO.：17，SEQ ID NO.：8的24149到25516位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因17）
SEQ ID NO.：18，SEQ ID NO.：8的30759到33875位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因21）
SEQ ID NO.：19，SEQ ID NO.：8的34083到42374位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因22）
SEQ ID NO.：20，SEQ ID NO.：8的44506到46263位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因26）
SEQ ID NO.：21，SEQ ID NO.：8的50857到54471位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因29）
SEQ ID NO.：22，SEQ ID NO.：8的54651到56963位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因30）
SEQ ID NO.：23，SEQ ID NO.：8的57008到59614位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因31）
SEQ ID NO.：24，SEQ ID NO.：8的59766到60197位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因32）
SEQ ID NO.：25，SEQ ID NO.：8的64807到65832位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因36）
SEQ ID NO.：26，SEQ ID NO.：8的66074到68599位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因37）
SEQ ID NO.：27，SEQ ID NO.：8的70633到71355位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因39）
SEQ ID NO.：28，SEQ ID NO.：8的71540到75730位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因40）
SEQ ID NO.：29，SEQ ID NO.：8的75847到76797位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因41）
SEQ ID NO.：30，SEQ ID NO.：8的78170到80200位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因43）
SEQ ID NO.：31，SEQ ID NO.：8的80360到81451位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因44）
SEQ ID NO.：32，SEQ ID NO.：8的82719到83318位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因46）
SEQ ID NO.：33，SEQ ID NO.：8的84667到86322位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因48）
SEQ ID NO.：34，SEQ ID NO.：8的87881到90388位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因51）
SEQ ID NO.：35，SEQ ID NO.：8的90493到92808位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因52）
SEQ ID NO.：36，SEQ ID NO.：8的95996到98641位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因55）
SEQ ID NO.：37，SEQ ID NO.：8的110581到111417位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因63）
SEQ ID NO.：38，SEQ ID NO.：8的111565到112107位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因64）
SEQ ID NO.：39，SEQ ID NO.：8的113037到114218位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因66）
SEQ ID NO.：40，SEQ ID NO.：8的114496到115560位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因67）
SEQ ID NO.：41，SEQ ID NO.：8的115808到117679位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因68）
SEQ ID NO.：42，SEQ ID NO.：8的120764到124696位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因71）
SEQ ID NO.：43SEQ ID No.：8的部分序列（基因27）
SEQ ID NO.：44，SEQ ID NO.：43的1到999位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因27）
SEQ ID NO.：45，SEQ ID No.：8的部分序列（基因47）
SEQ ID NO.：46，SEQ ID NO.：45的1到1530位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因47）
SEQ ID NO.：47，SEQ ID No.：8的部分序列
SEQ ID NO.：48，SEQ ID NO.：47的1到243以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因49）
SEQ ID NO.：49，SEQ ID No.：8的部分序列
SEQ ID NO.：50，SEQ ID NO.：49的1到732位以5’→3’方向编码的氨基酸序列（基因56）
SEQ ID NO.：51，SEQ ID No.：8的互补序列
SEQ ID NO.：52，SEQ ID NO.：8的118480到119316位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的5569到6405位）（基因70）
SEQ ID NO.：53，SEQ ID NO.：8的117790到118332位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的6553到7095位）（基因69）
SEQ ID NO.：54，SEQ ID NO.：8的112332到112640位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的12245到12553位）（基因65）
SEQ ID NO.：55，SEQ ID NO.：8的105201到109133位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的15752到19684位）（基因62）
SEQ ID NO.：56，SEQ ID NO.：8的103082到104485位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的20400到21803位）（基因61）
SEQ ID NO.：57，SEQ ID NO.：8的100302到101219位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的23666到24583位）（基因59）
SEQ ID NO.：58，SEQ ID NO.：8的99411到99626位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的25259到25474位）（基因57）
SEQ ID NO.：59，SEQ ID NO.：8的92855到93850位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的31035到32030位）（基因53）
SEQ ID NO.：60，SEQ ID NO.：8的68668到70293位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的54592到56217位）（基因38）
SEQ ID NO.：61，SEQ ID NO.：8的63977到64753位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的60132到60908位）（基因35）
SEQ ID NO.：62，SEQ ID NO.：8的62171到63910位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的60975到62714位）（基因34）
SEQ ID NO.：63，SEQ ID NO.：8的60321到62138位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的62747到64564位）（基因33）
SEQ ID NO.：64，SEQ ID NO.：8的47052到50636位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的74249到77833位）（基因28）
SEQ ID NO.：65，SEQ ID NO.：8的44148到44618位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的80267到80737位）（基因25）
SEQ ID NO.：66，SEQ ID NO.：8的43212到44021位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的80864到81673位）（基因24）
SEQ ID NO.：67，SEQ ID NO.：8的42431到43138位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的81747到82454位）（基因23）
SEQ ID NO.：68，SEQ ID NO.：8的29024到30475位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的94410到95861位）（基因20）
SEQ ID NO.：69，SEQ ID NO.：8的26518到28845位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的96040到98367位）（基因19）
SEQ ID NO.：70，SEQ ID NO.：8的25573到26493位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的98392到99312位）（基因18）
SEQ ID NO.：71，SEQ ID NO.：8的22568到23794位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的101091到102317位）（基因16）
SEQ ID NO.：72，SEQ ID NO.：8的21258到22478位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的102407到103627位）（基因15）
SEQ ID NO.：73，SEQ ID NO.：8的19431到21113位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的103772到105454位）（基因14）
SEQ ID NO.：74，SEQ ID NO.：8的9477到10667位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的114218到115408位）（基因8）
SEQ ID NO.：75，SEQ ID NO.：8的5326到8577位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的116308到119559位）（基因6）
SEQ ID NO.：76，SEQ ID NO.：8的4252到5274位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的119611到120633位）（基因5）
SEQ ID NO.：77，SEQ ID NO.：8的2783到4141位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的120744到122102位）（基因4）
SEQ ID NO.：78，SEQ ID NO.：8的1908到2447位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的122438到122977位）（基因3）
SEQ ID NO.：79，SEQ ID NO.：8的589到915位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的123970到124296位）（基因1）
SEQ ID NO.：80，SEQ ID No.：51的部分序列
SEQ ID NO.：81，SEQ ID NO.：80的1到1056和4556到5740位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的46847到48034和42292到43347位）（基因42和基因45）
SEQ ID NO.：82，SEQ ID No.：51的部分序列
SEQ ID NO.：83，SEQ ID NO.：82的1到1305位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的123580到124884位）（基因50）
SEQ ID NO.：84，SEQ ID No.：51的部分序列
SEQ ID NO.：85，SEQ ID NO.：84的1到2307位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的122578到124884位）（基因54）
SEQ ID NO.：86，SEQ ID No.：51的部分序列
SEQ ID NO.：87，SEQ ID NO.：86的1到663位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的124222到124884位）（基因58）
SEQ ID NO.：88，SEQ ID No.：51的部分序列
SEQ ID NO.：89，SEQ ID NO.：88的1到427位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的124458到124884位）（基因60）
SEQ ID NO.：90，SEQ ID No.：51的部分序列
SEQ ID NO.：91，SEQ ID NO.：90的1到903位以3’→5’方向编码的氨基酸序列（相应于SEQ ID No.：51的60321到61229位）（基因33.5）
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Claims (62)

1.重组、减毒水痘－带状疱疹病毒，其包含BAC载体序列，其中，至少部分前述BAC载体序列插入到水痘－带状疱疹病毒基因组的非必需区域之中，并且其中，前述非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。
2.如权利要求1所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF和基因12的ORF之间的区域。
3.如权利要求1所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
4.如权利要求1所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
5.如权利要求4所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
6.如权利要求1所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
7.如权利要求1所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自野生株。
8.如权利要求1所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
9.如权利要求1所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
10.如权利要求1所述的重组水痘－带状疱疹病毒，其中，所述的BAC载体序列包含SEQ ID NO.：7所示的序列。
11.包含权利要求1所述病毒的药物组合物。
12.如权利要求11所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗的形式。
13.载体，其包含水痘－带状疱疹病毒必需基因和BAC载体序列，其中，一部分BAC载体序列位于该水痘－带状疱疹病毒基因组的非必需区域内，所述的非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域或基因12的ORF的侧翼区域。
14.如权利要求13所述的载体，其进一步包含基因62。
15.如权利要求13所述的载体，其中，当所述载体插入哺乳动物细胞时，哺乳动物细胞产生水痘－带状疱疹病毒。
16.如权利要求13所述的载体，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF与基因12的ORF之间的区域。
17.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
18.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
19.如权利要求18所述的载体，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
20.如权利要求18所述的载体，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
21.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自野生株。
22.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
23.如权利要求13所述的载体，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
24.如权利要求13所述的载体，其中，所述的BAC载体序列包含SEQ ID NO.：7所示的序列。
25.包含权利要求13所述载体的细胞。
26.如权利要求25所述的细胞，其中，所述的细胞是细菌细胞。
27.如权利要求26所述的细菌细胞，其中，所述的细菌是大肠杆菌。
28.如权利要求25所述的细胞，其中，所述的细胞是哺乳动物细胞。
29.如权利要求28所述的哺乳动物细胞，其中，所述的哺乳动物细胞来源于人。
30.如权利要求28所述的哺乳动物细胞产生的病毒。
31.包含如权利要求30所述的病毒的药物组合物。
32.如权利要求31所述的药物组合物，其中所述的组合物是疫苗的形式。
33.生产重组、减毒水痘－带状疱疹减毒病毒的方法，该方法包含以下步骤：
将含有水痘－带状疱疹病毒基因组必需基因与BAC载体序列的载体导入到哺乳动物宿主细胞中的步骤；和
培养所述的哺乳动物宿主细胞，生产重组水痘－带状疱疹病毒的步骤，其中，所述BAC载体序列位于该水痘－带状疱疹病毒基因组的非必需区域内，所述的非必需区域选自基因11的ORF的侧翼区域，或基因12的ORF的侧翼区域。
34.如权利要求33所述的方法，其中所述的哺乳动物宿主细胞来源于人。
35.如权利要求33所述的方法，其中，所述的BAC载体序列至少包含两种重组蛋白依赖的重组序列。
36.如权利要求35所述的方法，其进一步包含在上述两种重组蛋白依赖的重组序列之间的重组步骤。
37.如权利要求33所述的载体，其中，所述的非必需区域是基因11的ORF和基因12的ORF之间的区域。
38.如权利要求33所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含重组蛋白依赖的重组序列。
39.如权利要求33所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
40.如权利要求39所述的方法，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
41.如权利要求39所述的方法，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
42.如权利要求33所述的方法，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自野生株。
43.如权利要求33所述的方法，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
44.如权利要求33所述的方法，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
45.如权利要求33所述的方法，其中，所述的BAC载体序列包含SEQ ID NO.：7所示的序列。
46.如权利要求33所述的方法制备的病毒。
47.包含权利要求46所述病毒的药物组合物。
48.如权利要求47所述的药物组合物，其中，所述的组合物是疫苗的形式。
49.将突变导入如权利要求13所述的载体中的方法，该方法包括以下步骤：
将所述载体导入到细菌宿主细胞中的步骤；
将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成的片段的质粒载体导入该细菌宿主细胞的步骤，其中，所述片段至少具有一个突变；
培养所述的细菌宿主细胞的步骤；
由经培养的细菌宿主细胞分离具有BAC载体序列的载体的步骤。
50.向如权利要求13所述的载体中导入突变的方法，该方法包括以下步骤，将所述载体导入细菌宿主细胞的步骤；
将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成的第一片段的第一质粒载体导入所述细菌宿主细胞的步骤，其中，所述的第一片段至少具有一个变异；
将包含由水痘－带状疱疹病毒基因组的一部分组成的第二片段的第二质粒载体导入所述细菌宿主细胞的步骤，其中，所述的第二片段至少具有一个变异，并且所述的第二片段与第一片段不同；
培养所述细菌宿主细胞的步骤；
从所培养的细菌宿主细胞分离具有BAC载体序列的载体的步骤。
51.核酸盒，其包含能够在细菌细胞内与水痘－带状疱疹病毒基因组基因组同源重组的第一片段，BAC载体序列，能够在细菌细胞内与水痘－带状疱疹病毒基因组基因组同源重组的第二片段，其中，所述的BAC序列两端与第一片段和第二片段相连，所述的第一片段和第二片段分别独立地选自基因11的ORF的侧翼区域，或基因12的ORF的侧翼区域。
52.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段至少为1kb。
53.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的第一片段和第二片段来自不同的区域。
54.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体包含重组蛋白依赖的重组序列。
55.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含选择标记。
56.如权利要求55所述的核酸盒，其中，所述的选择标记是药物选择标记。
57.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的选择标记是编码绿荧光蛋白的基因。
58.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自野生株。
59.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自突变型病毒株。
60.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的水痘－带状疱疹病毒基因组来自Oka疫苗株。
61.如权利要求51所述的核酸盒，其中，所述的BAC载体序列包含SEQ ID NO.：7所示的序列。
62.如权利要求51所述的核酸盒，其具有SEQ ID NO.：2所示的核酸序列。
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