CN117737006A - 重组溶瘤痘苗病毒及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种重组痘苗病毒、其在制备治疗人类癌症的药物中的应用以及包含该病毒的药物组合物。所述重组痘苗病毒通过在Lister痘苗病毒毒株的胸苷激酶(TK)基因中插入TGF‑βRII基因片段、并在痘苗病毒生长因子(VGF)基因中插入GM‑CSF基因而获得，其中，所述插入使得所述胸苷激酶(TK)基因和所述痘苗病毒生长因子(VGF)基因均失活，且所述TGF‑βRII基因片段包含编码TGF‑βRII的TGF‑β结合结构域的序列。

Description

重组溶瘤痘苗病毒及其应用
技术领域
本发明涉及溶瘤病毒及其在治疗癌症中的应用，更具体而言，涉及一种经遗传改造的重组痘苗病毒及其在治疗癌症中的应用。
背景技术
溶瘤病毒(Oncolytic virus)是一类能够在肿瘤细胞中选择性地增殖而在正常细胞中相对无增殖的病毒，这种选择性增殖能够导致肿瘤细胞的生长减缓或死亡。
痘苗病毒(vaccinia virus)属于痘病毒属(poxvirus)，是一种双链DNA病毒，基因组为180-200kb，曾一直被用作预防天花的疫苗，后发现痘苗病毒对肿瘤细胞具有强趋向性，表现出溶瘤病毒的作用。还发现痘苗病毒能够携带大量外源DNA序列，因此常常被用作遗传工程的工具载体。
痘苗病毒基因组含有病毒胸苷激酶(TK)基因。正常细胞自身的TK表达较低，痘苗病毒在感染正常细胞后，其DNA的复制依赖于其病毒胸苷激酶(TK)活性来提供足够浓度的核苷酸；但是在快速增殖的肿瘤细胞中，肿瘤细胞本身表达高水平的TK，使得痘苗病毒DNA的复制不再依赖于其自身的病毒TK。因此，在大多数正常细胞中，痘苗病毒的TK基因的缺失大大降低了其复制能力，从而导致病毒对正常细胞的毒力下降；而在肿瘤细胞中，病毒TK基因的缺失对其复制的影响很小。由此，TK活性缺失的痘苗病毒可以显示出对肿瘤细胞的选择性。因此，删除痘苗病毒的全部或一部分TK基因或在其中插入其他序列以使TK基因失活是一种常用的痘苗病毒遗传改造手段。
痘苗病毒生长因子(VGF)是由痘苗病毒编码的一种多肽，其与细胞生长因子EGF和TGF-生具有氨基酸序列同源性。
近来的研究发现，在各种痘苗病毒株中，Lister株在多数人类癌细胞中表现出比WR株更强的肿瘤选择性复制和细胞毒性，从而表现出更强的抗肿瘤效力和更少的脱靶复制，但在鼠癌细胞中则相反(Hughes,J.,et al.Gene Ther 22,476–484(2015))。野生型Lister痘苗病毒毒株的基因组序列可以参见Genbank KX061501.1。
本领域中对开发能够更有效地选择性抑制肿瘤细胞的溶瘤病毒存在持续需求。
发明内容
为了实现本发明的目的，发明人开发了一种对人类癌细胞具有更强的选择性的痘苗病毒溶瘤病毒株，并完成了本发明。具体而言，发明人利用CRISPR-Cas9基因编辑技术将表达TGF-βRII的基因片段插入痘苗病毒Lister株的tk基因中，在使tk失活的同时使该重组病毒株(Lister TT)高效表达TGF-βRII。另外，发明人利用CRISPR-Cas9基因编辑技术将表达GM-CSF的基因片段插入痘苗病毒Lister株或Lister TT株的VGF基因中，在使VGF失活的同时使该重组病毒株高效表达GM-CSF。经上述遗传改造的病毒株能够高效表达TGF-βRII和/或GM-CSF，病毒活性和增殖能力优异，而且显示出比Lister株更强的人肿瘤细胞选择性。
本发明的第一方面提供了一种重组痘苗病毒(Lister TT)，其通过在Lister痘苗病毒毒株的胸苷激酶(TK)基因中插入TGF-βRII基因片段而获得，其中，所述插入使得所述胸苷激酶(TK)基因失活，且所述TGF-βRII基因片段包含编码TGF-βRII的TGF-β结合结构域的序列。在下文中，本发明第一方面的重组痘苗病毒简称为“Lister TT”或“TT”。
本发明还提供了上述重组痘苗病毒，其中，在所述胸苷激酶(TK)基因中还可以插入有EGFP基因。优选地，所述EGFP基因的两端连接有能够被Cre酶识别并切割的LoxP位点，其中，LoxP的序列优选为SEQ ID No:16。优选地，所述TGF-βRII基因片段和EGFP基因通过CRISPR-Cas9技术插入所述胸苷激酶(TK)基因中。优选地，所述CRISPR-Cas9技术中使用的gRNA的序列选自SEQ ID No:1、SEQ ID No:2和SEQ ID No:3，优选为SEQ ID No:1。优选地，所述TGF-βRII基因片段和EGFP基因被构建在同一个供体质粒中，而后通过CRISPR-Cas9技术插入所述胸苷激酶(TK)基因中。
本发明还提供了上述任一种重组痘苗病毒，优选地，所述TGF-βRII基因片段的序列为SEQ ID No:4。
本发明还提供了上述任一种重组痘苗病毒，优选地，插入外源基因片段(例如TGF-βRII基因片段、GM-CSF基因、EGFP基因等)之前的所述Lister痘苗病毒毒株的基因组序列如Genbank KX061501.1所示。
本发明还提供了一种上述重组痘苗病毒(Lister TT)，所述重组痘苗病毒于2022年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No:V202270。
本发明的第二方面提供了一种重组痘苗病毒(Lister TT-VG)，其通过在Lister痘苗病毒毒株的胸苷激酶(TK)基因中插入TGF-βRII基因片段、并在其痘苗病毒生长因子(VGF)基因中插入GM-CSF基因而获得，其中，所述插入使得所述胸苷激酶(TK)基因和所述痘苗病毒生长因子(VGF)基因均失活，其中，所述TGF-βRII基因片段包含编码TGF-βRII的TGF-β结合结构域的序列。在下文中，本发明第二方面的双插入型重组痘苗病毒简称为“ListerTT-VG”或“TT-VG”。
本发明的第三方面提供了上述第一和第二方面中的任一种重组痘苗病毒在制备治疗人类癌症的药物中的应用。优选地，所述人类癌症选自人肝癌、人乳腺癌、人淋巴瘤、人胰腺癌、人结肠癌、人头颈部鳞状细胞癌、人舌鳞状细胞癌、人咽鳞状细胞癌、人胃癌和人卵巢癌。优选地，所述药物还包含免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体或抗LAG-3抗体。
本发明的第四方面提供了一种用于治疗人类癌症的药物组合物，其包含上述第一和第二方面中的任一种重组痘苗病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。优选地，所述人类癌症选自人肝癌、人乳腺癌、人淋巴瘤、人胰腺癌、人结肠癌、人头颈部鳞状细胞癌、人舌鳞状细胞癌、人咽鳞状细胞癌、人胃癌和人卵巢癌。优选地，所述药物组合物还包含免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体或抗LAG-3抗体。
本发明的第五方面提供了一种治疗人类癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的上述第一和第二方面中的任一种重组痘苗病毒。优选地，所述人类癌症选自人肝癌、人乳腺癌、人淋巴瘤、人胰腺癌、人结肠癌、人头颈部鳞状细胞癌、人舌鳞状细胞癌、人咽鳞状细胞癌、人胃癌和人卵巢癌。优选地，所述方法还包括向所述受试者施用免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体或抗LAG-3抗体。
附图说明
图1显示了用构建本发明的第一方面的一个示例性实施方式的重组病毒基因组所用的TGF-βRII基因片段供体质粒的基因图谱。
图2A至2C分别显示了本发明第一方面的一个示例性实施方式的重组病毒和痘苗病毒Lister株对MCF-10A、MCF7和MC38细胞的杀伤活性。
图3显示了本发明的第一方面的一个示例性实施方式的重组病毒和痘苗病毒Lister株在MCF-7和MCF10A细胞中的增殖活性；其中，纵坐标的单位是PFU/ml。
图4显示了在小鼠肿瘤动物模型中施用本发明的第一方面的一个示例性实施方式的重组病毒和/或抗mPD-1抗体后荷瘤小鼠体重的变化。G1：溶媒对照组；G2：抗mPD-1抗体组；G3：重组病毒13-1；G4：重组病毒13-1+抗mPD-1抗体(各组的详细信息见表9)。
图5显示了在小鼠肿瘤动物模型中施用本发明的第一方面的一个示例性实施方式的重组病毒和/或抗mPD-1抗体后肿瘤体积的变化。G1：溶媒对照组；G2：抗mPD-1抗体组；G3：重组病毒13-1；G4：重组病毒13-1+抗mPD-1抗体(各组的详细信息见表9)。统计学显著性：**p<0.01，G4相对于G1(Dunnett多重比较检验)。
图6显示了在小鼠肿瘤动物模型中施用本发明的第一方面的一个示例性实施方式的重组病毒和/或抗mPD-1抗体后小鼠的存活百分比随时间的变化。G1：溶媒对照组；G2：抗mPD-1抗体组；G3：重组病毒13-1；G4：重组病毒13-1+抗mPD-1抗体(各组的详细信息见表9)。
图7显示了构建本发明的第二方面的一个示例性实施方式的重组病毒基因组所用的hGM-CSF基因供体质粒的基因图谱。
图8是本发明第二方面的一个示例性实施方式的重组病毒(TT-VG)基因组的PCR产物凝胶电泳图。
图9是本发明第二方面的一个示例性实施方式的TT-VG病毒感染细胞48小时观察mScarlet和EGFP的荧光照片。
图10显示了用第二方面的一个示例性实施方式的TT-VG病毒和Lister病毒感染细胞后上清中的GM-CSF活性。
图11A和11B显示了第二方面的一个示例性实施方式的TT-VG和Lister病毒在HUVEC和HepG2细胞中的杀伤活性。
用于专利程序的微生物保藏
1)痘苗病毒Lister-13株
保藏日期：2022年9月14日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，中国典型培养物保藏中心
保藏编号：CCTCC No:V202270
分类命名：痘苗病毒(Vaccinia virus)
2)痘苗病毒Lister-TT-VG
保藏日期：2023年6月26日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，中国典型培养物保藏中心
保藏编号：CCTCC No:V202347
分类命名：痘苗病毒Lister-TT-VG(Vaccinia Virus sp.Lister-TT-VG)
具体实施方式
本发明在第一方面提供一种基于痘苗病毒Lister株的重组病毒(TT)，其中，在所述重组病毒的基因组的tk基因中插入有TGF-βRII基因片段，其中，所述TGF-βRII基因片段包含编码TGF-β结合结构域的序列。
TGF-β是一种调控免疫应答的细胞因子，在肿瘤晚期其具有促进肿瘤的作用。越来越多的临床前和临床数据表明，阻断TGF-β信号是治疗肿瘤的有效方法。此外，阻断TGF-β信号还可以增强肿瘤对免疫检查点抑制剂(ICI)的反应，例如PD-1或PD-L1抗体。
TGF-βII型受体(TGF-βRII)是一种567aa的跨膜蛋白，其由胞外结构域、跨膜结构域和胞内结构域构成，胞外结构域以高亲和力与TGF-β结合。本文中使用的术语“TGF-β结合结构域”是指该胞外结构域中负责结合TGF-β的功能区段，其可以对应于成熟的人TGF-βRII蛋白的第1-136位氨基酸(Boesen et al.,(2002),Structure,Vol10,Issue 7,913-919)。TGF-βRII与TGF-β的结合抑制TGF-β的活性。已发现TGF-βRII在许多肿瘤类型中都存在基因突变或缺失。基于此，通过在肿瘤细胞中表达TGF-βRII来捕获TGF-β是一种潜在的抑制肿瘤细胞的策略。因此，在本发明的重组痘苗病毒中插入了包含TGF-β结合结构域编码序列的TGF-βRII片段基因。此处，“TGF-βRII片段基因”也可以是全长TGF-βRII的编码序列。
可选地，在第一方面的重组病毒毒株中，在所述胸苷激酶(TK)基因中还可以插入有荧光蛋白筛选基因以便筛选病毒。优选地，所述荧光蛋白基因的两端连接有能够被Cre酶识别并切割的LoxP位点，允许通过Cre酶删除重组病毒中的该筛选标记。所述荧光蛋白可以是绿色荧光蛋白，例如EGFP，但不限于此。
CRISPR-Cas9是一种高效的基因编辑技术，该技术利用人工设计的向导RNA(sgRNA)来识别目标基因序列，并引导Cas9蛋白酶在靶位点切割DNA双链以形成双链断裂，该损伤被修复后就会实现基因编辑，例如敲除目标基因序列或敲入一段外源序列。
在第一方面的一个实施方式中，先将所述TGF-βRII片段基因和可选的荧光蛋白(例如EGFP)筛选基因构建到供体质粒中，然后通过CRISPR-Cas9技术将其敲入Lister株基因组的tk基因中。
在第一方面的一个实施方式中，上述CRISPR-Cas9技术中使用的向导RNA(gRNA)选自SEQ ID No:1(gRNA1)、SEQ ID No:2(gRNA2)和SEQ ID No:3(gRNA3)。在一个实施方式中，所述gRNA优选为gRNA1。
在第一方面的一个实施方式中，包含所述TGF-βRII基因片段和EGFP筛选基因的供体质粒的图谱如图1所示。其中，TGF-βRII基因片段序列(正向)为SEQ ID No:4；EGFP(反向互补)序列为SEQ ID No:5；P11(正向)的序列为SEQ ID No:6；P7.5(反向互补)的序列为SEQID No:7；SV40(正向)的序列为SEQ ID No:8；BGH(反向互补)的序列为SEQ ID No:9。
在第一方面的一个实施方式中，本发明的重组病毒中的TGF-βRII基因片段是编码SEQ ID No:10的核酸序列。SEQ ID No:10是一种TGF-βRII蛋白的胞外结构域的氨基酸序列，且带有N端信号肽。
在第一方面的一个实施方式中，基于病毒噬斑尺寸和/或TGF-βRII表达水平来筛选的重组毒株。在第一方面的一个实施方式中，所述筛选可以进行一轮、两轮或三轮以上。
在第一方面的一个优选实施方式中，本发明提供保藏号为CCTCC No:V202270的第13-1号毒株，其于2022年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。但本发明不限于此。
本发明的第一方面的毒株表现出稳定高效的TGF-βRII表达、优异的增殖能力和病毒活性，并且总体上表现出与亲本Lister株相似的对正常人细胞的低杀伤活性和对人癌细胞的高杀伤活性。特别而言，在本发明所构建的毒株中，13-1号毒株的TGFβ-RII表达水平总体最高且最为稳定，并且具有较高的病毒活性；其在正常人细胞上杀伤活性最低、在人肿瘤细胞上杀伤活性最高，且均与亲本Lister株相当；而其在正常人细胞中的增殖低于亲本Lister株。这说明13-1号重组病毒对于人肿瘤细胞的亲噬性优异，是优选的抗癌剂候选。
本发明在第二方面提供了一种重组痘苗病毒(TT-VG)，其通过在Lister痘苗病毒毒株的胸苷激酶(TK)基因中插入TGF-βRII基因片段、并在其痘苗病毒生长因子(VGF)基因中插入GM-CSF基因而获得，其中，所述插入使得所述胸苷激酶(TK)基因和所述痘苗病毒生长因子(VGF)基因均失活，所述TGF-βRII基因片段包含编码TGF-βRII的TGF-β结合结构域的序列。
在第二方面的一个实施方式中，在Lister痘苗病毒毒株的胸苷激酶(TK)基因中插入TGF-βRII基因片段的方法可以与上述第一方面中的各实施方式中相同。
在第二方面的一个实施方式中，重组痘苗病毒可以通过在第一方面的重组痘苗病毒基础上进一步在痘苗病毒生长因子(VGF)基因中插入GM-CSF基因而获得。
GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)是一种细胞因子，它能够刺激包括中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞在内的骨髓细胞亚群的产生。根据GM-CSF的表达水平、癌症类型和肿瘤微环境，GM-CSF可能具有抗癌作用或促癌作用。
在第二方面的重组病毒毒株中，在所述VGF基因中还可以插入有荧光蛋白筛选基因以便筛选病毒。优选地，所述荧光蛋白基因的两端连接有能够被Cre酶识别并切割的LoxP位点，允许通过Cre酶删除重组病毒中的该筛选标记。所述荧光蛋白可以与第一方面的荧光蛋白不同，例如可以是红色荧光蛋白(RFP)，例如mScarlet，但不限于此。
在第二方面的一个实施方式中，先将所述GM-CSF片段基因和可选的荧光蛋白(例如RFP)筛选基因构建到供体质粒中，然后通过CRISPR-Cas9技术将其敲入Lister株基因组的VGF基因中。
在第二方面的一个实施方式中，上述CRISPR-Cas9技术中使用的VGF向导RNA(VGF-gRNA)选自SEQ ID No:11(VGF-gRNA1)、SEQ ID No:12(VGF-gRNA2)和SEQ ID No:13(VGF-gRNA3)。在一个实施方式中，所述VGF-gRNA优选为VGF-gRNA1。
在第二方面的一个实施方式中，包含所述GM-CSF基因和RFP筛选基因mScarlet的供体质粒的图谱如图7所示。在图7所示的质粒的一个优选实施方式中，GM-CSF基因序列(正向)为SEQ ID No:14；mScarlet序列(反向互补)为SEQ ID No:15；P11(正向)的序列为SEQID No:6；P7.5(反向互补)的序列为SEQ ID No:7；SV40(正向)的序列为SEQ ID No:8；BGH(反向互补)的序列为SEQ ID No:9；LoxP的序列为SEQ IDNo:16；VGF左臂的序列为SEQ IDNo:17；VGF右臂的序列为SEQ ID No:18。
在第二方面的一个实施方式中，基于病毒噬斑尺寸和/或TGF-βRII表达水平和/或GM-CSF表达水平来筛选的重组毒株。在第二方面的一个实施方式中，所述筛选可以进行一轮、两轮或三轮以上。
在第二方面的一个实施方式中，所述重组痘苗病毒(TT-VG)于2023年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No:V202347，分类命名为痘苗病毒Lister-TT-VG(Vaccinia Virus sp.Lister-TT-VG)。
因此，本发明还提供本了本发明的第一和第二方面的重组痘苗病毒在制备治疗人类癌症的药物中的应用。本发明还提供本了用于治疗人类癌症的药物组合物，其包含本发明的第一和/或第二方面的重组痘苗病毒以及药学上可接受的载体或赋形剂。本发明还提供一种治疗人类癌症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用有效量的上述任一种重组痘苗病毒。
优选地，所述人类癌症选自人肝癌、人乳腺癌、人淋巴瘤、人胰腺癌、人结肠癌、人头颈部鳞状细胞癌、人舌鳞状细胞癌、人咽鳞状细胞癌、人胃癌和人卵巢癌。
优选地，所述药物或药物组合物还包含免疫检查点抑制剂。优选地，所述治疗人类癌症的方法还包括向所述受试者施用免疫检查点抑制剂。所述免疫检查点抑制剂例如为抗PD-1抗体(例如Pembrolizumab(Keytruda)、Nivolumab(Opdivo)、Cemiplimab(Libtayo)等)、抗PD-L1抗体(例如Atezolizumab(Tecentriq)、Avelumab(Bavencio)、Durvalumab(Imfinzi)等)、抗CTLA-4抗体(例如Ipilimumab(Yervoy)和tremelimumab(Imjuno)等)或抗LAG-3抗体(例如Relatlimab等)。发明人发现，当将本发明的重组病毒与免疫检查点抑制剂联用时，抑制肿瘤细胞的效果更佳。
实施例
实施例1.TGF-βRII供体质粒的构建
首先构建CRISPR Cas9质粒、三个gRNA质粒和图1所示的供体质粒。
将上述5个质粒的甘油菌活化并扩增过夜。各取100ml菌液用Axygen中提质粒试剂盒提取质粒，步骤参照试剂盒说明书。以50μl Eluent洗脱质粒并测浓度，置-20℃保存。各质粒的信息如表1所示。
表1
质粒名称 说明 浓度(μg/ml)
TGF-βRII供体质粒 图1 327
Cas9 315
gRNA1 SEQ ID No:1 TGATAGGTATCGATGAAGGA 971
gRNA2 SEQ ID No:2 ATCACGGAGAAATCTGTAAT 570
gRNA3 SEQ ID No:3 TCATCGATACCTATCACGGA 520
实施例2.细胞转染
1)细胞铺板：将BS-C-1细胞(ATCC,BS2018001-III1-IV29-P12)以5×105细胞/孔的密度接种至六孔板，每孔含有2ml 10％FBS MEM培养基，培养24小时。
2)Cas 9和gRNA质粒转染
A液制备：将Opti-MEM培养基(Gibco,2120548-01)加入EP管中，每管125μl，共8管。将Lipo 3000转染试剂(Invitrogen,2241260-01)按下表2所示转染试剂1的体积加入各管中，混匀。
B液制备：将Opti-MEM培养基(Gibco)加入EP管中，每管125μl。将Cas 9及gRNA质粒按下表2所示加入管中，然后添加P3000试剂，每管5μl，充分混匀。
在每管已稀释的Lipo 3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例)，室温孵育15分钟。在这期间，将6孔板中的细胞用2％ FBS MEM培养基冲洗两遍后，加入1ml 2％ FBS MEM培养基。逐滴加入6孔板中。同时设置空白细胞孔，细胞加病毒孔，细胞加转染试剂孔，细胞计数孔，共计5块6孔板。转染6小时后换成完全培养基。
3)病毒感染
转染24小时后。取板内一个孔，弃去培养液，加入适量胰酶(Gibco,2120822-01)消化并计数，根据计数细胞数，将野生型Lister病毒株(Genbank KX061501.1)以2％FBS MEM稀释至0.1MOI。将稀释好的病毒液加入至设计好的孔中，1ml/孔，37℃孵育2h。
4)TGF-βRII供体质粒转染
A液制备：将Opti-MEM培养基加入EP管中，每管125μl，共8管。将转染试剂按下表2所示转染试剂2的体积加入管中，混匀。
B液制备：将Opti-MEM培养基加入EP管中，每管125μl。将TGF-βRII供体质粒按下表2所示加入管中，然后添加P3000试剂，每管5μl，充分混匀。
在每管已稀释的Lipo 3000试剂中加入稀释的DNA(1:1比例)，室温孵育15分钟。在这期间，将6孔板中的细胞用2％ FBS MEM培养基冲洗细胞两遍后，加入1ml 2％FBS MEM培养基。逐滴加入6孔板中。同时设置空白细胞孔，细胞加病毒孔，细胞加转染试剂孔，细胞计数孔，共计5块6孔板。转染6小时后换成完全培养基。
5)培养
37℃孵育3天。将细胞刮下收集后，反复冻融三次备用。
表2.TGF-βRII供体质粒和转染试剂
gRNA1实验编号 Cas 9 gRNA1 转染试剂1 供体质粒 转染试剂2
1 1.2μg 1.8μg 3.75μl 3μg 3.75μl
2 1.2μg 1.8μg 7.5μl 3μg 3.75μl
3 1.0μg 2.0μg 3.75μl 3μg 3.75μl
4 1.0μg 2.0μg 7.5μl 3μg 3.75μl
5 1.2μg 1.8μg 3.75μl 3μg 7.5μl
6 1.2μg 1.8μg 7.5μl 3μg 7.5μl
7 1.0μg 2.0μg 3.75μl 3μg 7.5μl
8 1.0μg 2.0μg 7.5μl 3μg 7.5μl
gRNA2实验编号 Cas 9 gRNA2 转染试剂1 供体质粒 转染试剂2
1 1.2μg 1.8μg 3.75μl 3μg 3.75μl
2 1.2μg 1.8μg 7.5μl 3μg 3.75μl
3 1.0μg 2.0μg 3.75μl 3μg 3.75μl
4 1.0μg 2.0μg 7.5μl 3μg 3.75μl
5 1.2μg 1.8μg 3.75μl 3μg 7.5μl
6 1.2μg 1.8μg 7.5μl 3μg 7.5μl
7 1.0μg 2.0μg 3.75μl 3μg 7.5μl
8 1.0μg 2.0μg 7.5μl 3μg 7.5μl
gRNA3实验编号 Cas 9 gRNA3 转染试剂1 供体质粒 转染试剂2
1 1.2μg 1.8μg 3.75μl 3μg 3.75μl
2 1.2μg 1.8μg 7.5μl 3μg 3.75μl
3 1.0μg 2.0μg 3.75μl 3μg 3.75μl
4 1.0μg 2.0μg 7.5μl 3μg 3.75μl
5 1.2μg 1.8μg 3.75μl 3μg 7.5μl
6 1.2μg 1.8μg 7.5μl 3μg 7.5μl
7 1.0μg 2.0μg 3.75μl 3μg 7.5μl
8 1.0μg 2.0μg 7.5μl 3μg 7.5μl
实施例3.重组病毒(TT)的纯化、扩增及筛选
1)重组病毒纯化
将143B细胞以5×105细胞/孔的密度接种至六孔板，每孔含有2ml 10％ FBS MEM培养基，培养24小时。取转染收集样品稀释至10-2及10-3，细胞6孔板弃去培养液，每孔加入1ml稀释好的待测病毒液，并设立空白对照板，置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养2h。
配置病毒覆盖液：2％琼脂糖与2×4％ FBS MEM培养液，1:1混匀。弃去病毒液，每孔加入2mL的病毒覆盖液，待完全凝固后，翻转培养板，置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养3天。
2)重组病毒挑斑及扩增
将143B细胞以5×105细胞/孔的密度接种至六孔板，每孔含有2ml 10％ FBS MEM培养基，培养24小时。在荧光显微镜(MF-53)下蓝色荧光视野下用无菌枪头挑取阳性病毒噬斑36个，在含有200μl 2％ FBS1640的离心管中反复吹打，加入6孔板中。置于37℃二氧化碳培养箱培养3天，收集细胞及上清。
将收集的细胞及上清接种143B细胞并进行扩增，细胞铺板同上。置于37℃二氧化碳培养箱培养3天，收集细胞及上清，得到第一轮病毒纯化样品。
3)第一轮病毒纯化样品qPCR鉴定
采用MagicPure Viral DNA/RNA Kit提取病毒DNA(全式金)，并采用荧光定量PCR方法检测痘苗病毒纯化样品中的TGF-βRII含量。
首先，加20μl Proteinase K于无菌1.5ml离心管中，加入320μl Binding Buffer。加入200μl含有病毒的液体样本涡旋混匀5秒。加入20μl磁珠悬浮液(磁珠使用前涡旋混匀)，涡旋混匀30秒。室温孵育10分钟，期间上下颠倒混匀3-5次。将离心管置于磁力架上进行磁分离，吸去磁珠以外的液体，避免吸到磁珠。
取下离心管，加入800μl Clean Buffer(使用前检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀15秒后进行磁分离，吸去磁珠以外的液体，避免吸到磁珠。
取下离心管，加入500μl Wash Buffer(使用前检查是否已加入无水乙醇)，涡旋混匀15秒后进行磁分离，吸去磁珠以外的液体，避免吸到磁珠。该步骤重复1次。
将离心管置于磁力架上，晾干磁珠至磁珠表面干裂且确保管底无液体残留。取下离心管，加入70μl RNase-free Water洗脱DNA/RNA，涡旋或吹吸混匀1分钟后置于65℃孵育5分钟，期间轻轻涡旋2-3次以悬浮磁珠。将离心管置于磁力架上进行磁珠分离，吸取磁珠以外的液体于无菌的1.5ml离心管中，避免吸到磁珠，DNA/RNA溶液置于-70℃保存。
按下表配制DNA稀释液以制备标准曲线：
管标签 稀释液 DNA拷贝数/反应
标准品 TGF-βRII供体质粒 8.44×109
SD1 5μl供体质粒+417μl去离子水 1×108
SD2 10μl SD1+90μl去离子水 1×107
SD3 10μl SD2+90μl去离子水 1×106
SD4 10μl SD3+90μl去离子水 1×105
SD5 10μl SD4+90μl去离子水 1×104
SD6 10μl SD5+90μl去离子水 1×103
SD7 10μl SD6+90μl去离子水 1×102
SD8 10μl SD7+90μl去离子水 10
在定量PCR仪(7500AD-008，配SDS软件)上使用Taqman Universal PCR MasterMix(AB)对DNA/RNA溶液进行扩增。TGF-βRII正向引物为GCGTATCGCCAGCACGAT，反向引物为TGCACCGTTGTTGTCAGTGA，探针为CCACCGCACGTTCAGAAGTCGGT。热循环条件为：反应体积20μl；标准模式；先在50℃保持2分钟而后在95℃保持10分钟以激活AmpliTaq Gold enzyme，而后进行40个循环的变性-复性：95℃变性15秒，而后60℃复性1分钟。第一轮纯化qPCR结果如下表3所示：
表3.各重组病毒株样品基因组第一轮PCR产物中的TGF-βRII水平(拷贝数/ml)
基于各毒株的TGF-βRII表达水平和噬斑大小(表征毒株增殖能力)，序号8-12因病毒噬斑小未挑斑检测，综合选取了效果较好的12个噬斑：对应于gRNA1的病毒噬斑13、14、16号，对应于gRNA2的病毒噬斑20、22、24、25、29号，以及对应于gRNA3的病毒噬斑1、2、3、43号进行第二轮病毒筛选。
4)第二轮病毒纯化样品qPCR鉴定
纯化：将如上选取的各样品稀释至10-3、10-4及10-5同第一轮操作进行纯化。
挑斑：在荧光显微镜(MF-53)下，每个噬斑样品在蓝色荧光视野下随机挑取6个阳性噬斑，共计72个。
其余实验程序同第一轮，结果得到表4所示的第二轮纯化qPCR结果。
表4.各重组病毒株样品基因组PCR第二轮产物中的TGF-βRII水平(拷贝数/ml)
从上述表3和表4结果可以看出，13号噬斑的TGF-βRII水平总体最高。
野生型病毒检测：选取对应于gRNA1的噬斑13-1、13-3、14-2、14-5、16-1、16-2，对应于gRNA2的噬斑20-1、20-3、29-2、29-3，以及对应于gRNA3的噬斑1-5、1-6、3-2、3-3、3-5、3-6，用PCR凝胶电泳方法检测野生型痘苗病毒含量。具体而言，使用PCR仪DHS-96G(AD-008)、PrimeSTAR Max Premix(2×)(TAKARA)(10μL)、TK正向引物TTGATAATCGGCCCCATGTTT(0.5μL)、TK反向引物TTTCTACACACCGATTGATACATATCAT(0.5μL)进行PCR。在PCR产物中，野生型病毒应为494bp的片段，重组病毒应为大于2000bp的片段。电泳结果显示，所有测试的16个毒株样品均不含野生型病毒，表明插入成功且产物纯度高。
基于各毒株的TGF-βRII水平和噬斑大小，再次选取了效果较好的6个噬斑：对应于gRNA1的病毒噬斑13-1、16-1，对应于gRNA2的病毒噬斑20-3、29-3，以及对应于gRNA3的病毒噬斑1-5、3-5，进行第三轮病毒筛选。
5)第三轮病毒纯化样品qPCR鉴定
纯化：将样品稀释至10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7同第一轮操作进行纯化。
挑斑：在荧光显微镜(MF-53)下，每个噬斑样品在可见光视野下随机挑取10个噬斑，共计60个。
其余实验程序同第一轮，结果得到表5所示的第二轮纯化qPCR结果。
表5.各重组病毒株基因组PCR第三轮产物中的TGF-βRII水平(单位：拷贝数/ml)
对上述噬斑样品进行野生型病毒检测，方法同上。电泳结果显示，所有测试的样品均不含野生型病毒。
从上述结果还可看出，13号重组病毒的10个平行噬斑的TGFβ-R II含量均较高，且数值之间的差异较小，说明13号重组病毒最为稳定。
实施例4.重组病毒(TT)的活性检测
在本实施例中，将上述第三轮筛选出的病毒噬斑13-1、16-1、20-3、29-3、1-5、3-5扩增后测量病毒活性，具体过程如下。
准备BS-C-1细胞1瓶(规格T175)，弃去旧培养液，用PBS溶液润洗1次(10ml/瓶)，弃去PBS溶液，再加0.25％胰酶溶液(4ml/瓶)消化2分钟。镜检观察，待细胞收缩变圆开始脱落时，即加入10％ FBS MEM培养液12ml/瓶，终止胰酶反应，轻轻吹打混匀并分别收集至离心管中。
将细胞悬液以1500rpm离心5分钟，尽量弃去管中液体，加入10mL 10％ FBS MEM培养液重悬细胞混匀。取重悬液20μl加入离心管，再加入20μl 0.2％台盼蓝混匀，在Countstar细胞计数仪上计数，将细胞稀释至1.3×105细胞s/ml。置于37℃二氧化碳培养箱培养1天。
用2％FBS MEM培养液将病毒稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。
取待测病毒样品，分别做10倍稀释至10-6和10-7，取细胞6孔板弃去培养液，每孔加入1ml配好的相应稀释度待测病毒液，每个病毒浓度做2个孔，并设立空白对照板，置于37℃、5％ CO2的二氧化碳培养箱培养2h。
配置病毒覆盖液，4.0％ FBS2×MEM、2％甲基纤维素1:1混匀。弃去病毒液，每孔加入2mL的病毒覆盖液，置于37℃、5％ CO2的二氧化碳培养箱培养48h。
弃去培养液，每孔加入0.5ml的0.1％的结晶紫溶液，室温放置5分钟。弃去结晶紫溶液，计数每孔内的噬斑数。按照等式“病毒活性＝噬斑平均数/稀释倍数”计算病毒活性，结果如下表6所示。
表6.病毒活性测定
病毒噬斑编号 病毒活性(单位：PFU/mL)
1-5 1.08×107
3-5 1.10×107
13-1 5.6×106
16-1 1.22×106
20-3 2.0×106
29-3 6.2×106
由上述结果可以看出，所选择的6个噬斑均具有较高活性。
实施例5.重组病毒(TT)的细胞杀伤活性检测
在本实施例中，将上述第三轮筛选出的病毒噬斑13-1、16-1、20-3、29-3、1-5、3-5扩增后测量细胞杀伤活性，具体过程如下。
实验细胞采用MC38(小鼠结肠癌细胞)、MCF-7(人正常乳腺上皮细胞)、MCF10A(人乳腺癌细胞)。
取细胞1瓶(规格T175)，弃去旧培养液，用PBS溶液润洗1次，再加0.25％胰酶溶液(4ml/瓶)消化，加入培养基12ml/瓶，终止胰酶反应，轻轻吹打混匀，并收集至离心管中，1500rpm离心5分钟。尽量弃去管中液体，加入培养基重悬混匀，取重悬液20μl加入离心管，再加入20μl 0.2％台盼蓝混匀，在Countstar细胞计数仪上计数。将细胞稀释至60000细胞/ml。
在96孔(8×12)板上，将细胞悬液加入设计好的样品孔中(中央的6×10个孔)，100μl/孔，并加入供试病毒株13-1、16-1、20-3、29-3、1-5、3-5以及亲本Lister毒株；再取PBS加入外周的边缘孔中(外周36个孔)，200μl/孔；轻轻混匀，将96孔板置于37℃、5％ CO2的二氧化碳培养箱孵育24小时。
病毒稀释：
MC38：起始MOI＝20，2倍稀释
MCF10A：起始MOI＝20，5倍稀释
MCF-7：起始MOI＝40，2倍稀释
在加有细胞的96孔板内，将稀释浓度的供试品100μl分别加入设计好的样品孔中并轻轻混匀，阴性对照孔加稀释培养基，100μl/孔。将96孔板置于37℃、5％ CO2的二氧化碳培养箱分别孵72小时。培养结束后，加入室温孵育的CCK-8，30μl/孔，轻轻混匀，将96孔板置于37℃、5％ CO2的二氧化碳培养箱孵育1小时进行染色。
实验结果如图2A-2C所示。从图2A和2B可以看出，13号毒株(以毒株13-1为代表)在正常细胞(MCF-10A)上杀伤活性低于其他测试毒株，与亲本Lister株相当(图2A)；而13号毒株在肿瘤细胞(MCF-7)上杀伤活性高于其他测试毒株，与亲本Lister株相当(图2B)。这说明13号重组病毒对于肿瘤细胞的亲噬性更好。另外，在小鼠癌细胞(MC38)中，本发明的各重组毒株(除20号以外)的杀伤活性没有明显差异，且杀伤活性均低于亲本Lister株(图2C)。该结果证明了重组毒株对人癌细胞具有特异性杀伤力。
实施例6.重组病毒(TT)的细胞增殖实验
在本实施例中，将上述第三轮筛选出的6个病毒噬斑的痘苗病毒稀释后侵染细胞，收集增殖复制2h起始样品和24h、48h、72h增殖复制样品，反复冻融3次，进行后续噬斑法操作。具体操作如下。
取MCF-7或MCF10A细胞1瓶(规格T175)，弃去旧培养液，用PBS溶液润洗1次，再加0.25％胰酶溶液(4ml/瓶)消化，加入培养基12ml/瓶，终止胰酶反应，轻轻吹打混匀，并收集至离心管中，1500rpm离心5分钟。尽量弃去管中液体，加入培养基重悬混匀，取重悬液20μl加入离心管，再加入20μl 0.4％台盼蓝混匀，在Countstar细胞计数仪上计数。将细胞稀释至90000细胞/ml。
将细胞悬液加入6孔细胞板中，2ml/孔，置于37℃、5％ CO2培养箱中培养1天，待细胞长满，取其中一孔用胰酶消化并计数。
取用培养液稀释病毒样品，根据上述计数结果，将病毒用2％ FBS培养基稀释至0.01MOI。
弃去6孔细胞板的培养液，将病毒稀释液分别加入6孔板中，1mL/孔，设立空白对照孔(培养液)。
增殖复制起始样品制备：感染2h后弃上清，以2％ FBS培养基收集细胞，以2％FBS培养基将终体积定为每孔2mL，保存于-70℃。增殖复制样品制备：感染2h后弃上清，以2％FBS培养基2mL分别加入相应细胞，继续于37℃、5％ CO2件下培养24h、48h、72h。直接连同培养基收集细胞，保存于-70℃。于-70℃、37℃反复冻融3次，进行后续噬斑操作。
各病毒株在MCF-10A中的增殖结果如表7和图3所示，在MCF7中的增殖结果如表8和图3所示。
表7.病毒在MCF-10A中的增殖结果
病毒编号 2h 24h 48h 72h
1-5 1.3×102 3.8×105 7.8×106 6.8×106
3-5 1.3×102 5.2×105 1.01×107 9.8×106
13-1 1.4×102 3.8×105 4.6×106 7.1×106
16-1 2.1×102 4.2×105 9.6×106 1.45×107
20-3 1.0×102 2.8×105 8.9×106 1.10×107
29-3 1.6×102 1.8×105 3.7×106 3.4×106
LISTER 1.4×102 4.7×105 1.11×107 1.72×107
表8.病毒在MCF7中的增殖结果
病毒编号 2h 24h 48h 72h
1-5 66 3×103 4.4×104 2.8×105
3-5 75 2.2×104 4.7×104 3.9×105
13-1 84 1.4×104 3.3×104 1.7×105
16-1 78 1.0×104 1.6×104 4.3×105
20-3 57 8×103 8.2×104 3.6×105
29-3 35 5×103 1.5×104 1.9×105
LISTER 41 1.1×104 1.3×105 3.8×105
由表7、表8和图3可以看出，在正常人细胞MCF-10A中，本发明中筛选出的六种毒株的增殖水平总体上与Lister株相当，其中13-1号和29-3号毒株在24小时后的增殖低于其他毒株。此外还可以看出，在人癌细胞MCF7中，本发明的各毒株的增殖水平总体上与Lister株的增殖水平相当。
实施例7.重组病毒(TT)的动物肿瘤模型研究
在本实施例中，用小鼠B细胞淋巴瘤细胞A20在BALB/c小鼠(雌性，18-20g，上海吉辉实验动物饲养有限公司)中建立皮下移植瘤模型，使用13-1号重组溶瘤病毒来研究抗肿瘤效果，其中，阳性对照为抗mPD-1抗体(810421S1)，阴性对照为溶媒。具体操作如下。
1)细胞培养：小鼠B淋巴瘤细胞A20以RPMI-1640培养基添加10％ FBS培养于含5％CO2的37℃培养箱。细胞连续培养十代之前接种于小鼠皮下。接种前用3-4％异氟烷将小鼠麻醉。将约1×106A20细胞重悬于PBS中，通过皮下注射接种于35只BALB/c小鼠，接种体积为100μL。
2)动物分组和给药方案
肿瘤生长到平均约63mm3时，将24只肿瘤大小合适的小鼠根据肿瘤大小和体重随机分成4组，每组6只。分组给药当天定义为第0天。分组情况和第一次给药方案如表9所示。
表9.分组和给药方案
3)观察与测定
每天观察每只小鼠的外观及行为，自分组开始连续观察至第26天。所有非正常的外观形态和行为活动都记录在临床观察表内。分组后每周测量肿瘤体积两次。肿瘤体积(V)的计算方法如下：V＝(长×宽2)/2。每只小鼠相对肿瘤体积(RTV)的计算方法是：RTV＝Vt/V0，其中Vt为每次的测量体积，V0为治疗开始时的体积。分组后每周测量并记录小鼠体重两次。
在实验过程中，若出现以下任何一项或多项情况时，应对动物实施安乐死：
i.单只动物荷瘤体积超过3000mm3；
ii.肿瘤发生溃疡、坏死或感染；
iii.动物出现行动异常，或瘫痪；
iv.动物体重连续三天降低超过开始药物处理时体重的20％。
实验过程中，由于单只动物肿瘤体积超过3000mm3，部分动物于第18天进行安乐死。因此数据仅分析至第18天。
4)实验结果
小鼠体重变化见图4，可以看出各组小鼠的体重变化基本一致，无显著差异。
小鼠肿瘤体积变化见图5，可以看出G4组的肿瘤体积相对于G1组显著减少(p<0.01)，而G3组(重组病毒)的效果与阳性对照G2组相当，但均优于溶媒对照组G1。
小鼠生存率变化见图6，可以看出在第21天时，G1至G4组的存活率依此为33％、67％、50％、83％；第25天时G1组小鼠全部死亡，而此时G4组的存活率保持67％，高于G2组(33％)和G3组(17％)，G4组表现出良好的抑瘤效果。
由以上实验结果可知，在本发明第一方面的构建的重组痘苗病毒毒株中，13-1号毒株的TGFβ-R II表达水平总体最高且最为稳定，且具有较高的病毒活性；此外，13-1号毒株在正常细胞上杀伤活性低最低、在肿瘤细胞上杀伤活性最高，均与亲本Lister株相当；且在正常人细胞中的增殖低于亲本Lister株。这说明13-1号重组病毒对于人肿瘤细胞的亲噬性更好。
实施例8.构建和确认TGF-βRII和GM-CSF双插入的重组病毒(TT-VG)
1)构建CRISPR Cas9质粒、三种VGF-gRNA质粒(eSpcas9-2A-Puro(PX459)v2.0)和图7所示的GM-CSF供体质粒(基于pBR322 Donor Vector)。
在本实施例中，图7中的质粒的各元件的序列如下表11所示。
2)VGF-gRNA质粒转染。准备BS-C-1细胞(ATCC，CCL-26TM)，用10％ FBS MEM培养液(Gibco，11090081)稀释至1.3*105/mL，铺于6孔板，37℃二氧化碳培养箱中培养1天。向已稀释的Lipo3000试剂中加入稀释的DNA(1:1)，室温孵育10-15分钟。6孔板中的细胞用MEM培养基冲洗两遍后加入1ml 2％ FBS MEM培养基，随后将转染体系逐滴加入6孔板中，转染6h后换成2％ FBS MEM培养基。
3)病毒感染。转染24小时后，将13-1号重组溶瘤病毒以2％FBS MEM稀释至0.1MOI，37℃孵育2h。
4)GM-CSF供体质粒转染。病毒感染2h后转染供体质粒，操作方法同VGF-gRNA质粒转染，6小时后，换成2％ FBS MEM培养基。37℃孵育72h，观察荧光后收取细胞及上清，反复冻融3次。
5)病毒纯化。准备BS-C-1细胞，用10％ FBS MEM培养液稀释至1.3*105/mL，铺于6孔板，37℃二氧化碳培养箱培养1天。取转染收集样品用2％ FBS MEM稀释至1/5*10-3，每孔加入1ml稀释好的待测病毒液，使每孔病毒斑约为40-80个/孔，置于37℃、5％ CO2的培养箱中培养2h。
配置病毒覆盖液：2％低熔点琼脂糖(70℃，1h融化)与2×4％ FBS MEM培养液1:1混匀。弃去病毒液，每孔加入2mL的病毒覆盖液，待完全凝固后，翻转培养板，置于37℃、5％CO2的培养箱培养3天。
6)病毒挑斑及扩增。准备BS-C-1细胞，用10％ FBS MEM培养液稀释至1.3*105/mL，铺于6孔板，37℃二氧化碳培养箱培养1天。在倒置荧光显微镜下用无菌枪头挑取红绿双色的阳性病毒噬斑即为基因编辑成功的新毒株。在含有200μl 2％FBS MEM的离心管中反复吹打6次，将其加入6孔板中。置于37℃二氧化碳培养箱培养3天，收集细胞及上清。
反复重复纯化及扩增操作3-5次，使红绿双色的阳性病毒占比达到将近100％(见图9)。
此外，取适量的病毒的液体样本，使用基因组抽提试剂盒，获取病毒基因组，在TK或VGF上设计引物(引物如下表所示)进行PCR测定。
将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳成像(图8)和测序。TK敲入(KI)后条带大小为3189bp，WT TK条带大小为474bp；VGF敲入(KI)后条带大小为2226bp，WT VGF条带大小为291bp。经三轮纯化后，所得病毒仅有KI条带而无WT条带(见图8)，表明新毒株已完成纯化。由此确定获得了在DNA水平上插入了TGF-βRII和CM-CSF基因的双插入型重组病毒，其基因型为TK-/--EGFP-TGFβRII+VGF-/--RFP-GM-CSF痘苗病毒(在此简称为TT-VG)。
实施例9.ELISA检测TT-VG病毒的GM-CSF活性
准备BS-C-1细胞，用10％ FBS MEM培养液稀释至1.3*105/mL，铺于6孔板，37℃二氧化碳培养箱培养1天。将实施例8中纯化得到的TT-VG株及亲本Lister株病毒(无TGF-βRII插入、无GM-CSF插入)稀释至0.1MOI，感染BS-C1细胞24h、48h、72h及96h后，收集细胞上清，使用Human GM-CSF ELISA检测试剂盒检测GM-CSF活性。
结果发现，随着痘苗病毒TT-VG感染细胞的时间的增长，GM-CSF表达量逐渐增高，在感染后96h达到最高，而亲本Lister病毒由于未插入GM-CSF，故其表达在较低水平，且不随感染时间的增长而增加(见图10)。进一步在蛋白表达水平确定了GM-CSF的成功插入。
实施例10.TT-VG病毒的杀伤力
准备HUVEC细胞(人脐静脉内皮细胞，正常细胞)，用10％ FBS ECM培养液稀释至5*104/mL，每孔100μl铺于白板96孔板中，37中二氧化碳培养箱培养1天。
准备HepG2细胞(肝癌细胞)，用10％ FBS MEM培养液稀释至1*105/mL，每孔100μl铺于白板96孔板中，37℃二氧化碳培养箱培养1天。
分别用2％FBS ECM和2％FBS MEM培养液将实施例8中纯化得到的TT-VG株及亲本Lister株病毒(无TGF-βRII插入且无GM-CSF插入)稀释至10MOI，进行三倍梯度稀释，共计九个稀释梯度，体积为100μl/孔，进行两个技术重复。边缘孔加入PBS，200μl/孔；37/二氧化碳培养箱培养3天。加入Cell titer Glo染色液，50μL/孔，轻轻混匀，孵育10分钟。酶标仪上读取萤光素酶相对光单位(RLU)数值，利用SoftMax软件分析数据，选用四参数方程回归模型，拟合剂量效应曲线。
结果发现，在痘苗病毒基因组上敲除TK和VGF两个基因同时分别插入TGF-βRII和CM-CSF基因后，在0.37MOI感染HUVEC细胞时，TT-VG RLU读值是Lister的2.94倍(见图11A)。在相同MOI下，RLU读值越高，细胞活性越好，病毒对细胞的杀伤力越弱。这表明在HUVEC正常细胞中，TT-VG株的杀伤能力明显下降。在hepG2肝癌细胞中，TT-VG株与野生型Lister的杀伤能力基本一致，无明显差异(见图11B)，表明敲除TK和VGF并未降低痘苗病毒对癌细胞的杀伤能力。以上结果表明本发明的TT-VG痘苗病毒对正常细胞的杀伤能力减弱，而对癌细胞的杀伤能力没有减弱，体现了TT-VG的改进的选择性杀伤性。
实施例11.重组痘苗病毒(TT-VG)增殖能力的鉴定
为了确定本发明的重组痘苗病毒的毒力是否减弱，通过鉴定病毒增殖能力来进行判断和评估。将亲本Lister株病毒(无TGF-βRII插入且无GM-CSF插入)和实施例8中纯化得到的TT-VG株分别以0.1MOI的滴度感染BS-C1细胞，扩增72h后，获得病毒液。稀释病毒液，通过检测扩增后噬菌斑的数量，即可计算得到扩增后病毒滴度。通过滴度的高低，即可判断病毒的增殖能力。亲本Lister株扩增后的滴度为5.85×107PFU，TT-VG株扩增后的滴度为5.45×106PFU(见下表10)。
通过病毒增殖能力检测，发现野生型痘苗病毒Lister株的增殖能力为TT-VG的10.7倍。表明基因编辑后的TT-VG病毒的扩增能力变弱，毒力减弱。
表10
上述实施例中所用的序列的说明如下。
表11
本说明书已对具体实施方式进行了详细描述，本领域技术人员应认识到，上述实施方式仅是示例性的，不能理解为对本发明的限制，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，对本发明进行若干改进和修饰后得到的技术方案也落在本发明的范围内。

Claims (12)

1.一种重组痘苗病毒，其通过在Lister痘苗病毒毒株的胸苷激酶(TK)基因中插入TGF-βRII基因片段、并在痘苗病毒生长因子(VGF)基因中插入GM-CSF基因而获得，
其中，所述插入使得所述胸苷激酶(TK)基因和所述痘苗病毒生长因子(VGF)基因均失活，
其中，所述TGF-βRII基因片段包含编码TGF-βRII的TGF-β结合结构域的序列。
2.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中，所述TGF-βRII基因片段通过CRISPR-Cas9技术插入所述胸苷激酶(TK)基因中，并且其中使用的gRNA的序列选自SEQ ID No:1、SEQ IDNo:2和SEQ ID No:3，优选为SEQ ID No:1。
3.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中，所述TGF-βRII基因片段的序列是SEQ IDNo:4或者是编码SEQ ID No:10的核酸序列。
4.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中，所述Lister痘苗病毒毒株的基因组序列如Genbank KX061501.1所示。
5.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中，所述重组痘苗病毒通过在于2022年9月14日保藏于中国典型培养物保藏中心、保藏号为CCTCC No:V202270的病毒的痘苗病毒生长因子(VGF)基因中插入GM-CSF基因而获得。
6.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中，所述重组痘苗病毒于2023年6月26日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC No:V202347。
7.如权利要求1所述的重组痘苗病毒，其中，所述GM-CSF基因通过CRISPR-Cas9技术插入所述痘苗病毒生长因子(VGF)基因中，并且其中使用的gRNA的序列选自SEQ ID No:11、SEQ ID No:12和SEQ ID No:13。
8.如权利要求1至7中任一项所述的重组痘苗病毒，其中，所述GM-CSF基因的序列为SEQID No:14。
9.权利要求1至8中任一项所述的重组痘苗病毒在制备治疗人类癌症的药物中的应用。
10.一种用于治疗人类癌症的药物组合物，其包含权利要求1至8中任一项所述的重组痘苗病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
11.如权利要求9所述的应用或权利要求10所述的药物组合物，其中，所述人类癌症选自人肝癌、人乳腺癌、人淋巴瘤、人胰腺癌、人结肠癌、人头颈部鳞状细胞癌、人舌鳞状细胞癌、人咽鳞状细胞癌、人胃癌和人卵巢癌。
12.如权利要求9所述的应用或权利要求10所述的药物组合物，其中，所述药物或所述药物组合物还包含免疫检查点抑制剂，例如抗PD-1抗体、抗PD-L1抗体、抗CTLA-4抗体或抗LAG-3抗体。
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