CN103038269A - 用于制备可降解聚合物网络的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及用于制备可降解聚合物网络的方法。用于制备可降解聚合物网络的方法包括:a)在20℃至200℃之间的温度下制备聚合物组合物,其包含环状碳酸酯的单体和/或环状酯的单体和/或直链碳酸酯的单体和/或直链酯的单体和/或环醚的单体和/或直链羟基羧酸的单体;b)添加交联剂,其包含至少一个C-C双键或C-C三键,和/或交联自由基引发剂;c)将聚合物组合物(其包含交联剂)加工成所期望的形状;d)通过照射混合物进行交联。另外,本发明涉及可降解聚合物网络。此外,本发明涉及可降解聚合物网络的应用。
Description
技术领域
本发明涉及用于制备可降解聚合物网络的方法。另外,本发明涉及可降解聚合物网络。此外,本发明涉及可降解聚合物网络的应用。
背景技术
组织工程的多学科领域的发展已产生一组新的组织替代部件和实施策略。在生物材料、干细胞、生长和分化因子、以及仿生环境方面的科学进步已产生在实验室中通过工程化细胞外基质(“支架”)、细胞、和生物活性分子的组合用于制造组织的独特机会。因此,在组织工程中,这些支架材料的物理、化学和生物性能是非常重要的。其上培养细胞的基质的刚性会影响细胞行为。在软组织工程中,支架将机械刺激传递给细胞和组织,并经受体内重复的动态负载。而且在体外,这可能是需要的,因为在细胞培养期间细胞接种的组织工程支架的机械刺激会增强工程化组织的发育以及它们的功能。在此方面,允许细胞粘附和增殖的柔性的和非柔性的、形状稳定的和可再吸收弹性的或非弹性的聚合物网络是特别令人感兴趣的,包括无定形和半晶体聚合物材料。具有这些性能的交联聚合物材料是本发明的目的。
聚(碳酸三亚甲基酯)(PTMC)是生物相容的和可生物降解的聚合物,其具有大约-17℃的玻璃化转变温度(Tg)。可以通过在惰性气氛中照射来交联这种无定形和柔性聚合物以形成抗蠕变的和形状稳定的网络。这类弹性聚合物尤其用作软组织工程的支架材料或用作控制释放系统的长效制剂、或用于设计植入物,如抗黏附膜或血管修复术。抗蠕变性和形状稳定性是所期望的性能。在体内,通过表面侵蚀,PTMC较快地降解,而没有释放酸性降解产物。为了扩大这种聚合物的适用性,需要开发具有可调节的较低侵蚀速率的基于碳酸三亚甲基酯(TMC)的材料。
聚(D,L-丙交酯)(PDLLA)是生物相容的和可生物降解的聚合物,其用于可吸收缝线、受控药物释放系统、和组织工程支架的制备。PDLLA是玻璃状的、非晶体脂肪族聚酯,其通过体内本体水解而降解。当照射时,观测到PDLLA分子量降低。(D,L)-丙交酯是可以用来制备PDLLA的单体。
TMC和DLLA的共聚物呈现介于PTMC和PDLLA之间的中间物理性能:取决于共聚物的组成,可以调节玻璃化转变温度、弹性模量值、拉伸强度和降解速率。这使得这些聚合物适用于许多生物医学应用。然而,在体温下,玻璃化转变温度低于生理温度的无定形未交联共聚物具有较差的形状稳定性。因此,在交联以后,高压灭菌可以用作由这些共聚物制备的医疗器械的灭菌方法。
聚己内酯(PCL)是具有约60℃的低熔点和约-60℃的玻璃化转变温度的可生物降解聚酯。这种聚合物经常用作树脂添加剂用来改善它们的加工特性和它们的最终使用性能(例如,耐冲击性)。
聚(L-丙交酯)(PLLA)是源自可再生资源(如玉米淀粉或甘蔗)的可生物降解的、热塑性的、脂肪族聚酯。PLLA是源于L,L-丙交酯(也称为L-丙交酯)聚合反应的产物。PLLA具有50-80℃的玻璃化转变温度和170-200℃的熔化温度。PLLA目前用于多种生物医学应用,如缝线、支架,透析介质和药物递送装置。它还被评价为组织工程的材料。PLLA和PDLLA已被用作用于形成聚合物囊泡的小泡膜的两亲性合成嵌段共聚物的疏水性嵌段。PLLA和PDLLA是石化衍生产物的可持续的替代物,因为由其最终产生它们的丙交酯可以源自农业副产物(如玉米淀粉)或其他富含碳水化合物的物质(如玉米、糖或小麦)的发酵。
聚乙二醇(PEG)是具有从工业制造到医药的许多应用的聚醚化合物。它也称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)。PEG、PEO或POE是指环氧乙烷的低聚物或聚合物。通过环氧乙烷与水、乙二醇或乙二醇低聚物的相互作用来产生聚乙二醇。上述反应是通过酸性或碱性催化剂来催化的。它是多种轻泻药(例如,包含聚乙二醇的产品)和许多护肤霜的基础。
可以对PTMC、无定形和半晶体聚(丙交酯)、PCL和PEO聚合物(当它们交联时)进行高压灭菌的灭菌。对于基于它们各自单体的共聚物情况也是如此。
已知高能辐射通过形成自由基、离子、或可以使聚合物交联的激发态引起聚合物结构的化学变化。当照射时,对于一些聚合物,交联占优势,而对于其他聚合物,则断链是主要的。对于生物医学应用而言,γ照射和电子束照射已广泛用于改变聚合物生物材料的表面或本体性能以及用来以低成本方式对它们进行灭菌。
γ照射是用于对(聚合物)生物材料灭菌的广泛使用的低成本方法。高能γ射线可以引发自由基反应或离子反应,导致所灭菌材料的表面性能和本体性能的改变。对于一些聚合物,在γ照射期间观测到交联,而对于其他聚合物,照射则导致断链或解链反应和分子量的降低。这些降低的分子量可以限制可吸收的聚合物植入物(如组织工程支架、骨折固定装置或缝合线)的使用寿命(由于机械强度的迅速降低和装置的解体)。而且当植入由可生物降解聚合物制备的药物释放基质时,分子量的降低可以导致早期发生质量损失并影响药物释放特性。γ照射显著改善PTMC的抗蠕变性和形状稳定性。通过γ照射通过增加PTMC的交联效率,可以防止照射对网络拉伸性能的不利影响。获得的较高的凝胶含量和网络密度将进一步改善抗蠕变性并且还减慢降解和侵蚀。降解是通过聚合物骨架中的键断裂导致的聚合物断链过程。这导致聚合物链长度减小。侵蚀是聚合物基体的质量损失,这可能是由于单体、低聚物、聚合物链或其部分的丧失。侵蚀可以是生物、化学或物理作用的结果。因此,应当清楚的是聚合物降解是聚合物侵蚀过程的一部分。
另一种类型的聚合和交联是令人感兴趣的:由可降解低聚物制备的大分子单体的游离基聚合和交联。两种过程均已用来在环境温度下有效地制备可吸收性聚合物网络。
在现有技术中不断地需要进一步开发用于制备生物相容的和可降解的聚合物网络的方法。
发明内容
本发明的一个目标是(除其他以外)提供具有无定形结构和低玻璃化转变温度的柔性的、生物相容的和可降解的聚合物网络,具体地,具有低玻璃化转变温度和可调节降解性能的形状稳定的和抗蠕变材料的可降解聚合物网络。本发明的目的还在于制备具有不同柔韧性、不同弹性模量值以及增加的形状稳定性的聚合物网络,并且允许制备适合通过高压灭菌或热处理来灭菌的材料。
按照本发明,通过包括以下各项的用于制备可降解聚合物网络的方法来实现此目标(除其他以外):a)在20℃至200℃的温度下制备包括以下单体的聚合物组合物:环状碳酸酯和/或环状酯和/或直链碳酸酯和/或直链酯和/或环醚和/或直链羟基羧酸;b)添加交联剂,其包含至少一个C-C双键或C-C三键和/或交联自由基引发剂;c)将聚合物组合物(其包含交联剂)加工成所期望的形状;d)通过照射混合物进行交联。
聚合物网络是具有将一个聚合物链连接到另一个聚合物链上的键的聚合物。它们可以是共价键或离子键。术语“交联聚合物”还可以用于聚合物网络。聚合物是由通常通过共价化学键连接的重复结构单元组成的大分子(也称为高分子)。由其制备聚合物的化合物称为单体。
单体是一种或多种、两种或更多种、三种或更多种环状碳酸酯和/或环状酯和/或环醚和/或直链碳酸酯和/或直链酯和/或直链羟基羧酸。
碳酸酯是在碳氢化合物中具有至少一个碳酸酯基-O-C(=O)-O-(如一个碳酸酯基、两个碳酸酯基、三个碳酸酯基)的碳氢化合物。
酯是在碳氢化合物中具有至少一个酯基-COO-(如一个酯基、两个酯基、或三个酯基)的碳氢化合物。
羟基羧酸是具有包含第二有机基团羟基(-OH)的羧酸(有机官能团-COOH)的碳氢化合物。
环状分子具有环结构,如芳基、或芳环。直链分子是烃链,如烷烃。
可以在步骤a)中在惰性气氛下通过单体或单体混合物的反应来制备本发明的聚合物组合物。它可以是氮气、氩气或真空。在机械搅拌下进行反应直至均质化。搅拌直至均质化是搅拌直到形成对于肉眼观察而言均匀的混合物。可以通过任何其他类型的搅拌或混合来进行搅拌。
按照本发明的可降解聚合物是可吸收的聚合物和/或可生物降解的聚合物。本发明的聚合物网络可以是无定形、半晶体或晶体。
交联剂可以是交联剂或交联助剂。当它仅有助于形成更好的聚合物网络(在没有该试剂的情况下也形成网络)时,该试剂是交联助剂。仅当试剂存在时才形成网络,该试剂是交联剂。更好的网络可以是具有更高凝胶含量的网络、更加抗蠕变的网络、或更有弹性的网络。
交联剂包含至少一个C-C双键或C-C三键,如一个以上、两个以上、三个以上、四个以上C-C双键或C-C三键。C-C双键或C-C三键还分别称为sp2-sp2碳-碳键或sp-sp碳-碳键。C-C键应当理解为碳-碳键。
本发明的材料的交联可以在高温下(如通过高压灭菌或热处理)对由可降解聚合物网络制造或用其涂覆的装置进行灭菌。
自由基引发剂是在一些条件下(如暴露于照射、光、温度变动、或电化学反应)可以产生自由基物质的化学物质。具体类型的自由基引发剂可以是光引发剂、热引发剂或氧化还原引发剂。它们分别是当暴露于光、温度变化或暴露于电化学反应时产生自由基物质的化学物质。
照射是将物品暴露于辐射的过程。辐射通常可以是电离辐射,如电子束处理、X射线或γ射线,但此术语也应用于非电离辐射如在可见光、紫外线或红外光谱区中的光辐射,或微波。如果在适当水平下给予,则所有这些形式的辐射可以用来对物体灭菌,即它是用于生产医疗器械和一次性用品(如注射器),以及用于对食物消毒和灭菌的技术。
在步骤a)中的温度范围是20℃至200℃之间,如20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃、100℃、105℃、110℃、115℃、120℃、125℃、130℃、135℃、140℃、145℃、150℃、155℃、160℃、165℃、170℃、175℃、180℃、185℃、190℃、195℃、200℃,优选100℃至200℃。
交联剂是帮助形成聚合物网络的化合物。它们产生将一个聚合物链连接到另一个聚合物链上的键。它们可以是共价键。当通常是指使用交联来促进聚合物的物理性能的差异时,使用术语“交联”。
按照本发明,交联剂选自由以下组成的组:丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、多丙烯酸酯、多甲基丙烯酸酯、延胡索酸酯、多延胡索酸酯、马来酸酯、多马来酸酯、马来酸酐、衣康酸酯或多衣康酸酯。丙烯酸酯和多丙烯酸酯分别包含一个、和数个丙烯酸酯单元。丙烯酸酯单元包含一个乙烯基和一个酯基。它也称为丙烯酸酯(propenoate)并具有化学式C3H3O2。甲基丙烯酸盐/酯(CH2=CMeCOO-)是甲基丙烯酸的盐或酯。甲基丙烯酸酯包含甲基-乙烯基,即,彼此双键键合的两个碳原子直接连接于羰基碳上,并且其中用非末端甲基取代乙烯基。多甲基丙烯酸酯化合物包含数个甲基丙烯酸酯基。延胡索酸酯具有通式(O2CCH=CHCO2)并且可以用烷基或酰基来取代。多延胡索酸酯包含数个延胡索酸酯基。马来酸酯是相应延胡索酸酯的顺式异构体。多马来酸酯包含数个马来酸酯基。马来酸酐(也称为顺式丁烯二酸酐或马来酸酐(toxilic anhydride)或二氢-2,5-二氧呋喃)是化学式为C2H2(CO)2O的有机化合物。衣康酸酯是衣康酸的酯。衣康酸或亚甲基丁二酸是无毒的,并且易于生物降解。衣康酸酯还称作2-亚甲基丁二酸酯并且包含两个酯(-COO-)和sp2(C-C双键)甲基取代(在位置2处)。多衣康酸酯包含数个衣康酸酯基。
按照本发明,交联剂选自由以下组成的组:丙烯酸酯官能化的聚(碳酸三亚甲基酯)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(碳酸三亚甲基酯)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(碳酸三亚甲基酯)类低聚物、丙烯酸酯官能化的聚(D,L-丙交酯)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(D,L-丙交酯)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(D,L-丙交酯)类低聚物、丙烯酸酯官能化的聚(L-丙交酯)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(L-丙交酯)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(L-丙交酯)类低聚物、丙烯酸酯官能化的聚(ε-己内酯)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(ε-己内酯)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(ε-己内酯)类低聚物、丙烯酸酯官能化的聚(乙二醇)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(乙二醇)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(乙二醇)类低聚物、二丙烯酸亚乙酯、二丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸四乙二醇酯、二丙烯酸聚乙二醇酯、三丙烯酸三羟甲基丙烷酯、三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯、三丙烯酸季戊四醇酯、四丙烯酸季戊四醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸四乙二醇酯、二甲基丙烯酸聚乙二醇酯以及它们的衍生物。
甲基丙烯酸甲酯(MMA)是2-甲基丙-2-烯酸甲酯并具有线型化学式C5H8O2。二丙烯酸亚乙酯具有化学式C8H10O4。三丙烯酸季戊四醇酯(PETA)也称为2-丙烯酸2-(羟甲基)-2-[[(1-氧代-2-丙烯基)氧基]甲基]-1,3-丙二基酯并具有线型化学式(H2C=CHCO2CH2)3CCH2OH。照射包含作为交联剂的三丙烯酸季戊四醇酯的PTMC薄膜使得以这种方式形成的PTMC网络不仅具有非常高的凝胶含量,而且具有极好的弹性体性能:在拉伸试验中,试样显示低模量值、和高断裂强度和断裂伸长。当循环加载时,永久变形非常低。另外,以这种方式进行的交联还导致网络的酶侵蚀速率降低。三丙烯酸三羟甲基丙烷酯(TMPTA)具有线型化学式(H2C=CHCO2CH2)3CC2H5。三甲基丙烯酸三羟甲基丙烷酯具有线型化学式[H2C=C(CH3)CO2CH2]3CC2H5。四丙烯酸季戊四醇酯具有化学式(H2C=CHCO2CH2)4C。二甲基丙烯酸乙二醇酯具有化学式C10H14O4,也命名为CH2=C(CH3)C(O)OCH2CH2OC(O)C(CH3)=CH2,而二甲基丙烯酸四乙二醇酯具有化学式C14H22O6。聚乙二醇是环氧乙烷和水的缩聚物,通式为H(OCH2CH2)nOH,其中n是重复的氧化乙烯基的平均数。
它们的衍生物是指由任何有机基团和/或烷基、链烯基、炔基、芳基取代的上述交联剂。
在一种最优选的实施方式中,步骤b)包含按聚合物组合物的总重量的重量百分比计,0.01至15wt%,优选0.1%wt至10%wt,更优选0.5%wt至8%wt,最优选1%wt至5%wt的交联剂。
按照本发明的方法,在步骤a)中的单体获自选自下组的环状碳酸酯:碳酸三亚甲基酯、碳酸亚乙酯、二乙二醇双烯丙基碳酸酯、和它们的衍生物。碳酸三亚甲基酯称为1,3-二氧杂环己烷-2-酮(1,3-二噁烷-2-酮,1,3-dioxan-2-one)并具有化学式C4H6O3。化学式为C3H4O3的碳酸亚乙酯称为1,3-二氧杂环戊烷-2-酮(1,3-dioxolan-2-one)。二乙二醇双烯丙基碳酸酯具有化学式C12H18O7。
按照本发明的方法,在步骤a)中的单体获自选自下组的环状酯:L-丙交酯、D-丙交酯、D,L-丙交酯、ε-己内酯、二噁烷酮、聚乙二醇、乙交酯、和它们的衍生物。L-丙交酯是左旋丙交酯对映体,D-丙交酯是右旋对映体并且D,L-丙交酯是外消旋混合物。ε-己内酯或简称己内酯是环状酯(内酯家族的一个成员),具有七元环,具有化学式(CH2)5CO2。二噁烷酮是二噁烷衍生物(羰基代替亚甲基)并具有化学式C4H6O3。乙交酯,1,4-二噁烷-2,5-二酮,具有化学式C4H4O4。
按照本发明的方法,在步骤a)中的单体获自选自下组的直链碳酸酯:碳酸二乙酯或碳酸二苯酯。碳酸二乙酯具有化学式C5H10O3并且碳酸二苯酯具有化学式C13H10O3。
按照本发明的方法,在步骤a)中的单体获自选自下组的直链酯:富马酸单乙酯、富马酸二乙酯、对苯二甲酸二甲酯、对苯二甲酸二乙酯。富马酸单乙酯还称作(E)-丁烯二酸二甲酯并具有化学式C6H8O4。富马酸二乙酯还称作(E)-2-丁烯二酸二乙酯并具有化学式C8H12O4。对苯二甲酸二甲酯和对苯二甲酸二乙酯分别具有化学式C12H14O4。
按照本发明的方法,在步骤a)中的单体获自选自下组的直链醚:聚乙二醇和它的衍生物。聚乙二醇(PEG)还被称为聚环氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE),是指环氧乙烷的低聚物或聚合物。
它们的衍生物是指在任何位置由烷基、链烯基、炔基、酰基、环烷基、环炔基取代的单体。取代基可以携带有机基团。
具有低玻璃化转变温(Tg)的可吸收聚合物网络和无定形低聚物可以基于碳酸三亚甲基酯(TMC)、D,L-丙交酯(DLLA)、和ε-己内酯(CL)单体以及聚(癸二酸甘油酯),并已由数个组发展并且显示弹性体性能。在存在光引发剂下当UV照射时,或通过游离基聚合的热或氧化还原引发,具有(甲基)丙烯酸酯基或延胡索酸酯基的这些相对低分子量聚合物的末端官能化可以形成网络。以这种方式获得的柔性网络的最终拉伸强度和断裂伸长值随着大分子单体分子量和交联之间的分子量的增加而显著增加。
按照本发明的方法,在步骤a)中的聚合物组合物包含按总共聚物的摩尔百分比计,40%摩尔至85%摩尔,优选50%摩尔至70%摩尔,更优选60%摩尔至70%摩尔的环状或直链碳酸酯单体含量。碳酸酯可以是碳酸三亚甲基酯。
按照本发明的方法,交联自由基引发剂选自下组:光引发剂、热引发剂、氧化还原引发剂。自由基引发剂可以是任何可商购引发剂。
在本发明的一种更优选的实施方式中,这些方法包括在步骤b)中,按聚合物组合物的总重量的重量百分比计,0.001%wt至0.1%wt,优选0.005%wt至0.075%wt,更优选0.01%wt至0.05%wt,最优选0.025%wt的自由基引发剂。
在本发明的又另一种优选的实施方式中,步骤b)包含溶剂,该溶剂是丙酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、碳酸亚乙酯、碳酸亚丙酯、二甲基亚砜、甲苯、苯、四氢呋喃或1,4-二噁烷。丙酮具有化学式CH3COCH3,二氯甲烷具有化学式CH2Cl2,氯仿具有化学式CHCl3,四氯化碳具有化学式CCl4。碳酸亚乙酯和碳酸亚丙酯分别是乙二醇或丙二醇和碳酸的酯。它们具有化学式C3H4O3和C4H6O3。二甲基亚砜(DMSO)是化学式为(CH3)2SO的有机硫化合物。苯和甲苯是化学式分别为C6H6和C7H8的芳烃。四氢呋喃(THF)具有化学式C4H8O。1,4-二噁烷具有化学式C4H8O2。
按照本发明的方法,在步骤d)中的照射是紫外线、可见光、红外、微波、或γ照射。紫外线照射具有1至400nm的波长,可见光照射具有400至800nm的波长,并且红外照射具有0.8μm至300μm的波长。微波照射具有300MHz(0.3GHz)至300GHz的频率。
在本发明的一种优选实施方式中,γ照射包括10至150kGy,优选20至120kGy,更优选25至100kGy的辐射。KGy是指千戈瑞(辐射的测量单位)。辐射源可以是钴60、或任何其他γ源。
按照本发明的方法,在步骤c)中的聚合物组合物的所期望的形状是在20℃至200℃,优选100℃至180℃,更优选130℃至150℃,最优选140℃的温度下,通过压缩模制、挤出、注射模制或铸造(铸膜,casting)来获得。可以通过压缩模制来获得聚合物薄膜,上述压缩模制是一种模塑方法,其中首先将通常预热的模制材料放入开放的、加热的模腔中。通过顶柱塞或塞构件来闭合模具,施加压力以迫使材料接触所有模具区,同时保持加热和加压直到模制材料固化。挤出是一种方法,其用来产生具有固定横截面形状的物体。将材料推动或拉动通过具有所期望的横截面的模具。相对于其他制造过程,这种过程的两个主要优点是它能够产生非常复杂的横截面和加工脆性材料,这是因为材料仅受到压缩和剪切应力。它还形成具有极好表面光洁度的成品部件。注射模制是用于生产聚合物材料部件的制造过程。将材料送入加热机筒中,混合,并迫使进入模腔,在此它冷却并且硬化成模腔的形状。在设计产品以后,通常用钢或铝来制造模具并加以精密机械加工以形成所期望部件的特点。注射模制广泛用于制造各种各样的部件。铸造(铸膜)可以是通过溶剂浇注。溶剂浇注是通过以下步骤用于形成热塑性物品的过程:将阳模浸渍到树脂的溶液或分散液中并抽走溶剂以留下附着于模具上的一层塑料薄膜。
按照本发明的方法,在步骤c)中聚合物组合物的所期望的形状是薄膜,该薄膜具有1μm至1000μm的厚度,优选10μm至750μm,更优选50μm至600μm。
在一种优选实施方式中,聚合物组合物的制备包括开环聚合和/或缩聚。
开环聚合是加成聚合的一种形式,其中聚合物的末端作为反应中心,其中通过增长,另外的环状单体进行连接以形成更大的聚合物链。用引发剂和催化剂对一些环状化合物的处理造成环的裂解,接着聚合,以产生低聚物或聚合物。通常在惰性条件下(氩气、氮气或真空)以及在加热条件下进行反应。
缩聚是一种化学缩合,通过连接单体分子并释放小分子(如水)导致聚合物的形成。
在一种更优选的实施方式中,在本发明的方法中聚合物组合物的制备是在100℃至160℃的温度下进行,更优选120℃至150℃。
按照另一个方面,可以通过本发明的方法来获得可降解聚合物网络。
按照本发明的又一个方面,可降解聚合物网络用于涂覆表面,作为用于热绝缘和/或用于抗氧化绝缘的保护层,用于包装材料的制造。
按照本发明的又一个方面,可降解聚合物网络用于制备组织工程、细胞培养、或药物递送中的植入物。
通过附图和实施例来进一步描述本发明。附图和实施例用来说明本发明而并不旨在限制它的范围。
附图说明
附图
在实施例中,参照附图,其中:
图1.初始聚合物分子量和照射剂量对在真空中通过γ照射交联的PTMC薄膜的凝胶含量(A)以及在氯仿中的溶胀比(B)的影响。
图2.用于通过γ-照射不同初始分子量的PTMC薄膜所制备的网络的Charlesby-Pinner图(A),以及初始聚合物分子量对断链的辐射化学产率相对于交联的比率((G(s)/G(x))以及对可以获得的最大凝胶百分比(1-s)max)的影响(B)。
图3.加入PETA对在25kGy下当照射不同初始分子量的PTMC聚合物时形成的PTMC网络的凝胶含量(A)以及在氯仿中的平衡溶胀比(B)的影响。
图4.初始分子量、照射剂量、和PETA含量对PTMC薄膜的弹性模量(A)、屈服强度(B)、断裂应力(C)、和永久变形(D)值的影响。
图5.γ照射、PETA含量、和乙醇提取对PTMC88(A)和PTMC443(B)的应力-应变行为的影响(为了清楚起见,将曲线偏移)。
图6.在直接或间接接触PTMC网络下培养的成纤维细胞的存活率。在存在5wt%PETA下通过照射不同分子量的PTMC薄膜来制备网络。开始的两个条棒分别表示空白(仅培养基)和阳性对照的细胞存活率。
图7.在存在(5wt%)和不存在PETA下γ照射的PTMC443薄膜在胆固醇酯酶(CE)水溶液中的侵蚀。该图显示随时间推移的相对厚度(A)和相对质量(B)以及相对厚度和相对质量之间的关系(C)。
图8.共聚物组成和加入PETA对通过γ照射(25kGy)P(TMC-DLLA)共聚物薄膜所形成的网络的凝胶含量(A)和溶胀比(B)的影响。
图9.在直接或间接接触未提取的共聚物网络下培养的成纤维细胞的存活率。在25kGy下在存在5wt%PETA下通过照射共聚物薄膜来制备网络。开始的两个条棒分别表示空白(仅培养基,阴性对照)和阳性对照的细胞存活率。
图10.SEM显微照片,显示了在培养15天以后,未照射的P(TMC-DLLA)共聚物薄膜(A、C、E、G、I)和通过γ照射包含5%PETA的共聚物薄膜所制备的未提取网络薄膜(B、D、F、H、J)的巨噬细胞介导的侵蚀。
图11.在培养14天以后,在不同的未照射的P(TMC-DLLA)共聚物薄膜上(A),以及在通过γ照射包含5%PETA的共聚物薄膜所制备的未提取网络薄膜上(B),巨噬细胞的密度。
图12.UV照射时间和初始聚合物分子量对PTMC均聚物薄膜的凝胶含量(A)和在氯仿中的溶胀比(B)的影响,所述PTMC均聚物薄膜包含5wt%PETA和0.025wt%光引发剂并且暴露于254nm UV光。值表示为平均值±标准偏差,(n=3)。
图13.在循环拉伸试验中光致交联对PTMC聚合物和网络的滞后行为的影响。曲线显示在(PTMCx)以前以及在光致交联以后(在存在PETA和光引发剂下UV曝光(A、B、C)300分钟),重复(20个循环)施加50%应变于不同分子量的PTMC均聚物上。图D显示在动态负载下光致交联掺合物的行为。
图14.光致交联以及与嵌段共聚物掺合对基于PTMC373的网络的体外酶侵蚀作用的影响:随时间推移相对质量降低(A),以及随时间推移相对厚度减小(B)。
图15.由PTMC373制备的光致交联多孔支架的SEM显微照片。A和B显示支架的顶视图。纤维的微孔性示于C中。支架的横截面示于D中。
图16.显微照片,显示了在细胞接种以后(A、D、G)、以及在hMSC培养5天(B、E、H)和10天(C、F、I)以后,在由PTMC373(A、B、C)、PTMC373/PTMC-PCL-PTMC(D、E、F)、PTMC373/mPEG-PTMC(G、H、I)制备的3D制造的和光致交联的支架之上/之中的活细胞。每个支架的横截面示于插图中。
图17.SEM显微照片,显示了在hMSC培养5天(A、D、G)和10天(顶视图B、E、H,横截面C、F、I)以后,在由PTMC373(A、B、C)、PTMC373/PTMC-PCL-PTMC(D、E、F)、PTMC373/mPEG-PTMC(G、H、I)制备的3D制造的和光致交联的支架之上/之中的hMSC。
图18.在3D制造的和光致交联的PTMC类支架中培养的hMSC的葡萄糖消耗和乳酸生产。
图19.合成的双臂PTMC大分子单体(DMAC)(A)、三臂PTMC大分子单体(TMAC)(B)、和直链PTMC聚合物(C)的化学结构。
图21.所使用的照射时间和交联剂对光致交联的PTMC网络的凝胶含量(A)、和溶胀比(B)的影响。在所有PTMC薄膜中,PI/(聚合物中TMC重复单元)比率是1/1000。PTMC-PI薄膜仅包含光引发剂而不包含PTMC大分子单体。对于包含DMAC和TMAC的PTMC薄膜而言,甲基丙烯酸酯/(聚合物中TMC重复单元)比率是1/50。
图22.代表性曲线,显示了直链和光致交联的提取的PTMC网络薄膜的应力-应变行为。在所有PTMC薄膜中,PI/(聚合物中TMC重复单元)比率是1/1000。PTMC-PI薄膜仅包含光引发剂而不包含PTMC大分子单体。对于包含DMAC或TMAC的PTMC薄膜而言,甲基丙烯酸酯/(聚合物中TMC重复单元)比率是1/50。为了清楚起见,将曲线偏移。
图23.直链PTMC和UV交联的(120分钟)提取的PTMC网络薄膜(仅包含光引发剂或光引发剂和PTMC大分子单体)的滞后行为。在所有PTMC网络薄膜中,PI/(聚合物中TMC重复单元)比率是1/1000。PTMC-PI网络薄膜仅包含光引发剂而不包含PTMC大分子单体。对于包含DMAC或TMAC的PTMC网络薄膜而言,甲基丙烯酸酯/(聚合物中TMC重复单元)比率是1/50。为了清楚起见,将曲线偏移。
图24.SEM(左)和CLSM(右)显微照片,显示了在通过UV照射120分钟交联的PTMC-PI-TMAC(1/50甲基丙烯酸酯/聚合物中TMC重复单元)薄膜上培养28天以后的hMSC。PI相对于聚合物中TMC重复单元的比率是1/1000。在此图中,细胞核染成蓝色并且肌动蛋白细胞骨架染成绿色。
图25.SEM显微照片,显示了由直链PTMC制备的薄膜(A、B)、以及由光致交联(120分钟)的提取的薄膜的巨噬细胞介导的侵蚀,所述光致交联(120分钟)的提取的薄膜具有不同比率的甲基丙烯酸酯/(聚合物中TMC重复单元):PTMC-PI(C、D)、PTMC-PI-TMAC(1/200)(E、F)、PTMC-PI-TMAC(1/100)(G、H)、PTMC-PI-TMAC(1/50)(I、J)网络薄膜。在所有PTMC网络薄膜中,PI/(聚合物中TMC重复单元)比率是1/1000。PTMC-PI网络薄膜仅包含光引发剂而不包含PTMC大分子单体。
图26.在由直链PTMC制备的薄膜、以及光致交联(120分钟)的提取的网络薄膜上培养14天以后巨噬细胞的密度,所述光致交联(120分钟)的提取的网络薄膜具有不同比率的甲基丙烯酸酯/(聚合物中TMC重复单元)。在所有PTMC网络薄膜中,PI/(聚合物中TMC重复单元)的比率是1/1000。PTMC-PI薄膜仅包含光引发剂而不包含PTMC大分子单体。
具体实施方式
实施例
实施例1
材料
按原接收状态使用聚合物级碳酸1,3-三亚甲基酯(TMC,BoehringerIngelheim,德国)、和辛酸亚锡(Sigma,美国)。按原接收状态使用三丙烯酸季戊四醇酯(PETA,Aldrich,美国)。溶剂(Merck,德国,或Biosolve,荷兰)具有分析级。
聚合物合成
在真空下在130℃下,利用辛酸亚锡作为催化剂,通过TMC单体的开环聚合持续3天来合成聚(碳酸1,3-三亚甲基酯)(PTMC)均聚物。为了控制分子量,不同量的己二醇用作引发剂。通过溶解于氯仿并沉淀到乙醇中,用新鲜乙醇洗涤并在室温下在真空下干燥,来纯化聚合物。
聚合物表征
使用CDCl3(Merck,德国),通过质子核磁共振(1H-NMR)光谱仪(300MHz,Varian Innova,美国)来确定单体转化率。
通过凝胶渗透色谱法(GPC,Viscotek美国)来确定纯化的聚合物的数均和重均分子量(分别为和)、多分散指数(PDI)和特性粘度([η])。设备配备有串联放置的ViscoGEL I-guard-0478、ViscoGELI-MBHMW-3078、和ViscoGEL I-MBLMW-3078柱,以及带有折光检测器、粘度检测器、和光散射检测器的TDA302三检测器阵列(TripleDetector Array),从而可以测定绝对分子量。在30℃下利用氯仿作为洗脱剂,在1.0ml/分钟的流速下进行所有测定。
PTMC薄膜的制备
在140℃下利用厚度为500μm的不锈钢模具,使用实验室压制机(Fonteijne THB008,荷兰)来压缩模制纯化的聚合物。在大约25kg/cm2下模制薄膜,然后利用冷水骤冷至室温。为了在存在PETA下交联PTMC薄膜,将纯化的聚合物和PETA(1或5wt%的聚合物)溶解于二氯甲烷以实现良好的混合。在蒸发溶剂以后,以与纯化聚合物相同方式来制备压缩模制的薄膜。这些包含PETA的PTMC薄膜完全溶于氯仿,从而证实了在这些条件下没有发生交联。
γ照射、网络形成和网络表征
在真空下将压缩模制的薄膜密封于层压的聚乙烯/聚酰胺袋(HevelVacuum B.V.,荷兰)中并暴露于来自60Co源(Isotron B.V.,Ede,荷兰)的25、50或100kGyγ照射。
为了确定平衡溶胀比和凝胶含量,从照射的薄膜中冲切出盘状试样(厚度为500μm,直径为10mm)并放入30mL CHCl3中持续1周,在3天以后更换溶剂一次。这个过程确保溶胶部分的完全去除。然后称重溶胀的凝胶,在室温下在真空下干燥至恒重并再次称重。分别按照方程(1)和(2),计算凝胶和溶胶部分:
其中,md是干燥的(提取的)样品的质量并且m0是溶胀以前试样的质量。
按照方程(3)来计算溶胀比(q)。
其中,ms是提取的和溶胀的样品的质量,并且ρs和ρp分别是氯仿(1.48g/cm3)和PTMC(1.31g/cm3)的密度。
热性能和机械性能
通过差示扫描量热法(DSC)来确定不同PTMC薄膜的玻璃化转变温度(Tg)。在0或25kGy下照射包含0或5wt%PETA的薄膜。在利用乙醇来提取溶胶部分以后,还确定包含PETA的照射的薄膜的Tg。利用PerkinElmer Pyris1DSC,在-50至200℃的温度范围内,以10℃/分钟的加热速率,来分析样品(5-10mg)。在第一次扫描后,以300℃/分钟将样品骤冷至-50℃并在5分钟以后记录第二次扫描。由第二次扫描确定报告值。铟、铅、和环己烷用作仪器温度校准的标准品。
按照ASTM-D882-91,确定熔化压制的和照射的PTMC薄膜的机械性能,重复三次。以50mm/分钟的十字头速度,操作配备有500N测压元件(load cell)的Zwick Z020拉伸测试仪(Ulm,德国)。初始夹头间距离是50mm并施加0.01N的预加载。试样变形源自夹头间距离;因此,提供的杨氏模量(由应力-应变曲线的初始斜率计算)值仅给出聚合物刚度的指示。
为了评估它们在动态负载条件下的行为,在循环试验中,以50mm/分钟,将试样(n=1)重复(20x)伸长至50%应变。在2h恢复期以后,由第21个循环的应力-应变图估计永久变形。在这些实验中,施加0.01N的预加载,形变源自夹头间距离。数值的误差大约为0.5%应变。
按照ASTM1938,使用裤形试样(n=3)来确定薄膜的撕裂强度。试样的尺寸是75×25×0.5mm,具有一半通过试样宽度的50mm长度切口。以250mm/分钟的速度进行测量,重复三次。将报告的最大撕裂强度针对试样的厚度进行归一化处理并以N/mm为单位来表示。
细胞存活率测定
利用直接和间接MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑]测定法来评估γ照射的和未提取的PTMC薄膜(包含5wt%PETA)的可能的细胞毒性。简言之,使用96孔板(5000个细胞/孔)和Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)来培养小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3细胞系)。在37℃和5%CO2下温育细胞三天。
对于间接细胞毒性评估而言,在37℃和5%CO2下将每种薄膜的未提取圆盘(n=3,直径8mm,厚度500μm)与500μl DMEM2一起温育24小时以提取任何可浸出成分。在细胞培养3天以后,用包含可浸出物的DMEM培养基更换培养基。在直接细胞毒性测定中,将未提取的圆盘(n=3)直接放置在培养中的细胞上。在两种测定中,在培养另外两天以后,测量可溶于培养基的甲(formazan)的吸光度。仅用DMEM培养基(阴性对照)温育的细胞培养物获得的平均值被标准化为100%细胞存活率。乳胶橡胶(Hilversum Rubber Factory,Hilversum,荷兰)用作阳性对照。
体外酶侵蚀研究
使用来自猪胰腺的胆固醇酯酶(CE)来研究γ照射的PTMC薄膜的酶水解。使用包含作为杀菌剂的0.02wt%NaN3(Sigma,美国)的磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH=7.4),以20μg/mL的浓度,制备CE酶水溶液。将未提取的盘状薄膜(10mm直径,大约500μm厚度,n=3/时间点)放入包含1ml的酶溶液的小瓶中并在37℃下调节。每两天更换培养基一次。利用PBS(pH7.4,n=1/时间点)进行没有酶的对照实验。在冲洗和吸干它们的表面以后,在预定时间点,确定湿试样的质量和厚度。在真空下在室温下干燥试样至恒重以后再次进行测量。
结果
评估了初始聚合物分子量和三丙烯酸季戊四醇酯含量对γ照射交联行为以及对产生的PTMC网络的物理性能的影响。通过改变引发剂浓度(从0至0.1摩尔%),合成了分子量为80-450kg/mol的PTMC聚合物(参见表1,针对每种聚合物在索引中给出分子量)。在所有情况下,单体转化率均高于99%。获得的聚合物的分子量低于由单体相对于引发剂比例可以预期的(假设每个羟基引发一个增长的聚合物链)。这可能是由于由包含杂质(如水)的羟基引发聚合反应。在压缩模制以后,获得略有降低的值和较高的多分散指数。
表1在压缩模制之前和之后,合成的PTMC均聚物的特性。在括号中给出压缩模制的聚合物的数值。
a在30℃下使用氯仿作为洗脱剂通过GPC确定的
通过γ照射交联PTMC
在真空下在25、50或100kGy的剂量下,γ照射具有不同分子量的压缩模制的PTMC薄膜。图1A和1B给出凝胶含量和在氯仿中的平衡溶胀比。这些图显示,在给定照射剂量下,随着初始PTMC分子量增加,获得具有较高凝胶含量和较低溶胀比的网络。在25kGy下,PTMC88和PTMC157根本不交联,而PTMC277和PTMC443则分别具有22±1和60±1%的相对较低凝胶含量。对于所研究的聚合物分子量的范围,在100kGy的照射剂量下,凝胶含量为15±4%至73±1%,并且溶胀比为327±32至22±1。
在图1A和1B中,还可以看到,对于给定分子量,随着照射剂量增加,凝胶含量会增加而溶胀比则降低。增加照射剂量对较低分子量的PTMC具有更大影响。例如,在照射PTMC443期间,将剂量从25增加至100kGy会将凝胶含量从60±1g增加至73±1%,而对于PTMC157,则将凝胶含量从0增加至42±2%。同时,对于PTMC443,溶胀比从45±1降低至22±1,并且对于PTMC157,则从537±9(50kGy)降低至92±4。可以得出结论:可以通过增加聚合物的初始分子量或通过增加γ照射剂量来增加PTMC网络的凝胶含量和密度。
按照方程4来评估不同初始分子量的PTMC聚合物的交联行为,上述方程使照射剂量(r)与所形成的网络的溶胶部分(s)相关联(假设断链和交联事件均是随机发生以及它们的数目是正比于照射剂量):
其中,G(s)和G(x)分别是剪断和交联的辐射化学产率,并被定义为剪断和交联事件数目/100eV。因为每个交联涉及两个链,所以断链密度相对于交联密度的比率是G(s)/2G(x)。对于具有随机的、单峰分子量分布的聚合物而言,获得在和照射剂量的倒数之间的线性关系。在图2A中,针对在此研究中所使用的PTMC聚合物给予这样的曲线。外推至无限的照射剂量可以确定在方程4中给出的剪断相对于交联的辐射化学产率的比率。针对PTMC443、PTMC277、和PTMC157确定的比率G(s)/G(x)分别是2.1、2.0、和1.4。
可以利用以下表达式来确定可以获得的最大凝胶部分((1-s)max):
在图2B中,可以清楚地看到,随着PTMC聚合物的初始分子量增加,G(s)/G(x)比率降低,而(1-s)max则增加。具有最高分子量的聚合物,PTMC443,具有断链相对于交联的最低比率(1.4)以及最高的可获得的凝胶含量(77%)。
已通过电子自旋共振(ESR)研究了通过照射聚乙烯和线性脂族聚酯所形成的自由基的特性。对于聚乙烯而言,夺氢反应时形成的烷基可以结合以形成交联,虽然还可以发生主链断裂。因此,照射可以同时导致形成较低分子量的聚合物网络、分支结构和聚合物链。当照射聚(ε-己内酯)和聚(乙交酯)时也形成烷基。然而,观测到形成气体产物(一氧化碳、二氧化碳和氢气)表明当照射时也发生C-O键断裂。
当在25kGy下照射PTMC88和PTMC157,,各自的值降低到45和127kg/mol,而值则增加到173和394kg/mol。各自的多分散指数(PDI)从1.81和1.51增加至3.84和3.10,这表明分支PTMC结构的形成。当在50kGy下照射时,PTMC88的PDI值甚至进一步增加至6.99。
在存在三丙烯酸季戊四醇酯(PETA)下,通过γ照射交联PTMC
当γ照射时PTMC发生交联,但为了达到高凝胶含量,则需要非常高分子量的聚合物。在我们合成的最高分子量PTMC聚合物(443kg/mol)的情况下,在100kGy下的γ照射导致凝胶含量为73%的网络。从理论上讲,估计表明,可以预期77%的最大凝胶百分比(图1A、2B和方程5)。
一般而言,在存在交联剂(其降低断链相对于交联事件的比率)下,通过照射,可以增加所形成网络的凝胶百分比。为了增强当γ照射时PTMC的网络形成,PETA用作交联剂。就其本身而言,当在25kGy下进行γ照射时,PETA产生99.8±0.1%的凝胶百分比。
图3A和3B显示,通过在25kGy下γ照射不同初始分子量的PTMC(包含不同量的PETA(0、1、5wt%)),所制备的网络的凝胶含量和平衡溶胀比。可以清楚地看到加入PETA的作用:产生的PTMC网络具有大大增加的凝胶含量和降低的溶胀比。当将PETA加入具有相对较低分子量的PTMC时,上述作用是最明显的。对于包含0、1、和5wt%PETA的PTMC88,在25kGy下照射以后网络的凝胶含量分别从0%增加至31±1%和73±1%。对于PTMC443,各自的值为60±1%、76±1%、和96±1%。PETA的加入还导致更密集交联的PTMC网络。在25kGy下照射PTMC443以后,对于包含0、1、和5wt%PETA的薄膜而言,网络的溶胀比分别为45±1、22±1、和4.6±0.2。
对于所研究的PTMC聚合物分子量的范围而言,对于包含1和5%PETA的薄膜,当在25kGy下照射时形成的网络的凝胶含量分别为31±1至76±1%以及73±1至96±1%。在氯仿中的相应溶胀比为75±1至22±1以及7.1±0.1至4.6±0.2。这表明,通过加入PETA,大大增强了通过γ照射获得的PTMC交联的程度。通过调节PETA含量,可以容易地改变网络的凝胶含量和网络密度。
在50或100kGy的较高照射剂量下,照射包含5wt%PETA的PTMC薄膜,导致所形成网络较低的凝胶含量。当照射剂量从25kGy增加到100kGy时,使用PTMC443形成的网络的凝胶含量从96%降低到87%。很可能的是,在25kGy下,所有PETA已被耗尽,并且不能期望交联效率的进一步增强。实际上,包含PETA的γ照射的PTMC薄膜的提取物的NMR谱并未揭示存在包含未反应的丙烯酸酯基的化合物。
在存在5wt%PETA下,通过γ照射制备的不同PTMC网络的溶胀比为4.6至7.1。这些数值可以与前面提到的由分子量为1500和17200g/mol的三臂PTMC大分子单体制备的光致交联的网络(它们分别具有3.3±0.4和9.8±0.4的溶胀比)相比。作为粗糙近似,在存在5wt%PETA下,通过照射PTMC制备的网络的交联之间的分子量可以预期为大约1500至3600g/mol。
γ照射的PTMC网络的热性能和机械性能
所有PTMC聚合物均是无定形的,具有低于室温的玻璃化转变温度(Tg)。压缩模制的、未照射的PTMC薄膜的Tg不依赖于聚合物分子量并且为-17.7至-18.5℃。当未将PETA加入聚合物时,在25kGy下的γ照射对薄膜的Tg并没有显著影响。5wt%PETA的加入的确会增加γ照射的PTMC薄膜的玻璃化转变温度。这可能是由于更密集网络的形成。在提取以前,这些薄膜的Tg值为-16.2至-16.7℃,而在用乙醇提取以后数值略高(-14.7至15.1℃)。在所研究的温度范围(-50至200℃)内,薄膜的热分析仅显示单一Tg,表明PETA被均匀地结合到PTMC网络中。
初始分子量和网络形成对PTMC薄膜的弹性模量(E-模量)、屈服强度和断裂应力值的影响示于图4A、4B和8C,而PTMC88和PTMC443的代表性的应力-应变曲线则分别示于图5A和5B。
在未交联状态下,弹性模量、屈服强度和断裂应力值随聚合物分子量的增加而增加。所有PTMC薄膜是柔性的;PTMC88的弹性模量和屈服强度值分别是6.3±0.2和1.2±0.1MPa,而对于PTMC443,这些数值则分别为7.2±0.1和2.8MPa(图4A和4B)。断裂应力从PTMC88的0.7±0.1MPa增加至PTMC443的25.2±3.7MPa。以前已观测到机械性能对PTMC分子量的这种依赖性。当在25kGy下γ-交联不同PTMC薄膜时,弹性模量和屈服强度值分别降低为5.5±0.1至6.7±0.2MPa以及0.9±0.1至2.0±0.1MPa(图4A和4B)。类似地,这些未提取网络的断裂应力(0.7±0.1至14±0.4MPa)低于未交联薄膜的断裂应力(图4C以及图5A、5B)。这些数值接近硅氧烷弹性体薄膜的数值,其中上述硅氧烷弹性体薄膜具有2.6±0.2MPa的弹性模量和7.3±0.5MPa的断裂应力拉伸强度。
增加照射剂量会进一步降低PTMC薄膜的弹性模量和屈服强度。在100kGy下,薄膜的弹性模量和屈服强度分别为2.9±0.2至4.6±0.2MPa和0.5至1.2MPa。断裂应力值也较低,为0.5±0.1至2.7±0.2MPa。虽然增加照射剂量会产生较高凝胶含量和网络密度,但它还导致较低强度和刚度。这可能是由于在γ-照射期间与交联同时发生的断链。
通过将PETA加入网络结构,可以防止弹性模量和断裂应力的降低。在图4和5中,还可以看到,所有γ照射的(未提取的)包含5wt%PETA的PTMC网络仍然是非常柔性的和类似橡胶的。弹性模量和屈服强度值分别为9.5±0.6至10.7±0.2MPa(图4A)和3.1±0.1至4.9±0.1(图4B)。在存在PETA下,当照射时,观测到PTMC网络的断裂应力大量增加。在存在5wt%PETA下在25kGy下当照射时,PTMC157的断裂应力非常从1.4±0.1MPa显著地增加至25.0±1.8MPa(图4C)。在存在5wt%PETA下γ照射的PTMC443的薄膜具有非常高的最大拉伸强度,为35.3±0.3MPa。这使得它可以应用于需要高强度的用途,如韧带的组织工程中。在存在5wt%PETA下用乙醇提取制备的PTMC网络的溶胶部分会进一步改善最大拉伸强度。PTMC88的断裂应力从5.5±0.9增加至12.4±2.9MPa(图4C和5A),并且PTMC443的断裂应力增加至37.7±1.3MPa(图4C和5B)。提取网络的弹性模量和屈服强度值可与未提取网络的弹性模量和屈服强度值相比。如在实验部分中描述的,在循环变形实验中评估了PTMC薄膜的抗蠕变性。图4D表明,未交联PTMC薄膜的永久变形主要取决于聚合物分子量并且为11.2%至1.2%。最高分子量聚合物是最抗蠕变的。在25kGy下的γ照射会降低所有聚合物的永久变形。PTMC443和PTMC277的照射的未提取薄膜具有与硅橡胶相同的永久变形值(1.0%应变),表明这些可生物降解弹性体的极好的抗蠕变性。当在25kGy下照射PTMC88时,即使没有观测到凝胶形成,未提取薄膜也具有比未照射的薄膜(11.2%)低得多的永久变形(3.2%)。在存在5wt%PETA下,当在25kGy下γ照射时,未提取PTMC88和PTMC157的永久变形值分别进一步下降到1.4和1.6%应变。这意味着,甚至在相对较低初始分子量的PTMC聚合物的情况下,通过γ照射,可以获得具有极好抗蠕变性的网络。当用乙醇提取时,所有包含PETA的网络的永久变形甚至更低(0.9-1.2%)。
评估了γ照射对PTMC443的抗撕裂扩展性(tear propagation resistance)的影响。未照射的PTMC443薄膜具有1.9±0.2N/mm的最大撕裂强度,这个值已经远高于硅氧烷弹性体薄膜的最大撕裂强度(0.21±0.01N/mm)。当存在5wt%PETA下当γ照射时,PTMC网络的抗撕裂性显著增加到4.2±0.2N/mm。在用乙醇提取以后,撕裂强度甚至进一步增加到9.3±2.0N/mm。
与γ照射的PTMC网络接触的细胞的存活率
在存在5wt%PETA下,通过直接和间接细胞存活率测定法,评估了在25kGy下γ照射的(未提取的)PTMC薄膜的可能的细胞毒性(图6)。在两种测定中,并没有观测到对细胞形态的不利影响。当成纤维细胞直接接触薄膜时,细胞存活率值非常高,为87±16至117±26%。另外,在间接测定中,细胞存活率非常高,为91±8至100±7%。因此确认了,在存在5wt%PETA下交联对细胞存活率并不具有不利影响。
γ照射的PTMC网络的体外酶侵蚀
使用胆固醇酯酶(CE)研究了在25kGy下照射的未提取的PTMC443薄膜的体外酶侵蚀,因为上述酶在PTMC的侵蚀方面可能起重要作用。图7A、7B和7C显示在CE水溶液中温育的薄膜的质量和厚度的变化,为时间的函数。包含5wt%PETA的照射的PTMC薄膜的侵蚀远慢于不包含PETA的情况。在三周以后,并不包含PETA的薄膜的质量损失为大约64%,而包含5%PETA的薄膜已失去大约13%的它们的质量。包含5wt%PETA的薄膜的厚度减小也远低于并不包含PETA的薄膜的厚度减小(图7B)。在此酶溶液中的相应侵蚀速率分别为12.0±2.9μm/天和3.0±1.6μm/天。对于两种聚合物薄膜,质量的减少和厚度的减小同时发生(图7C),这意味着表面侵蚀过程。在图7C中,厚度的减小似乎是稍低于质量的减少,特别是在稍后的时间点。这可以是在确定薄膜的厚度中的误差的结果(起因于在降解过程中表面的粗糙化)。
这些结果显示,在存在PETA下,PTMC的交联是降低PTMC网络侵蚀速率的有效方式。这可能是由于包含PETA的PTMC443薄膜的较高凝胶含量和网络密度。另外,包含PETA的PTMC网络的较高的水吸收(由于存在于PETA中的羟基),可以发挥作用。在CE水溶液中温育21天以后,包含PETA的薄膜的水吸收是3.4±0.6%,而并不包含PETA的PTMC443网络则吸收1.7±0.4%的水。已知的是,当吸附于疏水性基质上时这种酶被最大程度地激活。
结论
在存在三丙烯酸季戊四醇酯(PETA)下,通过γ照射压缩模制的PTMC薄膜,可以获得具有高凝胶含量和高网络密度的柔性PTMC网络。加入这种交联剂还导致具有高拉伸强度以及极好的抗撕裂性和抗蠕变性的网络。此外,能够以这种方式来降低PTMC网络的酶侵蚀速率。基于直接和间接测定,这些网络对成纤维细胞的存活率并不具有任何不利影响。因此可以得出结论,在存在PETA下,γ照射是用来获得具有弹性体性能的可生物降解PTMC网络的非常有效的方法。这些类似橡胶的可生物降解PTMC网络非常适合于医疗应用如软组织和心血管组织的工程化,以及控制释放。
实施例2
材料
按原接收状态使用聚合物级碳酸1,3-三亚甲基酯(TMC,BoehringerIngelheim,德国)、聚合物级D,L-丙交酯(DLLA,Purac Biochem,荷兰)、辛酸亚锡(Sigma,美国)、和三丙烯酸季戊四醇酯(PETA,Aldrich,美国)。溶剂(Merck,德国,或Biosolve,荷兰)具有分析级。J774A巨噬细胞(ATCC-TIB-67)获自美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)。培养基,胎牛血清,GlutamaxTM和青霉素-链霉素获自Invitrogen(Gibco,美国)。培养一次性用品来自Nunc(美国)和Greiner(德国)。
聚合物合成
在真空在130℃下,利用辛酸亚锡作为催化剂,通过相应单体(50、60、和70摩尔%TMC)的开环聚合持续三天,来合成聚(碳酸1,3-三亚甲基酯)、聚(D,L-丙交酯)均聚物和TMC与DLLA的共聚物。通过溶解于氯仿并且沉淀到乙醇或异丙醇中,用新鲜醇洗涤并在室温下在真空下干燥,来纯化聚合物。在80℃下在氮气下进一步干燥含有DLLA的共聚物直至恒重。
聚合物表征
使用CDCl3(Merck,德国),通过质子核磁共振(1H-NMR)光谱仪(300MHz,Varian Innova,美国)并来确定单体转化率和共聚物组成。
通过凝胶渗透色谱法(GPC,Viscotek美国)来确定共聚物的数均和重均分子量(分别为和)、多分散指数(PDI)和特性粘度([η])。设置配备有串联放置的ViscoGEL I-guard-0478、ViscoGELI-MBHMW-3078、和ViscoGEL I-MBLMW-3078柱以及具有折光检测器、粘度检测器、和光散射检测器的TDA302三检测器阵列(Triple DetectorArray),从而可以测定绝对分子量。在30℃下使用氯仿作为洗脱剂,在1.0ml/分钟流速下进行所有测定。
聚合物薄膜的制备
在140℃下,在厚度为500微米的不锈钢模具中,利用实验室压制机(Fonteijne THB008,荷兰),来压缩模制纯化的聚合物。在大约25kg/cm2下模制薄膜,然后利用冷水骤冷至室温。对于包含PETA的聚合物薄膜的交联实验(见下文),将纯化的聚合物和PETA(5wt%聚合物)溶解于二氯甲烷以实现均匀混合。在蒸发溶剂以后,以与纯化的聚合物相同方式,制备压缩模制的薄膜。
γ照射、网络形成和网络表征
在真空下将压缩模制的薄膜密封在层压的聚乙烯/聚酰胺袋(HevelVacuum B.V.,荷兰)中并暴露于来自60Co源(Isotron B.V.,Ede,荷兰)的25kGyγ照射。
为了确定平衡溶胀比和凝胶含量,从照射的薄膜中冲切出盘状试样(500μm厚度,10mm直径)并放入30mL CHCl3中持续1周,在3天以后更换溶剂一次。这个过程可以确保溶胶部分的完全去除。然后称重溶胀的凝胶,在室温下在真空下干燥至恒重并再次称重。分别按照方程(1)和(2)来计算凝胶部分和溶胶部分:
其中md是干燥的(提取的)样品的质量并且m0是溶胀以前试样的质量。按照方程(3)来计算溶胀的体积程度(q):
其中ms是提取的和溶胀的样品的质量并且ρs和ρp分别是氯仿(1.4832g/cm3)和共聚物的密度。通过测量压缩模制薄膜的质量和尺寸来确定共聚物的密度。包含100%、72%、60%、48%、和0%TMC的TMC和DLLA共聚物的密度分别为1.31、1.29、1.27、1.26、和1.25g/cm3。
热性能和机械性能
按照ASTM-D882-91,确定包含PETA(0wt%、5wt%)的熔化压缩的和照射的(0kGy、25kGy)共聚物的机械性能,并重复三次。在提取的以及未提取的试样(0.5×10×0.05cm3)上进行测量。用乙醇进行可浸出成分的提取。在500mm/分钟的十字头速度下操作配备有500N测压元件(load cell)的Zwick Z020拉伸测试仪(Ulm,德国)。初始夹头间距离为50mm并施加0.01N的预加载。试样变形源自夹头间距离;因此,提供的弹性模量值(由应力-应变曲线的初始斜率计算)给出聚合物刚度的指示。
按照ASTM1938,使用裤形试样(n=3)来确定薄膜的撕裂强度。试样尺寸为75×25×0.5mm,并具有一半通过试样宽度的50mm长切口。以250mm/分钟的速度进行测量,并重复三次。将报告的最大撕裂强度化针对试样厚度进行归一化处理并以N/mm为单位来表示。
通过差示扫描量热法(DSC)来确定纯化的聚合物和照射的聚合物薄膜的玻璃化转变温度(Tg)和熔化温度。在-100至200℃的温度范围内利用PerkinElmer Pyris1DSC,在10℃/分钟的加热速率下,来分析样品(5-10mg)。在第一次扫描后,以300℃/分钟,将样品骤冷至-100℃,并在5分钟以后记录第二次扫描。由第二次加热扫描来确定报告值。铟、铅、和环己烷用作温度校准的标准品。
细胞存活率测定
使用直接和间接MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2基)-5-(3-羧甲氧基苯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑]测定法来评估包含5wt%PETA的γ照射的、未提取的共聚物薄膜的可能的细胞毒性。简言之,使用96孔板(5000个细胞/孔)和Dulbecco改良型Eagle培养基(DMEM)来培养小鼠皮肤成纤维细胞(NIH3T3细胞系)。在37℃和5%CO2下温育细胞持续三天。
对于间接细胞毒性评估而言,在37℃和5%CO2下用500μl DMEM来温育每种薄膜的未提取的圆盘(n=3,直径8mm,厚度500μm)持续24小时,以提取任何可浸出成分。在细胞培养三天以后,用包含可浸出物的DMEM培养基来更换培养基。在直接细胞毒性测定中,将未提取的圆盘(n=3)直接放置在培养中的细胞上。在两种测定中,在培养另外两天以后,测量可溶于培养基的甲臜的吸光度。将仅用DMEM培养基(阴性对照)温育的细胞培养物获得的平均值标准化为100%细胞存活率。乳胶橡胶(Hilversum Rubber Factory,Hilversum,荷兰)用作阳性细胞毒性对照。
巨噬细胞介导的侵蚀研究
将J774A巨噬细胞保持在包含4.5g/L D-葡萄糖、丙酮酸酯(盐)、10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和100μg/mL2mMGlutamaxTM的DMEM中。通过刮取,每4至7天,将细胞传代。
通过在薄膜表面上直接培养J774A巨噬细胞,研究了并不包含PETA的未照射的共聚物薄膜以及包含5wt%PETA的γ照射的、未提取的共聚物薄膜的巨噬细胞介导的侵蚀。测试样品为15mm直径和大约500μm厚度。接种密度为大约8x104个细胞/cm2。在第天7和第10天,将新鲜等分部分的细胞加入每个孔。每周更换培养基三次。在每种材料的6个圆盘上培养细胞。
在培养14天以后,首先将每种材料的三个试样放入Milli-Q水中以溶解细胞,然后彻底冲洗并称重。在真空下在室温下干燥薄膜至恒重以后,再次称重样品。用金溅射涂覆试样表面,然后在5kV的操作电压下通过扫描电子显微镜(SEM,Philips XL30ESEM-FEG,荷兰)进行分析。
用处于细胞骨架稳定(CS)缓冲液(0.1M哌嗪-1,4-二(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲剂、1mM乙二醇四乙酸(EGTA)、pH=6.9)中的3.7%多聚甲醛固定每种材料的剩余圆盘(n=3)持续15分钟,然后转移到PBS。试样用于使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核的荧光染色,以及使用四甲基罗丹明异硫氰化物-鬼笔环肽(TRITC-鬼笔环肽)进行肌动蛋白细胞骨架的荧光染色。然后通过共聚焦激光扫描显微镜(LEICATCS SP2,具有完全水浸式40x物镜(NA0.80))来分析这些试样。
结果
通过开环聚合来合成碳酸三亚甲酯(TMC)和D,L-丙交酯(DLLA)的高分子量共聚物、以及PTMC和PDLLA均聚物。单体的转化率高于95%,并在通过沉淀加以纯化以后,获得具有接近进料组成的单体组成的共聚物/聚合物(表2)。在压缩模制以后,共聚物的分子量仍然很高,虽然,当压缩模制时,具有高DLLA含量的共聚物的分子量已经有所下降。具有高分子量的聚合物是所期望的,因为已表明,通过γ照射的交联效率随聚合物分子量的增加而增加。合成的包含TMC的共聚物在生理温度下是橡胶状的,因为它们的玻璃化转变温度为-17.9至16.5℃。
表2在压缩模制之前和之后,合成的和纯化的P(TMC-DLLA)共聚物的特性。在括号中的数值是压缩模制试样的。
a在通过沉淀纯化的试样上通过1H-NMR确定的
b在30℃下使用氯仿作为洗脱剂通过GPC确定的。
c使用压缩模制薄膜通过DSC(第二次加热扫描)确定的。
通过γ照射交联的P(TMC-DLLA)共聚物
在不存在PETA下,首先研究了在真空下被γ照射的,压缩模制的共聚物薄膜的交联行为。产生的共聚物网络的凝胶含量和溶胀比示于图8。当在25kGy下照射时,48%的包含TMC的共聚物和PDLLA并没有交联。这与先前的研究是一致的。在PDLLA的情况下,值已分别下降到78kg/mol、117kg/mol,而对于共聚物,各自的值为60kg/mol、111kg/mol。可以通过γ照射来交联具有较高TMC含量(60%和72%)的共聚物,从而产生具有12±2%、和30±1%凝胶含量的网络。在氯仿中非常高的溶胀比表明这些共聚物网络的低交联密度。γ照射的PTMC薄膜具有60±1%的最高凝胶含量。
图8还清楚地表明,将少量PETA加入共聚物薄膜有可能通过增加在γ照射过程中发生的交联事件相对于断链事件的比率而显著增加所形成网络的凝胶百分比。在25kGy下,获得具有86±5至96±1%的高凝胶含量的透明的和形状稳定的共聚物网络。有趣的是,在γ照射期间,通过使用PETA作为交联剂,甚至可以有效地交联PDLLA。所形成的网络被稠密地交联,其中在氯仿中的溶胀比为4.6±0.2至11.0±2.5vol/vol。这表明以下可能性:通过γ照射来消毒这些共聚物,而没有显著断链和机械性能的损失。
在这些实验中,PETA被均匀混合并且使共聚物溶于溶液中。这使我们能够获得具有多丙烯酸酯交联剂的非常高的凝胶含量。
利用TMC和ε-己内酯的共聚物(具有41至100摩尔%的ε-己内酯含量的五种共聚物,均具有高于200kg/mol的值)还研究了在网络形成中PETA作为交联剂的潜力。在交联这些共聚物方面,PETA也是非常有效的:在25kGy下,使用5wt%的PETA含量,获得凝胶含量为88至93%和溶胀比为5.4至7.0vol/vol的网络。这表明,这种增强的交联方法也可以适用于其他可吸收聚合物。
γ照射的P(TMC-DLLA)共聚物网络的热性能和机械性能
在未交联状态下,所有P(TMC-DLLA)共聚物均是玻璃化转变温度(Tg)为-17.9至52.1℃的无定形材料(表3)。Tg值随着TMC含量的增加而降低并且通过调节共聚物组成来容易地调节。在不存在PETA下,γ照射似乎稍微降低Tg值,这可能是由于通过断链事件形成相对短的链。当在存在PETA下照射时,由于形成密集网络,Tg值增加(与图8B相比较)。当使用乙醇从网络中除去低分子量可浸出物时,玻璃化转变温度进一步增加,并且为14.9至53.7℃。包含PETA的网络显示单一Tg,这表明共聚物被均匀地结合到PETA网络中。
表3还给出P(TMC-DLLA)共聚物和网络的拉伸性能的综述。可以看出,通过调节共聚物组成,可以获得弹性模量值为5.1±0.1至2780±112MPa的未照射薄膜。当在不存在PETA下进行γ照射时,共聚物薄膜的弹性模量和断裂应力值略有下降(由于断链)。通过在存在PETA下进行照射,可以防止在γ照射期间共聚物的机械性能的恶化。获得具有较高弹性模量、屈服强度、和断裂应力值的网络薄膜,这可能是由于防止了断链和密集网络形成。出于同样的理由,与并不包含PETA的照射的薄膜相比较,包含PETA的网络具有较低的断裂伸长值和屈服应变值。在拉伸试验中,交联试样基本上返回到它们的原始尺寸。考虑到它们的玻璃化转变温度低于生理温度,包含TMC的网络可以用于微创手术,其中具有形状记忆的材料的使用是有利的。
通过用乙醇提取,除去在γ照射期间可能已形成的低分子量化合物,可以进一步增加网络薄膜的弹性模量和断裂应力值。虽然保留它们较高的拉伸强度,还发现,包含PETA的γ照射的薄膜的弹性模量值取决于共聚物组成。这表明,这些共聚物网络的机械性能可以被改变以适合任何预期的应用。
网络薄膜的一个重要特征是它们的抗撕裂性,因为缝合的聚合物生物材料通常经受体内动态环境。线性PTMC薄膜的确定的最大撕裂强度是1.9±0.2N/mm。通过在存在PETA下进行γ照射以及通过增加共聚物的DLLA含量,可以显著改善所形成的网络的抗撕裂扩展性。由100、72、60、和48%包含TMC的共聚物制备的包含PETA的网络的撕裂强度分别为4.2±0.2、10.6±1.0、13.7±1.2和38.9±6.4N/mm。
表3.在不存在或存在PETA下,在γ照射之前和之后,P(TMC-DLLA)共聚物的热性能和机械性能。值表示为平均值±标准偏差(n=3)。
a由针对应力-应变图切线的交叉估计的,因为无法观察到明显的屈服点。
b在用乙醇提取可浸出成分以后,在γ照射的试样上进行测量。
γ照射的共聚物网络薄膜与成纤维细胞的相容性
使用直接和间接测定法,研究了包含PETA的γ照射的未提取网络与成纤维细胞的相容性。图9显示,当与不同共聚物网络薄膜温育时,活的成纤维细胞的百分比。对于所有共聚物网络而言,活的成纤维细胞的百分比可以与针对阴性对照所获得的百分比相比(100±13.5%)。在直接测定中,细胞存活率为88±18至108±1%,而在间接测定中这些值为90±5至102±10。两种测定的结果证实了,这些包含PETA的网络是无细胞毒性的。另外,这些结果显示,可以从聚合物基质中有效地去除用于纯化和用于混合PETA的溶剂。
在巨噬细胞培养物中共聚物薄膜和网络的体外侵蚀
在体内,在对生物材料的组织反应方面以及在它们被分泌的许多物质降解方面,巨噬细胞发挥重要作用。可以由巨噬细胞分泌的超氧化物阴离子自由基可以降解线性PDLLA和PTMC网络。胆固醇酯酶(也由巨噬细胞分泌的一种水解酶),已表明也会侵蚀PTMC网络以及P(TMC-DLLA)共聚物。
作为巨噬细胞对它们的体内侵蚀行为和它们的生物相容性的影响的初步评估,在γ照射的和在未照射的共聚物薄膜上直接培养巨噬细胞。P(TMC-DLLA)共聚物是生物相容性材料并当皮下植入大鼠体内时诱导温和的炎症反应。在14天培养期间,没有观测到P(TMC-DLLA)共聚物网络或它们的降解产物对巨噬细胞存活率的不利影响。另外,当在这些表面上培养时并没有激活巨噬细胞。这表明,包含PETA的P(TMC-DLLA)网络是生物相容的材料。
研究了在存在PETA下,共聚物组成和交联对巨噬细胞介导的薄膜侵蚀的影响。图10显示在巨噬细胞培养14天以后共聚物薄膜的表面,相应的侵蚀速率则列于表4。从图10中可以看出,在巨噬细胞培养期间,所有未照射的共聚物薄膜已发生侵蚀。随着TMC含量降低,表面侵蚀的程度似乎减小,这种观测结果可以被表4所列质量损失和侵蚀速率值证实。质量损失值(在14天内)和侵蚀速率分别为5.35±0.49至0%以及276±23至0μg/(cm2×天)。这表明,包含较高量的TMC的共聚物易于被源自巨噬细胞的化合物表面侵蚀。这可能是由于化学结构的差异或由于它们较低的玻璃化转变温度。有趣的是,甚至在PDLLA薄膜上也看到侵蚀迹象。很显然,源自巨噬细胞的化合物能够在一定程度上降解PDLLA。虽然不能检测到质量损失,但在并不接触细胞的薄膜的侧面上检测不到侵蚀迹象。
表4.在巨噬细胞培养14天以后,共聚物组成对未照射的P(TMC-DLLA)共聚物薄膜以及在25kGy下γ照射的包含5%PETA的P(TMC-DLLA)共聚物薄膜的表面侵蚀速率和质量损失的影响。值表示为平均值±标准偏差(n=3)。
a不能检测到质量损失。
通过照射包含5wt%PETA的共聚物薄膜,可以在很大程度上减小它们的侵蚀速率。对于由PTMC均聚物制备的薄膜,侵蚀速率从276±23降低到31±12μg/(cm2×天)(比较图10A和10B)。这可能是由于形成密集网络。γ照射的并不包含PETA的PTMC的侵蚀速率具有相对较低的交联密度(图10B)并显示265±32μg/(cm2×天)的腐蚀速率,这可以与表4所示的未照射的PTMC的侵蚀速率相比。另外,当皮下植入大鼠体内时,γ照射的PTMC网络薄膜的体内侵蚀速率可以与未照射的线性PTMC的侵蚀速率相比。这表明,巨噬细胞培养测定是用于初步评估结构变量对生物材料体内侵蚀的影响的适当的模型。对于包含72%和60%TMC的共聚物网络薄膜也观测到侵蚀(图10D和10F),而对于包含48%和0%TMC的共聚物网络检测不到质量损失。在这些网络薄膜上,仅观测到很少的侵蚀斑点(图10H和10J)。
不同材料侵蚀方面的差异还可能涉及在薄膜表面上存在的巨噬细胞的数目。在图11中,可以看到在未照射的和γ照射的P(TMC-DLLA)薄膜上的巨噬细胞密度。对于未照射的共聚物薄膜而言,细胞数目是可比较的,为3537±137至4770±612个细胞/mm2,除了包含72%TMC的共聚物薄膜,其具有较高的细胞数目(6010±405个细胞/mm2)。这是合理的,因为这些共聚物是疏水性材料,其中相对于组成,接触角无显着性差异。在γ照射的网络的情况下,数值是非常接近的,为3317±815至42±215个细胞/mm2。细胞数目也没有受到交联的太大影响(再一次,除包含72%TMC的共聚物以外)。这些结果表明,在这些材料的巨噬细胞介导的侵蚀中结构效应(组成、玻璃化转变温度、交联)可能更有影响力。还通过非酶本体水解来降解TMC和DLLA的共聚物、和PDLLA均聚物,并且先前已研究了共聚物组成对它们降解行为的影响。在通过照射TMC和DLLA共聚物薄膜(包含5wt%PETA)所制备的网络上并没有进行非酶水解降解实验,然而,其他降解实验已表明,与线性高分子量PDLLA相比较,在光致交联的丙烯酸酯官能化的DLLA低聚物的情况下,质量损失的开始被推迟。
结论
三丙烯酸季戊四醇酯可以用作交联剂/交联试剂,用来通过γ照射有效地交联P(TMC-DLLA)共聚物。通过调节共聚物组成,可以容易地调节网络的热性能和机械性能。体外测定表明,这些包含PETA的共聚物网络和它们的降解产物与细胞相容。通过增加共聚物的DLLA含量,可以显著减少共聚物薄膜的巨噬细胞介导的侵蚀。还可以通过交联过程来大大减少侵蚀。这种交联方法可以用来在通过γ照射使TMC和DLLA类的材料灭菌期间将损害降至最低并且它允许制备具有广泛可调节性能的聚合物材料。
实施例3
材料
按原接收状态使用聚合物级碳酸1,3-三亚甲基酯(TMC)(BoehringerIngelheim,德国)和催化剂,辛酸亚锡(Sigma,美国)。在PTMC合成中,1,6-己二醇(Aldrich,德国)用作引发剂。另外,数均分子量分别为10000g/mol和5800g/mol的商购α,ω-二羟基聚(ε-己内酯)(PCL)(Aldrich,德国)和聚(乙二醇)单甲氧基醚(mPEG)(Fluka,德国)用作引发剂来合成TMC嵌段共聚物。分子量为46000g/mol的PCL聚合物(Aldrich,德国)用于交联研究。三丙烯酸季戊四醇酯(PETA)(Aldrich,德国)和-369(2-苄基-2-二甲基氨基-1-(4-吗啉代苯基)-丁酮-1)(瑞士)用作交联剂和光引发剂。
将来自猪胰腺的胆固醇酯酶(CE)(Sigma,英国,56.2U/mg)溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH=7.4,B.Braun MelsungenA.G.,德国),用于酶侵蚀研究。溶剂(Merck,德国,或Biosolve,荷兰)具有分析级。对于细胞培养,使用了α-最低程度基本增殖培养基(α-MEM,Gibco美国)。此培养基包含胎牛血清(10%,Biowhitaker,比利时)、抗坏血酸-2-磷酸盐(酯)(0.2mM,Sigma,美国)、青霉素G(100单位/ml,Invitrogen美国)和链霉素(100μg/ml,Invitrogen美国)、L-谷氨酰胺(2mM,Sigma,美国)、和碱性成纤维细胞生长因子(1ng/mL,Instruchemie,荷兰)。
聚合物合成
在真空下在130℃下,使用辛酸亚锡作为催化剂,通过TMC单体的开环聚合持续三天来合成聚(碳酸1,3-三亚甲基酯)(PTMC)均聚物。为了控制分子量,不同量的己二醇用作引发剂。
通过在130℃下TMC的开环聚合持续三天还制备了单甲氧基聚(乙二醇)-嵌段-聚(碳酸三亚甲酯)(mPEG-PTMC)二嵌段共聚物和聚(碳酸三亚甲酯)-嵌段-聚(ε-己内酯)-嵌段-聚(碳酸三亚甲酯)(PTMC-PCL-PTMC)三嵌段共聚物。在真空下在130℃下干燥mPEG和PCL引发剂持续90分钟。在两种情况下,进料的TMC含量均为60摩尔%。
通过溶解于氯仿并沉淀到乙醇或己烷中,用新鲜非溶剂洗涤并在室温下在真空下干燥,来纯化全部聚合物。
聚合物表征
使用CDCl3(Merck,德国),通过质子核磁共振(1H-NMR)光谱仪(300MHz,Varian Innova,美国),来确定残余单体含量和共聚物的组成。
使用氯仿作为洗脱剂,在1.0ml/分钟的流速下,通过凝胶渗透色谱法(GPC,Viscotek美国)来确定PTMC均聚物的数均和重均分子量(分别为和)、多分散指数(PDI)和特性粘度([η])。设置配备有串联放置的ViscoGEL I-guard-0478、ViscoGEL I-MBHMW-3078、和ViscoGEL I-MBLMW-3078柱,以及具有折光检测器、粘度检测器、和光散射检测器的TDA302三检测器阵列(Triple Detector Array),从而可以测定绝对分子量。GPC和NMR两者均用于PTMC-PCL-PTMC嵌段共聚物的分子量测定,而仅利用NMR来测定mPEG-PTMC的分子量。
聚合物薄膜的制备
在140℃下利用厚度为500μm的不锈钢模具(Fonteijne THB008实验室压制机,荷兰)来压缩模制纯化的PTMC聚合物。在大约25kg/cm2下模塑薄膜,然后利用冷水骤冷至室温。
通过将成分溶解于DCM,在培养皿中浇注溶液并干燥,来制备PTMC和PTMC掺合物以及包含PETA(5wt%)和369(0.025wt%)的嵌段共聚物(以9∶1重量比)的薄膜。在黑暗中进行这些步骤,然后进行压缩模制(如上所述)。
光致交联和网络表征
将包含PETA和光引发剂的压缩模制薄膜真空密封于层压的聚乙烯/聚酰胺袋中(Hevel Vacuum B.V.,荷兰)并在7cm的距离处暴露于短波UV光(UltraLum交联室,美国,波长254nm)。在室温下照射试样的两侧持续不同的时间。在此距离处的光强度为10-14mW/cm2,如使用光功率计(Newport1916-C,美国)测量的,聚乙烯/聚酰胺袋将强度降低至5-7mW/cm2。
利用氯仿来确定光致交联薄膜的平衡溶胀比和凝胶含量。
机械性能
按照ASTM-D882-91,在用乙醇进行提取之前和之后,确定熔化压缩的和光致交联的基于PTMC的网络薄膜的拉伸性能,重复三次。在50mm/分钟的十字头速度下,操作配备有500N测压元件(load cell)的ZwickZ020拉伸测试仪(德国)。初始夹头间距离为50mm并施加0.01N的预加载。试样变形源自夹头间距离;因此,提供的杨氏模量(由应力-应变曲线的初始斜率计算)值仅给出聚合物刚度的指示。
为了评估它们在动态负载条件下的行为,在循环试验中,以50mm/分钟,将试样(n=1)重复(20x)伸长至50%应变。在2h恢复期以后,由第21个循环的应力-应变图估计永久变形。在这些实验中,施加0.01N的预加载,形变源自夹头间距离。数值的误差大约为0.5%应变。
润湿性和水吸收
在通过在玻璃圆盘(n=8/材料)上浇注处于二氯甲烷中的聚合物溶液(大约1wt%),在真空下干燥,以及在惰性气氛下光致交联而制备的薄膜上进行接触角测量。在用乙醇提取光致交联薄膜以后进行测量。在室温下,利用配备有电子注射器模块的基于视频的系统(OCA20DataPhysics Instruments GmbH,德国)来确定超纯水(MilliQPlus-Millipore,法国)在不同表面上的静态接触角、前进接触角和后退接触角。
在用乙醇提取以后,确定压缩模制的和光致交联的薄膜的平衡水吸收。在37℃的PBS(pH=7.4)中调节试样(n=4)持续一周。水吸收被定义为试样的质量增加。
体外酶侵蚀
使用来自猪胰腺的胆固醇酯酶(CE)来研究基于PTMC的光致交联薄膜的酶水解。利用包含作为杀菌剂的0.02wt%NaN3(Sigma,美国)的磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH=7.4),以20μg/mL的浓度制备CE酶水溶液。将乙醇提取的、盘状薄膜(8mm直径,大约500μm厚度,n=3/时间点)放入包含1ml酶溶液的小瓶并在37℃下加以调节。每两天更换培养基一次。利用PBS(pH7.4,n=1/时间点)进行没有酶的对照实验。在预定时间点,在冲洗和吸干它们的表面以后,确定湿试样的质量和厚度。在真空下在室温下干燥试样至恒重以后再次进行测量。
组织工程支架的制造
熔融沉积成型用来制造具有互连孔的三维(3D)支架。通过在黑暗中将PTMC均聚物或PTMC掺合物连同PETA和光引发剂一起溶解于二氯甲烷,并添加80wt%(基于总聚合物质量)的碳酸亚乙酯(熔化温度35-38℃),来制备溶液。在蒸发二氯甲烷以后,利用Bioplotter装置(Envisiontec GmbH,德国),在100-120℃和4巴氮气压力下,挤出碳酸亚乙酯溶液(包含一种或多种聚合物、PETA、和光引发剂)。
通过沉积多达20层(每层为12×12mm)的通过内径为260μm的不锈钢针挤出的纤维来打印(plot)三维支架。打印参数是:在相邻纤维的中心之间的距离:500μm,层厚度:130μm。在每个连续层以后,将绘制方向改变90°。纤维沉积速度为100-200mm/分钟。使冷空气吹过建筑结构以使碳酸亚乙酯结晶。在打印以后,将支架保持于4℃下直到进一步使用。
通过UV照射300分钟来交联支架。在照射期间,通过使冷氮气流过交联室来将温度保持在大约20℃。这可以防止碳酸亚乙酯熔化并提供惰性气氛。随后,将支架放入4℃的轻柔搅拌的Milli-Q水中持续5天以沥滤出碳酸亚乙酯(每天更换水两次)。然后将支架放入乙醇中以除去其他可能的可浸出物并在真空下干燥至恒重。利用聚合物的已知密度(对于PTMC均聚物和掺合物,密度分别为1.31g/cm3和1.29cm3)并通过测量制造的支架的密度,来确定支架的孔隙率。
在用金溅射涂覆表面以后,在5kV的操作电压下,通过扫描电子显微镜(SEM,Philips XL30ESEM-FEG,荷兰),来分析支架的表面和横截面。
在3D制造的组织工程支架中人间充质干细胞(hMSC)的接种和培
养
通过浸泡在70%乙醇中持续15分钟来消毒由PTMC和掺合物制备的光致交联的和乙醇提取的支架(大约1mm厚度)。然后,在室温下,用无菌PBS洗涤和温育支架三次,持续两小时。在细胞培养以前,在37℃下使支架在αMEM增殖培养基中温育过夜。
hMSC获自接受全髋关节置换手术的供体,其给予知情同意书。得到当地医疗伦理委员会的批准。
以1,000个细胞/cm2,将融化的细胞(第2代)铺板于300cm2T-烧瓶(T-300烧瓶)中在αMEM增殖培养基中。使hMSC扩展一周,其中更新αMEM增殖培养基一次。使用颗粒计数和粒度分析仪(Z2,BeckmanCoulter,Fullerton,CA)来确定细胞数目。使用移液器,将来自细胞悬液相当于5x105个hMSC(第3代)的体积放置在每个支架上;然后将它们放置在培养箱中的25孔非组织培养处理板(Nunc)的孔中持续4小时。在这段时间以后,用2ml新鲜αMEM增殖培养基更换孔中的培养基。将细胞接种的支架培养5或10天。在10天培养期中,在第5天更换培养基。直接在接种以后,以及在第5和10天,用PBS洗涤包含细胞的构建物并用1.5%戊二醛/0.14M二甲胂酸盐缓冲液固定细胞持续15分钟。使用亚甲蓝来染色活细胞,利用立体显微镜对其进行观测。
从不同孔(n=3)取出培养基的样品以获得细胞的代谢图。利用VitrosDT60II系统(Ortho-Clinical Diagnostics,Tilburg,荷兰)来确定葡萄糖和乳酸盐浓度。
结果
为了制备弹性体的光致交联的基于PTMC的网络薄膜和支架,合成了PTMC均聚物以及PTMC与mPEG和PCL的嵌段共聚物。
基于PTMC的聚合物的特性
在纯化和压缩模制以后,合成的高分子量PTMC均聚物的特性列于表5。通过改变在聚合反应中用作引发剂的己二醇的量,可以调节聚合物分子量。在压缩模制以后,PTMC聚合物的分子量与纯化的聚合物并没有太大的差别。
表5还显示在纯化以后PTMC-PCL-PTMC和mPEG-PTMC嵌段共聚物的特性。在嵌段共聚物合成中单体转化率高于99%。在嵌段共聚物中的TMC含量非常接近进料量。
表5.用于制备光致交联网络的基于纯化TMC的聚合物的特性
a在纯化以后使用CDCl3作为溶剂通过1H NMR确定的。
b在纯化以后在30℃下使用氯仿作为洗脱剂通过GPC确定的。在括号内给出压缩模制聚合物的值。
n.d.:未确定的
UV交联基于PTMC的薄膜
为了光致交联高分子量PTMC,用短波UV光(254nm)来照射包含PETA和光引发剂的压缩模制薄膜。当用UV光照射时,可以相对容易地有效地交联PTMC,从而产生透明薄膜。图12A和12B显示了使用氯仿确定的光致交联的PTMC网络的凝胶含量和溶胀比,为照射时间的函数。凝胶含量最初随着照射时间增加迅速地增加,然后缓慢增加。与增加的凝胶含量一致,所形成的网络在氯仿中的溶胀比随照射时间增加而降低,这表明在更长的照射时间下形成了更密的网络。
在300分钟UV曝光下,取决于聚合物的初始分子量,网络的凝胶含量为57±1%至98±1%,并且溶胀比为11.3±0.8至3.7±0.1。
调节PTMC薄膜中的PETA含量还可以制备具有不同凝胶含量和溶胀比的光致交联网络。例如,照射包含1、3、5%PETA的PTMC183聚合物持续180分钟分别产生具有41、71、和91%的凝胶含量,以及65、14、7vol/vol溶胀比的网络。这些结果表明,可以改变PETA含量、UV照射时间、和初始聚合物分子量,以调节网络的凝胶含量和网络密度。光致交联PTMC网络可以由分子量为0.7至40.7kg/mol的三臂PTMC-甲基丙烯酸酯大分子单体来制备。这些网络在氯仿中的溶胀比为3.1至16.9。通过将这些结果与这些基于PTMC(大分子单体)网络的溶胀比相比较,可以估计,在PTMC网络(包含PETA和光引发剂并用UV光照射300分钟)的交联之间的分子量为1100至7600kg/mol的第一近似值,这取决于聚合物的初始分子量。
与通过使用不同臂长的末端官能化大分子单体相比较,仅使用交联剂和光引发剂的光致交联PTMC是更加实用的,并且用于制备不同交联密度的网络。此外,已观察到,甚至在存在自由基清除剂下在处理以前,可以提前交联(甲基)丙烯酸酯末端官能化的PTMC低聚物(未公开的数据)。在本研究中使用的包含PETA的聚合物薄膜仍然可溶于氯仿(甚至在压缩模制以后),这意味着在UV曝光以前没有发生交联。
有趣的是,当并不包含PETA和369的PTMC均聚物薄膜暴露于UV光时,聚合物的数均和重均分子量会增加。在照射300分钟以后,PTMC45、PTMC183和PTMC373的值分别为49、244、和435kg/mol。相应的PDI值为2.2、1.9、和1.3。我们观察到,用短波UV光对非常高分子量PTMC的延长照射会导致聚合物的交联。当48小时照射PTMC443的压缩模制的薄膜时,形成了凝胶含量为53±13%以及在氯仿中的溶胀比为84±10vol/vol的网络。
照射仅包含-369而不包含PETA的PTMC薄膜导致网络形成,但凝胶含量远低于包含PETA和-369两者薄膜的凝胶含量,当UV照射300分钟时,包含0.025wt%光引发剂的PTMC183和PTMC373薄膜分别仅具有25±3和50±2%的凝胶含量以及253±6和72±4vol/vol的溶胀比。
在包含仅光引发剂或光引发剂和PETA两者的薄膜的凝胶含量之间的这种差异可能是由于丙烯酸酯网络有效掺入PTMC链。光致交联PTMC薄膜的溶胶部分的1H-NMR分析并未揭示任何丙烯酸酯相关峰。这意味着所有PETA已结合到所形成的网络中。
除PTMC聚合物和掺合物以外,PCL薄膜的光致交联还研究了包含与PTMC薄膜相同量的PETA和光引发剂的薄膜。初步结果表明,也能够以这种方式来光致交联PCL。相对低分子量的PCL均聚物薄膜具有41±1的凝胶百分比以及在氯仿中的11.3±0.7vol/vol的溶胀比。
另外,可以有效地光致交联PTMC373与PTMC-PCL-PTMC或与包含5wt%PETA和光引发剂的mPEG-PTMC嵌段共聚物的掺合物。当UV照射300分钟时,PTMC373/PTMC-PCL-PTMC掺合物以及PTMC373/mPEG-PTMC掺合物的凝胶含量分别为96±1和93±1。在氯仿中的相应溶胀比为6.3±0.1和6.1±0.6vol/vol。在UV曝光以前,掺合物包含90wt%PTMC373。网络的溶胶部分的1H-NMR分析揭示了,嵌段共聚物含量高于在初始薄膜中的嵌段共聚物含量。可以表明,当将薄膜暴露于UV照射时,大约75-80%的嵌段共聚物已结合到网络中。
光致交联的基于PTMC的网络的机械性能
为了评估光致交联对PTMC聚合物的拉伸机械性能的影响,在未照射的压缩模制的PTMC薄膜和包含5wt%PETA和0.025wt%光引发剂的PTMC薄膜上进行测量,并用UV光照射300分钟(由UV光照射300分钟的薄膜简称为PTMCx-300)。表6给出未交联的和光致交联的PTMC均聚物、以及光致交联的PTMC373/PTMC-PCL-PTMC和PTMC373/mPEG-PTMC掺合物的拉伸机械性能的综述。
所有PTMC均聚物都是弹性模量为3.7±0.1至7.7±0.3MPa的柔性材料。它们的屈服强度、断裂应力、和断裂应变值随聚合物分子量增加而增加。光致交联的PTMC网络薄膜也是柔性材料,虽然它们的弹性模量高于未交联的PTMC薄膜的弹性模量。数值为7.2±0.2至9.6±0.3MPa。当光致交联时,PTMC均聚物的屈服强度和最终拉伸强度显著增加。取决于初始聚合物分子量,未交联薄膜的断裂应力值为0.2±0.1MPa至6.7±2.8MPa。当交联时,薄膜的断裂应力值会增加并且为2.7±0.1至30±9MPa。另外,断裂光致交联的PTMC网络薄膜所需要的能量比未交联的PTMC薄膜高3至9倍,这意味着,在存在PETA下,通过光致交联,可以显著改善PTMC薄膜的韧性。表6清楚地说明,取决于初始PTMC分子量,可以获得具有一定范围的屈服强度、最终拉伸强度和韧性的PTMC网络。
在用乙醇(对于PTMC相对差的溶剂)提取PTMC网络薄膜的溶胶部分以后,还进行拉伸测量。对于由PTMC45制备的网络而言,性能的增强是最明显的,因为提取的薄膜具有较高的弹性模量、屈服强度、断裂应力、和断裂能量值。在由PTMC183和PTMC373制备的网络的情况下,这些数值还似乎略有增加。
与由PTMC373制备的未提取网络相比较,由PTMC373和相对低分子量mPEG-PTMC嵌段共聚物的掺合物制备的光致交联薄膜仅具有稍微降低的弹性模量和屈服强度值,而它们的断裂应力和断裂能量值是可比较的。这表明,在干燥状态下,使PTMC373与高达10%mPEG-PTMC掺合并未显著恶化拉伸性能。然而,与仅由PTMC373制备的网络相比较,由与PTMC-PCL-PTMC嵌段共聚物的掺合物获得的网络具有更低的屈服强度、最终拉伸强度和韧性。由掺合物制备的网络的拉伸性能并不受到用乙醇提取溶胶部分的太大影响。
表6.在存在PETA下,光致交联对基于PTMC的聚合物的机械性能的影响。值表示为平均值±标准偏差(n=3)。
a单次测量。永久变形是由在两小时恢复期以后进行的第21个循环估计的。误差为大约0.5%应变。
b由针对应力-应变图切线的交叉估计,因为无法观察到明显的屈服点。
因为这些PTMC网络旨在经受体外以及体内的重复的动态负载,所以进行循环试验以评估光致交联对它们在在动态条件下的蠕变行为的影响。图2A、2B、和2C显示在光致交联之前和之后PTMC聚合物的滞后行为。这些图清楚地表明,在所有情况下,在存在PETA和光引发剂下,PTMC的光致交联会显着降低滞后并在每个连续的循环中观测到减小的蠕变程度。在未交联状态下,在第20个循环的结束时,PTMC45、PTMC183和PTMC373分别具有45、29、15%的蠕变值。当在存在PETA和光引发剂下进行光致交联时,这些值显著下降:PTMC45-300、PTMC183-300和PTMC373-300分别具有29、12、和8%的蠕变值。此外,当光致交联时,PTMC薄膜的应力松弛(在每个循环中达到的最大应力的减小)也非常大地减小。表6显示在施加50%应变的20次循环和2h恢复期以后这些薄膜的永久变形。可以看出,当光致交联时,PTMC均聚物的永久变形显著下降:在循环试验中,乙醇提取的PTMC网络显示可以与未提取网络比较的蠕变行为,虽然对于提取的网络薄膜而言,永久变形似乎略有降低。在PTMC373的光致交联和提取以后,永久变形值低至1.0%应变。图13A、13B、13C和表6中的永久变形值的比较表明,在循环试验中,由PTMC373制备的光致交联网络显示最小的滞后、最小的应力松弛和最小的永久变形。这意味着,与由相对较低初始分子量的聚合物制备的那些网络相比较,高初始PTMC分子量可以制备具有更好弹性体性能的网络。
图13D和在表6中的永久变形值表明,光致交联掺合物还具有极好的弹性体性能。可以看出,PTMC373与PTMC-PCL-PTMC或mPEG-PTMC掺合对于网络的循环蠕变行为并不具有不利影响。
光致交联的基于PTMC的网络的体外酶侵蚀和润湿性
利用胆固醇酯酶水溶液,研究了基于PTMC373的光致交联网络的酶侵蚀。上述酶是巨噬细胞的分泌产物之一,并且已知可有效地降解γ照射的和光致交联的PTMC网络。温育的聚合物薄膜随时间推移的相对质量和厚度的变化示于图14。在胆固醇酯酶水溶液中线性PTMC373均聚物的侵蚀是相对快速的。当温育11天时,PTMC373试样的质量损失是84±2.5%,对应于2.48±0.45mg/(cm2×天)的质量损失速率。
在酶水溶液中温育28天以后,PTMC373-300、PTMC373/PTMC-PCL-PTMC-300、和PTMC373/mPEG-PTMC-300的光致交联薄膜的质量损失分别为24±2.7、16±1.8、和1.5±0.4%(图14A)。质量损失的相应速率为0.41±0.11、0.27±0.07、和0.017±0.01mg/(cm2×天)。光致交联PTMC373薄膜导致具有大大减小的侵蚀速率的网络,从而允许它们用于长期生物医学应用中。侵蚀速率的降低可能是由于密集网络形成造成的链的受阻移动,因为链需要针对酶攻击采取正确构象。这些结果还表明,通过与嵌段共聚物掺合并且与其光致交联,可以调节PTMC网络的酶侵蚀速率。尤其,当与mPEG-PTMC嵌段共聚物掺合时,会显著降低酶侵蚀。很可能的是,包含mPEG-PTMC的掺合物的表面特性并不允许酶结合于聚合物的表面,如已表明的,上述酶在亲水性-疏水性界面处是最具活性的。实际上,在表7中可以看出,与由PTMC373均聚物或由它与PTMC-PCL-PTMC嵌段共聚物的掺合物制备的光致交联的网络相比较,包含mPEG-PTMC嵌段共聚物的光致交联网络具有显著更低的接触角和略高的水吸收值。显然,通过与亲水性-疏水性嵌段共聚物掺合,可以容易地改变光致交联的PTMC网络的表面特性。
表7.与嵌段共聚物光致交联以及与其掺合对基于PTMC373的薄膜的水接触角和水吸收值的影响。值表示为平均值±标准偏差。
a在浇注在玻璃圆盘(n=8)上的聚合物薄膜上进行的。
b在37℃的PBS中调节压缩模制的、光致交联的、和提取的薄膜持续1周(n=4)。
未照射的PTMC373薄膜具有77.4±0.8的平均静态接触角。有趣的是,与未照射薄膜的接触角相比较,包含PETA和光引发剂(PTMC373-300)的UV照射的PTMC373薄膜的接触角显著地更大(98.9±3.4)。为了评估UV照射的单独作用,我们照射并不包含PETA或光引发剂的PTMC373薄膜。在照射300分钟以后,PTMC373的静态接触角、前进接触角、和后退接触角分别为85.3±1.1°、87.5±0.9°、和52.0±1.4°,它们同样高于未照射的PTMC。这证实了,在惰性条件下进行交联,因为在空气中短波长紫外线照射将导致聚合物表面氧化并增加亲水性(更小的接触角)。据报道,在2×10-4Pa的减压下,当真空UV照射(126nm)时,PMMA的接触角也增加大约20°。这与在聚合物表面上碳的百分比增加相关。
图7B显示,在酶降解期间,随时间推移,未交联的PTMC373薄膜以及光致交联的PTMC373-300和TMC373/PTMC-PCL-PTMC-300薄膜的厚度也减小。这表明,通过表面侵蚀过程来侵蚀这些聚合物和网络薄膜。可以确定PTMC373/mPEG-PTMC-300试样的厚度没有显著减少,但SEM分析揭示了这些薄膜一定程度的表面点蚀,这证实了它们的缓慢的表面侵蚀(数据未显示)。
光致交联的基于PTMC的组织工程支架
为了制造TE支架,制备了聚合物(PTMC373均聚物、PTMC373/PTMC-PCL-PTMC或PTMC373/mPEG-PTMC掺合物)、PETA、光引发剂、和碳酸亚乙酯的溶液。使用生物打印机(bioplotter)、光致交联、以及提取处于水和乙醇中的碳酸亚乙酯和其他可能的可浸出物,通过计算机控制挤出聚合物溶液来制备光致交联的基于PTMC的三维支架。
由基于PTMC的柔性聚合物制备的支架具有70±6%的高孔隙率以及互连孔。图4显示由PTMC373聚合物制备的光致交联支架的SEM显微照片。当使用PTMC373/PTMC-PCL-PTMC或PTMC373/mPEG-PTMC掺合物时,也获得类似的结构。从图15A和15B中可以看出,在设计在x或y方向上打印的纤维之间的距离为大约200-250μm并且纤维的直径为100-150μm。孔的高度为50至100μm(图15D)。
使用碳酸亚乙酯(EC)作为溶剂允许在100-120℃的相对较低的温度下挤出高分子量PTMC聚合物。在不使用EC的情况下,甚至对于挤出相对低分子量PTMC45聚合物也需要高于220℃的温度。此外,用冷氮气冷却挤出的纤维会诱导碳酸亚乙酯结晶。EC的结晶不仅为无定形PTMC聚合物的挤出纤维提供所需要的形状稳定性,而且还导致形成具有微孔性的纤维。在图15C中可以特别清楚地看出在纤维中的这些微孔(几微米至几十微米)和纤维表面的粗糙度。在组织工程中这些PTMC支架的微孔性可以是有利的,因为已经显示通过表面粗糙度,可以改善细胞与基质的附着以及它们的存活率。这种微孔性还可以导致营养物运输到细胞中以及从细胞中去除废物的增强。
将人间充质干细胞(hMSC)接种于光致交联的(300分钟)基于PTMC的支架并培养10天。图16显示用亚甲蓝染色的活细胞。可以看出,在由PTMC373和PTMC373/PTMC-PCL-PTMC制备的支架之上和之中存在的细胞数目从接种当天(图16A、16D)至第5天(图16B、16E)会增加。在培养10天以后,这些支架包含很高数目的活细胞,如从图16C和16F中的广泛的(蓝色)染色可以看到的。在由PTMC373/mPEG-PTMC掺合物制备的支架之上和之中的细胞量远小于其他两种材料。这种材料的亲水特性可能不容许吸附存在于细胞培养基中的细胞结合蛋白,这会阻碍hMSC粘附于这些表面。
通过SEM,证实了这些观测结果(图17)。在培养5天以后,在纤维上观测到具有拉伸的成纤维细胞样形态的hMSC(图17A、17D、17G)。图17B和17E显示,hMSC增殖并且由PTMC373和PTMC373/PTMC-PCL-PTMC制备的光致交联支架的表面几乎完全覆盖着细胞。从图17C、和17F的横截面可以看出,细胞也存在于支架内并已产生细胞外基质。这表明,这些材料与hMSC相容。并且使用SEM,在由PTMC373/mPEG-PTMC掺合物制备的支架上看到少量的细胞。
在hMSC培养期间,通过确定培养基中葡萄糖和乳酸盐浓度来监测细胞的代谢图。图18A和18B显示在第5、8和10天的葡萄糖和乳酸盐浓度(请注意,在第5天更换培养基。)。在所有培养物中,随时间的推移,葡萄糖浓度降低而乳酸盐浓度则增加。因为较高数目的细胞存在于由PTMC373和PTMC373/PTMC-PCL-PTMC制备的光致交联支架中,所以在包含这些细胞接种支架的孔中葡萄糖消耗和乳酸盐生产均较高。在包含由PTMC373/mPEG-PTMC掺合物制备的细胞接种支架的孔中,葡萄糖消耗和乳酸盐生产均较低,因为在这些支架中存在显着较少的细胞。对于使用PTMC373-300、PTMC373/PTMC-PCL-PTMC-300、和PTMC373/mPEG-PTMC-300的支架的培养物而言,葡萄糖消耗的速率分别为23.3±1.7、25.0±2.4、和9.8±1.5μM/h。相应的乳酸生产速率为60.8±6.5、63.2±8.1、和34.1±3.9。这些结果表明,与由PTMC373/mPEG-PTMC制备的那些支架相比较,PTMC373-300和PTMC373/PTMC-PCL-PTMC-300的支架更适合于组织工程的应用。(然而,包含mPEG-PTMC嵌段共聚物的网络可以用来改善生物材料(如血管移植物)的血液相容性。)
结论
这项研究表明,通过包含PETA和光引发剂的PTMC薄膜的有效的光致交联,可以获得具有极好的弹性体性能和降低的酶侵蚀速率的、柔性的和韧性的PTMC网络。通过与包含嵌段共聚物的PCL或PEG掺合,可以很容易地改变这些PTMC网络的性能(如润湿性和酶侵蚀)。可以通过热塑性PTMC聚合物的熔融沉积成型以及随后UV光致交联支架,来获得具有互连孔和广泛的微孔性的组织工程支架。由PTMC373聚合物和PTMC373/PTMC-PCL-PTMC掺合物制备的光致交联支架适用于组织工程的应用,因为它们允许人间充质干细胞的黏着和增殖。这种通用的交联方法为高分子量聚合物的简便交联和以这种方式来改进它们的性能提供了令人感兴趣的机会。
实施例4
材料
按原接收状态使用聚合物级碳酸1,3-三亚甲基酯(TMC,BoehringerIngelheim,德国)、1,3-丙二醇、三羟甲基丙烷、和辛酸亚锡(均来自Sigma,美国或德国)。甲基丙烯酸酐和氢醌购自Aldrich(德国)。(±)-□-生育酚获自Fluka(瑞士)。溶剂(Merck,德国,或Biosolve,荷兰)具有分析级。按原接收状态使用光引发剂2959(1-[4[(2-羟基乙氧基)-苯基]-2-羟基-2-甲基-1-丙烷-1-酮)、369(2-苄基-2-二甲基氨基-1-(4-吗啉代苯基)-丁酮-1)、500(50%1-羟基-环己基-苯基-酮、50%二苯甲酮)(瑞士)、二苯甲酮(Aldrich,德国)、和DMPA(2,2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮)(Aldrich,德国)。
J774A巨噬细胞(ATCC-TIB-67)获自美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)。培养基、胎牛血清、GlutamaxTM和青霉素-链霉素获自Invitrogen(Gibco,美国)。培养一次性用品来自Nunc(美国)和Greiner(德国)。对于人间充质干细胞培养,使用了α-最低限度的基本培养基(α-MEM,Gibco美国)。这种培养基还包含胎牛血清(10%,Biowhitaker,比利时)、青霉素G(100单位/ml,Invitrogen美国)和链霉素(100μg/ml,Invitrogen美国)、L-谷氨酰胺(2mM,Sigma,美国)。在使用前,将来自猪胰腺的胆固醇酯酶(CE)(Sigma,英国,56.2U/mg)和二氧化钾(KO2,Sigma,美国)分别溶解于磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH=7.4,B.Braun MelsungenA.G.,德国)和NaOH/NaCl缓冲液(pH=13,Scharlau Chemie,西班牙)中。
PTMC聚合物和PTMC大分子单体交联剂的合成
在真空下在130℃下,使用辛酸亚锡作为催化剂,通过TMC单体的开环聚合反应持续三天来合成线性高分子量聚(碳酸三亚甲酯)(PTMC)。通过溶解于氯仿并沉淀到乙醇中,用新鲜乙醇洗涤并在室温下在真空下干燥,来纯化聚合物。
通过使用1,3-丙二醇(20摩尔%)或三羟甲基丙烷(14.3摩尔%)作为引发剂,通过开环聚合反应(低聚反应),来合成双臂和三臂的羟基封端的PTMC低聚物(参见图19)。在氩气下在130℃下,使用辛酸亚锡作为催化剂,进行合成持续48h。为了获得甲基丙烯酸酯官能化的PTMC低聚物(大分子单体),在120℃下使羟基封端的低聚物和30摩尔%过量的甲基丙烯酸酐反应8h。为了防止在此步骤期间的过早交联,将氢醌和(±)-α-生育酚(0.06wt%)用作抑制剂。通过在减压下蒸馏来除去过量的甲基丙烯酸酐和形成的甲基丙烯酸。通过溶解于丙酮,沉淀到水中并冷冻干燥,来进一步纯化PTMC大分子单体。
表征
使用CDCl3通过质子核磁共振(1H-NMR)光谱仪(300MHz,VarianInnova,美国)来确定TMC单体的转化。
通过凝胶渗透色谱法(GPC,Viscotek,美国)来确定PTMC的数均和重均分子量(分别为和)、多分散指数(PDI)和特性粘度([η])。设置配备有串联放置的ViscoGEL I-guard-0478、ViscoGELI-MBHMW-3078、和ViscoGEL I-MBLMW-3078柱,以及具有折光检测器、粘度检测器、和光散射检测器的TDA302三检测器阵列(TripleDetector Array),从而可以测定绝对分子量。在30℃下,使用氯仿作为洗脱剂,在1.0ml/分钟的流速下,进行所有测定。
通过1H-NMR光谱术来确定两臂大分子单体和三臂大分子单体(分别为二甲基丙烯酸酯低聚碳酸酯,DMAC,和三甲基丙烯酸酯低聚碳酸酯,TMAC)的分子量。
PTMC薄膜的制备
通过在黑暗中将化合物溶解和混合于二氯甲烷,将PTMC均聚物与不同量的光引发剂和大分子单体交联剂混合。在蒸发溶剂以后,利用厚度为500μm的不锈钢模具和实验室压制机(Fonteijne THB008,荷兰)来制备压缩模制的薄膜。在大约25kg/cm2下,在140℃下,模塑薄膜,并使用冷水骤冷至室温。
光致交联和网络表征
将包含大分子单体(DMAC或TMAC)和光引发剂的压缩模制的薄膜真空密封于层压的聚乙烯/聚酰胺袋(Hevel Vacuum B.V.,荷兰)中并在7cm的距离处暴露于短波UV光(UltraLum交联室,美国,波长254nm)。在室温下照射试样的两侧持续不同时间。在此距离处的光强度为10-14mW/cm2,如使用光功率计(Newport1916-C,美国)测量的,聚乙烯/聚酰胺袋将强度降低至5-7mW/cm2,。
为了确定平衡溶胀比和凝胶含量,从照射的薄膜冲切出盘状试样(500μm厚度,10mm直径)并放置在30mL CHCl3中持续1周,在3天以后更换溶剂一次。此程度可以确保完全去除溶胶部分。然后称重溶胀的凝胶,在室温下在真空下干燥至恒重并再次称重。按照方程(1)和(2)来分别计算凝胶部分和溶胶部分:
其中md是干燥(提取)样品的质量并且m0是溶胀以前试样的质量。
按照方程(3)来计算体积溶胀比(q)。
其中ms是提取和溶胀样品的质量,并且ρs和ρp分别是氯仿(1.48g/cm3)和PTMC(1.31g/cm3)的密度。
机械性能
按照ASTM-D882-91,在乙醇中提取以后,重复三次确定光致交联PTMC薄膜的拉伸性能,测得为大约100x5x0.5mm3。在50mm/分钟的十字头速度下,操作配备有500N测压元件(load cell)的Zwick Z020拉伸测试仪(Ulm,德国)。初始夹头间距离为50mm并施加0.01N的预加载。试样变形源自夹头间距离;因此提供的杨氏模量(由应力-应变曲线的起始斜率计算)仅给出聚合物刚度的指示。
为了评估它们在动态负载条件下的行为,在循环试验中,在50mm/分钟下,将试样(n=1)重复(20x)伸长至50%应变。在2h恢复期以后,由第21个循环的应力-应变图估计永久变形。在这些实验中,施加0.01N的预加载,形变源自夹头间距离。数值的误差大约为0.5%应变。
人间充质干细胞培养
在盘状光致交联和乙醇提取的PTMC薄膜(15mm直径和大约200μm厚度)上培养人间充质干细胞(hMSC)。在细胞培养以前,通过在70%乙醇中浸泡15分钟来消毒薄膜,然后用无菌PBS洗涤。hMSC获自接受全髋关节置换手术的供体,其给予知情同意书。得到当地医疗伦理委员会的批准。使用αMEM以5x104个细胞/cm2的初始接种密度来培养细胞(第2代)。每周更换培养基两次。
在培养4周以后,用3.7%多聚甲醛来固定在薄膜上的细胞。一半试样用金溅射涂覆,然后在5kV的操作电压下通过扫描电子显微镜(SEM,Philips XL30ESEM-FEG,荷兰)来分析它们的表面。剩余一半用于使用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)进行细胞核荧光染色。使用小鼠单克隆α-肌节肌动蛋白作为一抗以及异硫氰酸荧光素(FITC)标记的同型特异性山羊抗小鼠二抗来染色细胞的肌动蛋白细胞骨架。然后通过共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)来分析这些试样。
体外侵蚀研究
将用于巨噬细胞介导的侵蚀研究的J774A巨噬细胞保持在包含4.5g/L D-葡萄糖、丙酮酸盐(酯)、10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素和100μg/mL2mM GlutamaxTM的DMEM中。通过刮取,每4至7天,将细胞传代。
通过在薄膜表面上直接培养J774A巨噬细胞,研究了在巨噬细胞培养物中光致交联和乙醇提取的聚合物薄膜的侵蚀。测试样品的直径为15mm并且厚度为大约500μm。接种密度为大约8x104个细胞/cm2。在不同表面上培养细胞8天以后,将新鲜等分部分的细胞加入培养物。在每种材料的6个圆盘上培养细胞。一周一次更换培养基。
在培养14天以后,首先将每种材料的3个试样放入Milli-Q水中以溶解细胞,然后彻底冲洗并称重。在真空下在室温下干燥薄膜至恒重以后,再次称重试样。如上文所述,通过SEM来评估试样的表面。
用处于细胞骨架稳定(CS)缓冲液(0.1M哌嗪-1,4-二(2-乙磺酸)(PIPES)缓冲剂、1mM乙二醇四乙酸(EGTA),pH=6.9)中的3.7%多聚甲醛来固定每种材料的剩余圆盘(n=3)持续15分钟,然后转移到PBS。试样用于使用DAPI进行细胞核的荧光染色,以及使用四甲基罗丹明异硫氰化物-鬼笔环肽(TRITC-鬼笔环肽)进行肌动蛋白细胞骨架的荧光染色。利用CLSM(配备有40X NA0.80全浸水透镜的Leica TCS SP2)来分析样品以允许粘附的细胞深度可视化。
来自猪胰腺的胆固醇酯酶(CE)用来研究未交联和光致交联的PTMC薄膜的酶水解。使用包含作为杀菌剂的0.02wt%NaN3(Sigma,美国)的磷酸盐缓冲盐水(PBS,pH=7.4)以20μg/mL的浓度来制备CE酶水溶液。将乙醇提取的、盘状薄膜(8mm直径,大约500μm厚度,n=8)放入包含1ml新鲜制备的酶溶液的小瓶中并在37℃下加以调节。每两天更换培养基一次。在温育14天以后,在冲洗和吸干它们的表面以后,确定湿试样的质量。在真空下在室温下干燥试样至恒重以后再次进行测量。
通过在使用NaOH/NaCl缓冲液(pH=13)制备的KO2水溶液[5M]中温育,还研究了具有相同尺寸的PTMC(网络)薄膜的体外侵蚀。将试样(n=4)放入包含1mL新鲜制备的超氧化物溶液的小瓶中。每日更换溶液。在37℃下温育1周以后,如上文所述确定质量损失。
润湿性和水吸收
在通过在玻璃圆盘(n=6/材料)上浇注处于二氯甲烷中的聚合物溶液(大约1wt%),在真空下干燥,并在惰性气氛下光致交联而制备的薄膜上进行接触角测量。在室温下,利用配备有电子注射器模块的基于视频的系统(OCA20DataPhysics Instruments GmbH,德国)来确定超纯水(MilliQ Plus-Millipore,法国)在不同表面上的静态接触角、前进接触角和后退接触角。
在用乙醇提取以后,确定压缩模制的和光致交联的薄膜的平衡水吸收。在37℃下在PBS(pH=7.4)中调节试样(n=4)持续1周。水吸收被定义为试样的质量增加。
结果
通过TMC的开环聚合来合成的线性高分子量PTMC。通过用少量的1,3-丙二醇或三羟甲基丙烷来引发TMC的开环聚合,并且随后使双臂和三臂低聚物与甲基丙烯酸酐反应,来制备PTMC大分子单体。在用UV光照射高分子量PTMC期间,将甲基丙烯酸酯官能化的DMAC大分子单体和TMAC大分子单体用作交联剂。
1H NMR分析表明,在开环聚合(低聚反应)反应中TMC的转化率高于95%,并且在大分子单体中99%以上的羟基端基已被转化成甲基丙烯酸酯。通过NMR还确定了纯化的DMAC和TMAC大分子单体的数均分子量,各自的值为810g/mol和1100g/mol(或2.9和2.5TMC单位/臂)。
利用光引发剂光致交联PTMC薄膜
在初步实验中,制备包含不同光引发剂(PI)的线性高分子量PTMC的薄膜并用短波UV光照射30至120分钟。(PI与聚合物中TMC重复单元的摩尔比率为1∶1000)。令人惊讶地发现,当2959、500、或二苯甲酮用作PI时,则获得具有高凝胶含量的PTMC网络。使用这些PI,在120分钟照射以后,获得具有84-87%凝胶的网络。当照射包含DMPA、或369的PTMC薄膜持续120分钟时,凝胶含量低得多:分别为62%和0%。
还已表明,在存在经历Norrish II型光解的光引发剂(如二苯甲酮)下,当UV照射时聚乙烯和聚(环氧乙烷)发生交联,并作为氢夺取剂(hydrogen abstracting agent)。据提议,通过两个大分子基团结合形成H型交键,两种聚合物发生交联。另外,在存在经历Norrish I型光解(α-裂解)的光引发剂下,聚(环氧乙烷)也可以较低效地交联。在使用PTMC的实验中情况也是这样,其中经历Norrish I型光解的光引发剂(DMPA和369)产生最低的网络凝胶含量。
通过照射包含不同量的2959的PTMC薄膜持续范围从30分钟直至300分钟的时间,评估了PI浓度对凝胶含量和网络密度的影响。对于所有照射时间(30、60、120、180、240、和300分钟),增加PTMC薄膜的PI含量会最初增加所形成的PTMC网络的凝胶含量并降低其溶胀比。图20显示照射时间为120分钟的情况。对于所有照射时间,发现最佳PI/TMC比(其中获得最高凝胶含量和最低溶胀比)为1/1000。在高于1/1000的PI浓度下,凝胶含量的降低可能是由于量子产率的降低。这可能是由于竞争反应:光引发自由基可以和PTMC链反应或光引发自由基可以彼此反应或与PTMC大分子基团反应。
对于所有PI浓度,照射薄膜持续少于120分钟会导致较低的网络凝胶含量和较高溶胀比。增加照射时间超过120分钟并不产生具有较高凝胶含量或较高网络密度的网络。
在PTMC大分子单体的恒定浓度(1/50甲基丙烯酸酯/聚合物中TMC重复单元)下,随着PI浓度增加(1/8000、1/4000、1/2000、1/1000PI/聚合物中TMC重复单元),所形成网络的凝胶含量增加而溶胀比则降低。当DMAC和TMAC两者用作交联剂时观测到这种情况。例如,当照射包含DMAC的薄膜持续30分钟时,当PI/TMC比从1/8000增加到1/1000时,所形成的网络的凝胶含量从53±2%增加到89±1%。在氯仿中的相应溶胀比为23.2±0.6和13.9±0.2vol/vol。因此,在进一步的实验中,使用1/1000的最高PI/TMC比。当照射PTMC薄膜持续60分钟或120分钟时,观察到同样的趋势:增加照射时间也产生具有较高凝胶含量和较低溶胀比的网络。
所使用的照射时间和交联剂对PTMC网络薄膜的凝胶含量和溶胀比的影响示于图21。PTMC薄膜具有1/1000的PI/TMC比,并且对于包含DMAC或TMAC的薄膜,则具有1/50的甲基丙烯酸酯/TMC比。取决于UV照射时间,由并不包含PTMC大分子单体的PTMC薄膜制备的网络(PTMC-PI)的凝胶含量和溶胀比分别为64±3至87±2%以及48±1至14.6±1.2vol/vol。对于由包含PTMC大分子单体的薄膜制备的网络,凝胶含量为89±1至95±1%(对于PTMC-PI-DMAC)以及91±1至94±1%(对于PTMC-PI-TMAC)。重要的是,通过调节照射时间,可以调节这些网络的密度,同时维持高凝胶含量。在氯仿中的溶胀比为13.9±0.2至8.5±0.1vol/vol。
在图2中也可以看到,在薄膜中使用PTMC大分子单体作为交联剂会显著增加交联速率,从而比仅包含光引发剂的PTMC薄膜快得多地产生高凝胶含量和低溶胀比。在30分钟UV照射以后,PTMC-PI、PTMC-PI-DMAC、和PTMC-PI-TMAC分别具有64±3、89±1、91±1%的凝胶含量。相应的溶胀比为48±1、13.9±0.2、12.2±0.3vol/vol。由包含二甲基丙烯酸酯交联剂或三甲基丙烯酸酯交联剂的PTMC薄膜制备的网络的特性差异是最小的,虽然TMAC网络薄膜似乎稍微更密集地交联。
我们还研究了薄膜中大分子单体含量对PTMC网络形成的影响。在恒定PI/TMC比(1/1000)下,我们变化薄膜的TMAC含量。以此方式,我们也可容易地调节这些薄膜的网络密度:对于0、1/200、1/100、1/50的甲基丙烯酸酯/TMC比而言,网络的溶胀比分别为14.6±1.2、12.4±0.3、11.4±0.3、8.5±0.1vol/vol。所有上述网络具有87±2至94±1%的高凝胶含量。
观测到的高凝胶含量和网络密度表明,大分子单体被并入PTMC网络。
光致交联的PTMC网络的机械性能
由线性PTMC制备的以及由光致交联和提取PTMC网络薄膜制备的压缩模制薄膜的拉伸性能示于表7,同时代表性的应力-应变曲线则示于图22。PTMC光致交联已导致显著较高的断裂应力值,而断裂应变值仍然很高。光致交联导致具有高得多的韧性的薄膜。由包含作为交联剂的TMAC的高分子量PTMC薄膜制备的PTMC网络具有高达24±3MPa的断裂应力值。此外,PTMC的柔性特性没有受到交联的很大影响。由线性PTMC制备的薄膜的弹性模量值为6.6±0.5MPa,而对于光致交联的PTMC薄膜而言,弹性模量值则为7.1±0.1至7.5±0.2。这是最重要的,因为这些网络旨在用于涉及软组织的医疗应用。
当在组织工程支架中培养细胞时,经常使用生物反应器,因为这可以紧密地配合体内动态条件。因此,在有待这样的应用中使用的材料应能够经受施加的重复循环应力并从中恢复。通过施加伸长至50%应变的20次循环,我们评估了网络薄膜的抗蠕变性。图23示出应力-应变曲线,显示了不同材料的这些20次循环。在20次循环以后,未照射的PTMC薄膜具有最大蠕变(15.3%)。在2h恢复期以后,它们的永久变形为1.6%应变(表7)。在循环试验中,光致交联网络薄膜显示显著改善的弹性行为以及小得多的蠕变。在第20个循环以后,PTMC-PI、PTMC-PI-DMAC、和PTMC-PI-TMAC分别具有9.9、7.5、和7.6%应变的蠕变值。这些网络的永久变形值低至0.6%应变。
在循环测试中观察到的另一种现象是最大应力值的降低,由于应力松弛在加载循环结束时达到所述最大应力值是。应力松弛是不希望的,因为,当施加循环应力时,它会导致构建物(如血管组织工程支架和移植物)的扩张和故障。通过光致交联,还可以降低PTMC的应力松弛。对于未交联的PTMC而言,最大应力从3.2降低至2.4MPa,而在光致交联薄膜的情况下,这种降低仅为0.3-0.4MPa。
表7.通过UV光致交联仅包含光引发剂或光引发剂和PTMC大分子单体的PTMC薄膜所制备的PTMC和PTMC网络的机械性能。值表示为平均值±标准偏差(n=3)。
a基于聚合物中的TMC重复单元
b单次测量。在两小时恢复期以后,由第21个循环估计永久变形。误差为大约0.5%应变。
c线性PTMC聚合物,通过沉淀纯化并且在真空中干燥,然后压缩模制
d用乙醇提取网络并在真空中干燥。
e由针对应力-应变图切线的交叉来估计,因为无法观察到明显的屈服点。
人间充质干细胞培养
为了评估光致交联和提取的PTMC网络与细胞的相容性,在PTMC-PI-TMAC(1/50甲基丙烯酸酯/聚合物中TMC重复单元)表面上培养人间充质干细胞(hMSC)。在培养期间,hMSC保持存活;图24显示在4周以后在薄膜表面上的hMSC。在此时,在网络薄膜上存在具有伸长形态的hMSC的密集群体。这种初步测定表明,这些光致交联的PTMC网络是用于制备组织工程支架的合适材料,因为hMSC在这些表面上会很长时间保持存活并处于健康状态。在这些基于PTMC的网络薄膜上hMSC的分化是进一步研究的课题。
光致交联的PTMC网络的体外侵蚀和润湿性
在植入可吸收性聚合物以后,在组织-生物材料界面处巨噬细胞变成主要细胞。巨噬细胞可以参与异体反应事件以及参与生物材料降解和侵蚀事件。巨噬细胞培养已用作用于可降解聚合物的生物相容性和生物降解的初步体外测定。通过这样的测定,表明短链聚(3-羟基丁酸)的小晶体颗粒可能以剂量依赖方式损害巨噬细胞,这表明降解产物和降解速率对于可生物降解聚合物的生物相容性的重要性。为了评估光致交联PTMC网络的侵蚀行为,我们在提取的网络薄膜上培养巨噬细胞并将它们的侵蚀作用与线性PTMC薄膜进行比较。所有网络薄膜包含1/1000的PI/TMC重复单元、不同量的TMAC(甲基丙烯酸酯/TMC重复单元为0、1/200、1/100、1/50)并通过120分钟UV照射进行光致交联。
在巨噬细胞培养14天以后,发现所有PTMC薄膜已受到侵蚀。它们的质量已减少并且在薄膜表面上观测到形成凹点,这表明在巨噬细胞培养期间表面的侵蚀(图25)。表8给出在巨噬细胞培养物中薄膜的侵蚀速率的综述。值得注意的是,在培养期间,没有观测到所使用的基于PTMC的材料或它们的降解产物对巨噬细胞的细胞毒性作用。此外,上述材料和它们的降解产物均没有诱导巨噬细胞的活化。这表明这些材料的生物相容性并证实用间充质干细胞进行的观察。
表8.在巨噬细胞培养物中,或在胆固醇酯酶或二氧化钾水溶液中温育的,未交联的和光致交联的PTMC薄膜的表面侵蚀速率。
a基于聚合物中的TMC重复单元
b线性PTMC聚合物,通过沉淀纯化并在真空中干燥。
c用乙醇提取网络并在真空中干燥。
在由线性PTMC制备的薄膜上,巨噬细胞是最有效的。这些薄膜的侵蚀速率为159±8(μg/(cm2×天)),这相应于3.8±0.2%的质量损失。SEM揭示了,表面已被广泛侵蚀(图25A和25B)。通过光致交联可以减少PTMC薄膜的侵蚀,因为PTMC-PI网络薄膜的侵蚀远小于未交联的PTMC薄膜。这是非常重要的,因为线性或轻度交联的PTMC薄膜在体内相对快速地侵蚀,从而阻碍它们用于长期生物医学应用。通过使用PTMC大分子单体作为交联剂,可以进一步减小侵蚀速率。具有甲基丙烯酸酯相对于TMC的比率为0、1/200、1/100、和1/50的薄膜的侵蚀速率分别为28±4、16±4、12±1、11±3(μg/cm2×天)(相应于0.7%至0.3%的质量损失)。在图25C至25J中,随着交联剂的量增加,薄膜侵蚀程度的减小是非常明显的;在薄膜表面上的凹点已变得浅得多。
所观测到的光致交联薄膜的巨噬细胞介导的侵蚀的减小可能是由于(更密集的)网络形成,这使得键更加不易(酶)水解。在氯仿中这些网络的溶胀比为14.6±1.2至8.5±0.1vol/vol。另一个原因可能是在不同表面上巨噬细胞的黏着和增殖的差异。在培养14天以后,我们确定了在不同网络薄膜上的细胞数目。图26中显示与在未交联的PTMC薄膜(5657±755个细胞/mm2)或PTMC-PI网络薄膜(6574±1433个细胞/mm2)上的情况相比较,包含作为交联剂的TMAC的网络薄膜具有较低数目的巨噬细胞(2607±1033至4082±681)。然而,在不同表面上细胞数目的减少远小于不同薄膜侵蚀的减少。因此,甚至在将侵蚀速率归一化到细胞数目以后,当交联时PTMC薄膜的侵蚀速率降低也是显而易见的。
细胞在生物材料上的附着在很大程度上取决于蛋白质吸附,这取决于生物材料的表面性能。针对未交联的和光致交联的PTMC薄膜的水在空气中的接触角和水吸收量列于表9。数值表明,PTMC和它的网络是疏水性的。当在PBS中温育1周以后,所有薄膜获得大约1%重量。当交联时,并随着TMAC的量增加,接触角从80°增加至97°。与线性PTMC相比较,包含TMAC的网络薄膜的非常高的疏水性可能导致巨噬细胞在较小程度上附着于这些表面,因为非常疏水的或非常亲水的表面并不促进细胞附着。
表9.光致交联和大分子单体含量对PTMC薄膜的水接触角和水吸收值的影响。值表示为平均值±标准偏差。
a在37℃的PBS中调节压缩模制的薄膜持续1周(n=4)。
b在玻璃圆盘上浇注的聚合物薄膜上进行(n=6)。
另外,根据本发明,使用胆固醇酯酶(CE)水溶液和KO2水溶液,研究了光致交联的PTMC网络的侵蚀。表8显示当在这些溶液中温育时确定的未交联的和光致交联的PTMC薄膜的侵蚀速率。
当在胆固醇酯酶水溶液中温育时,未交联的PTMC薄膜随时间推移线性地侵蚀。未交联的PTMC试样的表面侵蚀以2160±600(μg/cm2×天)的速率进行,从而导致在14天内87.9±1.6%的质量损失。在这种情况下,与在巨噬细胞介导的侵蚀中观测到的相比较,光致交联对PTMC的酶侵蚀具有更显着的影响。当在CE溶液中温育15天时,具有0至1/50的甲基丙烯酸酯相对于TMC比率的网络薄膜的质量损失为6.6±1.8%至0.6±0.2%(相应于137±38至15±3(μg/cm2×天)的速率)。
当在包含超氧化物阴离子自由基的缓冲液中温育时,未交联的和交联的PTMC薄膜的质量以恒定速率减少,这意味着在这些介质它们的表面侵蚀。未交联PTMC的侵蚀速率为2040±360(μg/cm2×天),这可以与当在CE溶液中温育这些薄膜时所观测到的侵蚀速率(2160±610(μg/cm2×天))相比较。当在KO2水溶液中温育1周时,未交联薄膜的质量损失为48.7±8.5%。在仅存在光引发剂下,通过光致交联也可以减小通过氧化性物质的PTMC降解。当温育1周时,PTMC-PI网络的质量损失为30.8±3.7,而PTMC-PI-TMAC网络则具有大约16±0.5%的质量损失。
结论
Claims (22)
1.一种用于制备可降解聚合物网络的方法,包括:
a)通过在20°C至200°C之间的温度下聚合获自环状碳酸酯和/或环状酯和/或环醚和/或直链碳酸酯和/或直链酯和/或直链醚和/或直链羟基羧酸的单体来制备聚合物组合物;
b)添加包含至少一个C-C双键或C-C三键的交联剂和/或交联自由基引发剂;
c)将所述聚合物组合物加工成所期望的形状;
d)通过照射所述混合物进行交联。
2.根据权利要求1所述的方法,所述交联剂选自由丙烯酸酯、甲基丙烯酸酯、多丙烯酸酯、多甲基丙烯酸酯、延胡索酸酯、多延胡索酸酯、马来酸酯、多马来酸酯、马来酸酐、衣康酸酯、多衣康酸酯、或它们的衍生物组成的组。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,所述交联剂选自下组:二丙烯酸亚乙酯、二丙烯酸乙二醇酯、二丙烯酸四乙二醇酯、二丙烯酸聚乙二醇酯、三丙烯酸三羟甲基丙烷酯、三丙烯酸季戊四醇酯、四丙烯酸季戊四醇酯、二甲基丙烯酸乙二醇酯、二甲基丙烯酸四乙二醇酯、二甲基丙烯酸聚乙二醇酯、丙烯酸酯官能化的聚(碳酸三亚甲基酯)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(碳酸三亚甲基酯)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(碳酸三亚甲基酯)类低聚物、丙烯酸酯官能化的聚(D,L-丙交酯)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(D,L-丙交酯)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(D,L-丙交酯)类低聚物、丙烯酸酯官能化的聚(L-丙交酯)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(L-丙交酯)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(L-丙交酯)类低聚物、丙烯酸酯官能化的聚(ε-己内酯)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(ε-己内酯)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(ε-己内酯)类低聚物、丙烯酸酯官能化的聚(乙二醇)类低聚物、甲基丙烯酸酯官能化的聚(乙二醇)类低聚物、延胡索酸酯官能化的聚(乙二醇)类低聚物、或它们的衍生物。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法,其中按所述聚合物组合物的总重量的重量百分比计,所述交联剂包含0.01至15wt%,优选0.1%wt至10%wt,更优选0.5%wt至8%wt,最优选1%wt至5%wt的交联剂。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法,其中在步骤a)中的所述单体获自选自下组的环状碳酸酯:碳酸三亚甲基酯、碳酸亚乙酯、二乙二醇双烯丙基碳酸酯、和它们的衍生物。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中在步骤a)中的所
述单体获自选自下组的环状酯:L-丙交酯、D-丙交酯、D,L-丙交酯、
ε-己内酯、二噁烷酮、乙交酯、和它们的衍生物。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中在步骤a)中的所述单体获自选自下组的直链碳酸酯:碳酸二乙酯或碳酸二苯酯。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中在步骤a)中的所述单体获自选自下组的直链酯:富马酸单乙酯、富马酸二乙酯、对苯二甲酸二甲酯、对苯二甲酸二乙酯。
9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中在步骤a)中的所述单体获自选自下组的直链醚:聚乙二醇。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中按总共聚物的摩尔百分比计,在步骤a)中的所述聚合物组合物包含40%摩尔至85%摩尔,优选50%摩尔至70%摩尔,更优选60%摩尔至70%摩尔的环状或直链碳酸酯含量。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述交联自由基引发剂选自下组:光引发剂、热引发剂、氧化还原引发剂。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中按所述聚合物组合物的总重量的重量百分比计,步骤b)进一步包含0.001%wt至0.1%wt,优选0.005%wt至0.075%wt,更优选0.01%wt至0.05%wt,最优选0.025%wt的所述交联自由基引发剂。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中步骤b)包含溶剂,所述溶剂是丙酮、二氯甲烷、氯仿、四氯化碳、碳酸亚乙酯、碳酸亚丙酯、二甲基亚砜、甲苯、苯、四氢呋喃或1,4-二噁烷。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中在步骤d)中的所述照射是紫外线、可见光、红外、微波、或γ照射。
15.根据权利要求14所述的方法,其中所述γ照射包括10至150kGy,优选20至120kGy,更优选25至100kGy的辐射。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中在20℃至200℃的温度下,通过压缩模制、挤出模制、注射模制或铸造,来获得在步骤d)中的所述聚合物组合物的所述期望的形状。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法,其中在步骤c)中的所述期望的形状是薄膜,所述薄膜具有1μm至1000μm,优选10μm至750μm,更优选50μm至600μm的厚度。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法,其中所述聚合物组合物的制备包括开环聚合和/或缩聚。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法,其中在100°C至160°C之间、更优选120°C至150°C的温度下,制备所述聚合物组合物。
20.一种可降解聚合物网络,可以通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法来获得。
21.一种根据权利要求20所述的可降解聚合物网络的应用,用于涂覆表面,作为用于热绝缘和/或用于抗氧化绝缘的保护层,用于包装材料的制造。
22.一种根据权利要求20所述的可降解聚合物网络的应用,用于制备组织工程、细胞培养、或药物递送中的植入物。
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