CN103030620B

CN103030620B - 抗肥胖剂及有脂肪蓄积抑制作用的医药品、食品或化妆品

Info

Publication number: CN103030620B
Application number: CN201210488828.7A
Authority: CN
Inventors: 太田富久; 高野文英; 辰野贵则; 高桥知也; 清水崇之
Original assignee: ARSOA Co Ltd
Current assignee: ARSOA Co Ltd
Priority date: 2010-02-19
Filing date: 2011-02-17
Publication date: 2014-10-22
Anticipated expiration: 2031-02-17
Also published as: CN102160862A; CN102160862B; JP2011190251A; JP5602049B2; TWI417091B; TW201129358A; TWI453016B; TW201350115A; CN103030620A

Abstract

本发明提供不用担心其副作用的、安全且具有优异的脂肪蓄积抑制作用的抗肥胖剂，提供不用担心其副作用的、安全且具有优异的脂肪蓄积抑制作用的医药品、食品或化妆品。具体为：含有下述式（2）表示的新型化合物A的抗肥胖剂，含有这些抗肥胖剂的具有脂肪蓄积抑制作用的医药品、食品或化妆品。

Description

抗肥胖剂及有脂肪蓄积抑制作用的医药品、食品或化妆品

本申请是申请日为2011年2月17日、发明名称为“抗肥胖剂及有脂肪蓄积抑制作用的医药品、食品或化妆品”的申请号为201110040999.9的专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及抗肥胖剂及具有脂肪蓄积抑制作用的医药品、食品或化妆品。

背景技术

近年来，伴随着饮食生活的欧美化或生活方式的变化，肥胖的比例在不断增加。由于通过饮食物摄取的能量超过了通过运动等消耗的能量，所以产生的过剩能量以脂肪的形式而蓄积在体内，这种状态持续将会导致肥胖。肥胖与高血压、糖尿病、动脉硬化等生活习惯病的发病有很大的相关性，从预防和治疗这些疾病发病的观点来看，肥胖的预防或消除也极为重要。此外，不仅从医学的观点看，就是从美容的观点来看，肥胖的预防或消除也极为重要。在这样的社会背景下，已知有各种作用方式的抗肥胖剂、具有抗肥胖作用的医药品、食品或化妆品。

作为与脂肪的分解促进机理相关的物质，已知有呈现出脂肪酶活化作用的蒽醌衍生物（例如参照专利文献1）及具有脂肪分解作用的异喹啉生物碱衍生物（例如参照专利文献2）。此外，作为具有脂肪酶抑制作用的基于游离脂肪酸的产生抑制效果的物质，已知有以巴拉圭茶含有的皂苷化合物为有效成分的抗肥胖剂（例如参照专利文献3）。作为起因于中性脂肪降低及胆固醇降低作用的物质，已知有以含有环阿屯烷型三萜或其糖苷为特征的血液中的中性脂肪降低剂（例如参照专利文献4）。作为基于脂肪细胞特异性作用机理的物质，已知有以内分泌因子对脂联素（Adiponectin）的作用为介质，以花青素化合物作为有效成分的脂联素表达促进剂（例如参照专利文献5）以及以花青素3－葡萄糖苷作为有效成分的抗肥胖剂（例如参照专利文献6）。作为抑制脂肪细胞数量增加具有抗肥胖效果的物质，已知有含有母菊中所含有的甜没药萜醇氧化物-A-β-葡萄糖苷（Bisabolol oxide-A-β-glucoside）的脂肪蓄积抑制剂（例如参照专利文献7）。作为基于脂肪蓄积抑制以及脂肪细胞分化抑制作用的物质，已知有含有牛蒡子苷及／或牛蒡子苷配基的脂肪代谢改善组合物（例如参照专利文献8）。此外，作为基于脂肪细胞分化抑制作用的具有脂肪蓄积抑制作用的外用剂，已知有含有ω-3系多不饱和脂肪酸作为有效成分的脂肪蓄积抑制剂（例如参照专利文献9）。

另一方面，在含有本发明的“白鹤灵芝素D”，同时通过本发明证明其含有“下述新型化合物A”的白鹤灵芝（以下有时也称为白鹤灵芝草，Rhinacanthusnasutus(L.)Kurz），是属于被认为原产于印度南部德干高原（Deccan Plateau）的白鹤灵芝属爵床科的常绿矮灌木，已知其全草具有驱虫、消炎、对皮肤真菌的抗菌作用（例如参照非专利文献1），主要在中国、台湾等地作为中药使用，并且最近在日本也作为中药使用。此外，在本申请者以往的申请中公开了白鹤灵芝具有清除活性氧的能力（例如参照专利文献10）、具有促进排泄作用（例如参照专利文献11）、具有抗过敏作用（例如参照专利文献12）以及抗肿瘤作用（例如参照专利文献13）。

现有技术文献

专利文献

专利文献1日本特开2006-347952号公报

专利文献2日本特开2008-308446号公报

专利文献3日本特开2009-196902号公报

专利文献4日本特开2006-290882号公报

专利文献5日本国际公开第WO2004/078741号公报

专利文献6日本特开2003-252766号公报

专利文献7日本特开2006-213648号公报

专利文献8日本特开2008-297209号公报

专利文献9日本专利第3607062号公报

专利文献10日本特开平9-143091号公报

专利文献11日本特开平9-169662号公报

专利文献12日本特开2001-10964号公报

专利文献13日本特开2002-53481号公报

非专利文献

非专利文献1原色牧野和汉药草大图鉴（日语原名：原色牧野和漢薬草大図鑑）、492页、北隆馆、1988年

发明内容

但是，尚不知道白鹤灵芝草植物本体、白鹤灵芝草提取物或者白鹤灵芝草植物本体或白鹤灵芝草提取物中含有的“白鹤灵芝素D”或者“下述新型化合物A”具有脂肪蓄积抑制作用（脂肪细胞分化抑制作用、抗代谢综合征作用）。

因此，本发明的目的是提供：不用担心其副作用的、安全且具有优异的脂肪蓄积抑制作用的“抗肥胖剂”及“含有该抗肥胖剂，具有优异的脂肪蓄积抑制作用的医药品、食品或化妆品”。

本发明者对具有脂肪蓄积抑制作用的化合物进行搜索的结果，发现从白鹤灵芝草中得到的白鹤灵芝素D及下述的新型化合物A中具有优异的脂肪蓄积抑制作用（前体白色脂肪细胞的分化抑制作用），完成了本发明。为了解决上述课题，本发明由下述事项构成。

[1]下述式（2）表示的化合物在制备具有抗肥胖作用的医药品、食品或化妆品中的应用：

[2]上述[1]所述的应用，所述抗肥胖作用为脂肪蓄积作用。

由下述试验例也可知，根据本发明能够提供“不用担心其副作用的、安全且具有优异的脂肪蓄积抑制作用的抗肥胖剂”以及“含有该抗肥胖剂，具有脂肪蓄积抑制作用的医药品、食品或化妆品”。

本文中所述的白鹤灵芝素D具有下述式（1）：

附图说明

图1为从白鹤灵芝根中区分·分离白鹤灵芝素D及新型化合物时的流程图。

具体实施方式

本发明中使用的白鹤灵芝素D及/或新型化合物A，可将白鹤灵芝草作为原料通过提取·纯化工序得到，也可从其它植物体中得到。而且在本发明中也可使用通过合成得到的白鹤灵芝素D及/或新型化合物A。此外，还可使用白鹤灵芝草、从含有白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的植物体中得到的提取物、粗纯化物、或植物体的干燥物、植物体的浆料。

从白鹤灵芝草等植物体中提取·纯化本发明使用的白鹤灵芝素D及/或新型化合物A时，可使用通常工业上使用的任何提取·纯化工序。将作为原料的植物叶、茎、根、花等在适当时期采集后，直接或者实施通常的通风干燥等干燥工序，制成提取原料。从上述干燥后的植物体中进行提取白鹤灵芝素D及新型化合物A时，可参考公知的方法（例如参照“Fight Medicine第16卷、929～934页2009年”）进行。

即：将原料粉碎或切碎后，用溶剂进行提取。作为提取溶剂，可将水，乙醇、甲醇、异丙醇等醇类，丙酮、甲基乙基酮等酮类，乙酸甲酯、乙酸乙酯等酯类，己烷、氯仿等亲油性的溶剂单独使用或形成混合溶剂使用。提取温度通常为0～100℃，优选为5～50℃。提取时间为1小时～10天左右，溶剂量为平均每份干燥原料通常为1～30倍重量，优选为5～10倍重量。提取操作可通过搅拌，也可通过浸渍放置进行。提取操作可根据需要重复进行2～3次。从用上述操作得到的粗提取液中通过过滤或离心分离而除去不溶性残渣后的提取液中、或者从植物的榨汁液中纯化白鹤灵芝素D及新型化合物A的方法，只要是公知的生药的分离纯化方法，可采用任何方法，但优选单独或组合使用两相溶剂分配法、逆流分配法、柱色谱法、制备型高效液相色谱法等。例如作为两相溶剂分配法，可例举通过在正己烷、氯仿、甲基乙基酮、乙酸乙酯、乙酸甲酯等溶剂和水中进行分配，从而将目标化合物从上述提取液中回收到溶剂相中的方法等。作为柱色谱法，可例举离子交换柱色谱法、使用正相或反相硅胶作为载体的方法、使用DIAION HP-20等的吸附柱色谱法、使用Sephadex LH-20等的修饰葡聚糖凝胶作为载体的凝胶过滤法等，可以将这些方法单独或组合使用，而且可反复地使用。作为制备型高效液相色谱法，可例举使用十八烷基硅等的反相柱的方法，使用硅胶等的正相柱的方法等。

作为本发明抗肥胖剂的给药途径，无特别限定，例如可例举口服给药?直肠内给药等肠内给药，经鼻给药等的粘膜给药，静脉内给药?皮下给药等的注射给药等。作为本发明抗肥胖剂的剂型，可采取任何与给药方法相适合的制剂的形态，例如可例举片剂、散剂、细粒剂、颗粒剂、胶囊剂、粉末、丸剂、含片剂等固体制剂，溶液、悬浮液、乳剂、糖浆剂、注射剂等液体制剂，凝胶制剂等。可将白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的纯品、纯化物、粗纯化物等直接给药，也可与药理上允许的赋型剂一同给药。作为赋型剂，只要是单糖类、二糖类、多糖类、无机盐类、油脂、蒸馏水等作为制剂通常可使用的赋型剂，可使用任何赋型剂。进行制剂化时，也可使用粘合剂、润滑剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、稀释剂、缓冲剂、抗氧化剂、细菌抑制剂等添加剂。

白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的有效给药量，根据给药途径、剂型、疾病的症状、对象的年龄等的不同而不同，通常成人平均每天为0.1～1000mg、优选为0.5～300mg、进一步优选为1～100mg。本发明的口服抗肥胖剂中的白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的含量，可根据制剂的形态·有效给药量·作为制剂的给药量的数据来设定与各给药形态最适合的制剂中的有效成分含量。

作为食品的形态，可例举将白鹤灵芝草、含有白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的植物体的干燥物制成茶的形态，或者是配合有白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的纯品、这些化合物的部分纯化品、从含有该化合物的植物中提取的该化合物的粗提取物、含有该化合物的植物体浆料、含有该化合物的植物体干燥物的食品等。

作为茶，可单独或与其他茶原料混合使用。作为其它茶原料，只要是绿茶、乌龙茶、普洱茶、红茶、煎茶、糙米茶、杜仲茶、柿叶茶、桑叶茶等通常作为茶可食用的原料，可使用任何茶原料。

要得到植物提取物时，只要是用热水提取，用乙醇、含水乙醇提取等通常食品提取中可使用的方法，可使用任何方法。可通过常法从植物体中得到白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的粗提取物、部分纯化品。

作为本发明的具有脂肪蓄积抑制作用的食品的形态，除茶以外，只要是保健饮料、果冻、饼干、片剂、丸剂、软胶囊剂、硬胶囊剂、散剂、细粒剂、颗粒剂等通常作为食品可提供的形态，可使用任何形态。作为副原料，也可使用赋型剂、粘合剂、润滑剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、稀释剂、缓冲剂、抗氧化剂、细菌抑制剂等添加剂。

通过本发明具有脂肪蓄积抑制作用的食品而摄取的白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的有效摄取量，根据摄取形态、对象的健康状态、对象的年龄等的不同而不同，但通常成人平均每天通常为0.001～100mg，优选为0.01～10mg，进一步优选为0.1～1mg。

本发明具有脂肪蓄积抑制作用的食品中的白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的含量，根据食品形态的不同而不同，但通常为0.0001～1wt%，优选为0.001～0.5wt%，更优选为0.01～0.1wt%。

作为本发明的外用医药品及化妆品的形态的例子，无特别限定。

作为外用医药品的形态，例如可例举软膏剂、霜剂、糊剂、胶带剂、外用剂等。本发明的医药品，在白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的基础上，可根据需要含有其它的医药成分，此外，也可使用粘合剂、分散剂、悬浮剂、乳化剂、稀释剂、缓冲剂、抗氧化剂、细菌抑制剂等添加剂。

作为化妆品的形态，可使用化妆水、美容液、乳液、乳霜、凝胶、面膜、美容粉饼、洗面奶、浴用剂等作为外用剂·化妆品制剂可使用的任何形态。在上述化妆品中，在白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的纯品、该化合物的部分纯化品、从植物中提取的该化合物的粗提取物、或含有该化合物的植物体等必需成分的基础上，也可根据需要含有可在化妆品制剂中配合的成分。作为配合成分，例如可例举固体油、半固体油、液体油、低分子保湿剂、高分子保湿剂、脂溶性保湿剂、润肤剂、表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、pH调节剂、乙醇、水等。

白鹤灵芝素D及/或新型化合物A在外用时的有效给药量，根据对象的症状、对象的年龄的不同而不同，但通常成人平均每天为0.001～100mg，优选为0.01～10mg，进一步优选为0.1～1mg。

本发明的具有脂肪蓄积抑制作用的医药品或化妆品中的白鹤灵芝素D及/或新型化合物A的含量，单独或作为混合物时通常为0.0001～1wt%，优选为0.001～0.5wt%，更优选为0.01～0.1wt%。

以下例举白鹤灵芝素D及新型化合物A的区分·分离例、脂肪蓄积抑制作用的试验例、毒性试验例以及实施例，对本发明更加详细地说明，但本发明并不限于这些。

1.白鹤灵芝素D及新型化合物A的区分·分离例

1－1.白鹤灵芝素D

（1）白鹤灵芝素D的区分·分离

白鹤灵芝素D的区分·分离按照图1所示的流程进行。即：在室温下，用25L的90%(v/v)乙醇对白鹤灵芝（Rhinacanthus nasutus(L.)Kurz）干燥根（5Kg）进行每次24小时共计3次的提取，将这些合并在一起后进行浓缩，得到干固物（407g）。

接着，使其在7L的90%(v/v)甲醇中悬浮溶解后，用等量的己烷进行3次分配，然后取出90%(v/v)甲醇相进行减压浓缩。在该减压浓缩物中加入纯水至5L，移入分液漏斗中，用5L的氯仿进行3次两相溶剂分配。接着将通过该操作得到的氯仿相合并在一起，得到干固物69.3g。

将其中69.0g供给将己烷／乙酸乙酯作为洗脱溶剂的硅胶柱色谱法（80mmφ×150mm、关东化学株式会社制）。即：用3床体积(BV)的洗脱溶剂己烷／乙酸乙酯（9：1）将硅胶柱洗涤后，用1BV的洗脱溶剂己烷／乙酸乙酯（8：2）洗脱，得到组分A（干固物4.71g）。

接着，将组分A供给将甲醇作为洗脱溶剂的Sephadex LH-20柱色谱法（20mmφ×200mm、Pharmacia公司制）。即：用1.5BV的甲醇将Sephadex LH-20柱洗涤后，用0.5BV的甲醇洗脱，得到组分A-2(干固物1.34g)。

进而，用将水／甲醇作为洗脱溶剂的Flash ODS柱色谱法（20mmφ×150mm、和光纯药公司制）区分组分A-2。即：用180ml的50%(v/v)甲醇将Flash ODS柱洗涤后，逐步地依次用60%(v/v)甲醇、70%(v/v)甲醇洗涤后，用80%(v/v)甲醇洗脱，得到含有目标化合物的组分A-2-2(干固物407mg)。

进而，用制备型高效液相色谱法（ODS柱、20mmφ×250mm、野村化学公司制，流动相：72%(v/v)乙腈/水/0.1%（v/v）甲酸，检测：254nm UV检测器）对组分A-2-2(干固物407mg)进行纯化，得到白鹤灵芝素D（rhinacanthinD）（干固物18.8mg）。

对于通过上述方法区分·分离的白鹤灵芝素D，利用核磁共振光谱法得到¹HNMR光谱数据，结果出现了以下谱峰，与文献(自然产品杂志(Journal ofNatural Products)第59卷、808～811页、1996年）的数值大致一致。

δ1.06(H-,6H,s)、2.74(H-,2H,s)、4.03(H-,2H,s)、5.97(H-,2H,s)、6.70(H-,1H,d)、7.38(H-,1H,s)、7.56(H-,1H,d)、7.63(H-,1H,t)、7.67(H-,1H,t)、8.02(H-,2H,d)。

此外，在上述中，高效液相色谱法使用了Waters515系统及Waters600系统（均为日本Waters株式会社制）。此外，硅胶柱色谱法、Sephadex LH-20柱色谱法以及Flash ODS色谱法使用通常用的实验器具和实验装置。

1-2.新型化合物A

（1）新型化合物A的区分·分离

新型化合物A的区分·分离按照图1所示的流程进行。即：在室温下，用25L的90%(v/v)乙醇对白鹤灵芝（Rhinacanthus nasutus(L.)Kurz）干燥根（5Kg）进行每次24小时共计3次的提取，将这些合并在一起后进行浓缩，得到干固物（407g）。

接着，使其在7L的90%(v/v)甲醇中悬浮溶解后，用等量的己烷进行3次分配，然后取出90%(v/v)甲醇相进行减压浓缩。在该减压浓缩物中加入纯水至5L，移入分液漏斗中，用氯仿进行3次两相溶剂分配。接着将通过该操作得到的氯仿相合并在一起，得到干固物69.3g。

将其中69.0g供给将己烷／乙酸乙酯作为洗脱溶剂的硅胶柱色谱法（80mmφ×150mm、关东化学株式会社制）。即：用3BV的洗脱溶剂己烷／乙酸乙酯（9：1）、2BV的洗脱溶剂己烷／乙酸乙酯（8：2）、以及2BV的洗脱溶剂己烷／乙酸乙酯（7：3）依次将硅胶柱洗涤后，用2BV的洗脱溶剂己烷／乙酸乙酯（6：4）洗脱，得到组分C（干固物3.73g）。

接着，对于组分C，实施将甲醇作为洗脱溶剂的Sephadex LH-20柱色谱法（20mmφ×200mm、Pharmacia公司制）。即：用2BV的甲醇将柱洗涤后，用1BV的甲醇洗脱，得到组分F(干固物369mg)。

进而，将组分F(干固物369mg)供给将水／甲醇作为洗脱溶剂的Flash ODS柱色谱法（20mmφ×150mm、野村化学公司制）。即：用180ml的50%(v/v)甲醇将Flash ODS柱洗涤后，逐步地依次用60%(v/v)甲醇、70%(v/v)甲醇洗涤后，用80%(v/v)甲醇洗脱，得到含有目标化合物的组分G(干固物75.6mg)。

进而，用制备型高效液相色谱法（ODS柱、20mmφ×250mm、野村化学公司制，流动相：45%(v/v)乙腈，检测：254nm UV检测器）对组分G(干固物75.6mg)进行纯化，得到新型化合物A的干固物（9.8mg）。

（2）新型化合物A的结构分析

新型化合物A的结构分析使用高分辨质谱分析法（HRFABMS）及核磁共振光谱法（¹H NMR、¹³C NMR）进行。以下表示结果。

（2-1）高分辨质谱分析法（HRFABMS）的结果

在高分辨质谱分析法（HRFABMS）中，出现了“m/z272.1039[M]⁺(calcd.272.1049Δ0.9mmu).”，已知分子式为“C₁₆H₁₆O₄”。此外，在低分辨质谱分析法（LRFABMS）中，出现了“m/z272.”。

（2-2）核磁共振光谱法（1H NMR）的结果

在核磁共振光谱法（1H NMR）中，出现了以下谱峰。

“¹H NMR(CDCl₃,500MHz)：δ3.69(H-14,J=11.2Hz,1H,d)、3.75(H-14,J=11.2Hz,1H,d)、3.95(8-OMe,3H,s)、4.22(H-2,J=11.7Hz,1H,d)、4.31(H-2,J=11.7Hz,1H,d)、5.93(H-4,J=11.7Hz,1H,d)、6.43(H-5,J=11.7Hz,1H,d)、6.51(H-7,1H,s)、7.47(H-10,J=1.5,6.7,7.5Hz,1H,m)、7.50(H-11,J=1.5,6.7,7.5Hz,1H,m)、8.14(H-9,J=1.5,7.5Hz,1H,d)、8.24(H-12,J=1.5,7.5Hz,1H,d).”

（2-3）核磁共振光谱法（13C NMR）的结果

在核磁共振光谱法（13C NMR）中，出现了以下谱峰。

“¹³C NMR(CDCl₃,125MHz)：δ55.7(8-OMe)、65.9(C-14)、74.4(C-2)、74.9(C-3)、106.8(C-7)、119.1(C-6)、121.6(C-9)、122.7(C-12)、126.0(C-12a)、126.3(C-10)、126.7(C-11)、127.6(C-8a)、130.1(C-5)、132.1(C-4)、148.9(C-13)、150.6(C-8).”

此外，在上述中，作为高分辨质谱分析装置，使用JEOL JMS SX-102型质谱分析装置（日本电子株式会社制）。此外，作为核磁共振光谱装置（¹H NMR及¹³C NMR），使用JEOL JNM-GSX500型核核磁共振光谱装置（日本电子株式会社制）。

由上述结果及HMQC光谱、HMBC光谱可知，新型化合物A为上述式（2）表示的新型化合物。

2.脂肪蓄积抑制作用的试验例

脂肪蓄积抑制作用的试验通过测定对于来自SD大鼠的前体白色脂肪细胞的脂肪蓄积抑制活性来进行。

（1）试验方法

将来自SD大鼠的前体白色脂肪细胞（从日本宝生物工程株式会社购入）进行1次继代培养后，在液体氮容器内冷冻保存，供给以后实验。按照常法使该冷冻细胞在37℃的温水中融化，以1×10⁵cells/ml细胞浓度悬浮于基本培养基［在高葡萄糖DMEM培养基（Lonza公司制）中添加抗坏血酸、生物素、泛酸、三碘甲状腺氨酸、辛酸、胎牛血清、青霉素（50U/ml）、链霉素（50μg/ml）］中，在24孔培养平板（1cm²/well、NUNC）上分别接种1ml，在37℃、5%二氧化碳气体存在下进行培养。在细胞增殖到90%～95%融合时将基本培养基吸除，加入分化培养基［在基本培养基中添加胰岛素（10μg/ml）、地塞米松（2.5μM）、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（0.5mM）］，进而在37℃、5%二氧化碳气体存在下继续培养48小时。在分化培养基中培养48小时后将分化培养基吸除，用无钙·镁PBS[杜氏磷酸缓冲液（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline）]溶液（以下称PBS）洗涤2次后，加入含有白鹤灵芝素D或新型化合物A（均溶解在DMSO中，培养基中的最终DMSO浓度＝0.2%(v/v)；此外，将在仅加入1/500体积量DMSO的培养基上培养的细胞株作为对照组）的维持液（maintenance medium）[在基本培养基中添加10μg/ml胰岛素]，进一步在37℃、5%二氧化碳气体存在下培养6天。

培养6天后将培养基吸除，用PBS洗涤2次，添加Mildform(和光纯药工业公司制)每1孔200μl，通过在4℃下静置2小时将细胞固定。接着将Mildform吸除，用60%(v/v)异丙醇洗涤1次。此后分别添加制备的油红O试剂［在异丙醇中以0.5%(w/v)浓度溶解了油红O的储备溶液中，添加2/3量的超纯水，在室温放置15分钟后，用膜过滤器（0.45μm）过滤而制备］每1孔100μl，在室温下静置15分钟。静置15分钟后，用60%(v/v)异丙醇洗涤2次，使培養基干燥后，每1孔加入100μl异丙醇并振荡，使油红O色素溶出。将80μl的色素溶出液回收到96孔微孔板中，使用免疫检测仪（immuno reader）（大日本制药株式会社制），测定540nm处的吸光度。由吸光度计算出中性脂肪的相对蓄积值。

（2）试验结果

在表1中表示白鹤灵芝素D、新型化合物A以及作为比较例的白鹤灵芝素C的“前体白色脂肪细胞中的中性脂肪蓄积值”的相对值。

表1

如表1所示，可以确认白鹤灵芝素D及新型化合物A在10μg/ml这样比较低的浓度下，显示出优异的脂肪蓄积抑制作用（对于前体白色脂肪细胞的优异的中性脂肪蓄积抑制活性）。

3.毒性试验例

毒性试验通过测定对于来自SD大鼠的前体白色脂肪细胞的增殖抑制活性来进行。

（1）试验方法

将来自SD大鼠的前体白色脂肪细胞（从日本宝生物工程株式会社购入）进行1次继代培养后，在液体氮容器内冷冻保存，供给以后实验。按照常法使该冷冻细胞在37℃的温水中融化，使用基本培养基［在高葡萄糖DMEM培养基（Lonza公司制）中添加抗坏血酸、生物素、泛酸、三碘甲状腺氨酸、辛酸、胎牛血清、青霉素（50U/ml）、链霉素（50μg/ml）］，以1×10⁴cells/100μl的细胞浓度接种于96孔培养平板（NUNC）上，在37℃、5%二氧化碳气体存在下培养48小时。培养48小时后，加入白鹤灵芝素D或新型化合物A（均溶解在DMSO中，培养基中的最终DMSO浓度＝0.1%(v/v)；此外，将在仅加入1/1000体积量的DMSO的培养基上培养的细胞株作为对照组），进一步在37℃、5%二氧化碳气体存在下培养48小时。

细胞增殖度的测定通过使用噻唑蓝（MTT）[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四氮唑Nacalai Tesque]［（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）］的方法进行［参照株式会社东京化学同人发行，新生物化学实验讲座12分子免疫学Ｉ免疫细胞·细胞因子（日语原名：新生科学実験講座12分子免疫学Ⅰ免疫細胞·サイトカイン）358-359页］。即：加入毒性试验对象的各化合物培养48小时后，交换培养基，在96孔培养平板（0.33cm²/well）的各孔的培养液90μl中加入10μl的MTT溶液{5mg/ml；在无钙·镁PBS[杜氏磷酸缓冲液（Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline）]溶液中溶解后，用膜过滤器（0.22μm）过滤}，进行振荡使其均匀，在37℃、5%二氧化碳气体存在下培养4小时。培养4小时后在各孔中加入10%(w/v)SDS-50%(v/v)N,N-二甲基甲酰胺-0.005N盐酸溶液100μl，在37℃、5%二氧化碳气体存在下静置18小时后，使用免疫检测仪（immuno reader）（大日本制药株式会社制），以750nm作为对照，测定590nm处的吸光度，作为存活率的指标。

（2）试验结果

白鹤灵芝素D、新型化合物A以及作为比较例的白鹤灵芝素Ｃ的“前体白色脂肪细胞的存活率”在第1表中表示。

[表2]

如表1所示，可以确认白鹤灵芝素D及新型化合物A显示低毒性（对于前体白色脂肪细胞的低増殖抑制活性）。

实施例

实施例1.片剂的制作

使用按照上述“1－1.白鹤灵芝素D（1）白鹤灵芝素D的区分·分离”中记载的方法进行区分·分离的白鹤灵芝素D，用下述处方制作片剂(每1片500mg)。

（制备法）

在乳糖(95.8g)中添加白鹤灵芝素D(0.2g)、干燥玉米淀粉(2g)、滑石(1.8g)、硬脂酸钙(0.2g)并进行混合。接着，使用单冲压片机，根据常法制作片剂。

实施例2.硬胶囊剂的制作

使用按照上述“1-2.新型化合物A(1)新型化合物A的区分·分离”中记载的方法进行区分·分离的新型化合物A，用下述处方制作硬胶囊剂（每1粒360mg）。

（制备法）

在新型化合物A（5g）中添加乳糖（220g）及玉米淀粉（110g）并进行混合，在其中添加羟丙基纤维素（25g）的水溶液后进行捏合。接着，使用挤压造粒机通过常法制作颗粒。通过将该颗粒填充到明胶硬胶囊中来制作硬胶囊剂。

实施例3.软胶囊剂的制作

使用按照上述“1-1.白鹤灵芝素D(1)白鹤灵芝素D的区分·分离”中记载的方法进行区分·分离的白鹤灵芝素D，用以下处方制作软胶囊剂（每1粒170mg）。

白鹤灵芝素D 0.5mg

大豆油 169.5mg

（制备法）

在大豆油（169.5g）中添加白鹤灵芝素D（0.5g）进行混合。接着通过使用转模式自动成型机按照常法填充到软胶囊中来制作软胶囊剂。

实施例4.丸剂的制作

使用按照上述“1-1.白鹤灵芝素D(1)白鹤灵芝素D的区分·分离”中记载的方法进行区分·分离的白鹤灵芝素D，用以下处方制作丸剂（每1粒100mg）。

（制备法）

以上述配比将原料混合，适量加水后，用捏合机制造均匀的捏合物，使用滚筒式制丸机将得到的捏合物制丸后进行干燥从而制作丸剂。

实施例5.散剂的制作

使用按照上述“1－1.白鹤灵芝素D（1）白鹤灵芝素D的区分·分离”中所记载的方法进行区分·分离的白鹤灵芝素D，用以下处方制作散剂(1包1000mg)。

白鹤灵芝素D 1mg

乳糖 799mg

玉米淀粉 200mg

实施例6.果冻的制作

使用按照上述“1－1.白鹤灵芝素D（1）白鹤灵芝素D的区分·分离”中所记载的方法进行区分·分离的白鹤灵芝素D，用以下处方通过常法制作果冻（100g）。

（制备法）

将上述成分混合，加热到90℃。确认明胶溶解后填充到容器内并进行冷却。通过明胶固化从而制作果冻。

实施例7.软膏的制作

使用按照上述“1-1.白鹤灵芝素D(1)白鹤灵芝素D的区分·分离”中所记载的方法进行区分·分离的白鹤灵芝素D，用以下处方通过常法制作软膏（100g）。

（油相成分）

（水相成分）

（制备法）

将油相成分及水相成分分别在80℃加热均匀，在油相中边搅拌边加入水相，乳化后冷却，制作软膏。

实施例8.胶带剂的制作

使用按照上述“1-2.新型化合物A(1)新型化合物A的区分·分离”中所记载的方法进行区分·分离的新型化合物A，用以下处方通过常法制作胶带剂（100g）。

（粘合剂溶剂）

(药效成分)

新型化合物A 0.1g

乙醇 5.0g

(经皮吸收促进剂)

油醇 0.8g

总量100g

（制备法）

分别使粘合剂溶剂及药效成分均匀化，将药效成分及经皮吸收促进剂加在粘合剂溶剂中，在室温下搅拌制备组合物。将该组合物在有机硅处理后的聚酯薄膜上延展，在120℃下干燥并冷却后，使粘合剂层转移到聚乙烯薄膜上，制作胶带剂。

实施例9.瘦身用化妆水的制备

使用按照上述“1－1.白鹤灵芝素D（1）白鹤灵芝素D的区分·分离”中所记载的方法进行区分·分离的白鹤灵芝素D，用以下处方通过常法制备瘦身用化妆水。

（油相成分）

白鹤灵芝素D 0.1g

聚氧乙烯（60摩尔）氢化蓖麻油 2.0g

1，3-丁二醇 5.0g

（水相成分）

（制备法）

将油相成分及水相成分分别均匀溶解，通过在水相中边搅拌边加入油相，制备化妆水。

实施例10.瘦身用按摩凝胶的制作

使用按照上述“1-2.新型化合物A(1)新型化合物A的区分·分离”中所记载的方法进行区分·分离的新型化合物A，用以下处方通过常法制备按摩凝胶（100g）。

(油相成分)

(水相成分)

（制备法）

将油相成分及水相成分分别在80℃加热均匀，在油相中边搅拌边加入水相，乳化后冷却，制作按摩凝胶。

Claims

1.下述式（2）表示的化合物在制备具有抗肥胖作用的医药品、食品或化妆品中的应用：

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗肥胖作用为脂肪蓄积抑制作用。