CN103025749A - 2’-o-岩藻糖基乳糖的多晶型物及其制备 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及式(1)的三糖2’-O-岩藻糖基乳糖(2-FL)的新的多晶型物、用于制备所述多晶型物的方法以及它们在药物或营养组合物中的用途。

Description

2’-O-岩藻糖基乳糖的多晶型物及其制备
发明领域
本发明提供三糖2-FL的新的多晶型物、其制备以及包含其的制剂。
发明背景
近年来，对于包括分泌寡糖在内的复杂碳水化合物的合成的商业化努力，由于它们在活有机体中发生的大量生物学过程中的作用而显著增多。分泌的寡糖如人乳寡糖正在成为用于营养和治疗工业的重要商业靶标。然而，这些寡糖和它们的中间体的合成和纯化仍然是有挑战性的科学任务。最重要的人乳寡糖中的一种是在母乳中以最高浓度发现的2’-O-岩藻糖基乳糖(2-FL，见式1)。
Figure BDA00002473251100011
式1
已经提出了2’-O-岩藻糖基乳糖的多种生物学作用，包括但不限于它的益生作用、抗细菌作用、抗病毒作用、免疫系统增强作用、大脑发育增强作用等，使其成为用于营养和治疗工业的大规模制备/分离/纯化的有吸引力靶标。
文献中对2’-O-岩藻糖基乳糖的第一次提及出现于20世纪50年代，Kuhn等(Chem.Ber.1955，88，1135；ibid.1956，89，2513)。根据Kuhn的方法，将分离自母乳的糖浆状或无定形2-FL溶解在热的75％甲醇中，并且在有晶种存在下逐渐加入无水乙醇。晶种以两种方式制备：在“延长的”存储后，一些小晶体在容纳有糖浆状2-FL的烧瓶的壁附近沉淀，或者在“几”周后，2-FL在4℃从由含水甲醇、正丁醇和正己醇组成的溶液中沉淀出来。由此获得的结晶2-FL的熔点为230-231℃(发生分解)，不含有结构水(constitutional water)并且被认为是α型。
在那时，特定人乳寡糖通过使用复杂的色谱方案(主要是纸色谱法)从人乳分离。然而，这样的早期分离的样品的纯度相当不确定，原因在于大量的人乳寡糖异构体存在于母乳中以及缺乏如今在这样的复杂任务的研究和解决中是常见的高性能色谱技术。例如，2’-O-岩藻糖基乳糖和3-O-岩藻糖基乳糖都存在于人乳中，而它们的色谱分离在数十年后才被解决。虽然2-FL在1956年被Kuhn报道为结晶化合物，但是由于以上提及的考虑因素，分离的样品的纯度相当不清楚。此外，自该出版物以来，在本领域中没有发现关于2-FL的结晶存在或出现的其他证据、参考文献或指示，因此2-FL通常作为无定形(冻干)固体可得到并使用。
结晶或再结晶是用于从污染物分离产物并获得纯物质的最简单且最廉价方法之一。此外，提供固体的一种或多种结晶变体(多晶型物)是产品开发中的重要因素，因为不同结晶形式不同地影响化合物的性质-例如热力学稳定性、溶解性、密度、吸湿性、电性质(如介电常数、电导率)、机械性质(如脆性、硬度、抗断强度、弹性)、光学性质(如颜色、透明度、折射)等。其扩充了科学家可用于改善产品特性的材料的清单。对于2-FL，仍需要可以简化迄今遇到的分离、纯化和配制问题的结晶产物。
发明内容
本发明提供结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物和适于大规模纯化2’-O-岩藻糖基乳糖的方法。因此，本发明提供的结晶产物可用于开发用于营养和药物工业的高纯度2’-O-岩藻糖基乳糖。
附图说明
在下文将参考附图更详细地描述本发明，其中：
图1显示根据实施例A、项目1的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的X射线粉末衍射图。
图2显示根据实施例C的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的X射线粉末衍射图。
图3显示根据实施例D的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的X射线粉末衍射图。
图4显示来自对于CuKα辐射的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的单晶结构的经计算的X射线粉末衍射图。
图5显示不同的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I样品的X射线粉末衍射图的比较。1：实施例A，项目1；2：从多晶型物I单晶计算的衍射图；3：实施例D；4：实施例C。
图6显示2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的单晶结构。
图7显示结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的IR光谱。
图8显示根据实施例A、项目1的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的DSC热谱。
图9显示根据实施例C的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的DSC温谱图。
图10显示根据实施例A、项目1的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的固态13C-NMR谱。
图11显示根据实施例C的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的固态13C-NMR谱。
图12显示根据实施例E的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的X射线粉末衍射图。
图13显示根据实施例F的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的X射线粉末衍射图。
图14显示根据实施例G的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的X射线粉末衍射图。
图15显示不同的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II样品的X射线粉末衍射图的比较。1：实施例G；2：实施例E；3：实施例F。
图16显示结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I和II的X射线粉末衍射图的比较。1：实施例E；2：实施例F；3：实施例A、项目1。
图17显示2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的IR光谱。
图18显示根据实施例E的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的DSC温谱图。
图19显示根据实施例F的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的DSC温谱图。
图20显示根据实施例G的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的DSC温谱图。
具体实施方式
本发明的发明人已发现，2’-O-岩藻糖基乳糖可以以不同结晶形式获得。
结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I，作为多晶物质或单晶，基于使用CuKα辐射的测量，包括在21.34±0.20、20.92±0.20和18.37±0.202θ角，更优选在21.34±0.20、20.92±0.20、18.37±0.20和16.70±0.202θ角，甚至更优选在21.34±0.20、20.92±0.20、18.37±0.20、16.70±0.20和9.91±0.202θ角，最优选在21.34±0.20、20.92±0.20、18.37±0.20、16.70±0.20、9.91±0.20和13.13±0.202θ角，尤其是在21.34±0.20、20.92±0.20、18.37±0.20、16.70±0.20、9.91±0.20、13.13±0.20、7.87±0.20和8.90±0.202θ角处的X射线粉末衍射反射。结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的XRPD图的峰的列表显示在表1中。
Figure BDA00002473251100051
表1：结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的XRPD图的峰的列表
结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的不同样品的XRPD图显示在图1-4中。
结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I具有在3428±4cm-1的特征IR峰，优选具有在3428±4和1021±4cm-1，更优选在3428±4、1021±4和1039±4cm-1，甚至更优选在3428±4、1021±4、1039±4和1066±4cm-1，尤其是在3428±4、1021±4、1039±4、1066±4、1088±4、1113±4、1133±4、1165±4、1346±4、1389±4、1451±4、2916±4、2956±4和2975±4cm-1的特征IR峰。
结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的IR光谱显示在图7中。
2-FL的新的结晶多晶型物I可以被认为是α-和β-端基异构体(异头物，anomer)的端基异构体混合物，或甚至是这些端基异构体中的一种的纯的形式。如果2-FL多晶型物I作为多晶物质分离，则它形成α-和β-端基异构体的混合物，其中α-端基异构体相对于β-端基异构体占优势，并且根据固态13C-NMR测量存在至多30％的β-端基异构体，优选7-25％的β-端基异构体。如果2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I作为单晶获得，则它以单斜晶系、空间群P21存在，并且具有以下晶胞参数：
Figure BDA00002473251100061
Figure BDA00002473251100062
Figure BDA00002473251100063
Figure BDA00002473251100064
α＝90.00°，β＝107.871(3)°，γ＝90.00°。在该晶体结构中没有结合结构水和/或溶剂。端基异构体的OH基团占据轴向位置，即它涉及O-(α-L-吡喃岩藻糖基)-(1→2)-O-(β-D-半乳吡喃糖基)-(1→4)-α-D-葡萄糖(见图6)。结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的晶体数据和结构精修的细节在表2中给出。
Figure BDA00002473251100065
Figure BDA00002473251100071
表2：结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的单晶参数
用于获得包括在表2中的数据的试验和程序在本领域是标准的，并且本领域技术人员基于本说明书以及他/她的本领域知识将知晓如何进行这些试验。
具有不同α/β比率的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的XRPD图以及模拟的单晶的粉末图彼此相同，表明所述不同样品属于一种且相同的结晶多晶型物(见图5)。
含有20±3％的β-端基异构体的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I在DSC研究中显示吸热反应，其中峰最大值在260±5℃，更优选在260±4℃，甚至更优选在260±3℃，最优选在260±2℃，尤其是在260±1℃(见图8)。具有12±3％的β-端基异构体的结晶2-FL样品显示在246±5℃，更优选在246±4℃，甚至更优选在246±3℃，最优选在246±2℃，尤其是在246±1℃的吸热峰最大值(见图9)。
优选地，该结晶2-FL多晶型物I基本上不含有机溶剂和/或水。表达“基本上不含有机溶剂和/或水”意在表示，有机溶剂和/或水的含量至多为1000ppm，优选至多为800ppm，更优选至多为600ppm，最优选至多为400ppm并且尤其是至多为200ppm。
根据另一个优选实施方案，该结晶2-FL多晶型物I基本上是纯的。表达“基本上纯的”意在表示，结晶2-FL多晶型物I含有少于10w/w％的杂质，优选少于5w/w％的杂质，更优选少于1w/w％的杂质，最优选少于0.5w/w％的杂质，尤其是少于0.1w/w％的杂质，其中“杂质”是指不同于该结晶2-FL多晶型物I的任何物理实体，如无定形2-FL、不同的(多种)2-FL多晶型物、从合成2-FL剩余的未反应的(多种)中间体、(多种)副产物、(多种)降解产物、(多种)无机盐和/或不同于(多种)有机溶剂和/或水的其他污染物。
为了进行比较研究，分派了大量工作并且进行了很多尝试以获得根据文献方法的结晶2-FL，但是这些程序不起作用并且本发明的发明人从未能够再现由Kuhn所述的方法。此外，包括步骤如“延长的”存储或存储达“几”周的方法保持太多再现的希望。然而，本申请的发明人能够制备结晶2-FL多晶型物。
因此，本发明提供一种用于通过在没有晶种存在下从含有一种或多种C1-C3醇和任选的水的溶剂系统进行结晶来制备结晶2-FL多晶型物I的方法。术语“C1-C3醇”是指具有1-3个碳原子的一羟基或二羟基烷烃，即甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、乙二醇、1，2-丙二醇和1，3-丙二醇，优选具有1-3个碳原子的一羟基烷烃，更优选甲醇或乙醇。根据另一个优选的实施方案，所述溶剂系统还可以含有水。溶剂系统总体积中的水含量的范围可以优选多达30v/v％，更优选多达15v/v％，最优选多达5v/v％。
在优选的实施方式中，将要进行结晶的2-FL溶解在热(比沸点温度低5-10℃)或沸腾的含水(多种)醇中，然后向该混合物中逐渐加入热或沸腾的相同或不同(多种)醇。使该溶液冷却至室温(rt)并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并且用冷的(多种)溶剂洗涤。特别有利的醇是甲醇和甲醇/乙醇混合物。
根据另一个优选的实施方案，将要进行结晶的2-FL溶解在热或沸腾的(多种)醇中，然后向该混合物中逐渐加入热或沸腾的含有水的相同或不同(多种)醇。使该溶液冷却至室温并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并且用冷的(多种)溶剂洗涤。特别有利的醇是甲醇以及甲醇/乙醇混合物。
在另一个优选的方法中，将要进行结晶的2-FL溶解在热或沸腾的含水(多种)醇中，然后向该混合物中逐渐加入热或沸腾的含有水的相同或不同(多种)醇。使该溶液冷却至室温并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并用冷的(多种)溶剂洗涤。特别有利的醇是甲醇以及甲醇/乙醇混合物。
根据另一个优选的实施方案，将在国际申请WO 2010/115934或WO2010/115935中描述的苄化2-FL的催化氢解中获得的、在含水甲醇中的2-FL用乙醇或异丙醇稀释，并使该溶液进行静置和结晶。
更优选地，O-(2-O-苄基-α-L-吡喃岩藻糖基)-(1→2)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-D-葡萄糖(见国际申请WO 2010/115935)在酸如cc.HCl存在下在甲醇中进行催化氢解。在过滤催化剂之前，可以用碱(任选以碱的水溶液的形式)来中和酸，将溶剂部分地蒸发并且任选地将水加入至甲醇浓缩物，然后搅拌该溶液或者使其静置并结晶。
本发明提供用于制备结晶2-FL多晶型物I的另一种方法，其特征在于，在有多晶型物I的晶种存在下，从含有一种或多种C1-C6醇和任选的水的溶剂系统进行结晶。术语“C1-C6醇”是指具有1-6个碳原子的一羟基或二羟基烷烃，如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、戊醇、正己醇、乙二醇、丙二醇等。优选的C1-C6醇是C1-C6一羟基烷烃，更优选C1-C4一羟基烷烃如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。甚至更优选的溶剂系统含有甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、或其混合物，尤其是甲醇或甲醇/异丙醇。
在一个优选的实施方案中，将要进行结晶的2-FL在搅拌下溶解在热(比沸点温度低5-10℃)或沸腾的醇中直到获得清液。使此溶液冷却至室温，加入多晶型物I的晶种并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并且用冷的溶剂洗涤。
在另一个优选的实施方式中，将要进行结晶的2-FL在搅拌下溶解在热或沸腾的醇中，然后向此混合物中逐渐加入热或沸腾的另外的醇直到获得清液。使此溶液冷却至室温，加入多晶型物I的晶种并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并用冷的溶剂洗涤。
根据另一个优选的实施例，溶剂系统还含有水。溶剂系统的总体积中的水含量的范围可以多达30v/v％，优选多达20v/v％，更优选多达10v/v％。
在一个特别优选的实施方式中，将要进行结晶的2-FL溶解在热(比沸点温度低5-10℃)或沸腾的含水醇中，然后向此混合物中逐渐加入热或沸腾的相同或不同的(多种)醇。使该溶液冷却至室温，加入多晶型物I的晶种并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并且用冷的(多种)溶剂洗涤。特别有利的醇是甲醇、乙醇和甲醇/异丙醇混合物。
根据另一个优选的实施方案，将要进行结晶的2-FL溶解在热或沸腾的(多种)醇中，然后向此混合物中逐渐加入热或沸腾的含有水的相同或不同的(多种)醇。使该溶液冷却至室温，加入多晶型物I的晶种并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并且用冷的(多种)溶剂洗涤。特别有利的醇是甲醇、乙醇以及甲醇/异丙醇混合物。
在另一种优选的方法中，将要进行结晶的2-FL溶解在热或沸腾的含水(多种)醇中，然后向此混合物中逐渐加入热或沸腾的含有水的相同或不同的(多种)醇。使该溶液冷却至室温，加入多晶型物I的晶种并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并且用冷的(多种)溶剂洗涤。特别有利的醇是甲醇、乙醇和甲醇/异丙醇混合物。
无定形固体形式的2-FL可以通过在国际申请WO 2010/115934或WO2010/115935中描述的方法制备。
在本发明的另一方面，基于使用CuKα辐射的测量，结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II包括在16.98±0.20、13.65±0.20和18.32±0.202θ角，更优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20和21.70±0.202θ角，甚至更优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20和15.22±0.202θ角，最优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20、15.22±0.20和20.63±0.202θ角，尤其是在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20、15.22±0.20、20.63±0.20和11.94±0.202θ角处的X射线粉末衍射反射。结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的XRPD图的峰的列表显示在表3中。
Figure BDA00002473251100111
表3：结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的XRPD图的峰的列表
结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的不同样品的XRPD图显示在图12-14中。
根据本发明的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II具有在3571±4cm-1的特征IR峰，优选具有在3571±4和1042±4cm-1，更优选在3571±4、1042±4和1412±4cm-1，甚至更优选在3571±4、1042±4、1412±4和1255±4cm-1，尤其是在3571±4、964±4、1042±4、1072±4、1124±4、1154±4、1255±4、1295±4、1342±4、1412±4、2877±4、2906±4、2956±4、3333±4和3442±4cm-1的特征IR峰。
2-FL多晶型物II的IR光谱显示在图17中。
结晶2-FL多晶型物II可以被认为是α-和β-端基异构体的端基异构体混合物，或者甚至是这些端基异构体中的一种的纯的形式。在该晶体结构中没有结合结构水和/或溶剂。
在不同条件下获得的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的XRPD图彼此相同，表明这些不同样品属于一种且相同的结晶多晶型物(见图15)。
在DSC研究中，结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II显示吸热反应，其中峰最大值在259.5±5℃，更优选在259.5±4℃，甚至更优选在259.5±3℃，最优选在259.5±2℃(见图18-20)。
优选地，结晶2-FL多晶型物II基本上不含有机溶剂和/或水。表达“基本上不含有机溶剂和/或水”意在表示有机溶剂和/或水的含量至多为1000ppm，优选至多为800ppm，更优选至多为600ppm，最优选至多为400ppm并且尤其是至多为200ppm。
根据另一个优选的实施方案，结晶2-FL多晶型物II是基本上纯的。表达“基本上纯的”意在表示结晶2-FL多晶型物II含有少于10w/w％的杂质，优选少于5w/w％的杂质，更优选少于1w/w％的杂质，最优选少于0.5w/w％的杂质，尤其是少于0.1w/w％的杂质，其中“杂质”是指不同于结晶2-FL多晶型物II的任何物理实体，如无定形2-FL、不同的(多种)2-FL多晶型物、从合成2-FL剩余的未反应的(多种)中间体、(多种)副产物、(多种)降解产物、(多种)无机盐和/或不同于(多种)有机溶剂和/或水的其他污染物。
本发明提供用于制备结晶2-FL多晶型物II的方法，其特征在于，在多晶型物II的晶种存在下，从含有一种或多种C1-C6醇的溶剂系统进行结晶。术语“C1-C6醇”是指具有1-6个碳原子的一羟基或二羟基烷烃，如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇、叔丁醇、戊醇、正己醇、乙二醇、丙二醇等。优选的C1-C6醇是C1-C6一羟基烷烃，更优选C1-C4一羟基烷烃如甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、仲丁醇和叔丁醇。一种甚至更优选的溶剂系统包含甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇或其混合物，尤其是甲醇。
在一个优选的实施方案中，将要进行结晶的2-FL在搅拌下溶解在热(比沸点温度低5-10℃)或沸腾的醇中直到获得清液。使此溶液冷却至室温，加入多晶型物II的晶种并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并用冷的溶剂洗涤。
根据另一个优选的实施例，溶剂系统还含有水。溶剂系统的总体积中的水含量的范围可以多达60v/v％，优选多达55v/v％，更优选在40-55v/v％之间。
在一个特别其优选的实施方式中，将要进行结晶的2-FL溶解在热(40-80℃)的含水醇中。使该溶液冷却至室温，加入多晶型物II的晶种并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体并且用冷的(多种)溶剂洗涤。特别有利的醇是甲醇。
根据用于制备结晶2-FL多晶型物II的另一种方法，将糖浆状2-FL、包含无定形2-FL或不同于多晶型物II的任何(多种)2-FL多晶型物的固体2-FL、或无定形2-FL和不同于多晶型物II的任何(多种)2-FL多晶型物的混合物悬浮在一种或多种较低极性的非质子有机溶剂中，并搅拌6-72小时。任选地，要进行(再)结晶的固体2-FL也可以含有2-FL多晶型物II。
较低极性的非质子有机溶剂是指介电常数小于约21的非质子有机溶剂。例如这样的典型溶剂是酯类、酮类、醚类、烃类和卤代烃类。
酯类优选地是指C1-C6羧酸与C1-C6醇的酯，更优选为乙酸与C1-C6醇的酯如乙酸甲酯、乙酸乙酯、乙酸正丙酯、乙酸异丙酯、乙酸正丁酯、乙酸异丁酯、乙酸戊酯、乙酸己酯等。
酮类优选地是指具有3-6个碳原子的开链或环状酮，更优选为丙酮或甲乙酮。
醚类优选地是指具有2-6个碳原子的开链或环状醚，更优选为二乙醚、甲基叔丁基醚、THF或二
Figure BDA00002473251100131
烷。
烃类优选地是指具有5-7个碳原子的烷烃(直链或支链)或环烷烃，更优选为正戊烷、正己烷或环己烷。此外，烃类也涉及芳族烃如苯、甲苯和二甲苯。
卤代烃类是指被选自氟、氯和溴的一个或多个卤素原子取代的以上定义的烃类，更优选为二氯甲烷、氯仿、四氯甲烷、1，2-二氯乙烷或氯苯。
在一个优选的实施方案中，酯类溶剂被用作较低极性的非质子溶剂。在一个更优选的实施方案中，该酯类溶剂还可以含有水。溶剂系统的总体积中的水含量的范围可以多达5v/v％，优选多达2v/v％，更优选在1-2v/v％之间。
根据另一个优选的实施方案，悬浮液在0℃至回流，优选20℃至80℃范围内的温度下搅拌。
在一个特别优选的实施方案，乙酸乙酯是所选的溶剂，其可以含1-2v/v％的水。悬浮液可以使用纯的乙酸乙酯或含水的乙酸乙酯来制备。备选地，水可以被连续或顺序地加入到悬浮液中。然后将该悬浮液在搅拌下缓慢加热至60-75℃，优选65-70℃，并在此温度下保持6-24小时，优选10-14小时。
结晶2-FL多晶型物I和多晶型物II，基于它们的粉末衍射图的证据，代表不同的结晶变体(见图16)。此外，两种结晶变体可以容易且可再现方式制备。
在另一个实施方案中，结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II适用于制药用途。2-FL充当抑制以下疾病的预防剂和治疗剂：由造成腹泻(尤其是在婴儿中)的黏膜病原体如弯曲菌属(Campylobacter)、杯状病毒(caliciviruses)和轮状病毒(rotavirus)引起的疾病，或者由引发肺炎的呼吸病原体引起的疾病。2-FL通过其免疫调节作用而有益于在一些单核细胞介导的疾病中发现的异常免疫反应。在人和动物中，通过给药2-FL，有可能促进胰岛素分泌，抑制血糖水平升高，改善糖尿病，促进生长并且增加母乳中的胰岛素水平。此外，2-FL与作为益生菌剂的一种或多种双歧杆菌种(Bifidobacterium species)如乳双歧杆菌(Bifidobacterium lactis)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)或长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)的组合适合用于防止免疫受损个体中的机会性感染。
在另一方面，本发明提供药物组合物，所述药物组合物包含作为活性成分的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II以及一种或多种药用载体，所述药用载体包括但不限于添加剂、佐剂、赋形剂和稀释剂(水、明胶、滑石、糖、淀粉、阿拉伯树胶、植物胶、植物油、聚亚烷基二醇、调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、润滑剂、着色剂、填料、湿润剂等)。合适的载体描述于最新版的Remington′s PharmaceuticalSciences(雷明顿药物科学)，其是本领域中的标准参考文本。用于给药的剂型包括，例如，片剂、粉剂、颗粒剂、丸剂、混悬剂、乳剂、浸剂、胶囊、糖浆、注射剂、液体、酏剂、浸膏剂和酊剂。包含结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II的药物组合物抑制由造成腹泻(尤其是在婴儿中)的黏膜病原体如弯曲菌属、杯状病毒和轮状病毒引起的疾病，或者由引发肺炎的呼吸病原体引起的疾病，影响在一些单核细胞介导的疾病中发现的异常免疫反应，促进胰岛素分泌，抑制血糖水平升高，改善糖尿病，促进生长并且增加母乳中的胰岛素水平。包含结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II和作为益生菌剂的一种或多种双歧杆菌种如乳双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、短双歧杆菌或长双歧杆菌的药物组合物适合用于防止免疫受损个体中的机会性感染。
在另一个实施方案中，结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II用于制备药物组合物。药物组合物可以借助于本领域中已知的任何常规方式例如在最新版的Remington′s Pharmaceutical Sciences(雷明顿药物科学)中描述的方式制备，该文献是本领域中的标准参考文本。
在另一个实施方案中，提供了包含结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II的营养制剂，如食品、饮料或饲料。营养制剂也可以含有可食用微量营养物、维生素和矿物质。这样的成分的量可以变化，其取决于该制剂是否意图用于正常、健康的婴儿、儿童、成人或具有专门需要(例如患有代谢性疾病)的受试者。微量营养物包括例如可食用的油、脂肪或脂肪酸(如椰子油、大豆油、甘油一酸酯、甘油二酯、棕榈油精、葵花油、鱼油、亚油酸、亚麻酸等)、碳水化合物(如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉、氢化玉米淀粉等)和来自酪蛋白、大豆、乳清或脱脂乳的蛋白质，或者这些蛋白质的水解产物，但是也可以使用其他来源的蛋白质(完整或水解的)。维生素可以选自由以下各项组成的组：维生素A、B1、B2、B5、B6、B12、C、D、E、H、K、叶酸、肌醇和烟酸。营养配方可以含有以下矿物质和痕量元素：Ca、P、K、Na、Cl、Mg、Mn、Fe、Cu、Zn、Se、Cr或I。
在一个优选的实施方案中，营养制剂是婴儿配方。婴儿配方是意在用于由在生命的前4-6个月期间的婴儿的特定营养用途并且自身满足婴儿的营养需求的食品。它可以含有一种或多种益生双歧杆菌种，益生元如低聚果糖和低聚半乳糖，来自酪蛋白、大豆、乳清或脱脂乳的蛋白质，碳水化合物如乳糖、蔗糖、麦芽糊精、淀粉或其混合物，脂质(例如棕榈油精、葵花油、红花油)以及每日饮食中必需的维生素和矿物质。婴儿配方含有结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II，其总量为0.1-3.0g/100g配方。
在另一个优选的实施方案中，营养制剂可以是包含结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II的食品补充剂。食品补充剂可以包含一种或多种益生菌剂，其量足以在个体(优选儿童和成人)中实现期望的效果。食品补充剂还可以含有维生素、矿物质、痕量元素以及其他微量营养物。食品补充剂可以例如为片剂、胶囊、锭剂或液体的形式。所述补充剂可以含有常规添加剂，所述常规添加剂选自但不限于粘合剂、包衣、乳化剂、增溶剂、包封剂、成膜剂、吸附剂、载体、填料、分散剂、湿润剂、胶凝剂、凝胶形成剂等。2-FL的日剂量范围为0.1至3.0g。
根据一个更优选的实施方案，食品补充剂是消化性健康功能食品，因为2-FL的给予对消化健康提供有益效果。消化性健康功能食品是经处理的食品，用于以片剂、胶囊、粉剂等形式，通过作为生理功能成分或组分的结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II来增强和保持消化健康。不同的术语如饮食补充剂、营养食品、设计食品、健康产品也可以用于指功能食品。
在另一个实施方案中，结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II用于制备营养制剂，所述营养制剂包括食品、饮料和饲料，优选婴儿配方、食品补充剂和消化性健康功能食品。营养制剂可以以任何常规方式制备。例如，它可以通过以适当的比例混合微量营养物组分来制备。然后加入维生素和矿物质，但是为了避免热降解或分解，热敏感维生素可以在均质化后加入。亲脂性维生素可以在混合之前溶解在脂肪源中。液体混合物使用水形成，水的温度优选为约50-80℃以有助于这些成分的溶解或分散。结晶2-FL多晶型物I和/或结晶2-FL多晶型物II可以在这个阶段添加。然后，所得的混合物借助于注蒸汽、热交换器或高压釜快速加热至约80-150℃进行均质化。这种热处理也显著减少细菌负载。然后将热的混合物快速冷却至约60-80℃。如果需要，可以在此温度、在约2-30Mpa的高压下进行进一步的均质化。冷却后，可以在此阶段加入热敏组分，并且可以方便地调整pH和固体含量。然后，所得的混合物通过常规方法如喷雾干燥或冻干成粉末进行干燥。益生菌剂可以在此时通过干混合加入。
在以下对示例性实施方案的描述过程中，本发明的其他特征将变得明显，给出这些示例性实施方案是用于举例说明本发明，而不用于限制本发明。
实施例
结晶程序
多晶型物I
A)在搅拌下，将无定形2-FL溶解在第一热或沸腾的溶剂中，并且任选地逐渐加入第二热或沸腾的溶剂。使该溶液冷却至室温，任选地用多晶型物I种晶并且继续搅拌12-24h。通过过滤收集沉淀的晶体，用冷的溶剂洗涤并干燥。使用的溶剂列于下表中。收率范围为63-90％。
项目 第一溶剂 第二溶剂 种晶
1. 热的80％含水甲醇(1体积) 沸腾的甲醇(2体积) 否
2. 热的80％含水甲醇(1体积) 沸腾的甲醇(2体积) 是
3. 沸腾的甲醇(2体积) - 是
4. 沸腾的甲醇(5体积) 热的异丙醇(2.5体积) 是
根据固态13C-NMR测量(见图10)，根据项目1的样品含有20±3％的β-端基异构体。
B)根据国际申请WO 2010/115935，在10％炭负载钯(850mg)存在下，使在甲醇(40ml)和水(6.5ml)中的10.0g的O-(2-O-苄基-α-L-吡喃岩藻糖基)-(1→2)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-D-葡萄糖经过氢化。在通过过滤除去催化剂后，滤液用2.5倍体积(相比于滤液)的乙醇稀释。使该溶液在室温静置2天，并收集沉淀的晶体
C)将O-(2-O-苄基-α-L-吡喃岩藻糖基)-(1→2)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-D-葡萄糖(200g)溶解在甲醇(1200ml)中，并加入在甲醇(200ml)中的cc.HCl溶液(4ml)。在加入在甲醇(100ml)中的10％Pd/C(10g)的浆料之后，混合物在氢气氛下在室温和3-3，5巴下搅拌1小时。滤掉催化剂并用甲醇洗涤，将滤液浓缩至重量为约600g的溶液，然后加入10ml的水。晶体在搅拌下沉淀，其通过过滤收集，用甲醇洗涤并干燥，从而得到113g产物(67％)。根据固态13C-NMR测量，该样品含有12±3％的β-端基异构体(见图11)。
D)将O-(2-O-苄基-α-L-吡喃岩藻糖基)-(1→2)-O-(β-D-吡喃半乳糖基)-(1→4)-D-葡萄糖(200g)溶解在甲醇(1400ml)中，并加入cc.HCl溶液(4ml)。在加入在甲醇(100ml)中的10％Pd/C(10g)的浆料之后，将混合物在氢气氛下在室温和3，5-4巴下搅拌1小时。反应混合物用碳酸钠(2.0g，在30ml甲醇中)中和，然后滤掉催化剂并用甲醇洗涤，将滤液浓缩至重量为约600g的溶液，然后加入10ml水。晶体在搅拌下沉淀，其通过过滤收集，用甲醇洗涤并干燥，从而得到102g产物(61％)。
多晶型物II
E)将无定形2-FL(50g)溶解在甲醇(25ml)和水(30ml)的混合物中并加热至76℃。使该溶液在搅拌下冷却至室温，同时用多晶型物II进行种晶以引发结晶。继续搅拌12-24h，通过过滤收集沉淀的晶体，用(多种)冷的溶剂洗涤并干燥，从而得到40g白色晶体。HPLC测定：99.9％。
F)将2-FL多晶型物I(50g)溶解在甲醇(35ml)和水(26ml)的混合物中并加热至40℃。使该溶液在搅拌下冷却至室温，同时用多晶型物II进行种晶以引发结晶。继续搅拌12-24h，通过过滤收集沉淀的晶体，用冷的溶剂洗涤并干燥，从而得到26g白色晶体。HPLC测定：98.2％。
G)将多晶型物I(16.1g)悬浮在乙酸乙酯(80ml)和水(8ml)中，并在65-70℃搅拌12h。过滤固体并在真空下干燥，从而得到15.9g白色晶体。HPLC测定：98.6％。
X射线粉末衍射
使用借助于石墨单色器制成为单色的CuKα辐射，利用Philips PW1830/PW1050仪器在透射几何形状中进行XRPD研究。基于
Figure BDA00002473251100191
的波长，从2θ值计算晶面间距(D-spacing)。作为一般规则，2θ值具有
Figure BDA00002473251100192
的误差率。
DSC分析
使用标准100μl铂坩埚，在SETARAM Labsys Evo TG-DSC热分析仪上，在流动的高纯度(6.0)氦气氛(流速20ml/min)中，在30-300℃的温度范围，在10K/min的恒定加热速率下，进行测量。样品量在5-10mg之间变化。
婴儿配方的实例
Figure BDA00002473251100201
点心的实例
富强粉(cake flour) 100g
淀粉 74g
水 14ml
根据本发明的2-FL 30g
发酵粉 2茶匙
盐 2茶匙
蛋 1个
黄油 80g
牛奶 2汤匙
从以上成分可以制备约30个小甜饼。
奶粉的实例
根据本发明的2-FL 20g
脱脂乳 5kg
乳清蛋白浓缩物 158g
乳糖 924g
水溶性维生素混合物 75g
矿物质 75g
亲脂性维生素 578g
借助于常规方法将这些成分混合、均质化、灭菌并干燥，从而制备奶粉。

Claims (24)

1.结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II，其特征在于，基于使用CuKα辐射的测量，所述结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II在16.98±0.20、13.65±0.20和18.32±0.202θ角，更优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20和21.70±0.202θ角，甚至更优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20和15.22±0.202θ角，最优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20、15.22±0.20和20.63±0.202θ角，尤其是在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20、15.22±0.20、20.63±0.20和11.94±0.202θ角处显示X射线粉末衍射反射。
2.根据权利要求1所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II，其基本上是纯的。
3.根据权利要求1或2中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II，其基本上不含有机溶剂和/或水。
4.一种用于制备根据权利要求1至3中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的方法，其特征在于，在根据权利要求1至3中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的晶种存在下，从包含一种或多种C1-C6醇的溶剂系统进行结晶。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述C1-C6醇是甲醇和/或乙醇。
6.根据权利要求4或5中任一项所述的方法，其中所述溶剂系统还含有水。
7.一种用于制备根据权利要求1至3中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II的方法，其特征在于，将糖浆状2-FL、包含无定形2-FL或不同于多晶型物II的任何2-FL多晶型物的固体2-FL、或无定形2-FL和不同于多晶型物II的任何2-FL多晶型物的混合物悬浮在一种或多种较低极性的非质子有机溶剂中。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述较低极性的非质子有机溶剂是酯类溶剂，优选乙酸与C1-C6醇的酯，更优选乙酸乙酯。
9.多晶或单晶形式的2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I，其特征在于，基于使用CuKα辐射的测量，所述2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I在21.34±0.20、20.92±0.20和18.37±0.202θ角，更优选在21.34±0.20、20.92±0.20、18.37±0.20和16.70±0.202θ角，甚至更优选在21.34±0.20、20.92±0.20、18.37±0.20、16.70±0.20和9.91±0.202θ角，最优选在21.34±0.20、20.92±0.20、18.37±0.20、16.70±0.20、9.91±0.20和13.13±0.202θ角，尤其是在21.34±0.20、20.92±0.20、18.37±0.20、16.70±0.20、9.91±0.20、13.13±0.20、7.87±0.20和8.90±0.202θ角处显示X射线粉末衍射反射。
10.根据权利要求9所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I，其为单晶形式，其特征在于，所述结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I具有单斜晶，空间群P21，优选具有以下晶胞参数：
Figure FDA00002473251000021
Figure FDA00002473251000022
α＝90.00°，β＝107.871(3)°，γ＝90.00°。
11.根据权利要求9所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I，其特征在于，所述结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I含有至多30％的β-端基异构体，优选7-25％的β-端基异构体。
12.根据权利要求9-11中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I，其基本上是纯的。
13.根据权利要求9-12中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I，其基本上不含有机溶剂和/或水。
14.一种制备根据权利要求9-13中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物I的方法，其特征在于，在没有晶种存在下，从含有一种或多种C1-C3醇和任选的水的溶剂系统进行结晶。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述C1-C3醇是甲醇和/或乙醇。
16.根据权利要求14或15中任一项所述的方法，其中所述溶剂系统还含有水。
17.根据权利要求1至3中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II和/或根据权利要求9至13中任一项所述的多晶型物I，其作为药剂。
18.根据权利要求1至3中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II和/或根据权利要求9至13中任一项所述的多晶型物I用于制备药物组合物的用途。
19.药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至3中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II和/或根据权利要求9至13中任一项所述的多晶型物I，以及一种或多种药用载体。
20.营养制剂，所述营养制剂包含根据权利要求1至3中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II和/或根据权利要求9至13中任一项所述的多晶型物I。
21.根据权利要求20的营养制剂，所述营养制剂是婴儿配方。
22.根据权利要求20的营养制剂，所述营养制剂是食品补充剂。
23.根据权利要求22的食品补充剂，所述食品补充剂是消化性健康功能食品。
24.根据权利要求1至3中任一项所述的结晶2’-O-岩藻糖基乳糖多晶型物II和/或根据权利要求9至13中任一项所述的多晶型物I用于制备营养制剂的用途。
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