CN115279778A - 2’-fl的结晶 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种通过向溶液中添加乙酸，从包含2’‑FL和一种或多种其它岩藻糖基化碳水化合物的水溶液中选择性结晶2’‑FL的方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种使用乙酸从水溶液(特别是从2’-FL的生物技术生产中获得的水溶液)中结晶2’-O-岩藻糖基乳糖(2’-FL)的方法。
背景技术
结晶或重结晶是从反应混合物中分离产物、将其与污染物/杂质分离并获得纯物质的最简单和最便宜的方法之一。使用结晶的分离或纯化使整个技术过程更稳健并且划算，因此具有优势。
2’-FL可以以不同的结晶形式存在，参见例如WO 2011/150939(多晶型物I和II)、WO 2014/009921(多晶型物A、B和C)或WO 2014/069625。在这方面，2’-FL的结晶可以有利地成为其生产的一部分，特别是在其从生产它的水性培养基中纯化和分离过程中。WO 2014/086373公开了使用甲醇从源自水性发酵液的冻干粉末中结晶2’-FL。WO 2015/188834公开了一种通过向溶液中添加一种或多种C1-C4醇(优选甲醇)，从包含2’-FL和除2’-FL以外的岩藻糖基化碳水化合物(优选DFL)的水溶液中选择性结晶2’-FL多晶型物II的方法。WO2016/095924公开了一种替代方法，其通过向溶液中添加乙酸，从包含2’-FL和一种或多种其它岩藻糖基化碳水化合物的水溶液中选择性结晶2’-FL多晶型物II。后一种方法提供了特别适用于膳食/食品/婴儿配方食品应用的结晶2’-FL。WO 2018/164937要求保护一种通过从其包含不大于1％(按重量计)有机溶剂的过饱和水溶液中蒸发结晶制备结晶2’-FL的方法。
对于结晶的2’-FL，仍然需要一种改进的结晶方法，其消耗较少量的抗溶剂和/或产生具有改进性能的晶体，例如稳定的晶体形态、更好的过滤性、更低水平的水分/挥发物、更快的粉末干燥和/或更好的干粉物理和流变性能，同时保持或甚至超过现有技术方法提供的良好产率和纯度。
发明内容
本发明的第一方面涉及一种用于使2’-FL(有利地2’-FL的多晶型物II)结晶的方法，其包括：
1)提供包含2’-FL的水溶液或糖浆，
2)将结晶2’-FL(有利地2’-FL的多晶型物II)在乙酸中的悬浮液添加至包含2’-FL的水溶液或糖浆中，从而产生浆液，
3)向所述浆液中添加乙酸以获得结晶物质，和
4)从所述结晶物质中过滤所述结晶2’-FL，有利地2’-FL的多晶型物II。
本发明的第二方面涉及结晶2’-FL，有利地2’-FL的多晶型物II，其根据本发明的第一方面获得或可获得。
本发明的第三方面涉及结晶2’-FL，有利地2’-FL的多晶型物II，其具有通过定量测量的组合确定的以下测定：2’-FL：至少97％，DFL：小于2％，乙酸：小于0.5％。
本发明的第四方面涉及一种营养或药物组合物，其包含根据本发明的第二或第三方面的结晶2’-FL，有利地2’-FL的多晶型物II。
本发明的第五方面涉及根据本发明的第二或第三方面的结晶2’-FL(有利地2’-FL的多晶型物II)在制备食品组合物或食品补充剂中的用途。
本发明的第六方面涉及根据本发明的第二或第三方面的结晶2’-FL(有利地2’-FL的多晶型物II)作为食品或食品补充剂的用途。
具体实施方式
对于2’-FL多晶型物II的结晶，优选在发酵培养基的一个或多个纯化步骤后，从2’-FL的微生物发酵生产中获得的水溶液中结晶，并且该水溶液除了2’-FL之外还包含例如一种或多种其它岩藻糖基化碳水化合物类型的副产物，例如二岩藻糖基乳糖(DFL)，从乙酸水溶液中结晶的溶剂-抗溶剂型结晶方法(参见WO 2016/095924)已被证明在技术上具有优势，可提供具有良好纯度的结晶2’-FL，适合并批准用于营养组合物和婴儿配方食品。可通过WO 2016/095924中公开的方法获得的结晶2’-FL多晶型物II通常含有低于1％、优选不大于0.5％的残留乙酸含量，这不代表任何安全或健康问题。然而，为了获得高产率和良好纯度的结晶的2’-FL，结晶过程中，水溶液中每千克2’-FL使用cca.5-7升乙酸。
本发明人努力减少用于结晶的乙酸的量，同时保持由原始方法提供的2’-FL的良好结晶产率和纯度，并且令人惊讶地发现如此产生的晶体具有有益的性质和晶体品质。
因此，提供一种用于使2’-FL(有利地2’-FL的多晶型物II)结晶的方法，其包括：
1)提供包含2’-FL的水溶液或糖浆，
2)将结晶2’-FL(有利地2’-FL的多晶型物II)在乙酸中的悬浮液添加至所述包含2’-FL的水溶液或糖浆中，从而产生浆液，
3)向所述浆液中添加乙酸以获得结晶物质，和
4)从所述结晶物质中过滤结晶2’-FL，有利地2’-FL的多晶型物II。
2’-FL多晶型物II是指在WO 2011/150939中公开的2’-FL的结晶变体，基于使用CuKα辐射的测量，其包含在16.98±0.20、13.65±0.20和18.32±0.202θ角，更优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20和21.70±0.202θ角，甚至更优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20和15.22±0.202θ角，最优选在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20、15.22±0.20和20.63±0.202θ角，特别是在16.98±0.20、13.65±0.20、18.32±0.20、21.70±0.20、15.22±0.20、20.63±0.20和11.94±0.202θ角处的X射线粉末衍射反射。
以上方法提供结晶2’-FL，优选2’-FL多晶型物II，与现有技术已知的2’-FL结晶材料相比具有有益特征。此外，要求保护的结晶方法的特征在于抗溶剂(乙酸)消耗较低(意味着更经济的过程)，而结晶产率和晶体纯度(通常通过HPLC测量)没有降低。
该方法的第一步是提供包含2’-FL的水溶液或糖浆。水溶液或糖浆不包含有机溶剂并且优选是均质的。如果是水溶液，则不需要是2’-FL的过饱和溶液。2’-FL的过饱和溶液是一种溶液，其含有超过在给定温度下能够溶解的最大量的2’-FL。“在给定温度下能够溶解的最大量的2’-FL”实际上是2’-FL的溶解度，这是一种热化学性质，指的是2’-FL溶解在溶剂中的能力。它根据溶解在处在平衡状态的溶剂中(这里是在水中)的溶质的最大量来测量。所得溶液称为饱和溶液。可以测量2’-FL在水中的溶解度，例如WO 2018/164937的实施例15中所公开，其通过引用并入本文。2’-FL在水溶液或糖浆中的浓度为至少40wt％，优选至少45wt％，更优选至少50wt％，甚至更优选至少53wt％，例如53-68wt％、55-61wt％、58-63wt％或57-61wt％(通过HPLC测定)。
在一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆在升高的温度(高于室温)下提供或在进行下一步骤之前加热至升高的温度。升高的温度为至少35℃，优选至少45℃，例如大约45-55℃或50±2℃。
以上公开的包含2’-FL的水溶液或糖浆可以包含一种或多种其它碳水化合物或碳水化合物衍生物，这取决于2’-FL先前是如何产生的。2’-FL可以通过化学全合成从更简单的碳水化合物前体制备，该合成包括适当保护的乳糖受体的化学岩藻糖基化；这样的方法公开于例如WO 2010/070616、WO 2010/115934、WO 2010/115935、WO 2014/009921、WO2015/032413、WO 2016/038192、WO 2017/134176或WO 2017/153452中。除2’-FL外，污染2’-FL的碳水化合物衍生物通常是其中公开的2’-FL合成路线中的中间体衍生物，尤其是在完全脱保护为2’-FL之前的最终中间体。这样的最终中间体是完全或部分保护的2’-FL衍生物，其中保护基团可以是酰基(主要是乙酰基或苯甲酰基)、任选取代的苄基、缩醛或缩酮(主要是异亚丙基或亚苄基)和/或甲硅烷基。在2’-FL的发酵生产中(参见例如Drouillard等人Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)、WO 2012/097950、WO 2012/112777、WO 2015/032412、WO 2015/188834、WO 2016/095924)，典型的碳水化合物副产物可以包含除2’-FL和/或乳糖和/或乳果糖和/或岩藻糖和/或葡萄糖和/或蔗糖和/或半乳糖和/或FLU(2’-O-岩藻糖基-乳果糖)和/或FFL(Fuc(α1-2)Fuc(α1-2)Gal(β1-4)Glc)之外的岩藻糖基化碳水化合物。除了2’-FL之外的岩藻糖基化碳水化合物可以是在发酵过程中由以下原因形成的任何其它单岩藻糖基化乳糖：除了乳糖的半乳糖部分上的α-1,2-岩藻糖基化之外的缺乏、缺陷或受损的岩藻糖基化(例如一种导致3-O-岩藻糖基乳糖，3-FL)，或在培养条件或发酵后操作下2’-FL上岩藻糖迁移，或从多岩藻糖基化(优选二岩藻糖基化)乳糖水解岩藻糖；或可以是由以下原因形成的多岩藻糖基化(优选二岩藻糖基化)乳糖：在培养条件下乳糖的过度岩藻糖基化。二岩藻糖基化乳糖优选为2,2’-二-O-岩藻糖基乳糖或2’,3-二-O-岩藻糖基乳糖(DFL)，特别是作为在2’-FL的发酵生产中形成的特征性副产物的DFL。在发酵过程中或发酵后纯化/分离步骤中可能形成的其它碳水化合物污染物是FLU或乳果糖(通过重排)，岩藻糖、葡萄糖、半乳糖或乳糖(由于产物和中间体的水解)，葡萄糖、乳糖或蔗糖(作为发酵过程中添加的未消耗的离析物或原料)。
如实验部分所公开，用折射计测量，根据步骤1)的水溶液或糖浆的总固体含量为至少57°Bx(白利糖度)，例如57-80、60-80、65-80、70-80、65-75或70-75°Bx。它是指溶解在水溶液中的任何溶质，即它包括如上文所公开的除2’-FL及其伴随的碳水化合物衍生物以外的物质，例如盐。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-77°Bx的总固体含量和52-62wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有70-75°Bx的总固体含量和56-62wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-71°Bx的总固体含量和52-56wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-77°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有70-75°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-71°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL和任选的乳糖作为伴随的碳水化合物。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL，其中2’-FL:DFL重量比大于2，优选大于4，更优选大于6，特别是8-13之间。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL和乳糖，其中2’-FL:乳糖重量比为10-110，并且DFL:乳糖重量比为1-10。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL和乳糖，其中2’-FL:DFL的重量比大于6，优选8-13，2’-FL:乳糖重量比为10-110，并且DFL:乳糖重量比为1-10。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL和乳糖，其中2’-FL:DFL的重量比大于13，优选大于25，例如大于50，并且DFL:乳糖重量比小于1。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-75°Bx的总固体含量和52-62wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，并且其中2’-FL:DFL重量比为8-13。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有70-75°Bx的总固体含量和56-62wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于6，优选8-13，2’-FL:乳糖重量比为10-110，并且DFL:乳糖重量比为1-10。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-71°Bx的总固体含量和52-56wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于6，优选8-13，2’-FL:乳糖重量比为20-50，并且DFL:乳糖重量比为2-6。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-77°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于13，优选大于25，例如大于50，并且DFL:乳糖重量比小于1。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有70-75°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于13，优选大于25，例如大于50，并且DFL:乳糖重量比小于1。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-71°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于13，优选大于25，例如大于50，并且DFL:乳糖重量比小于1。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-75°Bx的总固体含量和52-62wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有70-75°Bx的总固体含量和56-62wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-71°Bx的总固体含量和52-56wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-77°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有70-75°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL如通过HPLC所估计，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-71°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL和任选的乳糖作为伴随的碳水化合物，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL，其中2’-FL:DFL重量比大于2，优选大于4，更优选大于6，特别是8-13之间，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL和乳糖，其中2’-FL:乳糖重量比为10-110，DFL:乳糖重量比为1-10，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆包含DFL和乳糖，其中2’-FL:DFL的重量比大于6，优选8-13，2’-FL:乳糖重量比为10-110，DFL:乳糖重量比为1-10，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-75°Bx的总固体含量和52-62wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比为8-13，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有70-75°Bx的总固体含量和56-62wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于6，优选8-13，2’-FL:乳糖重量比为10-110，DFL:乳糖重量比为1-10，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-71°Bx的总固体含量和52-56wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于6，优选8-13，2’-FL:乳糖重量比为20-50，DFL:乳糖重量比为2-6，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-77°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于13，优选大于25，例如大于50，DFL:乳糖重量比小于1，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有70-75°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于13，优选大于25，例如大于50，DFL:乳糖重量比小于1，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在步骤1)的一个实施方式中，包含2’-FL的水溶液或糖浆具有67-71°Bx的总固体含量和62-70wt％，例如64-68wt％的溶解的2’-FL，如通过HPLC所估计，其中2’-FL:DFL重量比大于13，优选大于25，例如大于50，DFL:乳糖重量比小于1，并且在至少45℃，优选在50±2℃提供。
在第二步中，为了引发结晶，在升高的温度下，优选在与步骤1)相同的温度下，并且优选在连续搅拌下，将结晶2’-FL(优选2’-FL多晶型物II)在乙酸中的悬浮液添加至根据步骤1)的包含2’-FL的水溶液或糖浆中，从而生成浆液。在添加结晶2’-FL(优选2’-FL多晶型物II)在乙酸中的悬浮液后，浆液中乙酸的量应大于1wt％，优选大于1.5wt％，更优选大于2wt％，例如2至4wt％或2至3wt％之间。待添加至步骤1)中提供的包含2’-FL的水溶液或糖浆中的结晶2’-FL(优选2’-FL多晶型物II)在乙酸中的悬浮液为约10-30wt％(即100g悬浮液含有约10-30g结晶2’-FL，优选2’-FL多晶型物II)。此外，晶种的量适合生成浆液。优选地，相对于步骤1)中提供的水溶液或糖浆的总固体含量，晶种的量至少为0.5wt％，例如0.5-2wt％，优选0.9-1.2wt％。适用于制备上述悬浮液的乙酸是冰乙酸。
通常，将2’-FL/乙酸悬浮液立即添加至包含2’-FL的水溶液或糖浆中，优选在搅拌下。接种(seeding)后，将混合物在相同温度下搅拌几个小时，例如1-8或3-7小时，优选4-6小时，例如约5小时，以生成浆液。
在上述引发结晶的步骤中，不应用真空或减压。
使用2’-FL/乙酸悬浮液来接种包含2’-FL的水溶液或糖浆是有利的，因为它代表了一种不同的成核机制，与例如WO 2018/164937公开的蒸发结晶或简单添加晶种相反，因而影响所得结晶材料的形态。
在步骤2)的一种实施方式中，接种2’-FL的量为步骤1)中提供的水溶液或糖浆的固体含量的0.5-2wt％，2’-FL/乙酸悬浮液为10-30wt％，并且添加悬浮液后浆液中乙酸的量为2-3wt％。
在步骤2)的一种实施方式中，接种2’-FL的量为步骤1)中提供的水溶液或糖浆的固体含量的0.9-1.2wt％，2’-FL/乙酸悬浮液为10-30wt％，并且添加悬浮液后浆液中乙酸的量为2-3wt％。
在步骤2)的一种实施方式中，接种2’-FL的量为步骤1)中提供的水溶液或糖浆的固体含量的0.5-2wt％，2’-FL/乙酸悬浮液为24±2wt％，并且添加悬浮液后浆液中乙酸的量为2-3wt％。
在步骤2)的一种实施方式中，接种2’-FL的量为步骤1)中提供的水溶液或糖浆的固体含量的0.9-1.2wt％，2’-FL/乙酸悬浮液为24±2wt％，并且添加悬浮液后浆液中乙酸的量为2-3wt％。
在步骤2)的一个实施方式中，在添加2’-FL/乙酸悬浮液的情况下的搅拌和/或在添加2’-FL/乙酸悬浮液之后的浆液搅拌以150-300rpm进行。
在步骤2)的一个实施方式中，在添加2’-FL/乙酸悬浮液之后，在与先前进行接种相同的温度下将浆液搅拌至少2-5小时。
在接下来的步骤3)中，在步骤2)之后，在连续搅拌下将纯乙酸添加至上面得到的浆液中。在一个实施方式中，将纯乙酸添加至浆液中的温度与之前步骤中的温度相同。在其它实施方式中，温度低于步骤2)中的温度。在优选的实施方式中，浆液首先冷却，通常在大约5-60分钟内，或允许其自行冷却至所需温度，然后添加纯乙酸，并在添加纯乙酸的整个期间保持该温度。该温度优选为约30-40℃，例如约35±2℃。计算步骤3)中添加的乙酸的量，使得在步骤3)中添加乙酸结束时结晶悬浮液中乙酸与水的重量分数为4-6，优选4.6-6或4.6-5.5。在乙酸与水的重量分数中，乙酸的量应包括步骤3)中添加的乙酸和构成用于在步骤2)中接种的2’-FL/乙酸悬浮液的乙酸。步骤3)结束时的悬浮液的水含量实际上是步骤1)中提供的包含2’-FL的水溶液或糖浆中的水量，并且可以计算如下：水wt％＝100-Brix[步骤1中提供的包含2’-FL的水溶液或糖浆的量]。
可以在步骤3)中以给定的添加速率连续添加纯乙酸，或分几份，优选等份添加纯乙酸。计算出的乙酸的量相对缓慢添加，在几个小时内，但不少于3小时内，例如不少于5、7或9小时内，优选不少于10小时内，更优选12±2小时内。在乙酸添加结束时，浆液变成结晶物质。
在上述添加乙酸的步骤中，不应用真空或减压。
任选地，在根据以上步骤3)添加纯乙酸并获得2’-FL的结晶物质之后，如果需要，在几个小时内将最终温度降低至0℃与室温之间，优选在约20-25℃。在该最终温度下，将2’-FL的结晶物质搅拌几个小时，例如至少2或3小时，例如5±1小时。在平衡上述2’-FL的结晶物质的步骤中，不应用真空或减压。
在步骤3)的一个实施方式中，历时至少3小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4-6。
在步骤3)的一个实施方式中，历时至少10小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4-6。
在步骤3)的一个实施方式中，历时12±2小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4-6。
在步骤3)的一个实施方式中，历时至少3小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4.6-5.5。
在步骤3)的一个实施方式中，历时至少10小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4.6-5.5。
在步骤3)的一个实施方式中，历时12±2小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4.6-5.5。
在步骤3)的一个实施方式中，在35±2℃历时至少3小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4-6。
在步骤3)的一个实施方式中，在35±2℃历时至少10小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4-6。
在步骤3)的一个实施方式中，在35±2℃历时12±2小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4-6。
在步骤3)的一个实施方式中，在35±2℃历时至少3小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4.6-5.5。
在步骤3)的一个实施方式中，在35±2℃历时至少10小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4.6-5.5。
在步骤3)的一个实施方式中，在35±2℃历时12±2小时将乙酸添加至步骤2)中获得的浆液中以达到结晶物质中乙酸与水的重量分数为4.6-5.5。
在步骤3)中，上述公开的任何具体实施方式可选地遵循：
-将获得的结晶物质冷却至0-25℃，优选20-25℃，
-将获得的结晶物质搅拌至少2-3小时，优选5±1小时，或
-将获得的结晶物质冷却至0-25℃，优选20-25℃，然后将其搅拌至少2-3小时，优选5±1小时。
然后在步骤4)中过滤步骤3)中获得的2’-FL结晶物质或上述任选平衡的结晶物质。结晶2’-FL按照常规方法从母液中分离出来，例如在0℃和室温之间的温度，优选在约20-25℃，进行死端过滤、离心或倾析。在一些实施方式中，分离的2’-FL晶体，优选2’-FL多晶型物II的那些，用冰乙酸洗涤。然后按照常规方法干燥任选洗涤的晶体。
通过本发明的方法获得或可获得的结晶2’-FL，优选2’-FL多晶型物II具有至少92％、优选至少95％、更优选至少98％的纯度(通过HPLC测定)，和/或与2’-FL相比，按重量计，DFL的含量小于3％，优选小于2％，和/或乙酸含量小于1％，优选小于0.5％，和/或水含量小于0.5％，优选小于0.25％或0.1％。通过本发明的方法获得或可获得的结晶2’-FL，优选2’-FL多晶型物II具有通过定量测量的组合确定的以下测定：2’-FL：至少97％，DFL：小于2％，乙酸：小于0.5％；或2’-FL：至少97％，DFL：小于2％，乙酸：小于0.5％和水：小于0.1％。
以上方法提供了结晶2’-FL，优选2’-FL多晶型物II，其具有通过WO 2016/095924可获得的结晶2’-FL所不具有的以下有益特征中的至少一个，如已通过进一步详细描述中公开的实施例的比较试验所证明：
-由于晶体尺寸较大(根据粒度分布评估)和对机械剪切应力稳定的晶体形态，粉尘较少，
-更好的过滤性导致更短的过滤周期，
-较低的挥发物含量(如通过干燥失重，LoD测量)意味着较短的干燥期，优选地，LoD值降低至少25％，更优选至少40％，甚至更优选至少50％，
-干燥后残留溶剂(即AcOH和水)含量较低，
-更好的流动性，如Carr指数和Hausner比率所示，
-增加体积和振实密度，和/或
-更高的结晶产率。
此外，与根据2016/095924的现有技术方法相比，上述方法消耗显著更少(少至少25％，优选少至少35％，例如少约40、45或50％)AcOH。
由于粉末性能显著改善，下游操作可以显著促进，例如直接配制过程，如干混。
此外，上述要求保护的结晶方法优于在例如WO 2018/164937中公开的从水中蒸发结晶的方法，因为基本上没有必要提供从其中使2’-FL结晶的包含2’-FL的过饱和水溶液或糖浆，且/或获得的晶体在过滤性方面表现出更好的性能。
本结晶方法非常适合通过如上所述用乙酸处理水溶液，从水溶液中选择性结晶2’-FL，该水溶液优选从发酵液中获得，含有2’-FL和至少一种除2’-FL之外的岩藻糖基化碳水化合物，特别是DFL，和任选的其它碳水化合物类污染物。这种选择性结晶在一个步骤中提供高纯度的2’-FL，并且通常可以实现至少100g 2’-FL的批次的结晶，例如至少1kg，或至少100kg，或甚至至少1吨的2’-FL，尽管这样的水溶液中污染性糖类化合物的浓度范围很广。在这点上，2’-FL可以以至少70％、优选至少75％、更优选至少80％、例如至少85％的产率结晶。
根据本发明使2’-FL从中结晶的包含2’-FL的水溶液或糖浆优选是处理/纯化后的发酵液，其发酵通过培养遗传修饰细胞提供2’-FL。发酵优选如下进行。
外源添加的乳糖作为受体被遗传修饰细胞从培养基中内化，在包括酶促岩藻糖基化的反应中，它被转化为2’-FL。在一个实施方式中，内化可以通过被动转运机制发生，在此期间乳糖被动地扩散穿过细胞的质膜。流动是由细胞外和细胞内空间乳糖的浓度差引导的，乳糖应该从较高浓度的地方流向较低浓度区域趋于平衡。在另一个实施方式中，乳糖可以借助主动转运机制在细胞中内化，在此期间，乳糖在细胞的转运蛋白或通透酶的影响下扩散穿过细胞的质膜。乳糖通透酶(LacY)对乳糖具有特异性。因此，乳糖可以通过主动转运容易地被表达LacY通透酶的细胞(这种细胞在本文中也称为LacY+表型细胞)吸收并在被岩藻糖基化之前在细胞中累积(参见例如WO 01/04341，Fort等人.J.Chem.Soc.,Chem.Comm.2558(2005)，Drouillard等人.Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)、WO 2012/112777、WO 2015/036138)。优选地，表达编码乳糖通透酶的lacY基因的细胞缺乏能够降解内化的乳糖的酶。优选地，由于内源性lacZ基因的失活或缺失，细胞缺乏β1,4-半乳糖苷酶活性(这样的细胞在本文中也称为LacZ-表型细胞)或至少具有降低的β1,4-半乳糖苷酶活性，参见例如根据WO 2012/112777，具有低半乳糖苷酶活性的大肠杆菌(E.coli)。
在一个优选的实施方式中，乳糖的内化通过由细胞的乳糖通透酶(更优选LacY)介导的主动转运机制发生。
在被内化至细胞中后，乳糖通过由相应的异源基因或核酸序列表达的岩藻糖基转移酶被岩藻糖基化，该异源基因或核酸序列通过已知技术例如通过将其整合至细胞的染色体中或使用表达载体引入细胞中。制造2’-FL所必需的岩藻糖基转移酶是α-1,2-岩藻糖基转移酶。为岩藻糖基化提供岩藻糖残基的相应供体GDP-Fuc可以由细胞在GDP-Fuc从头生物合成通路中参与的酶(ManB、ManC、Gmd和WcaG)的作用下，从简单的碳源如甘油、果糖或葡萄糖开始，以逐步反应顺序生成。或者，遗传修饰细胞可以利用回收的岩藻糖，该岩藻糖由激酶磷酸化，然后由焦磷酸化酶转化为GDP-Fuc(参见例如WO 2010/070104)。
2’-FL可以由遗传修饰微生物根据例如Drouillard等人.Angew.Chem.Int.Ed.45,1778(2006)、WO 01/04341、WO 2010/070104、WO 2010/142305、WO 2012/112777、WO 2015/032412、WO 2015/036138、WO 2015/197082、WO 2017/101958、WO 2017/188684、US 2017/0152538、WO 2018/077892、WO 2018/194411或WO 2019/008133产生。
在优选的实施方式中，遗传修饰微生物是大肠杆菌。
因此，在一个优选实施方式中，产生过程包括以下步骤：
a)提供LacY+表型或LacZ-、LacY+表型的遗传修饰大肠杆菌细胞，其中所述细胞包含：
-α-1,2-岩藻糖基转移酶，和
-一种或多种编码GDP-Fuc生物合成通路的基因，和
b)在外源乳糖和合适的碳源存在下培养LacY+表型或LacZ-、LacY+表型的遗传修饰大肠杆菌细胞，从而产生包含2’-FL的发酵液。
大肠杆菌菌株优选仅具有一种重组糖基转移酶编码基因，该糖基转移酶为α-1,2-岩藻糖基转移酶，更优选为来自幽门螺杆菌(Helicobacterpylori)的futC基因编码的α-1,2-岩藻糖基转移酶。
如此产生的发酵液在生产细胞和培养基中都包含2’-FL。为了收获细胞内2’-FL并由此提高产物的滴度，上述方法还可以包括破坏或透化细胞的可选步骤c)，例如通过加热。
包含中性HMO的发酵液可伴有其它碳水化合物。通常，另一种碳水化合物是乳糖，它在发酵过程中用作受体并且未转化。尽管在将发酵液进行以下公开的分离/纯化步骤(例如WO 2012/112777或WO 2015/036138中所公开)之前，乳糖的量可以被显著降低，但没有必要这样做。在一个实施方式中，该纯化方法适用于从非碳水化合物污染物分离伴随有碳水化合物的2’-FL，而碳水化合物的相对比例在要求保护的方法的过程中基本上没有变化。然而，要求保护的方法的另一个实施方式适合通过将中性HMO从碳水化合物和非碳水化合物污染物中分离来纯化中性HMO，从而提供基本纯形式的2’-FL。
因此，2’-FL发酵生产中伴随的碳水化合物主要是乳糖和DFL(Fucα1-2Galβ1-4[Fucα1-3]Glc)作为过度岩藻糖基化的2’-FL，其具有与2’-FL相似的生物学特性。此外，发酵液中可能还有其它非HMO碳水化合物污染物。这些通常是乳果糖及其糖基化衍生物。当在将乳糖添加至发酵之前和/或在发酵过程中对其加热灭菌时，乳糖可以通过重排形成乳果糖。由于乳果糖也被细胞内化，它可以在同时发生的生物转化反应中类似于乳糖地被糖基化。然而，乳果糖及其糖基化衍生物的量不超过生物质分离后培养液总干固体物质的十分之二重量％(acouple oftenth weight％)。
从发酵液中去除/分离非碳水化合物颗粒和物质。这个过程可以包括一个常规的脱矿质步骤，在这个步骤中，矿物质、盐和其它带电分子从含有2’-FL和其它碳水化合物的发酵液中提取出来。可以使用常规的离子交换树脂进行脱矿质，例如使发酵液通过H+-形式的阳离子交换树脂和游离碱形式的阴离子交换树脂。阳离子交换树脂优选为强交换剂，阴离子交换树脂可以为弱交换剂或强交换剂。离子交换树脂除了从发酵液中去除盐和带电分子外，还可以物理吸附在先前的纯化步骤之后任选地留在发酵液中的蛋白质、DNA和着色体/焦糖体。或者，可通过常规电渗析或常规膜过滤/渗滤系统使用合适的粒径截留进行脱矿质。然后以上述任何方式获得的溶液可以通过常规蒸发步骤或常规纳米过滤步骤浓缩。
此外，上述从碳水化合物中去除/分离非碳水化合物颗粒和物质的方法还可以包括常规的木炭处理以去除先前的纯化步骤留下的有色体和任选的水溶性生物分子(例如核酸、肽、蛋白质、氨基酸、胞外多糖和脂质)。木炭对水性介质中的碳水化合物的亲和力比对某些水溶性亲脂性污染物(例如，含有亲脂性部分的蛋白质和氨基酸，脂质和有色芳香体)的亲和力弱。因此，木炭上不含亲脂性污染物的碳水化合物可以很容易地用(蒸馏的)水从木炭上洗掉。此外，上述方法还可以包括在发酵后，优选在上述木炭处理之前，用于去除细胞、细胞碎片和蛋白质的常规澄清步骤。可以以常规方式进行澄清，例如通过在离心机中沉淀产生澄清或部分澄清的上清液。或者，可以以常规方式对发酵液进行超滤以除去高分子量组分。用于超滤2’-FL发酵液的半透膜可以适当地具有5-50kDa、优选10-25kDa、更优选约15kDa的截留。根据待澄清的发酵液的特性，可以使用在上述给定范围内的较高和较低截留膜的组合(按此顺序)。任选地，可以在离心或超滤之后进行纳滤，在此期间，含有2’-FL和伴随的碳水化合物的水溶液在用木炭处理之前以常规方式浓缩。在此纳滤步骤中，其膜的孔径可确保滞留分子量为488的2’-FL；因此通常可以使用200-300Da的截留膜。或者，如果UF渗透物含有较高量的乳糖，则适用于纳滤的膜的MWCO为600-3500Da，确保滞留2’-FL并允许至少一部分乳糖通过膜，并且膜的活性(顶)层由聚酰胺构成，其中所述膜上的MgSO4排斥(rejection)因子为约20-90％，优选50-90％。在乳糖排斥相对较高(约90％)的情况下，可能有必要随后用纯水渗滤以将所有或至少大部分乳糖带入渗透物中。乳糖排斥越高，有效分离所必需的渗滤水就越多。这种纳滤膜对于2’-FL应该是紧密的，以便2’-FL被有效地滞留。优选地，2’-FL的排斥大于95％，更优选97％，甚至更优选99％。MWCO大于3500Da的膜预计允许更多或显著量的2’-FL通过膜，因此显示2’-FL的滞留减少，因此不适合。优选乳糖的排斥不大于80-90％。如果乳糖排斥变为90±1-2％，则2’-FL排斥应优选为约99％或更高，以实现实际令人满意的分离。当膜对MgSO4相对松散时，这些要求同时得到满足，即其排斥为约50-90％。在这方面，以上指定的膜对于2’-FL是紧密的，而对于单糖和乳糖以及MgSO4是松散的。因此，可以通过纳滤高效地将乳糖(通过发酵制备2’-FL的前体)与2’-FL分离，另外大部分二价离子也通过至渗透物。还优选地，该膜对NaCl的排斥因子低于对MgSO4的排斥因子。在约20-30％的NaCl排斥下，也可以实现滞留物中所有单价盐的显著减少。以上纳滤膜的活性层或顶层优选由聚酰胺构成，更优选聚酰胺膜为以苯二胺或哌嗪构建模块作为胺的聚酰胺，甚至更优选哌嗪(也称为哌嗪基聚酰胺)。合适的哌嗪基聚酰胺TFC膜的一个实例是
UA60。
实施例
一般：
术语“Brix”是指白利糖度，即水溶液的糖含量(100g溶液中的糖的克数)。在这方面，本申请的2’-FL溶液的白利糖度是指溶液的总碳水化合物含量，包括2’-FL及其伴随的碳水化合物，因此实际上代表了总溶解固体(TDS)。白利糖度在室温下通过校准的折射计测量。白利糖度测量值通过使用Karl-Fischer滴定法测量溶液中剩余的水份来验证。
HPLC：杂质浓度通过HPLC进行分析，在apHeraNH2聚合物(250mm×4.6mm；5μm)上，用72v/v％乙腈(ACN)以1.1ml/min的流速和25℃，使用带电的气溶胶检测器(CAD)。2’-FL的浓度通过HPLC进行测量，在TSKgel Amide-80(150mm×4.6mm，粒径：3μm)上，用64v/v％乙腈以1.1ml/min的流速和25℃，在37℃使用折光率检测器。
干燥结晶粉末的含水量通过Karl-Fischer滴定法测量。残留的AcOH含量使用Megazyme K-ACETRM 07/12测量。
粉末X射线衍射研究使用Philips PW 1830/PW1050仪器在透射几何中进行，通过石墨单色仪使用CuKα辐射制成单色。基于
的波长，从2θ值计算D间距。作为一般规则，2θ值的误差率为
基于它们的衍射图，根据以下实施例产生的所有结晶2’-FL样品证明是WO 2011/150939中公开的多晶型物II。
发酵和纯化：使用LacZ-、LacY+表型的遗传修饰大肠杆菌菌株通过发酵生成含有2’-FL的发酵液，其中所述菌株包含编码α1,2-岩藻糖基转移酶的重组基因和编码GDP-岩藻糖的生物合成通路的基因，所述α1,2-岩藻糖基转移酶能够将GDP-岩藻糖的岩藻糖转移至内化的乳糖。通过在外源添加的乳糖和合适的碳源的存在下培养菌株来进行发酵，例如根据WO 2015/197082或WO 2016/095924，由此产生2’-FL，伴随有DFL(≈5-14％，相对于2’-FL)和未反应乳糖(≈0.8-10％，相对于2’-FL)作为发酵液中的主要碳水化合物杂质。发酵液处理如下：超滤、纳滤、活性炭脱色和用强酸性(H+)树脂和弱碱性树脂进行离子交换处理。
实施例1
将处理过的含有2’-FL、DFL和乳糖的含水发酵液浓缩至73.0°Bx(238.3g；含有57.4wt％的2’-FL、1.6wt％的乳糖和6.4wt％的DFL)，然后将其添加至1升结晶器。在以150rpm搅拌的同时将糖浆加热至50℃。根据白利糖度，通过装载相对于总固体1wt％的2’-FL多晶型物II晶体来启动预热的透明糖浆的结晶。在以24.1wt％悬浮在乙酸中之后装载晶种。将浆液搅拌5小时，然后冷却至35℃。然后历时12小时将乙酸添加至浆液中以达到乙酸与水的重量分数为4.69。在乙酸进料结束时，将结晶物质冷却至25℃，同时再搅拌5小时。
收集一份浆液样品(75ml)并在1bar下进行压力过滤。收集另一份浆液样品(75ml)，在1bar下进行压力过滤，滤饼用乙酸(28g)洗涤。在65℃和50mbar下将洗涤和未洗涤的固体湿滤饼干燥过夜，分别产生17.3％和23.2％的干燥失重(LoD)。通过HPLC测定母液以及干燥固体中2’-FL和其它杂质的浓度。未洗涤的干燥结晶材料含有95.3％的2’-FL并产生81.5％的结晶2’-FL多晶型物II，而洗涤滤饼的纯度增加至97.0％。
实施例2
遵循实施例1的方案，参数如下(未具体提及的参数与实施例1中相同)：
浓缩糖浆为71.0°Bx(166.8g；含有60.9wt％的2’-FL、0.6wt％的乳糖和4.9wt％的DFL)；
在乙酸添加结束时乙酸与水的重量分数为5.58。
在65℃和50mbar下将未洗涤的固体湿滤饼干燥过夜，产生24.7％的干燥失重(LoD)。未洗涤的干燥结晶材料含有98.1％的2’-FL并产生86.2％的结晶2’-FL多晶型物II。
实施例3
遵循实施例1的方案，参数如下(未具体提及的参数与实施例1中相同)：
浓缩糖浆为74.5°Bx(148.3g；含有57.9wt％的2’-FL、4.4wt％的乳糖和5.4wt％的DFL)；
将糖浆加热至35℃并在35℃接种；
在乙酸添加结束时乙酸与水的重量分数为4.70。
在65℃和50mbar下将洗涤和未洗涤的固体湿滤饼干燥过夜，分别产生16.1％和22.5％的干燥失重(LoD)。未洗涤的干燥结晶材料含有95.7％的2’-FL并产生81.0％的结晶2’-FL多晶型物II，而洗涤滤饼的纯度提高至99.9％。
实施例4
遵循实施例1的方案，参数如下(未具体提及的参数与实施例1中相同)：
浓缩糖浆为69.0°Bx(161.4g；含有54.3wt％的2’-FL、1.4wt％的乳糖和6.0wt％的DFL)；
将糖浆加热至35℃并在35℃接种，同时以300rpm搅拌；
接种后搅拌浆液2h；
添加乙酸，历时15h；
在乙酸添加结束时乙酸与水的重量分数为4.68。
在65℃和50mbar下将未洗涤的固体湿滤饼干燥过夜，产生48.5％的干燥失重(LoD)。未洗涤的干燥结晶材料含有92.8％的2’-FL并产生84.9％的结晶2’-FL多晶型物II。
实施例5(比较试验)
收集分别来自以上实施例1-3和来自现有技术(根据WO 2016/095924实施例2，不同之处在于该程序在35℃下进行而不是室温，并且浓缩的糖浆为62°Bx(140.2g；包含48.8wt％的2’-FL、1.3wt％的乳糖和5.4wt％的DFL))在完成结晶后的结晶浆液的样品(75ml)，并在ΔP＝1bar时使用孔径为约3μm、过滤面积为13cm2的聚丙烯滤布进行压力过滤，测量直至液-气传质开始的时间。根据以下等式通过计算总过滤率来比较浆液的过滤性：滤液体积[cm3]/(时间[秒]·过滤面积[cm2])。
然后继续过滤60秒。在65℃和50mbar下将如此获得的固体湿滤饼干燥过夜(14小时)，并测定干燥损失(见下表中的数据)。
数据表明，根据本发明的新结晶方法产生更容易过滤和干燥的晶体。可通过新方法生产的晶体在干燥后具有量低得多的挥发性残留物，尤其是乙酸。
进一步的变化：在以上公开的结晶条件下，从含有64-68wt％的2’-FL(通常当DFL小于2％，相对于2’-FL)的71-74°Bx的浓缩糖浆可实现基本相同的改善的粉末性质。
Claims (26)
1.一种用于使2’-FL结晶的方法，所述方法包括：
1)在35-60℃的温度下提供包含2’-FL的水溶液或糖浆，
2)在相同温度下，将10-30wt％结晶2’-FL在乙酸中的悬浮液添加至所述包含2’-FL的水溶液或糖浆中，从而产生浆液，使得在添加结晶2’-FL在乙酸中的悬浮液后，所述浆液中乙酸的量为1.5-4wt％，
3)在35-60℃的温度下，将乙酸添加至所述浆液中以得到结晶物质，其中乙酸的添加量计算为在添加乙酸结束时结晶悬浮液中乙酸与水的重量分数为4-6，和
4)从所述结晶物质中过滤结晶2’-FL。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述结晶2’-FL是多晶型物II。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述乙酸为冰乙酸。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中用校准的折射计测量，根据步骤1)的所述水溶液或糖浆的总固体含量为57-80°Bx(白利糖度)，并且根据步骤1)的所述水溶液或糖浆中2’-FL的浓度为40-70wt％。
5.根据权利要求4所述的方法，其中包含2’-FL的水溶液或糖浆还包含DFL和任选的乳糖，优选其中
2’-FL:DFL重量比大于2，更优选大于4，甚至更优选大于6，特别是8-13之间，且/或
2’-FL:乳糖重量比为10-110，并且DFL:乳糖重量比为1-10。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中根据步骤1)的所述水溶液或糖浆的总固体含量为67-77°Bx，并且根据步骤1)的所述水溶液或糖浆中2’-FL的浓度为52-62wt％。
7.根据权利要求6所述的方法，其中根据步骤1)的所述水溶液或糖浆的总固体含量为70-75°Bx，并且根据步骤1)的所述水溶液或糖浆中2’-FL的浓度为56-62wt％。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述水溶液或糖浆在至少45℃、优选在50±2℃提供。
9.根据权利要求6所述的方法，其中根据步骤1)的所述水溶液或糖浆的总固体含量为67-75°Bx，根据步骤1)的所述水溶液或糖浆中2’-FL的浓度为52-62wt％，并且所述水溶液或糖浆在至少45℃、优选在50±2℃提供。
10.根据权利要求4所述的方法，其中包含2’-FL的水溶液或糖浆还包含DFL和任选的乳糖，优选其中
2’-FL:DFL重量比大于13，优选大于25，例如大于50，并且DFL:乳糖重量比小于1。
11.根据权利要求4或10所述的方法，其中根据步骤1)的所述水溶液或糖浆的总固体含量为67-77°Bx，并且根据步骤1)的所述水溶液或糖浆中2’-FL的浓度为62-70wt％，例如64-68wt％。
12.根据权利要求11所述的方法，所述水溶液或糖浆在至少45℃、优选在50±2℃提供。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中相对于步骤1)中提供的所述水溶液或糖浆的总固体含量，在步骤2)中添加的所述结晶2’-FL在乙酸中的悬浮液中所述结晶2’-FL的量为0.5-2wt％。
14.根据权利要求13所述的方法，其中在添加所述悬浮液之后，所述浆液中乙酸的量为2-3wt％。
15.根据权利要求14所述的方法，其中步骤2)中添加的2’-FL/乙酸悬浮液为24±2wt％。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤3)中乙酸的添加在30-40℃的温度下进行，优选所述乙酸在12±2小时中连续添加或分几部分添加。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在添加乙酸结束时结晶悬浮液中乙酸与水的重量分数为4.6-6，优选4.6-5.5。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中将步骤3)中获得的所述结晶物质冷却至0-25℃，优选20-25℃，并搅拌5±1小时。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中步骤1)中提供的所述水溶液或糖浆是纯化的发酵液。
20.结晶2’-FL，其通过根据权利要求1至19中任一项所述的方法获得或可获得。
21.根据权利要求20所述的结晶2’-FL，其具有以下测定值：2’-FL为至少97％，DFL小于2％，并且乙酸小于0.5％。
22.根据权利要求21所述的结晶2’-FL，其中水含量小于0.5％，优选小于0.25％或0.1％。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的结晶2’-FL，其为多晶型物II。
24.一种营养或药物组合物，其包含根据权利要求20至23中任一项所述的结晶2’-FL。
25.根据权利要求20至23中任一项所述的结晶2’-FL在制备食品组合物或食品补充剂中的用途。
26.根据权利要求20至23中任一项所述的结晶2’-FL作为食品组合物或食品补充剂的用途。
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