JP2023519488A - ２’－ｆｌの結晶化 - Google Patents
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Abstract
本発明は、２’－ＦＬと、１つ以上のその他のフコシル化炭水化物と、を含む水溶液から、酢酸を溶液に添加することによって２’－ＦＬを選択的に結晶化するための方法に関する。【選択図】なし
Description
本発明は、酢酸を用いて、水溶液から、特に２’－ＦＬのバイオテクノロジー生産で得られた水溶液から、２’－Ｏ－フコシルラクトース（２’－ＦＬ）を結晶化する方法に関する。
［発明の背景］
結晶化又は再結晶化は、反応混合物から生成物を単離し、これを夾雑物／不純物から分離し、純物質を得るための最も単純且つ安価な方法の１つである。結晶化を用いた単離又は精製は、技術プロセス全体をより堅牢にし、費用効果を高め、従って有利にする。
結晶化又は再結晶化は、反応混合物から生成物を単離し、これを夾雑物／不純物から分離し、純物質を得るための最も単純且つ安価な方法の１つである。結晶化を用いた単離又は精製は、技術プロセス全体をより堅牢にし、費用効果を高め、従って有利にする。
２’－ＦＬは様々な結晶形態で存在し得るが、例えば、国際公開第２０１１／１５０９３９号パンフレット（多形体Ｉ及びＩＩ）、同第２０１４／００９９２１号パンフレット（多形体Ａ、Ｂ、及びＣ）、又は同第２０１４／０６９６２５号パンフレットを参照されたい。この点に関して、２’－ＦＬの結晶化は、特にそれが生産された水性培地からの精製及び単離プロセスにおいて、有利にその生産の一部分となり得る。国際公開第２０１４／０８６３７３号パンフレットは、水性発酵ブロスから誘導されたフリーズドライ粉末からメタノールを用いて２’－ＦＬを結晶化することを開示している。国際公開第２０１５／１８８８３４号パンフレットは、２’－ＦＬと、２’－ＦＬ以外のフコシル化炭水化物、好ましくはＤＦＬと、を含む水溶液から、１つ以上のＣ１～Ｃ４アルコール、好ましくはメタノールを溶液に添加することによって２’－ＦＬ多形体ＩＩを選択的に結晶化するため方法を開示している。国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットは、２’－ＦＬと、１つ以上のその他のフコシル化炭水化物と、を含む水溶液から、酢酸を溶液に添加することによって２’－ＦＬ多形体ＩＩを選択的に結晶化するための代替的方法を開示している。後者の方法は、特に食餌／食品／乳児用調製粉乳用途に好適な結晶性２’－ＦＬを提供する。国際公開第２０１８／１６４９３７号パンフレットは、１重量％以下の有機溶媒を含むその過飽和水溶液から蒸発結晶化することによって結晶性２’－ＦＬを作製するための方法を特許請求している。
結晶化２’－ＦＬに関して、従来技術のプロセスによって提供される良好な収率及び純度を維持するか、又は更にはこれらを上回りつつも、より低量の逆溶媒を消費し、及び／又は改善された性質、例えば安定した結晶モルフォロジー、より良好な濾過性、より低レベルの水分／揮発性物質、より高速な粉末乾燥、並びに／又は乾燥粉末のより良好な物理的及び流動学的性質を有する結晶を生成する、改善された結晶化法に対するニーズが依然として存在する。
［発明の概要］
本発明の第１の態様は、２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩを結晶化するための方法に関し、方法は、
１）２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップを提供することと、
２）酢酸中の結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩの懸濁液を、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップに添加することによってスラリーを生成することと、
３）酢酸を前記スラリーに添加して結晶塊を得ることと、
４）結晶塊から結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩを濾過することと、を含む。
本発明の第１の態様は、２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩを結晶化するための方法に関し、方法は、
１）２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップを提供することと、
２）酢酸中の結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩの懸濁液を、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップに添加することによってスラリーを生成することと、
３）酢酸を前記スラリーに添加して結晶塊を得ることと、
４）結晶塊から結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩを濾過することと、を含む。
本発明の第２の態様は、本発明の第１の態様に従って得られた、又は得ることが可能な結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩに関する。
本発明の第３の態様は、定量的測定の組み合わせによって決定した以下のアッセイを有する、結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩに関する：２’－ＦＬ：少なくとも９７％、ＤＦＬ：２％未満、及び酢酸：０．５％未満。
本発明の第４の態様は、本発明の第２又は第３の態様による結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩを含む、栄養又は医薬組成物に関する。
本発明の第５の態様は、食品組成物又は栄養補助食品の調製における、本発明の第２又は第３の態様による結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩの使用に関する。
本発明の第６の態様は、食品又は栄養補助食品としての、本発明の第２又は第３の態様による結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩの使用に関する。
［発明を実施するための形態］
好ましくは２’－ＦＬの微生物発酵生産、続いて発酵培地の１つ以上の精製工程で得られた水溶液であって、２’－ＦＬの他にジフコシルラクトース（ＤＦＬ）などの１つ以上の他のフコシル化炭水化物型副生成物を含む水溶液から２’－ＦＬ多形体ＩＩを結晶化する場合、水性酢酸からの溶媒／逆溶媒型結晶化法（国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットを参照されたい）が技術的に有利であることが証明されており、これは栄養組成物及び乳児用調製粉乳での使用に好適であり、且つ認可された良好な純度の結晶性２’－ＦＬを提供する。国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットに開示される方法によって得ることが可能な結晶性２’－ＦＬ多形体ＩＩは、典型的には、安全性又は健康上の懸念を示さない１％未満、好ましくは０．５％以下の残留酢酸含量を含有する。しかしながら、結晶化２’－ＦＬ，ｃｃａの高い収率及び良好な純度を達成するために、結晶化において水溶液中の１キログラムの２’－ＦＬあたり５～７リットルの酢酸が用いられてきた。
好ましくは２’－ＦＬの微生物発酵生産、続いて発酵培地の１つ以上の精製工程で得られた水溶液であって、２’－ＦＬの他にジフコシルラクトース（ＤＦＬ）などの１つ以上の他のフコシル化炭水化物型副生成物を含む水溶液から２’－ＦＬ多形体ＩＩを結晶化する場合、水性酢酸からの溶媒／逆溶媒型結晶化法（国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットを参照されたい）が技術的に有利であることが証明されており、これは栄養組成物及び乳児用調製粉乳での使用に好適であり、且つ認可された良好な純度の結晶性２’－ＦＬを提供する。国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットに開示される方法によって得ることが可能な結晶性２’－ＦＬ多形体ＩＩは、典型的には、安全性又は健康上の懸念を示さない１％未満、好ましくは０．５％以下の残留酢酸含量を含有する。しかしながら、結晶化２’－ＦＬ，ｃｃａの高い収率及び良好な純度を達成するために、結晶化において水溶液中の１キログラムの２’－ＦＬあたり５～７リットルの酢酸が用いられてきた。
本発明者らは、原法によって提供される２’－ＦＬの良好な結晶化収率及び純度を維持しながらも結晶化に用いられる酢酸の量を減少させるために努力し、驚くべきことに、こうして生成された結晶が有益な性質及び結晶品質を有することを発見した。
したがって、２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩを結晶化するための方法が提供され、本方法は、
１）２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップを提供することと、
２）酢酸中の結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩの懸濁液を、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップに添加することによってスラリーを生成することと、
３）酢酸をスラリーに添加して結晶塊を得ることと、
４）結晶塊から結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩを濾過することと、を含む。
１）２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップを提供することと、
２）酢酸中の結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩの懸濁液を、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップに添加することによってスラリーを生成することと、
３）酢酸をスラリーに添加して結晶塊を得ることと、
４）結晶塊から結晶性２’－ＦＬ、有利には２’－ＦＬの多形体ＩＩを濾過することと、を含む。
２’－ＦＬ多形体ＩＩとは、国際公開第２０１１／１５０９３９号パンフレットに開示される、ＣｕＫα線を用いた測定に基づいて、１６．９８±０．２０、１３．６５±０．２０、及び１８．３２±０．２０の２Θ角度の、より好ましくは１６．９８±０．２０、１３．６５±０．２０、１８．３２±０．２０、及び２１．７０±０．２０の２Θ角度の、更により好ましくは１６．９８±０．２０、１３．６５±０．２０、１８．３２±０．２０、２１．７０±０．２０、及び１５．２２±０．２０の２Θ角度の、最も好ましくは１６．９８±０．２０、１３．６５±０．２０、１８．３２±０．２０、２１．７０±０．２０、１５．２２±０．２０、及び２０．６３±０．２０の２Θ角度の、特に１６．９８±０．２０、１３．６５±０．２０、１８．３２±０．２０、２１．７０±０．２０、１５．２２±０．２０、２０．６３±０．２０、及び１１．９４±０．２０の２Θ角度のＸ線粉末回折反射を含む２’－ＦＬの結晶変態を指す。
上記の方法は、従来技術で既知の２’－ＦＬ結晶性物質と比較して有益な特徴を備える結晶性２’－ＦＬ、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩを提供する。更に、特許請求される結晶化法は、より低い逆溶媒（酢酸）消費（より経済的なプロセスを意味する）を特徴とし、一方で結晶化収率及び結晶純度（典型的にはＨＰＬＣによって測定される）は低減されない。
本方法の第１の工程は、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップを提供することである。水溶液又はシロップは有機溶媒を含まず、好ましくは均質である。これが水溶液である場合は、２’－ＦＬに関して過飽和溶液である必要はない。２’－ＦＬに関する過飽和溶液とは、所与の温度で溶解可能な最大量を超える２’－ＦＬを含有する溶液である。「所与の温度で溶解可能な最大量の２’－ＦＬ」とは、実際のところ、２’－ＦＬの溶解度であり、これは２’－ＦＬが溶媒に溶解する能力を指す熱化学的性質である。これは、平衡状態で溶媒中、本明細書では水中に溶解した溶質の最大量に関して測定される。得られた溶液は飽和溶液と呼ばれる。水における２’－ＦＬの溶解度は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１８／１６４９３７号パンフレットの実施例１５に開示されるとおりに測定することができる。水溶液又はシロップ中の２’－ＦＬの濃度は、少なくとも４０重量％、好ましくは少なくとも４５重量％、より好ましくは少なくとも５０重量％、更により好ましくは少なくとも５３重量％、例えば５３～６８重量％、５５～６１重量％、５８～６３重量％、又は５７～６１重量％（ＨＰＬＣによって判定して）である。
一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、高温（室温よりも高い）で提供されるか、或いは次の工程を実施する前に高温に加熱される。この高温とは、少なくとも３５℃、好ましくは少なくとも４５℃、例えば４５～５５℃前後、又は５０±２℃である。
上記で開示された２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、以前に２’－ＦＬがどのように生成されたかに応じて、１つ以上のその他の炭水化物又は炭水化物誘導体を含み得る。２’－ＦＬは、より単純な炭水化物前駆体からの化学全合成によって作製することができ、その合成は、適切に保護されたラクトースアクセプターの化学的フコシル化を含み、こうした方法は、例えば国際公開第２０１０／０７０６１６号パンフレット、同第２０１０／１１５９３４号パンフレット、同第２０１０／１１５９３５号パンフレット、同第２０１４／００９９２１号パンフレット、同第２０１５／０３２４１３号パンフレット、同第２０１６／０３８１９２号パンフレット、同第２０１７／１３４１７６号パンフレット、又は同第２０１７／１５３４５２号パンフレットで開示されている。２’－ＦＬ以外の２’－ＦＬを夾雑する炭水化物誘導体は、典型的には、本明細書で開示される２’－ＦＬへと向かう合成経路中の中間誘導体、特に２’－ＦＬへと完全に脱保護する前の最終中間体である。こうした最終中間体は、完全に又は部分的に保護された２’－ＦＬ誘導体であり、ここで保護基は、アシル（主にアセチル又はベンゾイル）、任意選択的に置換されたベンジル、アセタール、若しくはケタール（主にイソプロピリデン又はベンジリデン）、及び／又はシリルであり得る。２’－ＦＬの発酵生産（例えば、Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５，１７７８（２００６）、国際公開第２０１２／０９７９５０号パンフレット、同第２０１２／１１２７７７号パンフレット、同第２０１５／０３２４１２号パンフレット、同第２０１５／１８８８３４号パンフレット、同第２０１６／０９５９２４号パンフレットを参照されたい）においては、典型的な炭水化物副生成物は、２’－ＦＬ及び／又はラクトース及び／又はラクツロース及び／又はフコース及び／又はグルコース及び／又はスクロース及び／又はガラクトース及び／又はＦＬＵ（２’－Ｏ－フコシル－ラクツロース）及び／又はＦＦＬ（Ｆｕｃ（α１～２）Ｆｕｃ（α１～２）Ｇａｌ（β１～４）Ｇｌｃ）以外のフコシル化炭水化物を含み得る。２’－ＦＬ以外のフコシル化炭水化物は、ラクトースのガラクトース部分上のα－１，２－フコシル化（例えば、３－Ｏ－フコシルラクトース、３－ＦＬをもたらすもの）以外の不十分な、不完全な、若しくは弱められたフコシル化の、若しくは培養条件又は発酵後操作下の２’－ＦＬ上のフコース移動の、若しくは多フコシル化、好ましくはジフコシル化ラクトースからのフコース加水分解の結果として発酵中に形成され得る任意の他のモノフコシル化ラクトース、又は培養条件下でラクトースの過フコシル化の結果として形成され得る多フコシル化、好ましくはジフコシル化ラクトースであってよい。ジフコシル化ラクトースは、好ましくは２，２’－ジ－Ｏ－フコシルラクトース又は２’，３－ジ－Ｏ－フコシルラクトース（ＤＦＬ）、特に２’－ＦＬの発酵生産中に形成される特徴的な副生成物としてのＤＦＬである。発酵、又は発酵精製後／単離工程中に形成され得るその他の炭水化物夾雑物は、ＦＬＵ又はラクツロース（再配列による）、フコース、グルコース、ガラクトース、又はラクトース（生成物及び中間体の加水分解の結果として）、グルコース、ラクトース、又はスクロース（未消費の抽出物又は発酵中に添加された成分として）である。
工程１）の水溶液又はシロップの全固形分は、実験の部で開示されるように、屈折計で測定して、少なくとも５７°Ｂｘ（Ｂｒｉｘ度）、例えば５７～８０、６０～８０、６５～８０、７０～８０、６５～７５、又は７０～７５°Ｂｘである。これは、水溶液中に溶解した任意の溶質を指し、つまり、これは２’－ＦＬ以外の物質、及び上記で開示されたその付随する炭水化物誘導体、例えば塩を含む。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７７°Ｂｘの全固形分及び５２～６２重量％の溶解２’－ＦＬを有する。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して７０～７５°Ｂｘの全固形分及び５６～６２重量％の溶解２’－ＦＬを有する。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７１°Ｂｘの全固形分及び５２～５６重量％の溶解２’－ＦＬを有する。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７７°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有する。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して７０～７５°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有する。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７１°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有する。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、付随する炭水化物として、ＤＦＬ、及び任意選択的にラクトースを含む。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＤＦＬを含み、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は２超、好ましくは４超、より好ましくは６超、特に８～１３である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＤＦＬ及びラクトースを含み、２’－ＦＬ：ラクトースの重量比は１０～１１０であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１～１０である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＤＦＬ及びラクトースを含み、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は６超、好ましくは８～１３であり、２’－ＦＬ：ラクトースの重量比は１０～１１０であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１～１０である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＤＦＬ及びラクトースを含み、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は、１３超、より好ましくは２５超、例えば５０超であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１未満である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７５°Ｂｘの全固形分及び５２～６２重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は８～１３である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して７０～７５°Ｂｘの全固形分及び５６～６２重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は６超、好ましくは８～１３であり、２’－ＦＬ：ラクトースの重量比は１０～１１０であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１～１０である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７１°Ｂｘの全固形分及び５２～５６重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は６超、好ましくは８～１３であり、２’－ＦＬ：ラクトースの重量比は２０～５０であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は２～６である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７７°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は、１３超、より好ましくは２５超、例えば５０超であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１未満である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して７０～７５°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は、１３超、より好ましくは２５超、例えば５０超であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１未満である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７１°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は、１３超、より好ましくは２５超、例えば５０超であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１未満である。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７５°Ｂｘの全固形分及び５２～６２重量％の溶解２’－ＦＬを有し、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して７０～７５°Ｂｘの全固形分及び５６～６２重量％の溶解２’－ＦＬを有し、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７１°Ｂｘの全固形分及び５２～５６重量％の溶解２’－ＦＬを有し、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７７°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して７０～７５°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７１°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、付随する炭水化物として、ＤＦＬ、及び任意選択的にラクトースを含み、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＤＦＬを含み、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は２超、好ましくは４超、より好ましくは６超、特に８～１３であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＤＦＬ及びラクトースを含み、２’－ＦＬ：ラクトースの重量比は１０～１１０であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１～１０であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＤＦＬ及びラクトースを含み、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は６超、好ましくは８～１３であり、２’－ＦＬ：ラクトースの重量比は１０～１１０であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１～１０であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７５°Ｂｘの全固形分及び５２～６２重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は８～１３であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して７０～７５°Ｂｘの全固形分及び５６～６２重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は６超、好ましくは８～１３であり、２’－ＦＬ：ラクトースの重量比は１０～１１０であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１～１０であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７１°Ｂｘの全固形分及び５２～５６重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は６超、好ましくは８～１３であり、２’－ＦＬ：ラクトースの重量比は２０～５０であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は２～６であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７７°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は、１３超、より好ましくは２５超、例えば５０超であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１未満であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して７０～７５°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は、１３超、より好ましくは２５超、例えば５０超であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１未満であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
工程１）の一実施形態では、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、ＨＰＬＣによって推定して６７～７１°Ｂｘの全固形分及び６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％の溶解２’－ＦＬを有し、２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比は、１３超、より好ましくは２５超、例えば５０超であり、ＤＦＬ：ラクトースの重量比は１未満であり、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される。
第２の工程では、結晶化を開始するために、酢酸中に懸濁した結晶性２’－ＦＬ、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩを、高温、好ましくは工程１）の温度と同じ温度で、好ましくは連続的に攪拌しながら工程１）の２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップに添加することによってスラリーを生成する。酢酸中の結晶性２’－ＦＬ、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩの懸濁液を添加した後の、スラリー中の酢酸の量は、１重量％超、好ましくは１．５重量％超、より好ましくは２重量％超、例えば２～４重量％又は２～３重量％であるべきである。工程１）で提供された２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップに添加される、酢酸中の結晶性２’－ＦＬ、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩの懸濁液は、１０～３０重量％前後である（つまり、１００ｇの懸濁液は、１０～３０ｇの結晶性２’－ＦＬ、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩを含有する）。更に、播種結晶（ｓｅｅｄｉｎｇ ｃｒｙｓｔａｌ）の量は、スラリーを生成するのに好適である。好ましくは、播種結晶の量は、工程１）で提供される水溶液又はシロップの全固形分に対して少なくとも０．５重量％、例えば０．５～２重量％、好ましくは０．９～１．２重量％である。上記の懸濁液を作製するのに好適な酢酸は、氷酢酸である。
典型的には、２’－ＦＬ／酢酸懸濁液は、一度に、好ましくは攪拌しながら、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップに添加される。播種後、混合物を同じ温度で数時間、例えば１～８又は３～７時間、好ましくは４～６時間、例えば５時間前後攪拌して、スラリーを生成する。
上記の結晶化開始工程の間、真空又は減圧は適用されない。
２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップを播種するための２’－ＦＬ／酢酸懸濁液の使用は、例えば、国際公開第２０１８／１６４９３７号パンフレットに開示される蒸発結晶化、又は播種結晶の単純な添加とは異なる核生成機構を示し、よって得ることが可能な結晶性物質のモルフォロジーに影響を与えるため、有利である。
工程２）の一実施形態では、播種２’－ＦＬの量は、工程１）で提供される水溶液又はシロップの固形分の０．５～２重量％であり、２’－ＦＬ／酢酸懸濁液は１０～３０重量％であり、懸濁液を添加した後のスラリー中の酢酸の量は２～３重量％である。
工程２）の一実施形態では、播種２’－ＦＬの量は、工程１）で提供される水溶液又はシロップの固形分の０．９～１．２重量％であり、２’－ＦＬ／酢酸懸濁液は１０～３０重量％であり、懸濁液を添加した後のスラリー中の酢酸の量は２～３重量％である。
工程２）の一実施形態では、播種２’－ＦＬの量は、工程１）で提供される水溶液又はシロップの固形分の０．５～２重量％であり、２’－ＦＬ／酢酸懸濁液は２４±２重量％であり、懸濁液を添加した後のスラリー中の酢酸の量は２～３重量％である。
工程２）の一実施形態では、播種２’－ＦＬの量は、工程１）で提供される水溶液又はシロップの固形分の０．９～１．２重量％であり、２’－ＦＬ／酢酸懸濁液は２４±２重量％であり、懸濁液を添加した後のスラリー中の酢酸の量は２～３重量％である。
工程２）の一実施形態では、２’－ＦＬ／酢酸懸濁液を添加しながらの攪拌、及び／又は２’－ＦＬ／酢酸懸濁液を添加した後のスラリーの攪拌は、１５０～３００ｒｐｍで行われる。
工程２）の一実施形態では、２’－ＦＬ／酢酸懸濁液を添加した後で、スラリーを、以前に播種が実施されたものと同じ温度で少なくとも２～５時間攪拌する。
工程２）に続く工程３）では、上記で得られたスラリーに、連続的に攪拌しながら純酢酸を添加する。一実施形態では、純酢酸がスラリーに添加されるときの温度は、先行する工程におけるものと同じである。その他の実施形態では、温度は工程２）におけるものよりも低い。好ましい実現では、最初に、純酢酸を添加する前に、スラリーを、典型的には５～６０分間前後冷却するか、又は自然冷却させて所望の温度にし、純酢酸を添加する期間全体でその温度を維持する。この温度は、好ましくは、３０～４０℃前後、例えば３５±２℃前後である。工程３）で添加される酢酸の量が計算され、その結果、工程３）における酢酸の添加終了時の結晶性懸濁液中の水に対する酢酸の重量分率は、４～６、好ましくは４．６～６又は４．６～５．５である。水に対する酢酸の重量分率においては、酢酸の量は、工程３）で添加された酢酸、及び工程２）で播種に用いられた２’－ＦＬ／酢酸懸濁液を構成する酢酸を含むものとする。工程３）の終了時の懸濁液の水の含有量は、実質的に、工程１）で提供された２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップ中の水の量であり、以下のように計算することができる：水重量％＝１００－［工程１で提供された２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップの］Ｂｒｉｘ。
純酢酸は、工程３）で、所与の添加速度で連続的に、又は好ましくは等量で数回にわたって添加され得る。酢酸の計算された量は、数時間であるが、３時間以上、例えば５、７、又は９時間以上、好ましくは１０時間以上、より好ましくは１２±２時間かけて、比較的ゆっくりと添加する。酢酸添加の終了時に、スラリーは結晶塊になる。
上記の酢酸添加工程の間、真空又は減圧は適用されない。
任意選択的に、上記の工程３）に従って純酢酸を添加して２’－ＦＬの結晶塊を得た後で、必要に応じて、数時間かけて温度を０℃～室温、好ましくは２０～２５℃前後の最終温度まで下げる。この最終温度で、２’－ＦＬの結晶塊を、数時間、例えば少なくとも２又は３時間、例えば５±１時間攪拌する。上記の２’－ＦＬの結晶塊を平衡化する工程の間、真空又は減圧は適用されない。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を少なくとも３時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４～６に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を少なくとも１０時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４～６に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を１２±２時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４～６に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を少なくとも３時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４．６～５．５に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を少なくとも１０時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４．６～５．５に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を１２±２時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４．６～５．５に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を３５±２℃で少なくとも３時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４～６に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を３５±２℃で少なくとも１０時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４～６に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を３５±２℃で１２±２時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４～６に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を３５±２℃で少なくとも３時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４．６～５．５に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を３５±２℃で少なくとも１０時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４．６～５．５に到達させる。
工程３）の一実施形態では、工程２）で得られたスラリーに酢酸を３５±２℃で１２±２時間添加して、結晶塊中の水に対する酢酸の重量分率を４．６～５．５に到達させる。
工程３）では、上記で開示された特定の実施形態のいずれにおいても、任意選択的に、続いて、
－ 得られた結晶塊を０～２５℃、好ましくは２０～２５℃に冷却するか、
－ 得られた結晶塊を少なくとも２～３時間、好ましくは５±１時間攪拌するか、又は
－ 得られた結晶塊を０～２５℃、好ましくは２０～２５℃に冷却し、続いて少なくとも２～３時間、好ましくは５±１時間攪拌する。
－ 得られた結晶塊を０～２５℃、好ましくは２０～２５℃に冷却するか、
－ 得られた結晶塊を少なくとも２～３時間、好ましくは５±１時間攪拌するか、又は
－ 得られた結晶塊を０～２５℃、好ましくは２０～２５℃に冷却し、続いて少なくとも２～３時間、好ましくは５±１時間攪拌する。
上記の工程３）で得られた２’－ＦＬの結晶塊又は任意選択的に平衡化された結晶塊を、続いて工程４）で濾過する。結晶性２’－ＦＬは、０℃～室温、好ましくは２０～２５℃前後の温度で、従来の方法、例えば全量濾過、遠心分離、又はデカンテーションで母液から分離する。いくつかの実施形態では、分離した２’－ＦＬ結晶、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩのものを、氷酢酸で洗浄する。任意選択的に洗浄された結晶を、続いて従来の方法で乾燥させる。
本発明の方法で得られた、又は得ることが可能な結晶性２’－ＦＬ、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩは、少なくとも９２％、好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９８％の純度（ＨＰＬＣによって判定して）、及び／又は２’－ＦＬと比較して３重量％未満、好ましくは２重量％未満のＤＦＬ含有量、及び／又は１％未満、好ましくは０．５％未満の酢酸含有量、及び／又は０．５％未満、好ましくは０．２５％又は０．１％未満の水含有量を有する。本発明の方法で得られた、又は得ることが可能な結晶性２’－ＦＬ、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩは、定量的測定の組み合わせによって決定した以下のアッセイを有する：２’－ＦＬ：少なくとも９７％、ＤＦＬ：２％未満、及び酢酸：０．５％未満；又は２’－ＦＬ：少なくとも９７％、ＤＦＬ：２％未満、酢酸：０．５％未満、及び水：０．１％未満。
上記の方法は、実施例で更に詳細に開示される比較試験によって実証されたように、国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットによって得ることが可能な結晶性２’－ＦＬが有さない下記の有益な特徴のうち少なくとも１つを備える結晶性２’－ＦＬ、好ましくは２’－ＦＬ多形体ＩＩを提供する：
－ （粒度分布から評価して）より大きな結晶サイズによるより少ない塵粉、及び機械的剪断応力に対する安定した結晶モルフォロジー、
－ より短い濾過期間をもたらすより良好な濾過性、
－ より少ない揮発分（乾燥減量（ＬｏＤ）により測定して）、つまり、より短い乾燥期間（好ましくは、ＬｏＤ値が少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％減少する）、
－ 乾燥後のより少ない残留溶媒（すなわち、ＡｃＯＨ及び水の両方）含有量、
－カー指数及びハウスナー比によって見てより良好な流動性、
－ 向上した嵩密度及びタップ密度、並びに／又は
－ より高い結晶化収率。
－ （粒度分布から評価して）より大きな結晶サイズによるより少ない塵粉、及び機械的剪断応力に対する安定した結晶モルフォロジー、
－ より短い濾過期間をもたらすより良好な濾過性、
－ より少ない揮発分（乾燥減量（ＬｏＤ）により測定して）、つまり、より短い乾燥期間（好ましくは、ＬｏＤ値が少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも４０％、更により好ましくは少なくとも５０％減少する）、
－ 乾燥後のより少ない残留溶媒（すなわち、ＡｃＯＨ及び水の両方）含有量、
－カー指数及びハウスナー比によって見てより良好な流動性、
－ 向上した嵩密度及びタップ密度、並びに／又は
－ より高い結晶化収率。
更に、上記の方法は、２０１６／０９５９２４による従来技術の方法と比較して著しく少ない（少なくとも２５％少ない、好ましくは少なくとも３５％少ない、例えば４０、４５、又は５０％少ない）ＡｃＯＨを消費する。
大幅に向上した粉末特性を有すると、下流操作、例えば乾燥混合などの直接配合プロセスが著しく容易になり得る。
更に、特許請求される上記の結晶化法は、それから２’－ＦＬが結晶化される２’－ＦＬを含む過飽和水溶液又はシロップの提供が本質的に必要でなく、且つ／或いは、得られた結晶が濾過性の点でより良好な性質を示すため、例えば国際公開第２０１８／１６４９３７号パンフレットに開示される水からの蒸発結晶化よりも有利である。
本発明の結晶化法は、好ましくは発酵ブロスから得られた２’－ＦＬ、及び２’－ＦＬ以外の少なくとも１つのフコシル化炭水化物、特にＤＦＬ、並びに任意選択的にその他の炭水化物様夾雑物を含有する水溶液から、上記で開示されるとおりに水溶液を酢酸で処理することによって２’－ＦＬを選択的に結晶化するのに極めて好適である。この選択的結晶化は、１工程で高純度の２’－ＦＬを提供し、典型的に、少なくとも１００ｇの２’－ＦＬ、例えば少なくとも１ｋｇ、若しくは少なくとも１００ｋｇ、又は更には少なくとも１トンの２’－ＦＬのバッチの結晶化は、こうした水溶液中で夾雑糖様の化合物の濃度が広範であるにも関わらず達成され得る。この点において、２’－ＦＬは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、例えば少なくとも８５％の収率で結晶化され得る。
本発明による、それから２’－ＦＬが結晶化される、２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップは、好ましくは、その発酵が遺伝子操作細胞を培養することによって２’－ＦＬを提供する、処理／精製済み発酵ブロスである。発酵は、好ましくは以下のとおり実施される。
アクセプターとして外因的に添加されたラクトースは、遺伝子操作細胞によって培地から内在化され、ここで、ラクトースは酵素フコシル化を含む反応中で２’－ＦＬに変換される。一実施形態では、この内在化は、ラクトースが細胞の原形質膜にわたって受動的に拡散する受動的輸送機構により起こり得る。この流れは、ラクトースに関する細胞外空間及び細胞内空間での濃度差により導かれ、濃度がより高い場所から、濃度がより低いゾーンに移動して平衡となる傾向があると考えられる。別の実施形態では、ラクトースは、これが細胞の輸送タンパク質又はパーミアーゼの影響下で細胞の原形質膜にわたって拡散する能動的輸送機構により細胞中に内在化し得る。ラクトースパーミアーゼ（ＬａｃＹ）は、ラクトースに向かう特異性を有する。したがって、ラクトースは、能動的輸送により、ＬａｃＹパーミアーゼを発現する細胞（こうした細胞は本明細書でＬａｃＹ＋表現型細胞とも称される）に容易に取り込まれ、細胞中に蓄積された後でフコシル化され得る（例えば、国際公開第０１／０４３４１号パンフレット、Ｆｏｒｔ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．２５５８（２００５），Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５，１７７８（２００６）、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット、同第２０１５／０３６１３８号パンフレットを参照されたい）。好ましくは、ラクトースパーミアーゼをコードするｌａｃＹ遺伝子を発現する細胞は、内在化したラクトースを分解できる酵素を有さない。好ましくは、この細胞は、内在性ｌａｃＺ遺伝子の不活性化又は欠失に起因してβ１，４－ガラクトシダーゼ活性を欠いている（こうした細胞は本明細書ではＬａｃＺ－表現型細胞とも称される）か、又は少なくともβ１，４－ガラクトシダーゼの活性が低下している（例えば、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレットによる、ガラクトシダーゼ活性が低いＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）を参照されたい）。
好ましい一実施形態では、ラクトースの内在化は、細胞のラクトースパーミアーゼ、より好ましくはＬａｃＹにより媒介される能動的輸送機構により起こる。
細胞中に内在化すると、ラクトースは、既知の技術、例えば細胞の染色体に組み込むことによるか又は発現ベクターを使用することにより、細胞中に導入されている対応する異種遺伝子又は核酸配列により発現されるフコシルトランスフェラーゼによりフコシル化される。２’－ＦＬを作製するのに必要なフコシルトランスフェラーゼは、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼである。フコシル化のためのフコース残基を提供する対応するドナーであるＧＤＰ－Ｆｕｃは、グリセロール、フルクトース又はグルコースなどの単純炭素源から出発する段階的反応順序において、ＧＤＰ－Ｆｕｃのデノボ生合成経路に関与する酵素（ＭａｎＢ、ＭａｎＣ、Ｇｍｄ、及びＷｃａＧ）の作用下で細胞により作製され得る。代わりに、遺伝子操作細胞は、キナーゼによりリン酸化され、続いてピロホスホリラーゼによりＧＤＰ－Ｆｕｃに変換された再利用フコースを利用することができる（例えば、国際公開第２０１０／０７０１０４号パンフレットを参照されたい）。
２’－ＦＬは、例えば、Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５，１７７８（２００６）、国際公開第０１／０４３４１号パンフレット、同第２０１０／０７０１０４号パンフレット、同第２０１０／１４２３０５号パンフレット、同第２０１２／１１２７７７号パンフレット、同第２０１５／０３２４１２号パンフレット、同第２０１５／０３６１３８号パンフレット、同第２０１５／１９７０８２号パンフレット、同第２０１７／１０１９５８号パンフレット、同第２０１７／１８８６８４号パンフレット、米国特許出願公開第２０１７／０１５２５３８号明細書、国際公開第２０１８／０７７８９２号パンフレット、同第２０１８／１９４４１１号パンフレット、又は同第２０１９／００８１３３号パンフレットに従って遺伝子操作された微生物により生成され得る。
好ましい実施形態では、遺伝子操作微生物は、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）である。
したがって、好ましい実施形態では、生成プロセスは、以下の工程を含む：
ａ）ＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子操作Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を提供する工程であって、上記の細胞は、
α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ＧＤＰ－Ｆｕｃへの生合成経路をコードする１つ以上の遺伝子を含む、工程、並びに
ｂ）外因性ラクトース及び好適な炭素源の存在下で、ＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子操作Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を培養し、それにより２’－ＦＬを含む発酵ブロスを生成する工程。
ａ）ＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子操作Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を提供する工程であって、上記の細胞は、
α－１，２－フコシルトランスフェラーゼ、及び
ＧＤＰ－Ｆｕｃへの生合成経路をコードする１つ以上の遺伝子を含む、工程、並びに
ｂ）外因性ラクトース及び好適な炭素源の存在下で、ＬａｃＹ＋表現型又はＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子操作Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を培養し、それにより２’－ＦＬを含む発酵ブロスを生成する工程。
Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株は、好ましくは、ただ１つの種類の組換えグリコシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を有し、このグリコシルトランスフェラーゼは、α－１，２－フコシルトランスフェラーゼであり、より好ましくは、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ ｐｙｌｏｒｉ）由来のｆｕｔＣ遺伝子によってコードされたα－１，２－フコシルトランスフェラーゼである。
こうした生成された発酵ブロスは、生成細胞及び培地の両方に２’－ＦＬを含む。細胞内２’－ＦＬを回収し、それにより生成物の力価を上昇させるために、上記で説明される方法は、例えば加熱により細胞を破壊又は透過化させる任意選択的な工程ｃ）を更に含み得る。
中性ＨＭＯを含む発酵ブロスは、他の炭水化物化合物を伴い得る。典型的には、別の炭水化物化合物は、発酵プロセスにおいてアクセプターとして使用され、変換されないままのラクトースである。その量は、例えば、国際公開第２０１２／１１２７７７号パンフレット又は同第２０１５／０３６１３８号パンフレットに開示されているように、下記で開示する分離／精製工程に発酵ブロスを供する前に、発酵ブロス中で実質的に低減させることができるが、そうすることは必須ではない。精製方法は、一実施形態では、炭水化物化合物を伴う２’－ＦＬを非炭水化物夾雑物から分離するのに好適であるが、炭水化物化合物の相対的比率は、特許請求される方法の過程で実質的に変化することはない。しかしながら、特許請求される方法の別の実施形態は、炭水化物夾雑物及び非炭水化物夾雑物から分離することにより中性ＨＭＯを精製し、それにより実質的に純粋な形態の２’－ＦＬを得るのに適している。
したがって、２’－ＦＬの発酵生産中に付随する炭水化物は、主に、２’－ＦＬと似た生物学的特性を有する過フコシル化２’－ＦＬとしてのラクトース及びＤＦＬ（Ｆｕｃα１－２Ｇａｌβ１－４［Ｆｕｃα１－３］Ｇｌｃ）である。更に、発酵ブロス中には、非ＨＭＯ炭水化物夾雑物が更に存在している可能性がある。これらは、典型的には、ラクツロース及びそのグリコシル化誘導体である。ラクツロースは、ラクトースを発酵へ添加する前及び／又は発酵中に加熱滅菌されるときに、転移によりラクトースから形成され得る。ラクツロースも細胞に内在化することから、同時に起こる生体内変換反応でラクトースと同様にグリコシル化され得る。しかしながら、ラクツロース及びそのグリコシル化誘導体の量は、バイオマス分離後のブロスの全乾燥固形物の数十重量％を超えない。
発酵ブロスから、非炭水化物粒子及び物質を除去／分離する。このプロセスは、２’－ＦＬ及びその他の炭水化物を含有する発酵ブロスから鉱物、塩、及びその他の荷電分子が抽出される従来式の脱塩工程を含み得る。脱塩は、例えば、Ｈ＋形態のカチオン交換樹脂及び遊離塩基形態のアニオン交換樹脂に発酵ブロスを通す、従来式のイオン交換樹脂を用いて実施され得る。カチオン交換樹脂は、好ましくは強い交換体であり、アニオン交換樹脂は、弱い交換体であっても、又は強い交換体であってもよい。イオン交換樹脂は、ブロスから塩及び荷電分子を除去することに加えて、事前の精製工程後に任意選択的にブロス中に残されたタンパク質、ＤＮＡ、及び着色／カラメル体を物理的に吸着することができる。或いは、脱塩は、適切な粒径カットオフを用いた従来の電気透析又は従来の膜濾過／ダイアフィルトレーションシステムによって実施されてもよい。上記の方法のいずれかで得た溶液を、続いて、従来の蒸発工程又は従来のナノ濾過工程のいずれかによって濃縮してよい。
更に、炭水化物から非炭水化物粒子及び物質を除去／分離する上記のプロセスは、事前の精製工程から残された発色体及び任意選択的に水溶性生体分子（例えば、核酸、ペプチド、タンパク質、アミノ酸、エキソ多糖類、及び脂質）を除去するための従来の炭処理も含むことができる。炭は、水性媒体中の炭水化物化合物に対して、一部の水溶性親油性夾雑物（例えば親油性部分、脂質、及び着色芳香体を含有するタンパク質及びアミノ酸）よりも弱い親和性を有する。したがって、炭上に親油性夾雑物を含まない炭水化物は、（蒸留）水で容易に炭から洗い流すことができる。更に、上記のプロセスは、発酵後、好ましくは上記の炭処理の前に、細胞、細胞断片、及びタンパク質を除去するための従来式の浄化工程も含むことができる。浄化工程は、従来の方法で、例えば、浄化又は部分浄化された上澄液を生成する遠心分離における沈殿によって行うことができる。或いは、発酵ブロスを従来の方法で限外濾過に供して、高分子量成分を除去してもよい。２’－ＦＬ発酵ブロスを限外濾過するために用いられる半透膜は、好適には、５～５０ｋＤａ、好ましくは１０～２５ｋＤａ、より好ましくは１５ｋＤａ前後のカットオフを有することができる。浄化されるべき発酵ブロスの特性に応じて、上記で与えられた範囲内での高カットオフ膜及び低カットオフ膜（この順序で）の組み合わせを用いてもよい。任意選択的に、遠心分離又は限外濾過の後にナノ濾過が続いてもよく、この間、２’－ＦＬ及び付随する炭水化物を含有する水溶液が炭で処理される前に従来の方法で濃縮される。このナノ濾過工程では、その膜は、４８８の分子量を有する２’－ＦＬの保持を確実にする孔径を有してもよく、そのため典型的には２００～３００Ｄａのカットオフ膜を用いてよい。或いは、ＵＦ透過液がより多量のラクトースを含有する場合は、ナノ濾過に好適な膜は６００～３５００ＤａのＭＷＣＯを有して２’－ＦＬの保持を確実にして且つラクトースの少なくとも一部を膜に透過させ、膜の活性（上部）層はポリアミドからなり、ここで上記の膜上のＭｇＳＯ４阻止率は約２０～９０％、好ましくは５０～９０％である。ラクトースの阻止が比較的高い（約９０％）場合、ラクトースの全て又は少なくとも大部分を透過液中に移動させるために、続いて純水によるダイアフィルトレーションが必要な場合がある。ラクトースの阻止が高いほど、効率的な分離のために、より多くの透析濾過水が必要である。このナノ濾過膜は、効率的に保持されるように、２’－ＦＬに対して密接であるべきである。好ましくは、２’－ＦＬの阻止は、９５％超、より好ましくは９７％、更により好ましくは９９％である。３５００Ｄａ超のＭＷＣＯを有する膜は、より多くの又は有意な量の２’－ＦＬが膜を通過することを可能にし、ひいては２’－ＦＬの保持の低減を示すことが予期されるため、好適ではない。ラクトースの阻止は８０～９０％以下であることが好ましい。ラクトースの阻止が９０±１～２％となる場合、実質的に十分な分離を達成するために、２’－ＦＬの阻止は、好ましくは、約９９％以上となるであろう。これらの要件は、膜がＭｇＳＯ４に対して比較的緩い、すなわち、その阻止が約５０～９０％である場合に同時に満たされる。これに関して、上記の膜は、２’－ＦＬに対して密接であり、単糖及びラクトース並びにＭｇＳＯ４に対して緩い。したがって、発酵による２’－ＦＬの作製における前駆体であるラクトースは、ナノ濾過によって良好な効力で２’－ＦＬから分離することが可能であり、更に、二価イオンの相当部分も透過液を通過する。同様に好ましくは、この膜は、ＮａＣｌの阻止率がＭｇＳＯ４の場合と比べて低い。約２０～３０％のＮａＣｌ阻止において、保持液中の全ての一価塩の相当な減少も達成可能である。上記のナノ濾過膜の活性層又は上部層は、好ましくはポリアミドから作製され、より好ましくは、ポリアミド膜は、アミンとしてフェニレンジアミン又はピペラジン構成要素、更により好ましくはピペラジンを有するポリアミドである（ピペラジン系ポリアミドとも称される）。好適なピペラジン系ポリアミドＴＦＣ膜の一例は、ＴｒｉＳｅｐ（登録商標）ＵＡ６０である。
［実施例］
［全般］
「Ｂｒｉｘ」という用語は、Ｂｒｉｘ度、すなわち水溶液の糖含量（溶液１００ｇ中の糖のｇ）を指す。この点に関して、本願の２’－ＦＬ溶液のＢｒｉｘは、２’－ＦＬ及びその付随する炭水化物を含む溶液の総炭水化物含有量を指し、従って、実質的に全溶解固形物（ＴＤＳ）を表す。Ｂｒｉｘは、較正された屈折計によって室温で測定した。Ｂｒｉｘ測定値は、カールフィッシャー滴定を用いて溶液の残留する水画分を測定することにより検証した。
［全般］
「Ｂｒｉｘ」という用語は、Ｂｒｉｘ度、すなわち水溶液の糖含量（溶液１００ｇ中の糖のｇ）を指す。この点に関して、本願の２’－ＦＬ溶液のＢｒｉｘは、２’－ＦＬ及びその付随する炭水化物を含む溶液の総炭水化物含有量を指し、従って、実質的に全溶解固形物（ＴＤＳ）を表す。Ｂｒｉｘは、較正された屈折計によって室温で測定した。Ｂｒｉｘ測定値は、カールフィッシャー滴定を用いて溶液の残留する水画分を測定することにより検証した。
ＨＰＬＣ：不純物の濃度を、帯電エアロゾル検出器（ＣＡＤ）を使用して、１．１ｍＬ／分の流速及び２５℃で、７２ｖ／ｖ％のアセトニトリル（ＡＣＮ）を用いるａｐＨｅｒａ ＮＨ２ポリマー（２５０ｍｍ×４．６ｍｍ；５μｍ）によるＨＰＬＣで分析した。２’－ＦＬの濃度を、３７℃で屈折率検出器を使用して、１．１ｍＬ／分の流速及び２５℃で６４ｖ／ｖ％のアセトニトリルを用いたＴＳＫｇｅｌ Ａｍｉｄｅ－８０（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、粒径：３μｍ）上のＨＰＬＣによって測定した。
乾燥結晶粉末の水含有量をカールフィッシャー滴定によって測定した。残留ＡｃＯＨ含有量を、Ｍｅｇａｚｙｍｅ Ｋ－ＡＣＥＴＲＭ ０７／１２を用いて測定した。
グラファイトモノクロメータによって単色化したＣｕＫα線を使用し、透過幾何学形状内でＰｈｉｌｉｐｓ ＰＷ １８３０／ＰＷ１０５０計器を用いて粉末Ｘ線回折調査を実施した。Ｄ間隔は、１．５４１８６Åの波長に基づいて２Θ値から計算した。原則として、２Θ値は±０．２Åの誤差率を有する。これらのディフラクトグラムに基づき、下記の実施例に従って生成した全ての結晶性２’－ＦＬ試料は、国際公開第２０１１／１５０９３９号パンフレットに開示される多形体ＩＩであることが証明された。
発酵及び精製：２’－ＦＬ含有ブロスを、ＬａｃＺ－、ＬａｃＹ＋表現型の遺伝子操作Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）株を使用する発酵により生成し、上記の株は、ＧＤＰ－フコースのフコースを内在化ラクトースに転移させ得るα１，２－フコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする組換え遺伝子と、ＧＤＰ－フコースへの生合成経路をコードする遺伝子と、を含む。この発酵を、例えば、国際公開第２０１５／１９７０８２号パンフレット又は同第２０１６／０９５９２４号パンフレットに従い、外因的に添加したラクトース及び好適な炭素源の存在下で株を培養することにより実施し、それにより発酵ブロス中の主要な炭水化物不純物としてＤＦＬ（２’－ＦＬに対し≒５～１４％）及び未反応ラクトース（２’－ＦＬに対し≒０．８～１０％）を伴う２’－ＦＬを生成した。ブロスは以下のように処理した：限外濾過、ナノ濾過、活性炭脱色、並びに強酸性（Ｈ＋）樹脂及び弱塩基性樹脂を用いたイオン交換処理。
［実施例１］
２’－ＦＬ、ＤＦＬ、及びラクトースを含有する処理済み水性発酵ブロスを７３．０°Ｂｘに濃縮し（２３８．３ｇ；５７．４重量％の２’－ＦＬ、１．６重量％のラクトース、及び６．４重量％のＤＦＬを含有する）、続いて１Ｌの晶析装置に添加した。シロップを１５０ｒｐｍで攪拌しながら５０℃に加熱した。予熱された透明なシロップの結晶化を、Ｂｒｉｘに従って全固形分に対して１重量％の２’－ＦＬ多形体ＩＩ結晶を投入することによって開始した。種結晶を、２４．１重量％で酢酸中に懸濁させた後に投入した。スラリーを５時間攪拌し、続いて３５℃に冷却した。続いて酢酸を１２時間にわたってスラリーに添加し、水に対する酢酸の重量分率を４．６９にした。酢酸供給の終了時に、結晶塊を更に５時間攪拌しながら２５℃に冷却した。
２’－ＦＬ、ＤＦＬ、及びラクトースを含有する処理済み水性発酵ブロスを７３．０°Ｂｘに濃縮し（２３８．３ｇ；５７．４重量％の２’－ＦＬ、１．６重量％のラクトース、及び６．４重量％のＤＦＬを含有する）、続いて１Ｌの晶析装置に添加した。シロップを１５０ｒｐｍで攪拌しながら５０℃に加熱した。予熱された透明なシロップの結晶化を、Ｂｒｉｘに従って全固形分に対して１重量％の２’－ＦＬ多形体ＩＩ結晶を投入することによって開始した。種結晶を、２４．１重量％で酢酸中に懸濁させた後に投入した。スラリーを５時間攪拌し、続いて３５℃に冷却した。続いて酢酸を１２時間にわたってスラリーに添加し、水に対する酢酸の重量分率を４．６９にした。酢酸供給の終了時に、結晶塊を更に５時間攪拌しながら２５℃に冷却した。
スラリーの試料（７５ｍＬ）を回収し、１ｂａｒで加圧濾過した。スラリーの別の試料（７５ｍＬ）を回収し、１バールで加圧濾過し、濾過ケークを酢酸（２８ｇ）で洗浄した。洗浄した固形湿潤濾過ケーク及び未洗浄の固形湿潤濾過ケークを６５℃及び５０ｍｂａｒで終夜乾燥させ、それぞれ１７．３％及び２３．２％の乾燥減量（ＬｏＤ）を生じさせた。母液中の２’－ＦＬ及びその他の不純物の濃度、並びに乾燥固体をＨＰＬＣによってアッセイした。未洗浄の乾燥結晶性物質は、９５．３％の２’－ＦＬを含有して８１．５％の結晶性２’－ＦＬ多形体ＩＩを産生し、一方で洗浄した濾過ケークの純度は９７．０％に増加した。
［実施例２］
以下のパラメータを用いて実施例１のプロトコルに従った（特に言及されていないパラメータは実施例１と同じである）：
濃縮シロップは７１．０°Ｂｘであり（１６６．８ｇ；６０．９重量％の２’－ＦＬ、０．６重量％のラクトース、及び４．９重量％のＤＦＬを含有する）：
酢酸添加終了時の水に対する酢酸の重量分率は５．５８であった。
以下のパラメータを用いて実施例１のプロトコルに従った（特に言及されていないパラメータは実施例１と同じである）：
濃縮シロップは７１．０°Ｂｘであり（１６６．８ｇ；６０．９重量％の２’－ＦＬ、０．６重量％のラクトース、及び４．９重量％のＤＦＬを含有する）：
酢酸添加終了時の水に対する酢酸の重量分率は５．５８であった。
未洗浄の固形湿潤濾過ケークを６５℃及び５０ｍｂａｒで終夜乾燥させて、２４．７％の乾燥減量（ＬｏＤ）を生じさせた。未洗浄の乾燥結晶性物質は、９８．１％の２’－ＦＬを含有して８６．２％の結晶性２’－ＦＬ多形体ＩＩを産生した。
［実施例３］
以下のパラメータを用いて実施例１のプロトコルに従った（特に言及されていないパラメータは実施例１と同じである）：
濃縮シロップは７４．５°Ｂｘであった（１４８．３ｇ；５７．９重量％の２’－ＦＬ、４．４重量％のラクトース、及び５．４重量％のＤＦＬを含有する）。
シロップを３５℃に加熱してその温度で播種した。
酢酸添加終了時の水に対する酢酸の重量分率は４．７０であった。
以下のパラメータを用いて実施例１のプロトコルに従った（特に言及されていないパラメータは実施例１と同じである）：
濃縮シロップは７４．５°Ｂｘであった（１４８．３ｇ；５７．９重量％の２’－ＦＬ、４．４重量％のラクトース、及び５．４重量％のＤＦＬを含有する）。
シロップを３５℃に加熱してその温度で播種した。
酢酸添加終了時の水に対する酢酸の重量分率は４．７０であった。
洗浄した固形湿潤濾過ケーク及び未洗浄の固形湿潤濾過ケークを６５℃及び５０ｍｂａｒで終夜乾燥させ、それぞれ１６．１％及び２２．５％の乾燥減量（ＬｏＤ）を生じさせた。未洗浄の乾燥結晶性物質は、９５．７％の２’－ＦＬを含有して８１．０％の結晶性２’－ＦＬ多形体ＩＩを産生し、一方で洗浄した濾過ケークの純度は９９．９％に増加した。
［実施例４］
以下のパラメータを用いて実施例１のプロトコルに従った（特に言及されていないパラメータは実施例１と同じである）：
濃縮シロップは６９．０°Ｂｘであった（１６１．４ｇ；５４．３重量％の２’－ＦＬ、１．４重量％のラクトース、及び６．０重量％のＤＦＬを含有する）。
シロップを、３００ｒｐｍで攪拌しながら３５℃に加熱して、その温度で播種した。
播種後のスラリーを２時間攪拌した。
酢酸を１５時間にわたって添加した。
酢酸添加終了時の水に対する酢酸の重量分率は４．６８であった。
以下のパラメータを用いて実施例１のプロトコルに従った（特に言及されていないパラメータは実施例１と同じである）：
濃縮シロップは６９．０°Ｂｘであった（１６１．４ｇ；５４．３重量％の２’－ＦＬ、１．４重量％のラクトース、及び６．０重量％のＤＦＬを含有する）。
シロップを、３００ｒｐｍで攪拌しながら３５℃に加熱して、その温度で播種した。
播種後のスラリーを２時間攪拌した。
酢酸を１５時間にわたって添加した。
酢酸添加終了時の水に対する酢酸の重量分率は４．６８であった。
未洗浄の固形湿潤濾過ケークを６５℃及び５０ｍｂａｒで終夜乾燥させて、４８．５％の乾燥減量（ＬｏＤ）を生じさせた。未洗浄の乾燥結晶性物質は、９２．８％の２’－ＦＬを含有して８４．９％の結晶性２’－ＦＬ多形体ＩＩを産生した。
［実施例５（比較試験）］
上記のそれぞれ実施例１～３からの、及び従来技術（手順が室温ではなく３５℃で実施され、濃縮シロップが６２°Ｂｘ（１４０．２ｇ；４８．８重量％の２’－ＦＬ、１．３重量％のラクトース、及び５．４重量％のＤＦＬを含有する）であったことを除いて、国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットの実施例２に従う）からの結晶化完了後の結晶化スラリーの試料（７５ｍＬ）を回収して、孔径約３μｍ及び濾過面積１３ｃｍ２のポリプロピレン濾布を用いてΔＰ＝１ｂａｒで加圧濾過し、液－気物質移動（ｌｉｑｕｉｄ－ｇａｓ ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ）が開始するまでの時間を測定した。スラリーの濾過性を、以下の式に従って全体の濾過率を計算することによって比較した：濾液の容積［ｃｍ３］／（時間［秒］・フィルタ面積［ｃｍ２］）。
上記のそれぞれ実施例１～３からの、及び従来技術（手順が室温ではなく３５℃で実施され、濃縮シロップが６２°Ｂｘ（１４０．２ｇ；４８．８重量％の２’－ＦＬ、１．３重量％のラクトース、及び５．４重量％のＤＦＬを含有する）であったことを除いて、国際公開第２０１６／０９５９２４号パンフレットの実施例２に従う）からの結晶化完了後の結晶化スラリーの試料（７５ｍＬ）を回収して、孔径約３μｍ及び濾過面積１３ｃｍ２のポリプロピレン濾布を用いてΔＰ＝１ｂａｒで加圧濾過し、液－気物質移動（ｌｉｑｕｉｄ－ｇａｓ ｍａｓｓ ｔｒａｎｓｆｅｒ）が開始するまでの時間を測定した。スラリーの濾過性を、以下の式に従って全体の濾過率を計算することによって比較した：濾液の容積［ｃｍ３］／（時間［秒］・フィルタ面積［ｃｍ２］）。
続いて濾過を６０秒間継続した。こうした得た固形湿潤濾過ケークを、６５℃及び５０ｍｂａｒで終夜（１４時間）乾燥させ、乾燥減量を決定した（下記の表のデータを参照されたい）。
データは、本発明の新規な結晶化法が、濾過及び乾燥がより容易な結晶を生成することを示す。この新規な方法によって生成可能な結晶は、乾燥後に有する揮発性残留物、特に酢酸の量がはるかに少ない。
更なる変形：基本的に、上記で開示された結晶化条件下で、（典型的にＤＦＬが２’－ＦＬに対して２％未満であるときに）６４～６８重量％の２’－ＦＬを含有する７１～７４°Ｂｘの濃縮シロップから、同じ改善された粉末性質が達成可能であった。
Claims (26)
- ２’－ＦＬを結晶化するための方法であって、
１）３５～６０℃の温度で２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップを提供することと、
２）同じ温度で、酢酸中の結晶性２’－ＦＬの１０～３０重量％懸濁液を、２’－ＦＬを含む前記水溶液又はシロップに添加することによってスラリーを生成し、それにより、酢酸中の結晶性２’－ＦＬの前記懸濁液を添加した後で、前記スラリー中の酢酸の量が１．５～４重量％である、ことと、
３）３５～６０℃の温度で、酢酸を前記スラリーに添加して結晶塊を得ることであって、ここで、添加された酢酸の量が計算され、前記酢酸の前記添加終了時における前記結晶性懸濁液中の水に対する前記酢酸の重量分率が４～６である、ことと、
４）前記結晶塊から前記結晶性２’－ＦＬを濾過することと、
を含む、方法。 - 前記結晶性２’－ＦＬが多形体ＩＩである、請求項１に記載の方法。
- 前記酢酸が氷酢酸である、請求項１又は２に記載の方法。
- 工程１）の前記水溶液又はシロップの全固形分が、較正された屈折計で測定して５７～８０°Ｂｘ（Ｂｒｉｘ度）であり、工程１）の前記水溶液又はシロップ中の２’－ＦＬの濃度が４０～７０重量％である、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
- ２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップが、ＤＦＬ、及び任意選択的にラクトースを更に含み、好ましくは、
前記２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比が、２超、より好ましくは４超、更により好ましくは６超、具体的には８～１３であり、且つ／又は、
前記２’－ＦＬ：ラクトースの重量比が１０～１１０であり、前記ＤＦＬ：ラクトースの重量比が１～１０である、請求項４に記載の方法。 - 工程１）の前記水溶液又はシロップの前記全固形分が６７～７７°Ｂｘであり、工程１）の前記水溶液又はシロップ中の２’－ＦＬの前記濃度が５２～６２重量％である、請求項４又は５に記載の方法。
- 工程１）の前記水溶液又はシロップの前記全固形分が７０～７５°Ｂｘであり、工程１）の前記水溶液又はシロップ中の２’－ＦＬの前記濃度が５６～６２重量％である、請求項６に記載の方法。
- 前記水溶液又はシロップが、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される、請求項７に記載の方法。
- 工程１）の前記水溶液又はシロップの前記全固形分が６７～７５°Ｂｘであり、工程１）の前記水溶液又はシロップ中の２’－ＦＬの前記濃度が５２～６２重量％であり、前記水溶液又はシロップが、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される、請求項６に記載の方法。
- ２’－ＦＬを含む水溶液又はシロップが、ＤＦＬ、及び任意選択的にラクトースを更に含み、好ましくは、
前記２’－ＦＬ：ＤＦＬの重量比が、１３超、より好ましくは２５超、例えば５０超であり、前記ＤＦＬ：ラクトースの重量比が１未満である、請求項４に記載の方法。 - 工程１）の前記水溶液又はシロップの前記全固形分が６７～７７°Ｂｘであり、工程１）の前記水溶液又はシロップ中の２’－ＦＬの前記濃度が６２～７０重量％、例えば６４～６８重量％である、請求項４又は１０に記載の方法。
- 前記水溶液又はシロップが、少なくとも４５℃、好ましくは５０±２℃で提供される、請求項１１に記載の方法。
- 工程２）で添加される酢酸中の結晶性２’－ＦＬの前記懸濁液中の前記結晶性２’－ＦＬの量が、工程１）で提供される前記水溶液又はシロップの前記全固形分に対して０．５～２重量％である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
- 前記懸濁液を添加した後の前記スラリー中の酢酸の量が２～３重量％である、請求項１３に記載の方法。
- 工程２）で添加される前記２’－ＦＬ／酢酸懸濁液が２４±２重量％である、請求項１４に記載の方法。
- 工程３）での酢酸の前記添加が３０～４０℃の温度で実施され、好ましくは、前記酢酸は、１２±２時間のうちに連続的に又は数回にわたって添加される、請求項１～１５のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酢酸の前記添加終了時の前記結晶性懸濁液中の水に対する前記酢酸の重量分率が４．６～６、好ましくは４．６～５．５である、請求項１６に記載の方法。
- 工程３）で得られた前記結晶塊が０～２５℃、好ましくは２０～２５℃に冷却され、５±１時間にわたり攪拌される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
- 工程１）で提供される前記水溶液又はシロップは、精製された発酵ブロスである、請求項１～１８のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法によって得られた、又は得ることが可能な結晶性２’－ＦＬ。
- ２’－ＦＬが少なくとも９７％であり、ＤＦＬが２％未満であり、酢酸：０．５％未満のアッセイ値を有する、請求項２０に記載の結晶性２’－ＦＬ。
- 前記水の含有量が０．５％未満、好ましくは０．２５％又は０．１％未満である、請求項２１に記載の結晶性２’－ＦＬ。
- 多形体ＩＩである、請求項２０～２２のいずれか一項に記載の結晶性２’－ＦＬ。
- 請求項２０～２３のいずれか一項に記載の結晶性２’－ＦＬを含む、栄養又は医薬組成物。
- 食品組成物又は栄養補助食品の調製における、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の結晶性２’－ＦＬの使用。
- 食品組成物又は栄養補助食品としての、請求項２０～２３のいずれか一項に記載の結晶性２’－ＦＬの使用。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
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