CN103002904B - 抗血管生成药剂及使用这种药剂的方法 - Google Patents
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Abstract
抗血管生成药剂或多肽,其包含与CD2第一结构域基本相似的氨基酸片段,其中多肽包含由两个片段所形成的β‑折叠。也包括使用这种药剂和多肽的方法。
Description
先前相关申请数据
本申请对2010年7月13日提交的序列号为61/363,933的美国临时专利申请要求优先权,其内容通过引用包含于此。
技术领域
本公开内容涉及抑制或预防血管生成从而控制或治疗依赖血管生成的疾病,该疾病以血管增生或以依赖于血管增生为特征。本公开内容还涉及抗血管生成药剂与化学治疗剂的联合应用。
背景技术
血管生成是从已有毛细血管形成新血管的过程,血管生成包括源自内皮祖细胞的血管生长。血管生成是一个由促血管生成分子和抗血管生成分子之间平衡调节的联合过程。血管生成的刺激(如缺氧或炎症细胞因子)导致血管生成生长因子,如血管内皮生长因子(VEGF)或成纤维细胞生长因子(FGF)的诱导表达和释放。这些生长因子刺激已存在的脉管系统中的内皮细胞(EC)增生并从组织中迁移出来形成新的内皮通路。血管生成包括内皮细胞增殖。
粥样硬化斑块生长、糖尿病性视网膜病、退化性黄斑病、晶状体后纤维组织增生症、特发性肺纤维变性、急性成人呼吸窘迫综合征以及哮喘均与不适当或病理性的血管生成相关。此外,肿瘤进展与新血管形成相关联,新血管形成提供了一种结构向持续生长的肿瘤组织输送营养。尽管远在30多年前就首先提有提议以血液供给为靶点来减缓甚至中止癌症的进展,直到最近血管生成抑制剂才进入癌症治疗的主流。
因此,本领域对减少病理性血管生成的方法和药剂有着持续的需求。本公开内容的目的正是为了满足这一需求。
附图说明
图1A为抗血管生成的示意图,显示了该蛋白中反平行β-折叠的两段短链。
图1B是抗血管生成的另一示意图,显示了该蛋白中反平行β-折叠的两段短链,其中疏水面朝外。
图1C为抗血管生成的另一示意图,显示了该蛋白中反平行β-折叠的两段短链,其中疏水面朝内。
图2为折叠(上)及非折叠(下)的抗血管生成的药剂和宿主蛋白的核磁共振(NMR)谱。
图3A显示抗血管生成药剂和本领域现有药剂(Anginex)相比对HUVEC细胞的增殖分析。
图3B显示抗血管生成药剂和本领域现有药剂(Anginex)相比对M4A4癌症细胞的增殖分析。
图4A图示在使用抗血管生成药剂开始治疗后8天的治疗的疗程里,肿瘤体积保持相对不变。
图4B图示在使用抗血管生成药剂开始治疗后22天的治疗的疗程里,肿瘤体积保持相对不变。
图5图示了首次使用抗血管生成药剂治疗结束时肿瘤重量有着显著的差异。
图6以图片方式展示用缓冲液和宿主蛋白治疗的小鼠肿瘤以正常的速率生长,而用抗血管生成药剂治疗的小鼠肿瘤生长速度则显著缓慢。
图7显示了用抗血管生成药剂治疗小鼠的血管密度试验结果。
图8显示任一治疗组的小鼠体重没有显著变化。
图9显示细胞存活力可随剂量而变。
图10显示了使用不同剂量的抗血管生成药剂治疗14天或以上的肿瘤生长曲线。
图11为和rProAgio-PEG的肿瘤生长曲线。
图12图示了14天疗程结束时的肿瘤重量。
定义
为帮助理解本文所使用的特定术语,本文作如下定义。
“血管生成”定义为已有血管床的任何改变或有助于组织灌注的新脉管系统形成。它包括内皮细胞从已存在血管萌牙而成的新脉管或已有脉管改变大小、成熟方向或流动属性从而改善组织血流灌注的重构。
术语“氨基酸”指天然存在的氨基酸或非天然氨基酸,也指以与天然氨基酸相似的方式发挥功能的氨基酸类似物及氨基酸模拟物。天然编码的氨基酸为20种常见的氨基酸(丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天门冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸和缬氨酸)及吡咯赖氨酸和硒半胱氨酸。氨基酸类似物指基本化学结构与天然存在的氨基酸相同的化合物,例如其α-碳与氢、羧基、氨基和R基结合。此类类似物可具有修饰过的R基团(如正亮氨酸)或是修饰过的肽链骨架,但仍保持其基本化学结构与天然存在的氨基酸相同。非限制性的氨基酸类似物实例包括高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜和甲硫蛋氨酸。
术语“保守修饰变体”同时适用于天然和非天然氨基酸、天然和非天然核酸序列,以及它们的组合。对于特定的核酸序列来说,“保守修饰变体”指编码相同或基本相同的天然及非天然氨基酸序列的那些天然和非天然核酸,或不编码基本相同序列的天然和非天然核酸序列的天然和非天然核酸。例如,由于遗传密码的简变性,大量功能相同的核酸可编码任意特定的蛋白质。比如密码子GCA、GCC、GCG和GCU都编码氨基酸丙氨酸。因此,在密码子指定为丙氨酸的每一个位点,密码子可以变成相应密码子的任一简变密码子而不改变所编码的多肽。这样的核酸变异为“沉默变异”,属于保守修饰变异的一种。同样举例来说,本文所述的编码天然或非天然多肽的每一天然或非天然核酸序列也描述了该天然或非天然核酸的每一可能沉默变异。技术人员将认识到可以将天然或非天然核酸的每一密码子(AUG和TGG除外,通常AUG是蛋氨酸的唯一密码子,TGG是色氨酸的唯一密码子)加以修饰得到功能完全相同的分子。因此,编码天然和非天然多肽的天然和非天然核酸其每一沉默变异也隐含于所述各序列中。
本文所用的术语“有效量”指所给药的药剂或化合物的量足以使所治疗的不适或疾病的一个或多个症状得到一定程序的缓解。其结果可以是疾病信号、症状或病因的减少及/或缓解,或是生物系统的任何其它期望的改变。举例来说,所给药的药剂或化合物包括但不限于天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、修饰过的天然氨基酸多肽或修饰过的非氨基酸多肽。含有这些天然氨基酸多肽、非天然氨基酸多肽、修饰过的天然氨基酸多肽或修饰过的非天然氨基酸多肽的组合物可以给药用于预防、增强及/或治疗性的处理。任一个体病例的适当“有效”量可以用技术,如剂量升级(爬坡)试验加以确定。
本文所用术语“核酸序列”指构成核酸的核苷酸顺序和标识。
“核酸”指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其单链或双链形态的聚合体。本术语包括含有已知核苷酸类似物或已修饰的骨架残基或连锁的核酸,其可以是合成而得,也可是天然存在或非天然存在,结合特性与参照核酸相似,代谢方式也与参照核酸相似。这样的类似物实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲基磷酸盐、手性甲基磷酸酸盐、2-O-甲基核糖核苷酸和肽核酸(PNAs)。
除非另外特指,特定的核酸序列也隐含了其保守修饰变体(如简变密码子置换体)和互补序列,以及明确指明的序列。具体来说,简变密码子置换体可以由一个或多个指定或全部密码子的第三个位点被混合碱基及/或脱氧次黄苷残基取代而来生成序列而得。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。
特定的核酸序列也隐含了“剪接变体”。类似地,核酸编码的特定的蛋白也隐含了该核酸剪接变体所编码的任意蛋白质。正如其字面所提示的那样,“剪接变体”是基因替代剪接的产物。经过转录后,初始核酸转录本可被剪接成不同(替代)的核酸剪接产物来编码不同的多肽。剪接变体产生的机制各式各样,其中包括了外显子的替代剪接。此定义也包括了连读转录而得的源自同一核酸的替代多肽。此定义也包括剪接反应的任意产物,包括剪接产物的重组型。
本文中术语“多肽”、“肽”和“蛋白”可以互换使用,指代氨基酸残基的聚合体。此术语适用于一个或多个氨基酸残基为相应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物的氨基酸聚合体,也适用于天然存在的氨基酸聚合体及非天然存在的氨基酸聚合体。
本文所用术语“药学可接受”指的是不防碍化合物的生物学活性或属性并且相对无毒性的材料,包括但不限于盐、载体或稀释剂,即该材料可以给药于个体而不会产生不期望的生物学效应,或不与组合物中所含的任意组分产生有害的相互作用。
本文所用术语“预防有效量”指的是含有至少一种非天然氨基酸多肽或至少一种已修饰非天然氨基酸多肽的组合物预防性地给药于患者的用量,该用量将可以使所治疗的疾病、不适或病症中一个或多个症状得到一定程度的缓解。在诸如此类的预防性应用中,这样的用量可能取决于患者的健康状态、重量等等。本领域的技术人员可用常规的试验,包括但不限于剂量升级临床试验来确定这样的预防有效量。
两个核酸或多肽语境中的短语“基本相似”指两个或多个序列或亚序列,当采用诸如下文实例中所述的序列对比算法或目检方法测定,而按照最大对应性来比较和对齐时,它们之间具有至少75%、优选至少85%、更优选至少90%、95%或更多或任意整数值的核苷酸或氨基酸残基同一性。优选的是,实质性同一性存在所比较序列的至少10个、优选约20个、更优选约40~60个长度或任意整数的残基的序列区域,或优选地60~80个以上残基的更长区域,或更优选地,至少约90~100个残基的更长区域,最优选的是序列与所比较序列整个长度,例如,核苷酸序列的编码区实质相同。
本文所用术语“协同作用”指的是预防或治疗有效的药剂联用后比任意两种或多种单独药剂的加起来的效果更有效。预防性或治疗性药剂联用的协同作用可降低单种或多种药剂给药于患有特定疾病或不适的受试者的使用剂量及/或给药频率。在某些情况下,预防性或治疗性药剂联用的协同作用可用来避免或减少使用单一治疗所带来的不良或不需要的副作用。
本文所用术语“治疗有效量”指含有至少一种非天然氨基酸多肽和/或至少一种已修饰非天然氨基酸多肽的组合物给药于患有疾病、不适或病症的患者后,其用量足以治愈或至少部分地遏制或一定程度地缓解了所治疗疾病、不适或病症的一个或多个症状。
这些组合物的有效性依具体情况而定,包括但不限于疾病、病症或不适的严重程度和进程,先前的治疗,患者的健康状态和对药物的反应,以及治疗医生的判断。举例来说,治疗有效量可以经由常规的试验包括但不限于剂量升级临床试验来确定。
详细说明
本公开内容提供了一种抗血管生成药剂及抑制血管生成的方法,其中将抗血管生成药剂以治疗有效的量和频率给药于患有相关疾病的哺乳动物进行治疗,使该疾病得以消退或得到遏制而没有明显的毒性。血管生成相关疾病可选自肿瘤,包括实体肿瘤包括乳腺癌、肺癌、前列腺癌、结肠癌、前列腺癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、中枢神经系统肿瘤、神经母细胞瘤、多形性成胶质细胞瘤或黑素瘤。尽管没有完整的清单,该抗血管生成药剂可使即使不是全部也是绝大部分实体瘤消退或受到遏制。接受治疗的哺乳动物可以是人类。
在一个具体实施方案中,抗血管生成药剂包括衍生自CD2第一结构域的多肽的变体,其可为人源和及非人源。更具体地说,将CD2第一结构域的结构和功能加以改变后制备稳定性和活性不同的新多肽。在一些实施例中,这些改变可用于制备拟几个内源性抗血管生成多肽,如PF4、IL8、TSP-1、内皮抑制素和其他合成多肽的活性部分的反向平行β-折叠的至少两段短链(如图1A、1B和1C)。在一些实施例中,抗血管生成药剂或多肽可包含由两个片段、反平行折叠、朝内的疏水面、朝外的亲水面所形成的β-折叠,这两个片段至少有四个氨基酸。在其他实施例中,一个片段由6个或更多氨基酸组成。在其他的另一些实施例中,一个片段由8个或更多氨基酸组成。氨基酸残基可在亲水性和疏水性之间交替(如亲水-疏水-亲水-疏水或亲水-疏水-疏水)。
抗血管生成药剂有许多体内、体外和先体外后体内的作用,包括临床及非临床使用情况下的抗血管生成特性。用定向进化技术制备或创造系统多肽变异的方法在本领域内是公知的。可以预期本文所公开的方法可用于制备其他具有至少两个短链的反向平行β-折叠的非CD2多肽。
在一个实施方案中,抗血管生成药剂可使用合理的多肽设计来制备。合理设计包括鉴定多肽序列中氨基酸残基并预测其对多肽特定影响的方法。例如,一种此类方法包括制备多肽变体的训练集,其中数据提供了训练集中每一多肽变体的活性及序列信息;衍生一个活性模型,使该模型可以根据特定氨基酸的改变来预测活性;并运用此模型来鉴定一个或多个多肽的特定位置上具有特定活性和属性的一个或多个氨基酸。
在另一实施方案中,通过在宿主多肽或CD2的第一结构域(如SEQ ID No.4、5和7)内产生突变来制备抗血管生成药剂。
本领域的普通技术人员可以用重组技术来制备特定的抗血管生成药剂。例如,可以用常规方法制备SEQ ID NO.1~11中的多肽或多肽的标识核酸。另外,SEQ IDNO.1~11中的多肽也可用定点突变技术生产生,从而生成需要的抗血管生成药剂。由于遗传密码的简变性,与包括SEQ ID NO.1~11序列的任何序列不同的任意核酸序列可能发生改变。然后突变后的核酸序列可以亚克隆入合适的表达载体并在宿主如酵母或大肠杆菌(E.coli.)中表达。制备后的纯化技术对于本领域的常规技术人员来说是显而易见的。
在一个实施方案中,抗血管生成药剂可包括N-糖基化。N-糖基化过程存在于真核生物中,与多肽折叠、可溶性以及长血液循环相关联。N-糖基化可能需要共有序列Asn-X-Ser/Thr,并且该共有序列在肽环上时更易发生。在一个实例即毕赤酵母(Pichia)表达系统中,N-糖基化位点在位置N65上。
在一些具体的实施方案中,抗血管生成药剂控制或抑制血管生成。血管生成的抑制通常认为是中止了新血管的发育,不管其发育是经由萌牙而成还是由循环的干细胞抵达分化成内皮细胞而成。然而,由于抗血管生成药剂可以诱导活化的内皮细胞发生凋亡,抑制血管生成应该也解释为包括杀死细胞,尤其是那些靠近或位于肿瘤内已有血管内被肿瘤血管生成因子活化的细胞。因此,在本发明的上下文中,抑制血管生成也应该解释为包括抑制新血管的发育,该抑制可伴有或不伴有邻近已有血管的的破坏。
抗血管生成药剂可能通过抑制或控制凋亡来抑制或预防血管生成。体外分析表明生成的多肽在诱导内皮细胞凋亡方面有很强的活性而对上皮细胞和成纤细胞没有影响。另外,生成的多肽对HUVEC细胞形成的管状结构影响较小,提示对已有的正常血管毒性较小。存活因子包括血管内皮细胞生长因子或分裂素,以及对没有直接生长刺激作用但可使细胞从受损恢复的因子。
这些抗血管生成药剂可以通过抑制血管生成的方式整合入治疗哺乳动物的方法中,所述方法包括给药抗血管生成药剂的步骤。在一些特定的实施方案中,与某些小分子和短肽药剂相比,抗血管生成多肽延长了循环时间。
一些具体的实施方案提供了抑制血管生成的方法及治疗与血管生成相关疾病的方法。在另一些实施文案中,本发明提供了抑制或减少肿瘤生长的方法,以及治疗癌症患者的方法。这些方法包括将上述一种或多种多肽治疗剂以治疗有效的量给药于患者。具体来说,这些方法针对动物的治疗性及预防性处置,更具体地说是针对人类。
正如本文所述,血管生成相关的疾病包括但不限于依赖于血管生成的癌症,包括如实体瘤、血液原生癌如白血病,以及肿瘤转移;良性肿瘤,如血管瘤、听神经瘤、神经纤维瘤、沙眼及脓性肉芽肿;炎症性病症,如免疫性及非免疫性炎症;慢性关节风湿病和银屑病;眼内血管生成疾病,如糖尿病性视网膜病、早产儿视网膜病、黄斑变性、角膜移植物排斥、新生血管性青光眼、晶状体后纤维组织形成及(虹膜)发红;奥-韦氏(Osler-Webber)综合征;心肌血管生成;斑块新血管形成;毛细血管扩张;血友病关节;血管纤维瘤;伤口肉芽生成及伤口愈合;银屑病硬皮症毛细血管扩张、脓性肉芽肿、冠脉侧支形成、缺血性四肢血管生成、角膜疾病、(虹膜)发红、关节炎、糖尿病性新血管形成、骨折、血管发生以及血细胞生成。
抗血管生成药剂与化疗剂联用的一个潜在好处是可以使用更低的化疗剂量改进血管生成相关疾病的治疗和控制。联用可以给药更长的时间,两者联用后由于效果增强也可以给药更短的时间。
根据联合治疗的不同属性,本发明的多肽治疗剂可在其他治疗施用时同时或之后接着给药。多肽治疗剂可以通过单剂量或多剂量的方式进行给药。在一些实施例中,多肽治疗剂至少在传统治疗开始前数天即开始给药,而在另一些实施例中,在传统治疗的给药开始时或之前给药多肽治疗剂。
在一个实施方案中,抗血管生成药剂可与化疗剂和其他治疗剂以及放射疗法联用。化疗剂可选自长春花生物碱、喜树生物碱、紫杉烷或者铂类似物,包括长春新碱、长春碱、长春瑞滨、长春地辛、紫杉醇、多西紫杉醇、5-FU、顺铂、卡铂、伊立替康、拓扑替康或环磷酰胺。由于抗血管生成药剂有抗肿瘤作用,化疗剂可以以低剂量方案与抗血管生成药剂联用给药。化疗剂给药的剂量可低于最大耐受剂量。
可以预期的是抗血管生成药剂可与抗肿瘤剂一起使用,包括下列的抗肿瘤剂:阿西维辛、阿柔比星、盐酸阿考达唑、阿克罗宁、阿多来新、阿地白介素、六甲蜜胺、安波霉素、醋酸阿美蒽醌、氨鲁米特、安吖啶、阿那曲唑、安曲霉素、天冬酰胺酶、曲林菌素、阿扎胞苷、阿扎替派、阿佐霉素、巴马司他、苯佐替派、比卡鲁胺、盐酸比生群、二甲磺酸双奈法德、比折来新、硫酸博来霉素、布喹那钠、溴匹立明、白消安、放线菌素C、卡鲁睾酮、卡醋胺、卡贝替姆、卡铂、卡氮芥、盐酸卡柔比星、卡折来新、西地芬戈、苯丁酸氮芥、西罗霉素、顺铂、克拉屈滨、甲磺酸克立那托、环磷酰胺、阿糖胞苷、达卡巴嗪、放线菌素D、盐酸柔红霉素、地西他滨、右奥马铂、地扎胍宁、甲碘酸地扎胍宁、地吖醌、多西他赛、多柔比星、盐酸多柔比星、屈洛昔芬、柠檬酸屈洛昔芬、丙酸甲雄烷酮、达佐霉素、依达曲沙、盐酸二氟甲基鸟氨酸、依沙芦星、恩洛铂、恩普氨酯、依匹哌啶、盐酸表柔比星、厄布洛唑、盐酸依索比星、雌氮芥、雌氮芥磷酸钠、依他硝唑、I131乙碘油、依托泊苷、磷酸依托泊苷、氯苯乙嘧胺、盐酸法罗唑啉、法扎拉滨、芬维A胺、氟尿苷、磷酸氟达拉滨、氟尿嘧啶、氟西他滨、磷喹酮、福司曲星钠、吉西他滨、盐酸吉西他滨、金Au198、羟基脲、盐酸伊达比星、异环磷酰胺、伊莫福新、干扰素α-2a、干扰素α-2b、干扰素α-n1、干扰素α-n3、干扰素β-Ia、干扰素γ-Ib、异丙铂、盐酸伊立替康、醋酸兰瑞肽、来曲唑、醋酸亮丙瑞林、盐酸利阿唑、洛美曲索钠、洛莫司汀、盐酸洛索蒽醌、马索罗酚、美登素、盐酸氮芥、乙酸甲地孕酮、醋酸美仑孕酮、美法仑、美诺立尔、巯嘌呤、甲氨喋呤、甲氨蝶呤钠、氯苯氨啶、美妥替哌、米丁度胺、米托卡星、丝裂红素、米托洁林、米托马星、丝裂霉素、米托司培、米托坦、盐酸米托蒽醌、麦考酚酸、诺考达唑、诺加霉素、奥马铂、奥昔舒仑、紫杉醇、培门冬酶、培利霉素、溴新斯的明、硫酸培洛霉素、培磷酰胺、哌泊溴烷、哌泊舒凡、盐酸吡罗蒽醌、普卡霉素、普洛美坦、卟吩姆钠、泊非霉素、泼尼莫司汀、盐酸丙卡巴肼、嘌呤霉素、盐酸嘌呤霉素、吡唑霉素、利波腺苷、罗谷亚胺、沙芬戈、盐酸沙芬戈、司莫司汀、辛曲秦、磷乙酰天冬氨酸钠、司帕霉素、盐酸锗螺胺、螺莫司汀、螺铂、链黑霉素、链佐星、氯化锶Sr89、磺氯苯脲、他利霉素、紫杉烷、类紫杉醇(Txoid)、替可加兰钠、替加氟、盐酸替洛蒽醌、替莫泊芬、替尼泊苷、替罗昔隆、睾内酯、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、塞替派、噻唑呋林、替拉扎明、盐酸拓扑替康、枸橼酸托瑞米芬、醋酸曲托龙、磷酸曲西立滨、三甲曲沙、葡萄糖醛酸三甲曲沙、曲普瑞林、盐酸妥布氯唑、乌拉莫司汀、乌瑞替派、伐普肽、维替泊芬、硫酸长春碱、硫酸长春新碱、长春地辛、硫酸长春地辛、硫酸长春匹定、硫酸长春甘酯、硫酸环氧长春碱、酒石酸长春瑞滨、硫酸长春罗定、硫酸长春利定、伏氯唑、折尼铂、净司他丁以及盐酸佐柔比星。
其他抗肿瘤化合物包括20-表-1,25二羟维生素D3、5-乙炔尿嘧啶、阿比特龙、阿柔比星、酰基富烯、腺环戊醇、阿多来新、阿地白介素、ALL-TK拮抗剂、六甲蜜胺、氨莫司汀、2,4-二氯苯氧基乙酸(amidox)、氨磷汀、氨基乙酰丙酸、氨柔比星、阿托沙克碱(atrsacrine)、阿那格雷、阿那曲唑、穿心莲内酯、血管生成抑制剂、拮抗剂D、拮抗剂G、安雷利克斯、抗背部化形态发生多肽-1、抗雄激素物质、前列腺癌、抗雌激素药、抗肿瘤肽、反义寡核苷酸、甘氨酸阿非科林、凋亡基因调节剂、凋亡调节剂、无嘌呤核酸、腺苷-CDP-DL-PTBA(ara-CDP-DL-PTBA)、精氨酸脱氨酶、苯胺丫啶(asulacrine)、阿他美坦、阿莫司汀、洋虫胶抑制素1(axinastatin 1)、洋虫胶抑制素2(axinastatin2)、洋虫胶抑制素3(axinastatin3)、阿扎司琼、阿扎毒素、重氮酪氨酸、浆果赤霉素III衍生物、博拉诺(balanol)、巴马司他、BCR/ABL拮抗剂、苯并二氢卟吩、苯甲酰星状孢子碱、β-内酰胺衍生物、β-鸠尾(β-alethine);β-克拉霉素B、桦木酸、bFGF抑制剂、比卡鲁胺、比生群、双乙烯亚氨基精胺(bisaziridinylspermine)、双奈法德、双枸橼酸环己噻卓酯A(bistratene A)、比折来新、布来福林(breflate)、溴匹立明、布度钛、丁硫氨酸硫酸亚胺、卡泊三醇、钙磷酸蛋白C、喜树碱衍生物、金丝雀痘IL-2、卡培他滨、氨甲酰-氨-三唑、羧氨基三唑、CaRest M3、CARN700、衍生自软骨的抑制剂、卡折来新、酪蛋白激酶抑制剂(ICOS)、澳粟精胺、天蚕抗菌肽B、西曲瑞克、二氢卟酚、磺胺氯喹恶啉、西卡前列素、顺卟啉、克拉屈滨、氯米芬类似物、克霉唑、克里斯霉素(collismycin)A、克里斯霉素(collismycin)B、考布他汀A4、考布他汀类似物、天然产物(conagenin)、五环胍类生物碱(crambescidin)816、克立那托、自念珠藻环肽8(cryptophycin8)、自念珠藻环肽A(cryptophycin A)衍生物、先导化合物(curacin)A、环戊烯蒽醌(cyclopentanthraquinones)、环铂(cycloplatam)、环青霉素(cypemycin)、阿糖胞嘧啶、溶细胞因子、磷酸己烷雌酚、达昔单抗、地西他滨、脱氢膜海鞘素B、地洛瑞林、右异环磷酰胺、右雷佐生、右维拉帕米、地吖醌、膜海鞘素B、3,4-二羟荃苯并氧肟酸(didox)、二乙基去甲精胺(diethylnorspermine)、二氢-5-氮胞苷、9-二氢紫杉醇、双草霉素、联苯螺莫司汀、二十二烷醇、多拉司琼、去氧氟尿苷、屈洛昔芬、屈大麻酚、苯并吡咯类(duocannycinSA)、依布硒、依考莫司汀、依地福新、依决洛单抗、依氟鸟氨酸、榄香烯、乙嘧替氟、表柔比星、爱普列特、雌氮芥类似物、雌激素激动剂、雌激素拮抗剂、依他硝唑、磷酸依托泊苷、依西美坦、法倔唑、法扎拉滨、芬维A胺、非格司亭、非那甾胺、夫拉平度(flavopiridol)、氟卓斯汀、氟海星酮(fluasterone)、氟达拉滨、盐酸氟代柔红霉(fluorodaunorunicin)、福酚美克、福美坦、福司曲星、福莫司汀、德克萨卟啉钆(gadolinium texaphyrin)、硝酸镓、加洛他滨、加尼瑞克、明胶酶抑制剂、吉西他滨、谷胱甘肽抑制剂、1,7一庚二醇一双氨基磺酸醋(hepsulfam)、神经生长因子、六甲撑二乙酰胺、金丝桃素、伊班膦酸、伊达比星、艾多昔芬、伊决孟酮、伊莫福新、伊洛马司他、咪唑吖啶酮、咪喹莫特、免疫刺激肽、胰岛素样生长因子-1受体抑制剂、干扰素激动剂、干扰素、白介素、碘苄胍、碘阿霉素、甘薯苦醇、伊立替康、伊罗普拉、伊索拉定、异苯唑(isobengazole)、同功卤素康得灵(isohomohalicondrin)B、伊他司琼、促微丝聚合剂(jasplakinolide)、环缩肽(kahalalide)F、片螺素(lamellarin)-N三乙酸盐、兰瑞肽、雷拉霉素(Leinamycin)、来格司亭、硫酸蘑菇多糖、来泊司汀(leptolstatin)、来曲唑、白血病抑制因子、白细胞α干扰素、亮脯利特+雌激素+黄体酮、亮丙瑞林、左旋咪唑、利阿唑、线性聚胺类似物、亲脂性双糖肽、亲脂性铂化合物、环肽噻唑啉海洋环肽(lissoclinamide)7、洛铂、蚯蚓磷脂、洛美曲索、氯尼达明、洛索蒽醌、洛伐他汀、洛索立宾、勒托替康、蓝花赝靛素鎦(lutetium texaphyrin)、利索茶碱(lysofylline)、溶解肽、美坦新、抑甘露糖苷酶素(mannostatin)A、马立马司他、马索罗酚、乳腺丝氨酸蛋白酶抑制物、基质溶解因子抑制剂、基质金属蛋白酶抑制剂、美诺立尔、美巴龙(merbarone)、美替瑞林、蛋氨酸酶(methioninas)、甲氧氯普胺、MIF抑制剂、米非司酮、米替福新、米立司亭、错配双链RNA、米托胍腙、二溴卫矛醇、丝裂霉素类似物、米托萘胺、丝裂毒素(mitotoxin)成纤维细胞生长因子-皂草素、米托蒽醌、莫法罗汀、莫拉司亭、单克隆抗体、人绒毛膜促性腺激素、单磷酸类脂A+分支杆菌(myobacterium)细胞壁sk、莫哌达醇、多药耐药基因抑制剂、基于多肿瘤抑制基因-1的治疗、芥末抗癌剂、印度洋海绵B(mycaperoxideB)、分枝杆菌(myobacterium)细胞壁提取物、苔藓虫海绵(myriaporone)、N-乙酰地那林、N取代苯酰胺类、那法瑞林、那哥斯普(nagrestip)、纳洛酮+喷他佐辛、纳帕维(napavin)、萘萜二醇(naphterpin)、那托司亭、奈达铂(nedaplati)、奈莫柔比星、奈立膦酸、中性肽链内切酶、尼鲁米特、尼萨米森(nisamycin)、一氧化氮调节剂、一氧化二氮抗氧化剂、尼楚林(nitrullyn)、O-6-苄基鸟嘌呤、奥曲肽、奥克三诺(okicenone)、寡核苷酸、奥那司酮、昂丹司琼、奥瑞森(oracin)、口服细胞因子诱导剂、奥马铂、奥沙特隆、奥沙利铂、奥诺米森(oxaunomycin)、紫杉酚类似物、紫杉酚衍生物、钯胺(palauamine)、棕榈酰根霉素、帕米磷酸、人参三醇、帕诺米芬、副菌铁素(parabactin)、帕折普汀、培门冬酶、培得星、戊聚糖聚硫酸钠、喷司他丁、喷曲唑(pentrozole)、全氟溴烷、培磷酰胺、紫苏子醇、吩嗪霉素(phenazinomycin)、乙酸苯酯、磷酸酶抑制剂、溶链菌制剂、盐酸毛果云香碱、吡柔比星、吡曲克辛、帕斯婷(placetin)A、帕斯婷(placetin)B、纤溶酶原活化因子抑制剂、铂复合物、铂类化合物、铂三胺复合物、卟吩姆钠、泊非霉素、丙基双吖啶酮、前列腺素J2、蛋白酶体抑制剂、基于A蛋白的免疫调节剂、蛋白激酶C抑制剂、微海藻类(microalgal)蛋白激酶C抑制剂、蛋白酪氨酸磷酸酶抑制剂、嘌呤核苷磷酸化酶抑制剂、红紫素、吡唑啉吖啶、吡醇羟乙酯血红蛋白聚氧乙烯缀合物、raf拮抗剂、雷替曲塞、雷莫司琼、ras法尼基蛋白转移酶抑制剂、ras抑制剂、ras-GAP抑制剂、脱甲基瑞替普汀、铼Re86依替膦酸盐、根霉素、核酶、维甲酰酚胺(retinamide)RII、罗谷亚胺、罗稀吐碱(rohitukine)、罗莫肽、罗喹美克、如彼给诺(rubiginone)B1、如波斯(ruboxyl)、沙芬戈、沙托品(saintopin)、SarCNU、肌肉叶绿醇(sarcophytol)A、沙格司亭、Sdi1模拟物、司莫司汀、衰老相关抑制剂1、正义寡核苷酸、信号转导抑制剂、信号转导调控剂、单链抗原结合蛋白、西佐非兰、索布佐生、卡钠(sodiumborocaptate)、苯乙酸钠、索沃澳(solverol)、生长调节素结合蛋白、索纳明、磷乙天冬氨酸、穗霉素D(spicamycin D)、螺莫司汀、脾脏五肽(splenopentin)、CD-螺环缩酮前体δ-内酯(spongistatin1)、角鲨胺、干细胞抑制剂、干细胞分化抑制剂、茎胺(stipiamide)、基质降解酶抑制剂、硫密斯(sulfmosine)、强效血管肠肽拮抗剂、磺酸偏端霉素(suradista)、舒拉明、苦马豆素、合成葡糖氨基葡聚糖、他莫司汀、它莫西芬甲碘化物、牛磺莫司汀、他扎罗汀、替可加兰钠、替加氟、碲吡喃洋(tellurapyrylium)、端粒末端转移酶抑制剂、替莫泊芬、替莫唑胺、替尼泊甙、四氯十氧化物、四氢恶唑环(tetrazomine)、白蓬草硝酸钠(thaliblastine)、沙立度胺、噻可拉林、血小板生成素、血小板生成素模拟物、胸腺法新、胸腺生成素受体激动剂、胸腺曲南、促甲状腺激素、本紫红素乙酯锡、替拉扎明、二氯环戊二烯钛、托泊替康、双吲哚碱(topsentin)、托瑞米芬、全能干细胞因子;翻译抑制剂、维甲酸、三乙酰尿苷、曲西立滨、三甲曲沙、曲普瑞林、托烷司琼、妥罗雄脲、酪氨酸激酶抑制剂、酪氨酸磷酸化抑制剂、UBC抑制剂、乌苯美司、泌尿生殖窦衍生生长抑制因子、尿激酶受体拮抗剂、伐普肽、全酸蚀树脂粘结剂(variolinB)、载体系统、红细胞基因治疗、维拉雷琐、藜芦明、黄雀(verdins)、维替泊芬、长春瑞滨、维夏汀(vinxaltine)、维它新(vitin)、伏氯唑、扎诺特隆、折尼铂、亚苄维C(zilascorb)、净司他丁斯酯(zinostatin stimalamer)。本领域常规技术人员应知属于此类药剂的大量其他化合物也可用于与所述抗血管生成药剂联用。
可以预期的是抗血管生成药剂可与抗癌补充增强剂,包括下列补充增强剂一起使用:抗癌补充增强剂,三环抗抑郁药(如丙咪嗪、地昔帕明、阿米替林、氯米帕明(clomiprainine)、曲米帕明、多塞平、去甲替林、普罗替林、阿莫沙平和马普替林)、非三环抗抑郁药(如舍曲林、曲唑酮和西酞普兰)、Ca2+阻滞剂(维拉帕米、硝苯地平、尼群地平和卡罗维林)、钙调蛋白抑制剂(如普尼拉明、三氟拉嗪和氯米帕明)、两性霉素B、曲帕拉醇类似物(如他莫昔芬)、抗心律失常药(如奎尼丁)、抗高血压药(如利血平)、硫醇耗竭剂(depleters)(如丁硫氨酸(buthionine)和亚砜亚胺(sulfoximine)),以及降低多药耐药性的药剂如Cremaphor EL。本发明的化合物也可与细胞因子,如粒细胞集落刺激因子一起给药。本领域常规技术人员应知属于此类药剂的大量其他化合物也可用于与所述抗血管生成药剂联用。
一个实施方案也包括一套治疗哺乳动物中血管生成相关疾病的试剂盒,其包括抗血管生成药剂和化疗剂。药剂联用后使其给药的剂量和频率对血管生成停止或消退有治疗效果。在一些特定实施方案中,抗血管生成药剂及/或多核苷酸单独给药或与抗炎剂联合给药。可与本发明抗血管生成药剂一起给药的抗炎剂包括但不限于皮质类固醇(如倍他米松、布地奈德、可的松、地塞米松、氢化可的松、甲泼尼龙、泼尼松龙、強的松和曲安西龙)、非类固醇抗炎药(如双氯芬酸、二氟尼柳、依托度酸、非诺洛芬、夫洛非宁、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、甲氯芬那酸(meclofenamate)、甲芬那酸、美洛昔康、萘丁美酮、萘普生、奥沙普秦、保泰松、吡罗昔康、舒林酸、替诺昔康、噻洛芬酸和托美丁),以及抗组胺药、氨基芳基羧酸衍生物、芳基乙酸衍生物、芳基丁酸衍生物、芳基羧酸、芳基丙酸衍生物、吡唑类、吡唑啉酮、水杨酸衍生物、噻嗪氨甲酰衍生物、e-乙酰氨基己酸、S-腺苷蛋氨酸、3-氨基-4-羟基丁酸、阿米西群、苄达酸、苄达明、布可隆、联苯吡胺、地他唑、依莫法宗、愈创蓝油烃、萘丁美酮、尼美舒利、奥古蛋白、奥沙西罗、瑞尼托林、哌立索唑、哌福肟、普罗喹宗、普罗沙唑和替尼达普。
药物学的药剂包括下列类属和具体实例。所述类属并不受具体的实例所限定。本领域常规技术人员应能容易地识别作用于中枢神经系统之外的药物学的药剂。本领域技术人员亦应知属于所述类属、依据本发明可用的大量其他化合物。
在一些实施方案中,可能需要增加抗血管生成药剂的溶解度和血液循环时间。可以用聚乙二醇将本发明多肽加以衍生以增加多肽的溶解度和血液循环时间,包括诸如聚乙二醇(PEG)、聚乙烯吡咯烷酮、多氧聚物(polyoxomers)、聚山梨醇酯和聚乙烯醇,尤其优选PEG聚合物。所述PEG聚合物分子量约为100到约4000。对于本领域技术人员显而易见的是,除上述列举实例外,也可根据本公开内容选用其他合适的亲水聚合物。所用聚合物通常包括可通过烃化或酰化反应连接于本发明多肽的聚合物。在一个实施例中,抗血管生成药剂用一个20kDa的PEG链进行PEG加聚。
聚乙二醇分子(或其他化学部分)连接时应考虑其对多肽功能结构域或抗原结构域的影响。本领域技术人员可以选用多种连接方法。举例来说,聚乙二醇可通过活性基团,如游离氨基或羧基与氨基酸残基共价结合。活性基团是指聚乙二醇分子活化后可以结合的基团。含游离氨基的氨基酸残基可包括赖氨酸残基和N-端氨基酸残基;含游离羧基的氨基酸残基可包括天门冬氨酸残基、谷氨酸残基和C-端氨基酸残基。巯基也可用作连接聚乙二醇分子的活性基团。出于治疗目的,连接优选氨基连接,如N-端或赖氨酸基连接。可能需要对多肽在N末端进行特别的化学修饰。以聚乙二醇为本组合物示例,可以选用各种不同的聚乙二醇分子(分子量、支链等)、反应混合物中聚乙二醇分子对多肽分子的比例、所进行的聚乙二醇化反应类型,以及获得所选N端聚乙二醇化多肽的方法。在适当的反应条件下,大体上实现了用含有聚合物的羰基在多肽N端进行的羰选择性衍生。
有多种给药途径可用。可以根据抗血管生成药剂、所治疗的具体疾病以及起效所需剂量来选择特定的模式。可使用临床可接受的任意给药模式来实践这些方法,即产生有效水平免疫应答而没有临床不可接受的副作用的任意模式。某些给药方式为非肠胃途径。
某些具体的实施方案也提供了药物组合物。所述组合物包含治疗有效量的活性组分(如抗血管生成药剂、抗血管生成剂药加化疗剂或抗血管生成药剂加抗炎剂)以及药物学上可接受的载体。所述药物学上可接受载体可以为无菌液体,如水和油,包括石油、动物油、植物油及合成的油,如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。药物组合物静脉给药时以水为载体。盐水溶液、葡萄糖水和甘油溶液也可用作液体载体,尤其是注射溶液的载体。合适的药物赋形剂包括淀粉、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、米、面粉、碳酸钙、硅胶、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、滑石粉、氯化钠、干脱脂乳、甘油、丙烯、乙二醇、水、乙醇等。必要时组合物也可含有小量的增湿剂或乳化剂,或pH缓冲剂。这些组合物剂型可是溶液、悬浮液、乳液、片剂、丸剂、胶囊、粉剂、缓释剂等。组合物也可与传统的粘合剂和诸如甘油三酯的载体一起制成栓剂。口服剂型可包含标准载体如药用级的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。此类组合物包含有治疗效量的抗血管生成药剂和适量载体,以便提供适合于给药给患者的剂型。剂型应与给药模式相称。
可以用标准临床技术来确定对治疗、抑制和预防异常表达相关疾病或病症起效(如参见图9)的抗血管生成药剂用量及/或治疗性多肽的活性。另外,也可用体外试验辅助鉴别最佳剂量范围。剂型中所采用的精确剂量也取决于给药途径以及疾病或病症的严重程度,应根据医师的判断和每个患者的情况来确定。可以从体外或动物模型实验系统制得的剂量应答曲线外推有效剂量。
更具体地说,在人类身上使用所述药剂或药物组合物之前可先在体外然后在体内测试所需的治疗或预防活性。例如,用体外试验证明化合物或药物组合物的治疗性或预防性用途,包括对细胞系或患者组织样本的效果。可以利用本领域技术人员公知的技术确定化合物或组合物对细胞系及/或组织样本的效果,包括但不限于玫瑰花环形成试验和细胞溶解试验。依据本发明,可用于确定是否给药了特定化合的体外试验包括体外细胞培养试验,患者组织样本于培养物中生长并暴露于或给药了化合物,并观察了此化合物对组织样本的效果。
可以预期的是,抗血管生成药剂可根据常规途径制成适于人类静脉内给药的药物组合物。典型的静脉内给药的组合物为无菌等渗缓冲液的溶液。必要时,组合物也可包括增溶剂和局部麻醉剂,如利多卡因来减轻注射部位的疼痛。通常来说,这些成分分别供应或以单位剂型混合一起供应,如将干燥冻干粉或无水浓缩物存于密封容器,象安瓿或包装袋(sachette)内,容器标明了活性成分含量。当组合物以输注方式给药时,组合物可用含无菌药用级水或盐水的输注瓶配制。当组合物以注射剂给药时,可提供注射用无菌水或盐水的安瓿以便所述成分在给药前可以混合。
已知有多种递药系统可用于本发明化合物的给药,如脂质体包囊、微粒、微囊、可表达所述化合物的重组细胞、受体介导的胞吞、构建核酸成为逆转录病毒或其他载体的一部分,等等。导入的方法包括但不限于皮内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、鼻内、硬膜外及口服途径。化合物或组合物可用任意方便的途径给药,例如输注或快速浓注,或者通过上皮或粘膜皮肤内层(如口腔粘膜、直肠粘膜和肠粘膜等),也可与其他具有生物学活性的药剂一起给药。可以全身性或局部给药。另外,可能需要将本发明的药物化合物或组合物以任意合适的途径,包括心室内注射和鞘内注射导入中枢神经系统,心室内注射可用心室内导管加以辅助。
在一个具体的实施方案中,可能需要将抗血管生成药剂局部给药于需治疗的区域。例如,可以用下述方法但不限于这些方法来实现:手术时局部输注,手述后例如和伤口敷料一起局部应用,应用方式为注射、使用导管、使用栓剂或使用植入物;所述植入物可为多孔性、无孔或凝胶状材料,其包括膜,如硅酮(sialastic)膜或纤维。给药多肽时应注意使用多肽不会吸收的材料。
在一个具体实施方案中,抗血管生成药剂为编码多肽的核酸,将所述核酸构建为适当核酸表达载体的一部分,使其给药后进入细胞内,在体内促进其编码的多肽表达,施用方式可以使用逆转录病毒载体、直接注射、使用微粒轰击、用脂质或细胞表面受体或转染剂包膜、或与公知进入胞核的同源异形盒样肽接合给药,等等。此外,可以通过同源重组使核酸导入细胞内并与宿主细胞的DNA整合进行表达。
其他实施方案专注于含有编码抗血管生成药剂多核苷酸的载体、宿主细胞,以及用合成和重组的技术生产抗血管生成药剂。例如,载体可以为噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。逆转录病毒载体可具有复制能力或有复制缺陷。在后一种情况下,病毒繁殖通常仅在互补宿主细胞内发生。编码抗血管生成药剂的多核苷酸可与含有选择性标记的载体连接在宿主内繁殖。质粒载体通常以沉淀物,如磷酸钙沉淀物或以带电脂质的复合物形式导入。多核苷酸插入应该与适当的启动子可操作地连接,在此仅列举数例,如λ噬菌体的PL启动子、大肠杆菌的lac、trp、phoA和tac启动子,SV40的早期启动子和后期启动子以及逆转录病毒LTR的启动子。本领域技术人员也公知其他适当的启动子。表达构建体还包含转录的起始位点和终止位点以及转录区内用于翻译的核糖体结合位点。构建体所表达的转录本的编码区优选在所翻译多肽的起始位置和大约终止的位置分别包括翻译起始密码子和终止密码子(UAA、UGA或UAG)。如前文所述,表达载体优选包括至少一个选择性标记。
可以预期的是,常规基因和序列可用于抗血管生成药剂的表达和复制。不同种属或细胞类型之间的基因表达调控序列的性质可能有差异,一般来说必须包括分别参与转录起始和翻译起始的5’非转录序列和5’非翻译序列,如TATA盒、加帽序列、CAAT序列等。启动子可以为组成型或诱导型。必要时调控序列也可包括增强子序列或上游激活序列。
在一个实施方案中,编码抗血管生成药剂的多核苷酸可与编码信号序列的多核苷酸融合,后者将多肽定位到原核细胞或真核细胞的特定隔室,并且/或者定位多肽的分泌。例如,在大肠杆菌内可能需要将蛋白的表达定向到胞质空间。有数个商用载体可用于构建融合蛋白来定位蛋白的位置。
一个具体实施方案提供了支架,其包含一个通常是管状的结构(例如包括螺旋形),其表面涂层有前述抗血管生成药剂。支架可以为基架,通常呈圆柱形,可插入到体内的管道(如胆管)或体内管道的一部分中防止其闭合或再闭合,所述管道已经狭窄、不规则的挫伤、堵塞或因疾病进展而闭塞(如肿瘤的向内生长)。
一个具体实施方案也提供抗血管生成药剂在不同手术操作中的广泛应用。例如,本发明一方面可以使用抗血管生成蛋白(例如,以喷雾或薄膜的形式)在去除肿瘤之前对区域包被或喷涂,从而将正常的周围组织与恶性组织分离,同时/或者预防疾病向周围组织扩散。然而,在本发明的另一方面,可在需要使用手术网状织物的任意手术操作中采用本发明抗血管生成蛋白包被过的手术网状织物。
下文所述实施例目的在于帮助理解本发明,无意也不应理解为对本发明的范围构成任何方面的限制。
实施例
实施例1:抗血管生成药剂的表达
抗血管生成药剂从大肠杆菌表达和纯化。为了有助于确认所设计多肽仍能正确地折叠,其结构用1H-NMR分析进行确证。抗血管生成药剂的NMR谱(120μm)与CD2-D1的NMR谱(120μm)进行对比。如图2所示,抗血管生成药剂的NMR谱几乎与CD2-D1的NMR谱(上)完全一样,而未折叠多肽(用有机溶剂处理)则显示完全不同的谱(下)。所得多肽显示了与宿主蛋白和生成的蛋白之间1H-NMR、圆二色谱(CD)及荧光光谱的相似性所证明的非常相似的结构性质。
实施例2:内皮细胞和细胞凋亡
用HUVEC细胞进行细胞存活分析来确定抗血管生成药剂对内皮细胞的作用。细胞用不同浓度的抗血管生成药剂生成的样例、血管生成抑制肽及用于衍生抗血管生成药剂的宿主多肽进行处理。如图3A所示,抗血管生成药剂更有效地诱导HUVEC细胞的细胞凋亡(图2A)。我们还测试了这种作用是否为内皮细胞特异性的。为此用HUVEC、M4A4在5μM或10μM抗血管生成药剂、血管生成抑制肽及宿主蛋白存在的条件下进行细胞增殖试验。如图3B和图9所示,非常明显抗血管生成药剂对HUVEC细胞的增殖有很强的抑制,而M4A4上皮细胞则没有观察到这种抑制作用。这些观察资料表明抗血管生成药剂的作用是内皮细胞特异性的。
实施例3:抑制PC-3细胞异种移植的肿瘤生长
明显地,抗血管生成药剂对抑制HUVEC细胞生长并诱导其细胞凋亡有着很强的活性。用免疫缺陷小鼠制备PC-3细胞的异种移植模型。患肿瘤小鼠(每组6只)用抗血管生成药剂(10mg/kg)、PEG化抗血管生成药剂(10mg/kg)、宿主蛋白(10mg/kg)和缓冲盐水每日剂量治疗两周。治疗于肿瘤接种7天后开始。测定肿瘤体积或肿瘤细胞的生物发光。
如图4A和4B所示,抗血管生成药剂和抗血管生成药剂PEG抑制了肿瘤的生长。图4A图示了在使用抗血管生成药剂治疗的疗程中,8天后治疗开始时,肿瘤体积保持相对不变。图4B图示使用抗血管生成药剂治疗的疗程里,22天后治疗开始时,抗血管生成药剂的剂量依赖效应,肿瘤体积也保持相对不变。同时在对照组中,用缓冲液和宿主蛋白治疗的小鼠其肿瘤以正常速度生长。治疗疗程结束,切除每个治疗组的肿瘤和称重。
如图5所示,抗血管生成药剂组和对照组之间的肿瘤重量有明显的差异。本试验中肿瘤的初始值为2x106细胞。治疗于肿瘤接种22天后开始。抗血管生成药剂完全抑制了肿瘤的生长。
如图6所示,对照组小鼠用缓冲液和宿主蛋白(CD2)治疗,其肿瘤以正常速度生长。从这些影像可以看出,用检测的抗血管生成药剂治疗后肿瘤保持稳定。仅出于参考目的,将蛋白M1WT称为促血管生成素1(Angio1),M1PEG为促血管生成素2(Angio2)。
实施例4:治疗后的血管密度
图7表明,从治疗小鼠制备肿瘤组织切片用免疫荧光染色后显示,与PEG化宿主蛋白治疗组和缓冲液治疗组相比,抗血管生成药剂组和PEG化抗血管生成药剂组治疗后血管密度显著降低。治疗结束后收集肿瘤以确定抗血管生成药剂治疗效果是否真正与肿瘤血管相关。从收集的肿瘤制备组织载玻片。组织载玻片用内皮细胞特异性的分子标志物,抗CD31抗体免疫染色。肿瘤组织载玻片的免疫染色用共聚焦显微镜观察。结果表明抗血管生成药剂对肿瘤血管生成具有特异性效果。
实施例5:抗血管生成药剂的毒性及免疫原性
CD2第一结构域的亲本蛋白的毒性之前已有分析,其对小鼠无毒。用CD-1小鼠检验抗血管生成多肽的毒性来辅助确保新设计没有改变此蛋白的毒性。首先在14天治疗期间密切监测患肿瘤裸小鼠体重。如图8所示,在任何治疗组的小鼠均未观察到体重明显变化。另外,测试正常CD-1小鼠的毒性。三组小鼠(每组7只小鼠)用一剂、两剂和三剂100μl多肽(100mg/kg,是所用剂量的20倍)静脉注射,每两次注射之间间隔三天。然后将动物放回笼里30天。未观察到有受试小鼠死亡。所有动物行为表现正常(饮食习惯未改变,体重无异常增加或减少,皮毛无异常表现)。
毒性试验表明,抗血管生成药剂和带有PEG的抗血管生成药剂在高于患肿瘤小鼠治疗所用剂量约20倍的至少三个剂量没有急性毒性。另外,我们也检验了抗血管生成药剂和带有PEG的抗血管生成药剂治疗时是否有肝、肾及心血管损伤。组织学检查未发现受试动物有器官损伤。
实施例6:N-糖基化
序列ID No.11所示多肽用毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统进行表达和纯化。此多肽的毕赤酵母表达同时由胞内表达和分泌表达实现。多肽进一步用离子交换柱进行纯化。此多肽表达为组氨酸标记多肽。组氨酸标记用凝血酶裂解去除。毕赤酵母表达和纯化的糖基化蛋白是一种抗血管生成药剂,其含有N-糖基化。如图13所示,用抗血管生成药剂不同样例处理后细胞存活力强健。
实施例7:序列
序列ID No.1为大鼠来源CD2第一结构域的氨基酸序列(WT大鼠CD2-D1):
RDSGTVWGAL GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RWERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILANGDLKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALDLRILE
序列ID No.2为人源的CD2第一结构域的氨基酸序列(WT人CD2-D1):
KEITNALETWGALGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETF KEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIYDTKGKNVLEKIFDLKIQER
序列ID No.3也称为M1WT或促血管生成素1(Angio1),是源自序列ID No.1的CD2第一结构域的在W7Q、G8M、A9K、D94N、R96K、I97V、L98I和E99I突变后的变体氨基酸序列:
RDSGTVQMKL GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RWERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILANGDLKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALNLKVII
序列ID No.4是源自序列ID No.1的CD2第一结构域在E41I、K43V、K45L、M46G、K47S、P48V和G53L突变后的变体氨基酸序列:
RDSGTVKWKA GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RWERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILANGDLKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALSLDVNI
序列ID No.5是源自序列ID No.1的CD2第一结构域在E41N、M46Q和F49S突变后的变体氨基酸序列:
RDSGTEVIKA GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RWERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILANGDLKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALKLTAIL
序列ID No.6,称为前促血管生成素(ProAngio)-PEG或促血管生成素2(Angio2),是源自序列ID No.3的CD2第一结构域在M23C突变后的变体氨基酸序列:
RDSGTVQMKL GHGINLNIPN FQCTDDIDEV RWERGSTLVA EFKRKMKPFL KSGAFEILANGDLKIKNLTR DDSGTYNVTV YSTNGTRILN KALNLKVII
序列ID No.7是源自序列ID No.1的CD2第一结构域在E41I、K43V、K45L、M46G、K47S和F49S突变后的变体氨基酸序列:
RDSGTVWGAL GHGINLNIPN FQMTDDIDEV RWERGSTLVA IFVRLGSVKM KPLLKSGAFEILANGDLKIK NLTRDDSGTY NVTVYSTNGT RILNKALDLR ILE
序列ID No.8是CD2第一结构域一个变体的氨基酸序列:
RDSGTVWGALGHGINLNIPNFQMTDDIDEVRWERGSTLVANFKRKQKPSLKSGAFEILANGDLKIKNLTRDDSGTYNVTVYSTNGTRILNKALDLRILE
序列ID No.9,称为hProAngioB或促血管生成素3(Angio3),是源自序列ID No.2的CD2第一结构域在E8S、T9V、W10Q、G11M、A12K、D99N、I102V、Q103I和E104I突变后的变体氨基酸序列:
KEITNALSVQMKLGQDlNLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETF KEKDTYELLKNGALKIKHLKTDDQDIYKVSIADTKGKNVLEKIFNLKVII
序列ID No.10,称为hProAngio或促血管生成素4(Angio4),是源自序列ID No.9的CD2第一结构域在M30C突变后的变体氨基酸序列:
KEITNALSVQMKLGQDINLDIPSFQCSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYELLKNGALKIKHLKTDDQDIYKVSIADTKGKNVLEKIFNLKVII
序列ID No.11,称为hProAngioY或促血管生成素5(Angio5),是酵母来源CD2第一结构域一个变体的氨基酸序列:
KEITNALSVQMKLGQDINLDIPSFQMSDDIDDIKWEKTSDKKKIAQFRKEKETFKEKDTYKLFKNGTLKIKHLKTDDQDIYKVSIADTKGKNVLEKIFNLKVII
实施例7:肿瘤生长抑制
图10显示了肿瘤治疗14天或以上的生长曲线。结果表明序列ID No.10所编码多肽得到的hProAgio或促血管生成素4(Angio4),可有效抑制肿瘤生长。试验使用hProAgio或促血管生成素4(Angio4)(日剂量为10mg/kg)的PC-3异种移植完成,并以缓冲盐水对照。肿瘤接种8天后开始治疗。
实施例8:与的效果对比
为进一步测试抗血管生成多肽的效果,用rProAgio-PEG或促血管生成素2(Angio2)(每日剂量20mg/kg)和Avastin(20mg/kg,隔日一剂)对PC-3异种移植进行试验和分析。肿瘤接种21天后开始治疗。图11为和rProAgio-PEG或促血管生成素2(Angio2)的肿瘤生长曲线。14天疗程结束时将各治疗组的肿瘤提取出来并称重,图12图示了肿瘤的重量。用促血管生成素2(Angio2)和治疗的动物组别的肿瘤重量和生长有显著差异。
前述详细说明及后附图的呈现仅以说明及描述为目的。其并不是毫无遗漏,也无意对本发明的实质构成限制。所选择和描述的实施方案最佳地阐述了本明的原理及其实践应用。本领域技术人员应该认识到对本说明所公开的发明进行许多改变不会超出本发明的实质和范围。
Claims (11)
1.修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域在制备用于减少个体中血管生成的抗血管生成药剂的用途,其中来源于人类或小鼠CD2多肽第一结构域的修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域包含由两个片段、反向平行折叠、朝内的疏水面和朝外的亲水面所形成的β-折叠;两个片段包含在亲水性和疏水性之间交替的至少五个氨基酸。
2.根据权利要求1所述的用途,其中个体中血管生成相关的病症选自:肿瘤生长、动脉粥样硬化、糖尿病性视网膜病、衰老相关的黄斑病以及晶状体后纤维组织形成。
3.根据权利要求1所述的用途,其中修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域选自:序列Id No.3、序列Id No.6、序列Id No.9、序列Id No.10及序列Id No.11。
4.根据权利要求1所述的用途,其中抗血管生成药剂诱导哺乳动物的细胞凋亡。
5.根据权利要求1所述的用途,其中抗血管生成药剂诱导内皮细胞的细胞凋亡。
6.修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域,其中修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域具有选自下列的氨基酸:序列Id No.3、序列Id No.6、序列Id No.9、序列Id No.10及序列IdNo.11。
7.根据权利要求6所述的修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域,还包含聚乙二醇(PEG)部分。
8.根据权利要求6所述的修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域,还包含聚糖部分。
9.一种包含权利要求6所述的修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域的药物组合物。
10.一种编码权利要求6所述的修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域的核酸。
11.一种制备包含修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域的氨基酸片段的抗血管生成多肽的方法,包括将编码权利要求6所述的修饰的人类或小鼠CD2多肽第一结构域的核酸在酵母中进行表达,表达过程中抗血管生成药剂被糖基化。
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