CN108148117A - 一种抗菌肽的蛋白质结构特性及其研究方法 - Google Patents

一种抗菌肽的蛋白质结构特性及其研究方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗菌肽的蛋白质结构特性及其研究方法,包括抗菌肽的分布及特性、抗菌肽抗细菌作用机制,抗菌肽的天然抗菌肽是一类由基因编码或者经大分子蛋白质水解产生的多肽,其中所有由基因编码的抗菌肽都来源于一段包含信号序列的前体,经过翻译后修饰如蛋白酶水解、糖基化、氨基酸异构化等过程得到具有生物学活性的抗菌肽,蛋白聚集受众多因素影响,其单体构象、聚集动力学和所形成聚集体的形态结构可因环境条件的微小改变而产生显著差异,而不同形式的蛋白单体和聚集体可能表现出不同的功能和抗原性,随着人们对抗菌肽的结构和作用机制了解的深入,抗菌肽最终会给人类生活带来深远影响,在畜牧业、养殖业和食品加工业等行业发挥重要作用。

Description

一种抗菌肽的蛋白质结构特性及其研究方法
技术领域
本发明涉及抗菌肽的研究技术领域,具体为一种抗菌肽的蛋白质结构特性及其研究方法。
背景技术
疟疾是世界上最严重的传染性疾病之一,每年感染上亿人并造成几百万人死亡,对它的防治是全球卫生健康的重大课题。虽然疟原虫裂殖子表面蛋白MSP2被认为在疟原虫附着和入侵红细胞的过程中扮演重要角色,其重组蛋白也已被证明具有成为高效抗疟疾疫苗组分的潜能,但其在体内的功能机制都还不清楚。对重组MSP2的体外研究表明,它是天然无序蛋白,在生理条件下易于聚集形成淀粉样纤维,但在某些类膜环境下其构象和聚集状态都受到改变;而有证据表明,MSP2在体内裂殖子表面以多聚体形式存在。对MSP2在更接近天然的膜环境下的结构和聚集的研究将有助于揭示其生理功能及作用机制,并可为开发更高效的基于MSP2的疟疾防治手段提供线索。本项目以前期在水溶液和某些模拟膜环境下的研究成果为基础,拟在类天然膜环境下对MSP2尤其是其N端保守区段的结构与聚集进行研究,以期阐明MSP2在体内的真实状态和行为机制,并为据此研发相应的药物或疫苗打下基础。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛋白聚集受众多因素影响,其单体构象、聚集动力学和所形成聚集体的形态结构可因环境条件的微小改变而产生显著差异,而不同形式的蛋白单体和聚集体可能表现出不同的功能和抗原性,随着人们对抗菌肽的结构和作用机制了解的深入,抗菌肽最终会给人类生活带来深远影响,在畜牧业、养殖业和食品加工业等行业发挥重要作用的一种抗菌肽的蛋白质结构特性及其研究方法,以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的,本发明提供如下技术方案:一种抗菌肽的蛋白质结构特性,包括抗菌肽的分布及特性、抗菌肽抗细菌作用机制,所述抗菌肽的分布及特性上包括抗菌肽的结构形式、抗菌肽的结构特性,所述抗菌肽抗细菌作用机制上包括抗菌肽与细菌细胞壁的作用、抗菌肽对细胞膜的选择性、抗菌肽的细胞膜作用模型、抗菌肽胞内作用机制。
优选的,所述抗菌肽的结构形式中带有正电荷,总静电量+2到+9之间,序列中富含Lys、Arg及疏水性氨基酸残基,线性阳离子α-螺旋抗菌肽已报道的抗菌,富含特定氨基酸的阳离子抗菌肽中富含的氨基酸Pro、Arg、Phe、Gly、Trp和His,所述Pro来源于昆虫的含有18到20个氨基酸残基的小分子抗菌肽,菌肽的氨基酸残基数≤40。
优选的,所述抗菌肽的结构特性抗菌肽至少含有一个PRP单元,所述抗菌肽的结构特性中包括抗菌肽和抗脂多糖因子,其中penaeidins是一种嵌合型阳离子抗菌肽,N末端含PRP序列,C末端富含Cys,富含Gly的抗菌肽其氨基酸序列中Gly占47%,一级序列中含有重复基序GGGFH(R/S)。
优选的,所述抗菌肽与细菌细胞壁革兰氏阳性细菌中,细胞膜外分布有由数层层叠在一起的肽聚糖层及纵向插入肽聚糖层的磷壁酸所构成的细胞壁,革兰氏阴性细菌中,只有一层肽聚糖包裹着细胞膜,肽聚糖层外还有一层富含脂多糖的外脂膜。
优选的,所述抗菌肽的细胞膜中PE在革兰氏阴性菌大肠杆菌细胞膜磷脂中占主要成分,另外还有PG和CL,革兰氏阳性菌巨大芽胞杆菌的磷脂包含PE、PG和CL,还有少量的糖基化PG。
优选的,所述抗菌肽的细胞膜作用模型包括桶板模型、毯式模型、环孔模型和凝聚模型。
优选的,一种抗菌肽的蛋白质结构特性的研究方法,包括以下步骤:
A、显微学方法,在显微学方法中共聚焦激光扫描显微镜通过一种或者多种荧光探针标记后,可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究,能够完成高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测;
B、基于磷脂膜模型体系的研究方法中磷脂双层由表面活性剂缔合成的胶体大小的聚集体质点微粒,胶束开始明显形成时溶液中表面活性剂的最低浓度称为临界胶束浓度,在浓度接近CMC的缔合胶体中,胶束有相近的缔合数并呈球形结构,随着表面活性剂浓度的不断增加,胶束的大小或缔合数增多,不再持球形而成为圆柱形乃至板形;
C、采用核磁共振方法,在核磁共振方法中将脂质双分子层置于液晶环境中,磷脂尾巴能够自由运动,与生物膜体系中的磷脂运动方式类似,更接近于生理条件,一维31P核磁共振技术是研究抗菌肽与磷脂膜相互作用快速有效的方法,磷脂分子中含有31P原子,31P原子核的自旋量子数为1/2,天然丰度为100%;
D、圆二色谱可以观察抗菌肽在脂质双分子层膜中的取向和二级结构,通过CD观察到抗菌肽在溶液环境中和大部分有机试剂中为无序构象。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明中,蛋白聚集受众多因素影响,其单体构象、聚集动力学和所形成聚集体的形态结构可因环境条件的微小改变而产生显著差异,而不同形式的蛋白单体和聚集体可能表现出不同的功能和抗原性,随着人们对抗菌肽的结构和作用机制了解的深入,抗菌肽最终会给人类生活带来深远影响,在畜牧业、养殖业和食品加工业等行业发挥重要作用。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种技术方案:一种抗菌肽的蛋白质结构特性,包括抗菌肽的分布及特性、抗菌肽抗细菌作用机制,抗菌肽的分布及特性上包括抗菌肽的结构形式、抗菌肽的结构特性,所述抗菌肽抗细菌作用机制上包括抗菌肽与细菌细胞壁的作用、抗菌肽对细胞膜的选择性、抗菌肽的细胞膜作用模型、抗菌肽胞内作用机制。
抗菌肽的结构形式中带有正电荷,总静电量+2到+9之间,序列中富含Lys、Arg及疏水性氨基酸残基,线性阳离子α-螺旋抗菌肽已报道的抗菌,富含特定氨基酸的阳离子抗菌肽中富含的氨基酸Pro、Arg、Phe、Gly、Trp和His,所述Pro来源于昆虫的含有18到20个氨基酸残基的小分子抗菌肽,菌肽的氨基酸残基数≤40,易于通过化学合成的方法获得;富含疏水性和碱性氨基酸,不含Cys有些含有铰链区等,最早发现的动物抗菌肽天蚕素就属于这一类型。有研究者发现线性阳离子α-螺旋抗菌肽HP(2-20)的抗菌活性具有力学机制,表现在结构刚性越强其抗菌活性也随之增强,为设计新一类抗菌肽提供了强有力的线索,这类抗菌肽来源于鱼类和天蚕素抗菌肽类似物CF17)还能够调节鳟鱼巨噬细胞中的炎症应答,在鱼类疫苗免疫佐剂方面有潜在的应用价值。
抗菌肽的结构特性抗菌肽至少含有一个PRP单元,所述抗菌肽的结构特性中包括抗菌肽和抗脂多糖因子,其中penaeidins是一种嵌合型阳离子抗菌肽,N末端含PRP序列,C末端富含Cys,富含Gly的抗菌肽其氨基酸序列中Gly占47%,一级序列中含有重复基序GGGFH(R/S),抗菌肽作为宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防线,能够对目标细胞产生特异性毒性,在此过程中,抗菌肽的活性与其结构和物理化学特性密切相关。
本发明中,抗菌肽与细菌细胞壁革兰氏阳性细菌中,细胞膜外分布有由数层层叠在一起的肽聚糖层及纵向插入肽聚糖层的磷壁酸所构成的细胞壁,革兰氏阴性细菌中,只有一层肽聚糖包裹着细胞膜,肽聚糖层外还有一层富含脂多糖的外脂膜。
抗菌肽的细胞膜中PE在革兰氏阴性菌大肠杆菌细胞膜磷脂中占主要成分(70-80%),另外还有PG(15-20%)和CL5%,革兰氏阳性菌巨大芽胞杆菌的磷脂包含PE(35%)、PG(48%)和CL(11%),还有少量的糖基化PG(6%),细菌细胞质膜电负性较高,含有阴离子磷脂PG和CL,而这两种磷脂在哺乳动物细胞膜中含量很低或几乎没有,人红细胞膜富含PC、PE和SM,而其它哺乳物细胞膜中含有的PE较少,SM含量却相对较高。
抗菌肽的细胞膜作用模型包括桶板模型、毯式模型、环孔模型和凝聚模型。
抗菌肽胞内作用机制包括完成其胞内攻击作用,与微生物的核酸物质结合、阻断DNA的复制及转录、阻碍细胞分裂、抑制细胞内蛋白酶的活性。
蛋白聚集受众多因素影响,其单体构象、聚集动力学和所形成聚集体的形态结构可因环境条件的微小改变而产生显著差异,而不同形式的蛋白单体和聚集体可能表现出不同的功能和抗原性,随着人们对抗菌肽的结构和作用机制了解的深入,抗菌肽最终会给人类生活带来深远影响,在畜牧业、养殖业和食品加工业等行业发挥重要作用。
一种抗菌肽的蛋白质结构特性的研究方法,包括以下步骤:
A、显微学方法,在显微学方法中共聚焦激光扫描显微镜通过一种或者多种荧光探针标记后,可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究,能够完成高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测;
B、基于磷脂膜模型体系的研究方法中磷脂双层由表面活性剂缔合成的胶体大小的聚集体质点微粒,胶束开始明显形成时溶液中表面活性剂的最低浓度称为临界胶束浓度,在浓度接近CMC的缔合胶体中,胶束有相近的缔合数并呈球形结构,随着表面活性剂浓度的不断增加,胶束的大小或缔合数增多,不再持球形而成为圆柱形乃至板形;
C、采用核磁共振方法,在核磁共振方法中将脂质双分子层置于液晶环境中,磷脂尾巴能够自由运动,与生物膜体系中的磷脂运动方式类似,更接近于生理条件,一维31P核磁共振技术是研究抗菌肽与磷脂膜相互作用快速有效的方法,磷脂分子中含有31P原子,31P原子核的自旋量子数为1/2,天然丰度为100%;
D、圆二色谱可以观察抗菌肽在脂质双分子层膜中的取向和二级结构,通过CD观察到抗菌肽在溶液环境中和大部分有机试剂中为无序构象
本发明中,蛋白聚集受众多因素影响,其单体构象、聚集动力学和所形成聚集体的形态结构可因环境条件的微小改变而产生显著差异,而不同形式的蛋白单体和聚集体可能表现出不同的功能和抗原性,随着人们对抗菌肽的结构和作用机制了解的深入,抗菌肽最终会给人类生活带来深远影响,在畜牧业、养殖业和食品加工业等行业发挥重要作用。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例,对于本领域的普通技术人员而言,可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型,本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (7)

1.一种抗菌肽的蛋白质结构特性,包括抗菌肽的分布及特性、抗菌肽抗细菌作用机制,其特征在于:所述抗菌肽的分布及特性上包括抗菌肽的结构形式、抗菌肽的结构特性,所述抗菌肽抗细菌作用机制上包括抗菌肽与细菌细胞壁的作用、抗菌肽对细胞膜的选择性、抗菌肽的细胞膜作用模型、抗菌肽胞内作用机制。
2.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的蛋白质结构特性,其特征在于:所述抗菌肽的结构形式中带有正电荷,总静电量+2到+9之间,序列中富含Lys、Arg及疏水性氨基酸残基,线性阳离子α-螺旋抗菌肽已报道的抗菌,富含特定氨基酸的阳离子抗菌肽中富含的氨基酸Pro、Arg、Phe、Gly、Trp和His,所述Pro来源于昆虫的含有18到20个氨基酸残基的小分子抗菌肽,菌肽的氨基酸残基数≤40。
3.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的蛋白质结构特性,其特征在于:所述抗菌肽的结构特性抗菌肽至少含有一个PRP单元,所述抗菌肽的结构特性中包括抗菌肽和抗脂多糖因子,其中penaeidins是一种嵌合型阳离子抗菌肽,N末端含PRP序列,C末端富含Cys,富含Gly的抗菌肽其氨基酸序列中Gly占47%,一级序列中含有重复基序GGGFH(R/S)。
4.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的蛋白质结构特性,其特征在于:所述抗菌肽与细菌细胞壁革兰氏阳性细菌中,细胞膜外分布有由数层层叠在一起的肽聚糖层及纵向插入肽聚糖层的磷壁酸所构成的细胞壁,革兰氏阴性细菌中,只有一层肽聚糖包裹着细胞膜,肽聚糖层外还有一层富含脂多糖的外脂膜。
5.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的蛋白质结构特性,其特征在于:所述抗菌肽的细胞膜中PE在革兰氏阴性菌大肠杆菌细胞膜磷脂中占主要成分,另外还有PG和CL,革兰氏阳性菌巨大芽胞杆菌的磷脂包含PE、PG和CL,还有少量的糖基化PG。
6.根据权利要求1所述的一种抗菌肽的蛋白质结构特性,其特征在于:所述抗菌肽的细胞膜作用模型包括桶板模型、毯式模型、环孔模型和凝聚模型。
7.实现权利要求1所述的一种抗菌肽的蛋白质结构特性的研究方法,其特征在于:其研究方法包括以下步骤:
A、显微学方法,在显微学方法中共聚焦激光扫描显微镜通过一种或者多种荧光探针标记后,可对固定的组织或活体样本进行亚细胞水平结构功能研究,能够完成高空间分辨率、非介入无损伤连续光学切片、三维图像、实时动态等细胞结构和功能的分析检测;
B、基于磷脂膜模型体系的研究方法中磷脂双层由表面活性剂缔合成的胶体大小的聚集体质点微粒,胶束开始明显形成时溶液中表面活性剂的最低浓度称为临界胶束浓度,在浓度接近CMC的缔合胶体中,胶束有相近的缔合数并呈球形结构,随着表面活性剂浓度的不断增加,胶束的大小或缔合数增多,不再持球形而成为圆柱形乃至板形;
C、采用核磁共振方法,在核磁共振方法中将脂质双分子层置于液晶环境中,磷脂尾巴能够自由运动,与生物膜体系中的磷脂运动方式类似,更接近于生理条件,一维31P核磁共振技术是研究抗菌肽与磷脂膜相互作用快速有效的方法,磷脂分子中含有31P原子,31P原子核的自旋量子数为1/2,天然丰度为100%;
D、圆二色谱可以观察抗菌肽在脂质双分子层膜中的取向和二级结构,通过CD观察到抗菌肽在溶液环境中和大部分有机试剂中为无序构象。
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