CN102993178A - 具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物、制备方法及用途，所述化合物结构如式（I）或（II）所示：

Description

具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物、制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物、制备方法及用途。

背景技术

心脑血管疾病已经成为人类的第一杀手，严重威胁着人们的生命安全和生活质量。研究发现，激活的Rho激酶能够导致血管收缩，血压上升，供血量降低，Rho激酶是治疗心脑血管疾病的重要靶点之一。抑制Rho激酶的激活能有效缓解心肌缺血/再灌注损伤，高血压，脑卒中。另外，有证据表明抑制Rho激酶在体内的激活还具有促进神经突触生长，促进损伤后的神经功能恢复的效果，可以治疗和缓解脊髓损伤，阿尔茨海默病，神经炎症脊髓脱鞘等中枢神经性疾病。除此之外，肿瘤的浸润和迁移也依赖于Rho激酶的激活，抑制Rho激酶的激活还能抑制肿瘤的转移。综上所述，高效选择性的抑制Rho激酶的激活是十分重要的。

能抑制Rho激酶激活的化合物被称之为Rho激酶抑制剂。Rho激酶(Rho associatedcoil-coiled forming protein kinase，ROCK)有两个亚型，即ROCK1和ROCK2，它们都是丝氨酸/苏氨酸激酶。ROCK1与ROCK2广泛分布于机体的大部分器官中，ROCK2主要存在于大脑中，而ROCK1在非神经系统的器官中表达较高，如心脏，肺，骨骼肌等。Rho激酶对细胞的分裂，收缩，粘附，迁移，分泌等活动具有重要的调节作用，如平滑肌收缩，细胞骨架重构，细胞迁移和增殖及神经元的形成和轴突的生长等。

时至今日，见诸报道的Rho激酶抑制剂主要有异喹啉类，吲哚类，酰胺及脲类和4-氨基吡啶类。属于异喹啉类的HA-1077（又名法舒地尔）作为一种新型的高效血管扩张药，能够有效缓解脑血管痉挛，改善蛛网膜下隙出血(SAH)患者的预后。日本于1995年正式批准其进入临床，防治慢性缺血性脑血管痉挛，是目前为止唯一上市的Rho激酶抑制剂，具有广阔的应用前景。

但在法舒地尔的使用过程中，人们发现其在体内代谢快，而且不易透过血脑屏障。为此本发明在设计、合成并生测了一系列异喹啉类化合物后筛选得到了两个对Rho激酶抑制活性更强，毒副作用更低，具有一定的成药前景。

发明内容

本发明的首要目的是为了克服现有法舒地尔在体内代谢快，不易透过血脑屏障的不足，提供具有Rho激酶抑制活性高而毒副作用低的异喹啉类化合物。

本发明的第二个目的是提供具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物的制备方法。

本发明的第三个目的是提供具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物的用途。

本发明的技术方案概述如下：

具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物，用式（I）或（II）表示：

化合物（I）的制备方法，包括如下步骤：

在冰浴下，将L-脯氨醇与5-氯磺酰基异喹啉反应，生成具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物（I）。

化合物（II）的制备方法，包括如下步骤：

（1）在冰浴下，将L-脯氨醇与5-氯磺酰基异喹啉反应，生成具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物（I）；

（2）将化合物（I）溶解在二氯亚砜中，于60℃反应7小时，得到具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物（II）。

化合物（I）或化合物（II）在制备抑制Rho激酶活性药物中的用途。

本发明所制备的具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物活性好，对靶点的作用更强，细胞再生和突触形成能力强，对细胞活性中成活率高，在细胞凋亡测试中死亡率低，且一氧化氮毒性测试较低，具有非常好成药前景。

附图说明

图1为Rho激酶抑制剂活性的测定。

图2为细胞再生和突触形成能力的测试（BV2细胞）。

图3为突触形成能力测试（BV2细胞）。

图4为细胞再生和突触形成能力测试（原代神经元细胞）。

图5为细胞活性测试。

图6为细胞凋亡测试。

图7为一氧化氮浓度测试。

具体实施方式

本实验设计、合成并检测了9个异喹啉类化合物，筛选得到了两个对Rho激酶抑制活性更强，毒副作用更低，具有一定的成药前景。

下面将这九个化合物的合成过程一一列出：

实施例1  5-(4-苄基-1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰基)异喹啉（1号化合物）的合成

将法舒地尔盐酸盐（1.00g，2.74mmol）溶于10mL水中，加入溶有碳酸钾（0.68g，4.93mmol）的5mL水溶液，混合均匀后，得到浅黄色溶液，再用CH₂Cl₂萃取（50mL×2），合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后，和三乙胺（0.33g，3.30mmol）共同溶于50mLCH₂Cl₂中，然后向其中加入苄氯（0.42g，3.29mmol），室温下搅拌，反应30h。减压蒸去CH₂Cl₂，柱层析[V（石油醚）：V（乙酸乙酯）=1:3]分离得到0.40g黄色油状物，收率38.1%。

所得化合物化学位移值如下：

¹H-NMR（500MHz，CDCl₃）δ：1.80～1.85（m，2H），2.65～2.68（m，4H），3.47～3.51（m，4H），3.59（s，2H），7.20～7.29（m，5H），7.65～7.68（m，1H），8.16（d，J＝9.0Hz，1H），8.33（d，J＝7.5Hz，1H），8.45（d，J＝6.0Hz，1H），8.66（d，J＝6.0Hz，1H），9.33（s，1H）。

实施例2  5-(4-甲氧羰乙基-1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰基)异喹啉（2号化合物）的合成

将法舒地尔盐酸盐（2.00g，5.49mmol）溶于10mL水中，加入溶有碳酸钾（1.36g，9.86mmol）的5mL水溶液，混合均匀后，得到浅黄色溶液，再用CH₂Cl₂萃取（50mL×2），合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后，溶于50mL CH₂Cl₂中，然后向其中加入丙烯酸甲酯（1.42g，16.47mmol），室温下搅拌，反应30h。减压蒸去CH₂Cl₂，柱层析（纯乙酸乙酯）分离得到1.65g浅黄色油状物，收率79.6%。

所得化合物化学位移值如下：¹H-NMR（500MHz，CDCl₃）δ：1.78～1.82（m，2H），2.65～2.68（m，4H），3.32，（s，2H），3.47～3.51（m，4H），3.68（s，3H），7.20～7.29（m，5H），7.65～7.68（m，1H），8.16（d，J＝9.0Hz，1H），8.33（d，J＝7.5Hz，1H），8.45（d，J＝6.0Hz，1H），8.66（d，J＝6.0Hz，1H），9.33（s，1H）。

实施例3  5-(邻氯苄基-1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰基)异喹啉（3号化合物）的合成

将法舒地尔盐酸盐（2.00g，5.49mmol）溶于10mL水中，加入溶有碳酸钾（1.36g，9.86mmol）的5mL水溶液，混合均匀后，得到浅黄色溶液，再用CH₂Cl₂萃取（50mL×2），合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后，和三乙胺（0.66g，6.59mmol）共同溶于50mLCH₂Cl₂中，然后向其中加入邻氯苄基氯（2.66g，16.47mmol），室温下搅拌，反应30h。减压蒸去CH₂Cl₂，柱层析（纯乙酸乙酯）分离得到1.94g浅黄色油状物，收率85.1%。

所得化合物化学位移值如下：

¹H-NMR（500MHz，CDCl₃）δ：1.81～1.85（m，2H），2.66～2.69（m，4H），3.50～3.53（m，4H），3.59（s，2H），7.23～7.27（m，4H），7.65～7.68（m，1H），8.18（d，J＝9.0Hz，1H），8.36（d，J＝7.5Hz，1H），8.45（d，J=6.0Hz，1H），8.66（d，J=6.0Hz，1H），9.36（s，1H）。

实施例4  5-(对氯苄基-1,4-二氮环杂庚烷-1-磺酰基)异喹啉（4号化合物）的合成

将法舒地尔盐酸盐（1.00g，2.74mmol）溶于10mL水中，加入溶有碳酸钾（0.68g，4.93mmol）的5mL水溶液，混合均匀后，得到浅黄色溶液，再用CH₂Cl₂萃取（50mL×2），合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后，和三乙胺（0.33g，3.29mmol）共同溶于50mLCH₂Cl₂中，然后向其中加入对氯苄基氯（1.33g，8.23mmol），室温下搅拌，反应30h。减压蒸去CH₂Cl₂，柱层析（纯乙酸乙酯）分离得到0.70g黄色油状物，收率61.4%。

所得化合物化学位移值如下：

¹H-NMR（500MHz，CDCl₃）δ：1.81～1.86（m，2H），2.65～2.68（m，4H），3.47～3.52（m，4H），3.56（s，2H），7.17～7.18（m，2H），7.24～7.27（m，2H）7.67～7.70（m，1H），8.19（d，J＝8.0Hz，1H），8.33～8.35（m，1H），8.45（d，J＝7.5Hz，1H），8.68（d，J＝6.0Hz，1H），9.35（s，1H）。

实施例5  5-(N-(2,2,6,6-四甲基哌啶-4-)-1-磺酰基)异喹啉（5号化合物）的合成

取异喹啉-5-磺酰氯的盐酸盐（1.00g，3.79mmol），溶于50mL水中，搅拌下滴加饱和碳酸氢钠溶液，调节pH=5~6，用CH₂Cl₂萃取（50mL×2），合并有机相，无水硫酸钠干燥，浓缩至50mL，然后向其中加入含有2，2，6，6-四甲基哌啶胺（1.17g，7.576mmol）的CH₂Cl₂溶液20mL，于室温下搅拌反应4h，减压蒸馏除去CH₂Cl₂，柱层析[V（甲醇）：V（乙酸乙酯）=1:1]分离，得淡黄色油状物0.23g，收率17.4%。

所得化合物化学位移值如下：

¹H-NMR（500MHz，CDCl₃）δ：0.97（s，6H），1.03（s，6H），1.24～1.28（m，2H），1.54～1.58（m，2H），3.47～3.62（m，1H），5.10（s，1H），7.70～7.73（m，1H），8.22（d，J＝10.0Hz，1H），8.44（d，J＝6.0Hz，1H），8.48～8.50（m，1H），8.68（d，J＝6.0Hz，1H），9.38（s，1H）。

实施例6  5-(4-羟乙基-1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰基)异喹啉（6号化合物）的合成

将法舒地尔盐酸盐（1.00g，2.74mmol）溶于10mL水中，加入溶有碳酸钾（0.68g，4.93mmol）的5mL水溶液，混合均匀后，得到浅黄色溶液，再用CH₂Cl₂萃取（50mL×2），合并有机相，无水硫酸镁干燥，过滤，减压浓缩后，和三乙胺（0.33g，3.29mmol）共同溶于50mLCH₂Cl₂中，然后向其中加入溴乙醇（0.90g，8.23mmol），室温下搅拌，反应30h。减压蒸去CH₂Cl₂，柱层析（纯乙酸乙酯）分离得到0.57g黄色油状物，收率65.1%。

¹H-NMR（500MHz，CDCl₃）δ：1.81～1.86（m，2H），2.61(t，J₁=6.0HZ，J₂=6.0Hz，2H)，2.65～2.68（m，4H），3.47～3.51（m，4H），3.59（m，2H），7.65～7.68（m，1H），8.17（d，J＝9.0Hz，1H），8.34（d，J＝7.5Hz，1H），8.45（d，J＝6.0Hz，1H），8.66（d，J＝6.0Hz，1H），9.33（s，1H）。

实施例7  5-(1-苄基氨基-1,4-二氮杂环庚烷-1-磺酰基)异喹啉（7号化合物）的合成

取Cbz保护的法舒地尔氮氧化物（2.00g，4.53mmol），溶于30mLCH₂Cl₂中，于冰浴下，滴加三氯氧磷5mL，回流反应7h，将反应液倾入含冰水的25%NaOH溶液，剧烈搅拌，并用5%的NaOH溶液调节溶液至pH=10，分出CH₂Cl₂相，水相用CH₂Cl₂萃取（50mL×2），合并有机相，干燥，过滤，减压蒸馏后得到深黄色黏稠液，柱层析[V（石油醚）：V（乙酸乙酯）=1:1]分离得到，白色固体1.47g，收率70.7%。

将上述白色固体（1.00g，2.17mmol）溶入15mL苄胺中，然后于70℃反应3h，加入大量水，然后1MHCl调pH=7，乙酸乙酯萃取，干燥，过滤，减压蒸去乙酸乙酯，得到淡绿色油状物1.00g，收率87.0%。

取上述淡绿色油状物（1.00g，1.89mmol）溶于50mL乙酸乙酯中，然后加入0.20g钯碳催化剂，室温搅拌反应24h，蒸出乙酸乙酯，柱层析[V（石油醚）：V（乙酸乙酯）=1:3]得淡绿色油状物0.41g，收率56.9%。

所得化合物化学位移值如下：

¹H-NMR（500MHz，CDCl₃）δ：1.99～2.04（m，2H），3.25～3.28（m，4H），3.43（t，J₁=6.0Hz，J₂=6.0Hz，2H），3.62（t，J₁=6.0Hz，J₂=6.0Hz，2H），4.75（s，2H），7.26～7.32（m，5H）,7.47（d，J＝7.5Hz，1H），7.59（d，J＝8.5Hz，1H），7.72～7.75（m，1H），8.29～8.30（m，1H），8.50（d，J＝6.0Hz，1H）。

实施例8  5-(2-羟甲基-吡咯烷-1-磺酰基)-异喹啉（8号化合物，即化合物（I））的合成

（1）将5-磺酸异喹啉的硫酸盐（10.00g，32.60mmol）溶于氯化亚砜（75.00g，630mmol）中，同时滴加N,N-二甲基甲酰胺（10mL），机械搅拌，于60℃反应5h。蒸馏除去多余的氯化亚砜，然后加入CH₂Cl₂（200mL），析出大量晶体，过滤，滤饼用CH₂Cl₂洗涤，真空常温干燥，得9.60g白色粉末5-氯磺酰基异喹啉盐酸盐，收率为90.5%。

（2）将上述白色粉末（2.00g，7.60mmol）加入冰水（25mL）中，搅拌下用饱和碳酸氢钠溶液调节pH值为5-6，CH₂Cl₂萃取（50mL×2），合并有机相，无水硫酸钠干燥，过滤，滤液浓缩至50mL备用（5-氯磺酰基异喹啉）。

（3）将L-脯氨醇（0.92g，9.10mmol）溶于CH₂Cl₂（50mL），于0~5℃下向其中滴加步骤（2）获得的溶液，加毕室温反应2h。蒸干CH₂Cl₂，用乙酸乙酯和水加入剩余物，分出有机相，浓缩，得2.12g浅黄色油状物。收率为95.9%，HPLC纯度>99%。

所得化合物化学位移值如下：

¹HNMR(400MHz，CDCl₃)δ：9.42(s，1H)，8.74(s，2H)，8.49(d，J＝7.3Hz，1H)，8.29(d，J＝8.1Hz，1H)，7.78(t，J＝7.8Hz，1H)，3.97~3.82(m，1H)，3.71(q，J₁=11.4，J₂=4.9Hz，2H)，3.56~3.32(m，2H)，1.99~1.70(m，3H)，1.66~1.51(m，1H)。

其结构式为：

化合物（I）

实施例9  5-(2-氯甲基-吡咯烷-1-磺酰基)-异喹啉（9号化合物，即化合物（II））的合成

将化合物（I）（1.60g，5.50mmol）直接溶解在25mL二氯亚砜中，于60℃反应7小时，然后减压蒸去过量的二氯亚砜，加入50mL水，饱和NaHCO₃溶液调节pH=6.0，二氯甲烷萃取（50mL×3），合并有机相，干燥，过滤，减压蒸去溶剂，柱层析分离后得淡黄色油状物1.20g，收率为70.6%，HPLC>98%。

所得化合物化学位移值如下：

¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ：9.45(s，1H)，8.93(d，J=5.8Hz，1H)，8.72(s，1H)，8.61(d，J=7.3Hz，2H)，7.92(t，J=7.4Hz，1H)，4.14(s，1H)，3.78(d，J＝11.0Hz，1H)，3.66~3.50(m，H)，3.40(d，J=16.5Hz，2H)，1.99~1.70(m，3H)，1.66~1.51(m，1H)。

其结构式为：

化合物（II）

HPLC条件：

用十八硅烷胶为填充剂：0.20g磷酸二氢钠加入500mL蒸馏水，滴入2滴磷酸，控制pH=3.0）为缓冲盐；甲醇：缓冲盐=7:3为流动相，检测波长为274nm，流速为1.0mL/min，理论塔板数应按法舒地尔衍生物算不超过4000。

(1)分别实施例1-9制备的产品适量，用甲醇稀释，配制成0.2mg/mL样品溶液，取20ul注入进样，在上述HPLC条件下进行检测。

(2)分析结果：实施例1-9制备的产品液相谱图所示：各产品含量均大于99%。

将实施例1-9制备的产品用于Rho激酶抑制活性，细胞凋亡以及突触再生的测试，化合物的结构如下所示。实施例的顺序与化合物的顺序一一对应。

实施例10生物活性测试

10.1Rho激酶抑制剂活性的测试

小胶质细胞BV2作为中枢神经系统内的免疫细胞，既可通过吞噬脑组织中的病原体及有害颗粒对神经元起保护作用，又可在致炎因子的作用下，激活成反应性小胶质细胞，分泌炎性细胞因子对神经元起毒性作用，是治疗神经炎症及神经退行性疾病的一个重要靶点。通过BV2小胶质细胞分别与法舒地尔、实施例1-9制备的产品作用24小时后细胞培养上清液Rho激酶活性测定，其结果如图1所示。

PBS处理的BV2小胶质细胞样品相比较，除了3，7号化合物对Rho激酶没有抑制活性以外，其他化合物都能表现出一定的Rho激酶抑制活性，其中以6，8，9号化合物最优。

10.2细胞再生和突触形成能力的测试

图2为BV2小胶质细胞分别与法舒地尔、实施例1-9制备的产品作用48小时后细胞固定洗涤后显微镜记录图像。PBS处理的BV2胶质细胞对比，法舒地尔，8号化合物和9号化合物具有明显的细胞再生和突触形成能力，1，2，6号化合物次之。和法舒地尔进行对比，8号化合物和9号化合物，具有比法舒地尔更强的细胞再生和突触形成能力。

图3为BV2小胶质细胞分别与法舒地尔、实施例1-9制备的产品作用后24小时培养状态下突触形成情况。比较PBS处理，法舒地尔和显示明显的突触形成能力。2和6化合物次之。

图4是原代培养神经元分别与法舒地尔、实施例1-9制备的产品作用48小时后细胞固定洗涤后，经单克隆抗神经元抗体染色显微镜记录图像。比较PBS处理，法舒地尔和8，9号化合物显示相同和明显的细胞再生和突触形成能力。2和6号化合物次之，其余化合物均较差。

综上，8和9号化合物具有明显的细胞再生和突触形成能力。2和6号化合物次之。

10.3细胞活性和凋亡测试

为了测试细胞活性，采用BV2小胶质细胞通过MTT法测定，通过LDH测试细胞的凋亡。

MTT法，主要用于检测细胞存活和生长的方法。其作用的基本原理如下：活细胞线粒体中的脱氢酶能够还原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮[3-(4,5-dimethylthiazol-2yl)-2,5-diphenylterazolium bromide,MTT]为蓝紫色的不溶于水的甲臜，生成的甲臜能够沉积在活细胞中，而死细胞则无此功能。用二甲基亚砜将细胞中的甲臜溶解，用酶联免疫检测仪在490nm的波长下测定其吸光值（OD值），可以间接反映活细胞数量。

图6是BV2小胶质细胞分别与法舒地尔、实施例1-9制备的产品作用48小时后，细胞MTT测定结果。比较PBS处理，可以看出只有法舒地尔和8和9号化合物显示较好的细胞活性，而其他化合物都有明显的抑制细胞活性的作用。

LDH就是测试乳酸脱氢酶，LDH测试就是测定LDH的浓度。向纯化的LDH抗体中加入受试化合物，经过彻底洗涤后用底物四甲基联苯胺（TMB）显色，TMB在乳酸脱氢酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下最终转化成黄色，用酶标仪在450nm的波长下测定吸光值（OD值），颜色的深浅（OD值的大小）与样品中的LDH浓度正相关。

图7为BV2小胶质细胞分别与法舒地尔、实施例1-9制备的产品24小时后细胞培养上清液LDH测定结果。和PBS处理的结果对比，法舒地尔和8和9号化合物显示LDH释放较低，表明细胞死亡数较低，而2和6号化合物次之，而其他的化合物则有较强的细胞致死率。

8和9号化合物的MTT细胞活性没有降低，而且LDH的细胞凋亡数少，即对细胞的毒性而言，8和9号化合物较小，2和6号化合物次之。

10.4一氧化氮浓度测试

一氧化氮参与了缺血性脑血管疾病的发生发展等诸多环节，高浓度的NO可以直接杀伤神经细胞。图8所示为BV2小胶质细胞法分别与法舒地尔、实施例1-9制备的产品作用后24小时细胞培养上清液一氧化氮浓度测定的结果。比较PBS处理，法舒地尔和6，8，9号化合物均有明显的抑制效果；相比法舒地尔，6，8，9号化合物显示出比法舒地尔更强的抑制NO的效果。6，8，9号化合物显示出比法舒地尔更强的神经细胞保护作用。

8和9号化合物具有比法舒地尔更强的Rho激酶抑制活性，并且具有Rho激酶抑制活性，以及更低的副作用，而2和6号化合物次之。

Claims (4)

1.具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物，其结构如式（I）或（II）所示：

2.权利要求1的化合物（I）的制备方法，其特征包括如下步骤：

在冰浴下，将L-脯氨醇与5-氯磺酰基异喹啉反应，得到具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物（I）。

3.权利要求1的化合物（II）的制备方法，其特征包括如下步骤：

（1）在冰浴下，将L-脯氨醇与5-氯磺酰基异喹啉反应，生成具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物（I）；

（2）将化合物（I）溶解在二氯亚砜中，于60℃反应7小时，得到具有Rho激酶抑制活性的异喹啉类化合物（II）。

4.权利要求1中所述化合物在制备抑制Rho激酶药物的用途。

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