CN102985807A - 分析装置以及分析方法 - Google Patents

Abstract

在使用了分光单元和多检测器的流式细胞仪中，辅助进行实时的荧光强度测定前的最佳的波长频带设定。在信号处理单元中，存储测定校准试样而得到的多个波长频带的强度，计算、显示所述多个波长频带的每个波长频带的强度的分布。

Description

分析装置以及分析方法

技术领域

本发明涉及进行流量计中的离子（也包含细胞）的定量分析的流式粒子分析方法以及装置。特别涉及具有后分光单元和多通道光检测单元的流式粒子分析方法以及装置。

背景技术

在对流量计中的粒子进行定量分析的装置之一中包括流式细胞仪（flowcytometer）。流式细胞仪是在流量计中流过荧光标识的试样（细胞/粒子），对流量计照射激光来测定从试样发出的散射光或荧光的强度，根据光强度对试样的性质进行定量化的装置。为了通过对细胞表面或细胞内部的特定对象物进行标识来进行目标对象物的定量或者判别细胞的种类，而进行试样的荧光标识。通常，荧光标识不仅通过单染色进行，也通过多重染色进行。图15表示用于检测多重染色的现有的装置结构例。被荧光染色的试样610用鞘液（sheathsolution）620夹着在流量计610内形成将细胞（粒子）逐个排列成一列的试样的流。试样610通过激光650被激励，发生散射光和荧光。荧光通过分色镜660被分割，通过与各个荧光的种类对应的带通滤波器670作为各个荧光而被选择性地检测出。在检测器中使用PMT（Photo-Multiplier Tube：光电倍增管）680等。检测出的光通过电信号处理部640被变换为电信号（电压脉冲）后被数值化，通过专用软件690进行直方图等统计分析。但是，该现有装置中，在想要增加要分析的荧光色数时需要增设滤波器组和检测器，因此装置变得大型、昂贵，存在分色镜导致的荧光强度的衰减增大的问题。另外，在不增加荧光数而想要变更要分析的荧光色的情况下，也存在需要再购买与其匹配的滤波器组的问题。

另外，近年来广泛进行了可以测定钙等细胞内离子的浓度的使用了荧光染料的细胞功能分析。这些荧光染料，已知根据细胞的状态例如PH或温度，荧光的中心波长移位。但是，在上述的现有装置中，可以检测的荧光波长频带受到滤波器限制并且是断续的，因此存在难以检测荧光的中心波长（峰值波长）的移位的问题。

专利文献1、专利文献2公开了考虑到这些问题的装置结构。专利文献1与滴定板读取器（microtiter plate reader）相关，专利文献2与激光显微镜相关，都揭示代替现有装置的滤波器组而使用衍射光栅或棱镜等分光单元，代替各个PMT而使用多联PMT或CCD等多检测器的装置结构。通过该结构，滤波器的再购买或更换等作业减少，抑制了滤波器导致的荧光强度的衰减。另外，在进行多重染色测定的情况下，可以将检测波长频带设定为荧光串扰（crossover）的影响小的频带。而且，由于可以自由地设定检测幅度，因此也能够自由改变灵敏度。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特表2005-513497

专利文献2：日本特开2003-057555

发明内容

发明要解决的课题

图16示意性地表示3种荧光染料的荧光光谱和检测中使用的波长频带的关系。纵轴700表示荧光强度，横轴705表示波长。曲线710、720、730分别表示3种荧光染料1、2、3的光谱。在此例中，用椭圆包围的区域740中荧光染料3的光谱730具有小峰。现有方式的装置中，根据带通滤波器的特性，假定记号750表示的3个带状的区域为检测波长频带。在这种情况下，最短波长区域的检测波长带包含光谱710的峰、光谱730的小峰、光谱720的峰的左侧的下摆部分，因此可知对3种荧光染料的全部荧光检测出信号。即，3种荧光染料的荧光的分离精度变差。

与之相对，在使用分光器和多检测器的情况下，能够以一个检测器检测出的波长频带770为单位设定任意的频带。例如能够进行记号760表示的3个带状的区域那样的波长频带的设定。能够以仅包含光谱710的峰的方式设定最短波长侧的频带，与现有技术相比，能够以高精度分离各荧光染料的荧光。

但是，在成为使用了衍射光栅那样的分光单元和多检测器的装置结构的情况下，如图16所示，在测定试样前需要预先设定用于检测目标荧光的波长频带。

在专利文献1中公开了使用与试样相同的荧光标识的标准试样取得荧光光谱图像，用户选择重叠的影响少的波长频带的方法。但是，在实际进行试样的测定时，没有评价能够以怎样的精度将目标荧光强度与目标外的荧光强度分离的方法。因此，在应用于流式细胞仪的情况下，用户考虑到在实际试样的测定中再次重复波长频带设定等，实际试样测定中的作业负担变大。

在专利文献2中公开了首先不设定波长频带，而在通过激光显微镜取得图像后由用户选择最佳的波长频带的方法。该方法无法应用于需要实时地进行试样的荧光强度测定的流式细胞仪。

即，在使用了分光单元和多检测器的流式细胞仪中，在进行实时的荧光强度测定前，如何设定最佳的波长频带成为问题。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本分析系统的特征在于，具备：光源；使接收来自光源的光而发光的试样流过的流量计；对从试样发出的光进行分光的分光单元；具备针对每个不同波长检测从分光单元输出的光的多个检测器的检测部；对通过检测部检测出的光的信号进行信号处理的处理单元；接受对信号处理的指示输入的输入单元；存储信号处理的结果的存储部；以及显示处理的结果的输出部，存储部针对多个不同试样，按所述多个检测器的每个检测器存储检测出的光信号，针对该光信号，将多个检测器中的强度按每个不同试样显示到输出部，并且具有通过输入单元设定该多个检测器中的至少一个检测器检测出的波长频带的频带设定单元。

另外，作为分析方法，其特征在于，使用了光源、流过试样的流量计、对通过来自光源的光而从流过流量计的试样发出的光进行分光的分光单元、针对每个不同波长检测从分光单元输出的光的多个检测器、对通过检测器检测出的光信号进行处理的处理单元、数据的存储单元、进行向处理单元的输入的输入单元、输出处理结果的输出部。存储部，按多个检测器中的每个检测器存储针对流量计中流过的多个不同试样分别检测出的光信号。并且，上述分析方法具有以下过程：将多个检测器中的光信号的强度，按每个不同试样显示到输出部；通过输入单元设定多个检测器中的至少一个检测器检测的波长频带；将设定的波长频带存储在存储部中；通过检测器检测来自在流量计中流动的检体的光；以及使用设定的波长频带将检体的信号输出到输出部。

发明的效果

通过计算并显示校准试样的光谱，在设定测定时的频带时，能够进行考虑了自身荧光和峰值移位等的影响的恰当的频带的设定。

附图说明

图1是表示流式细胞仪的概要的图。

图2是表示流式细胞仪的测定的过程的流程图。

图3是表示荧光染料的荧光光谱的例子的示意图。

图4是示意地表示荧光染料发光时的信号强度的分布的图。

图5是表示测定通道决定辅助信息提示的详细的处理流程的图。

图6是表示实施测定通道决定辅助信息提示的装置的结构的图。

图7是表示校准试样的荧光光谱计算、显示处理的详细的处理流程的图。

图8是表示校准试样的荧光光谱显示画面的例子的图。

图9是表示波长频带的测定强度信息计算、显示处理的详细的处理流程的图。

图10是表示平均频带强度、标准偏差的显示画面的例子的图。

图11是表示测定精度评价信息计算、显示处理的详细的处理流程的图。

图12是说明分布的重叠的计算方法的图。

图13是说明分布的重叠的计算方法的图。

图14是表示测定精度评价信息的显示例的图。

图15是表示流式细胞仪的现有的装置结构例的图。

图16是表示使用分光器和多检测器的情况下的检测波长频带的设定例的图。

图17是表示显示频带强度分布的画面例的图。

图18是表示测定精度评价信息计算、显示处理的详细的处理流程的图。

图19是表示测定精度评价信息的显示例的图。

图20是说明校准试样的频带强度的、对其他校准试样的频带强度分布主轴的投影成分的计算方法的图。

图21是表示检体的测定的处理流程的图。

图22是表示荧光修正后、检体中粒子的频带强度分布的图。

具体实施方式

实施例1

以下，参照附图详细说明在流式细胞仪中应用的实施方式。

图1是表示流式细胞仪的概要的图。包含预先被荧光标识的测定对象粒子的液体（以下表现为检体）在流量计102中从图1的表面向里面的方向以一定的流速通过。对流量计102照射从激光光源101发出的激光。当对象粒子在流量计102中通过时，荧光染料通过激光被激励并发光。通过发光而产生的光通过分光单元103被分光为多个波长成分，分光后的光通过多个PMT被变换为电信号。从PMT104输出的电信号通过A/D变换器105被变换为数字信号并被输入信号处理单元106。在信号处理单元106中，基于针对各波长而测定的荧光的强度，进行检体中的粒子的分类、粒子的成分、性质的分析等。

分光单元103可由用于聚光的透镜和衍射光栅来构成。也可以代替衍射光栅而使用棱镜。另外，也可以由多个光学滤波器和分色镜构成。

作为信号处理单元，例如可以使用具备键盘、鼠标、显示器的个人计算机（PC）。但是，在使处理高速化的情况下，可以在PC中或者在PC和A/D变换器105之间设置高速运算用的板卡。另外，也可以不用PC而全部作为专用硬件来实现。在此，作为输出单元设想在PC的画面上显示，另外作为输入单元设想使用鼠标或键盘进行的针对画面上的显示的指示输入，但是，只要是能够输入输出的形态则不限于此。

接着，参照图2说明利用图1所示的流式细胞仪进行检体的测定时的处理流程。假定在测定中使用多个荧光染料，通过粒子发出的荧光进行粒子的分析。

进行测定的用户，首先在测定检体之前准备校准用试样（步骤S101）。所谓校准用的试样，是使用在测定中使用的多个荧光染料的每一种颜色标识过的试样。例如在使用A、B、C这3种染料的情况下，准备用A标识的试样、用B标识的试样、用C标识的试样这3种试样。作为校准试样，例如可以使用像预先标识那样进行了处理的微小的液珠，也可以使用作为测定对象的检体的一部分。

接着，测定校准试样的荧光光谱（步骤S102）。具体来说，在图1所示的流式细胞仪中流过校准试样，通过图1所示的各PMT将试样中的各粒子发出的荧光的强度变换为电信号，针对各个通道存储从A/D变换器输出的输出值。输出的值存储在信号处理装置（PC）106内的存储装置中。在此，假定PMT全部有16个。在这种情况下，针对各粒子得到16个数据，按照检测的粒子的量存储这些数据。以与校准试样的种类、即使用的荧光染料的种类的数量相同的次数进行以上测定。

在此，为了简化说明，如上所述设PMT全部有16个，通过各PMT测定的光的波长为λ1~λ16。另外，使用的染色染料的种类设为A、B两种。另外，假定荧光染料具有例如图3所示的光谱。

图3（A）是示意地表示荧光染料A的荧光光谱的图，图3（B）是示意地表示荧光染料B的荧光光谱的图。纵轴111表示荧光强度，横轴112表示波长。曲线113、114分别表示荧光染料A、B的荧光光谱。另外，横轴的λ1~λ16表示通过16个PMT测量的波长。

在将这两种荧光染料添加到要测定的检体后进行测定。通过测定检体中的粒子发出的荧光，推定A、B各自的荧光染料以怎样的量结合，进行粒子的性质的判别。在荧光染料A、B具有图3（A）、（B）所示的荧光光谱的情况下，例如波长λ3的荧光染料A的荧光强度非常强，荧光染料B的荧光几乎没有。反之，波长λ14的荧光染料B的荧光强度非常强，荧光染料A的荧光几乎没有。此时，当在检体的测定中使用波长λ3和λ14时，粒子的发光强度中λ3的强度表示荧光染料A的量，λ14的强度表示荧光染料B的量。即，通过测定波长λ3和λ14的强度，能够推定各粒子中的通过荧光染料A标识的物质和通过荧光染料B标识的物质的量。

但是，在使用图1所示的结构的装置的情况下，进入各PMT的光的波长频带非常狭窄，因此，进入一个一个的PMT的光量非常少。因此，各PMT的信号非常小，噪声增多。理想的情况下，当荧光染料A发光时仅波长λ3的强度显现，λ14的强度成为0。反之，当荧光染料B发光时，波长λ3的强度成为0，仅λ14的强度显现。但是，由于上述理由而产生噪声，因此，在仅荧光染料A发光时也显现λ14的强度，在仅荧光染料B发光时也显现λ3的强度。图4（A）示意地表示此时的信号强度的分布。横轴121表示波长λ3的强度，纵轴122表示波长λ14的强度。另外，记号123表示荧光染料A发光时测定的λ3、λ14的信号强度的分布，记号124表示荧光染料B发光时测定的λ3、λ14的信号强度的分布。在图4中，一个记号（点）表示试样中的一个粒子发出的荧光强度。

在没有噪声的理想情况下，染料A发光时的信号强度分布在横轴上，染料B发光时的信号强度分布在纵轴上。此时，能够将波长λ3的强度设为荧光染料A的发光强度，将波长λ14的强度设为荧光染料B的发光强度。但是，在噪声多的情况下，如图4（A）所示，染料A发光时的分布在纵轴方向上也扩展，染料B发光时的分布在横轴方向也扩展。即，当将波长λ3的强度设为荧光染料A的发光强度，将波长λ14的强度设为荧光染料B的发光强度时，在仅荧光染料A发光的情况下，也产生好似荧光染料B也微弱发光那样的误差。

为了减小这样的误差，有必要使仅荧光染料A发光时的信号强度的分布的纵轴方向的扩展和仅荧光染料B发光时的信号强度的分布的横轴方向的扩展尽量小。为了减少噪声的影响，尽量减小分布的扩展，将多个PMT的信号相加即可。

例如，在图3中将波长λ1～λ6的频带设为Λ1，将该范围的波长的强度相加，设为Λ1的强度。另外，将波长λ11~λ16的频带设为Λ2，将该范围的波长的强度相加，设为Λ2的强度。Λ1、Λ2是多个信号的相加，因此，随机的噪声被抵消，噪声相对减小。但是，图3（A）所示的荧光染料A的荧光光谱在波长λ11的附近也具有一点强度，因此，在仅荧光染料A发光时也稍稍测定出Λ2的强度。反之，图3（B）所示的荧光染料B的荧光光谱，在波长λ6附近也具有一点强度，因此，在仅荧光染料B发光时也稍稍测定出Λ1的强度。

图4（B）示意地表示此时的信号强度的分布。横轴125、纵轴126分别表示波长频带Λ1、Λ2的强度。仅荧光染料A发光的情况下的信号强度的分布123，由于Λ1的强度大，Λ2的强度小，因此成为在虚线127的方向上变宽的分布。仅荧光染料B发光的情况下的信号强度的分布124，由于Λ1的强度小，Λ2的强度大，因此成为在虚线128的方向上变宽的分布。此时，可以将测定的信号投影在虚线127上的长度认为是荧光染料A的发光强度，将投影在虚线128上的长度认为是荧光染料B的发光强度。Λ1、Λ2分别是多个波长的信号强度的相加，因此，噪声成分减小，仅荧光染料A发光时的信号强度的分布123的平行于虚线127的方向的宽度，与图4（A）的纵轴方向的宽度相比减小。另外，仅荧光染料B发光时的信号强度的分布124的平行于虚线128的方向的宽度，与图4（A）的横轴方向的宽度相比减小。但是，分布123和分布124的中心间的距离与图4（A）相比变短。

如上可知，当将在测定中使用的波长频带选择得狭窄时，两种荧光染料A、B的发光强度分布的宽度增大，误差增大。另外，当将在测定中使用的波长频带中选择得宽时，分布的宽度减小，但是产生两个分布间的距离减小而导致的误差的影响。这样，图1的流式细胞仪中，如何选择在测定中使用的波长频带（PMT的通道）对测定精度影响较大。因此，图2的步骤S103中，当用户决定在测定中使用的通道时，提示了辅助通道的选择的信息。

在图2的步骤S104中由用户决定测定中使用的通道，在步骤S105中实施实际的检体的测定。

接着，参照图5、图6详细说明图2的步骤S103中的测定通道决定辅助信息提示的详细处理的例子。图5表示步骤S103的更详细的处理流程，图6表示用于执行图5的处理的装置的结构。此外，图6所示的处理通过图1中的信号处理单元106执行，图5的结构在信号处理单元中可以作为专用的硬件来实现，也可以作为软件的处理模块来实现。此外，在图2的步骤S102中，假定通过图6所示的荧光光谱数据取得单元220测定校准试样中的粒子发出的荧光光谱，测定的荧光光谱存储在存储单元210中。

首先，在图5的步骤S120中，光谱信息计算单元230计算校准试样中的粒子发出的荧光光谱，将计算出的光谱显示在显示单元240中。使用图7更详细地说明在步骤S120中进行的处理。在此，将校准试样的种类设为m种，将PMT的通道数设为n，将通过第j个通道测定的光的波长设为λj。首先，在步骤S121中，在表示校准试样的种类的变量i中代入1，进行初始化。在接下来的步骤S122中，在表示PMT的通道的变量j中代入1，进行初始化。

接着，在步骤S123中，从存储装置210中读出校准试样i中的粒子发出的光中通过PMT的第j个通道测定的各粒子的λj的信号强度，计算平均值μ。同样，在步骤S124中计算各粒子的λj的标准偏差σij。在步骤S125中，将变量j与n比较，判定是否针对校准试样i的全部波长计算了平均值和标准偏差。在针对全部波长进行了计算（j＝n）的情况下，将处理转移到步骤S127。在还有剩余的波长的情况下（j<n），在步骤S126中在j上加1，针对下一波长执行从S123开始的处理。在此，针对全部波长计算了平均值和标准偏差，但是也可以根据分析对象选择必要的信息。

在步骤S127中，通过将i与m比较判定是否针对全部校准试样执行了计算。如果针对全部校准试样结束了计算（i=m），则将处理转移到步骤S129。如果存在未进行处理的校准试样（i<m），则在步骤S128中在i上加1，针对下一校准试样执行从步骤S122开始的处理。

在步骤S129中，将计算出的各波长（PMT的各通道）的信号的强度的平均值μij和标准偏差σij存储在存储单元210中，作为平均荧光光谱显示在显示单元240中。图8表示在显示单元240中显示的画面的例子。

平均荧光光谱显示在显示单元240上的平均荧光光谱显示区域300中。在图8中表示校准试样的数量为3种的情况下的例子，显示了3种光谱。纵轴111表示荧光强度，横轴112表示波长。曲线301、302、303分别是标绘试样1、试样2、试样3的各波长的信号强度的平均值（μ1j、μ2j、μ3j，其中j＝1～n）的曲线，表示各试样中的粒子的平均的荧光光谱。另外，在平均荧光光谱上显示的垂直的条311表示该波长的信号强度的标准偏差。

使用的荧光染料具有固有的光谱，但是在试样中添加荧光染料来测定的情况下，有时发生自身荧光等、荧光染料的荧光以外的未预料到的荧光、或峰值移位等，有时表现出与荧光染料的固有光谱不同的形状。如上所述，通过计算并显示平均荧光光谱，即使在测定时的光谱与荧光染料的固有光谱不同的情况下也能够预先确认其光谱形状，能够进行更恰当的波长频带的设定，可以辅助准确的测定。

另外，荧光染料的固有的光谱，针对试样中的被染色的全部粒子共同被观测，因此，各波长的光谱的波动反映了强度的波动，在全部波长成为几乎相同的波动。与此相对，自身荧光或峰值移位等仅由试样中的一部分粒子（细胞）产生，因此认为它们影响的波长的强度分布的波动增大。因此，在平均光谱的各波长计算并显示标准偏差，由此，容易推定自身荧光或峰值移位在哪个波长产生，能够进行更恰当的波长频带的设定，可以辅助准确的测定。

接着，在图5的步骤S130中由用户设定测定用的波长频带。用户使用在图8的平均荧光光谱显示区域300的下部的频带设定区域320设定在测定中使用的波长的频带宽度。在该图中表示了设定3种频带（频带1、2、3）的例子。用户通过用鼠标点击相应频带的两端或者将鼠标从一端拖放到另一端来设定频带。图8的箭头321、322、333分别表示对频带1、2、3设定的波长频带的例子。此外，频带设定区域320的画面的控制、或用户设定的频带信息的读出由频带设定单元250进行。另外，用户设定的频带存储在存储单元210中。

接着，在图5的步骤S140中，波长频带强度计算单元260根据校准试样中的粒子的荧光计算在步骤S130中设定的各频带的信号强度，计算各个频带中的信号强度的平均值、标准偏差，并将计算出的结果存储在存储单元210中，显示在显示单元240中。使用图9更详细地说明在步骤S140中进行的处理。在此，将校准试样的种类设为m种，将用户设定的频带的数量设为p。首先，在步骤S201中，在表示校准试样的种类的变量i中代入1，进行初始化。在接下来的步骤S202中，在表示频带编号的变量k中代入1，进行初始化。

接着，在步骤S203中，针对校准试样i中的各粒子，根据通过PMT的各通道测定的信号计算由用户设定的波长频带k的信号强度。具体来说，例如将进入频带1的波长（PMT的通道）的信号的总和设为该频带的信号强度。例如假定频带1包含波长λ1、λ2、λ3，某粒子的λ1、λ2、λ3的强度为r1、r2、r3。此时，当设该粒子的频带1的强度为R1时，通过R1=r1+r2+r3来计算。计算出的各粒子的频带k的信号强度存储在存储单元210中。

利用在步骤S203中计算出的频带k的信号强度，在步骤S204中计算频带k的信号强度的平均值Mik。同样，在步骤S205中计算频带k的信号强度的标准偏差Sik。在步骤S206中将变量k与p比较，判定是否针对校准试样i的全部频带计算了平均值和标准偏差。在针对全部频带进行了计算（k=p）时，将处理转移到步骤S208中。在还有剩余的频带（k<p）的情况下，在步骤S207中在k上加1，针对下一频带执行从S203开始的处理。

在步骤S208中，通过将i与m比较判定是否针对全部校准试样执行了计算。如果针对全部校准试样结束了计算（i=m），则将处理转移到步骤S210。如果存在未处理的校准试样（i<m），则在步骤S209中在i上加1，针对下一校准试样执行从步骤S202开始的处理。

在步骤S210中，从存储单元210读出计算出的各频带中的信号强度的平均值Mik和标准偏差Sik，以曲线形式显示在显示单元240中。在图10中表示显示单元240中显示的画面的例子。

在显示单元240上的频带强度信息显示区域400中显示每个频带的信号强度的平均值、标准偏差。在图10中表示了校准试样的数量为3种的情况的例子，显示了3种曲线。纵轴401表示各频带的信号强度，横轴402表示频带。长方形的条411表示各频带的信号强度的平均值，在条411上用线段表示的条412表示该频带中的信号强度的标准偏差。

为了高精度地分离各荧光染料的荧光，必要条件是针对各校准试样，存在仅由该试样表示强的信号强度，由其它校准试样表示尽可能低的信号强度的频带，或者各频带中的信号强度的波动小。如上所述，针对每个校准试样，计算各频带的信号强度和波动（标准偏差）并如图10那样显示，由此，在开始检体的测定前能够掌握频带的选择的优劣。在此，针对全部频带计算平均频带强度和标准偏差，但是也能够根据分析对象选择必要的信息。

在图5表示的步骤S150的例子中，用户通过图10所示的画面例子确认各频带的信号强度、波动，判断是否在该频带设定下进行测定。如果判断为需要再设定，则将处理返回步骤S130，再次设定测定用的波长频带。在不需要再设定时，将处理转移到步骤S160。

此外，频带强度信息显示区域400优选与平均荧光光谱显示区域300同时显示。通过同时显示，能够同时掌握在哪里设定了频带这样的信息和其结果的优劣，能够高效率地进行频带的设定。

步骤S160是用户设定截止值的例子。所谓截止值是噪声水平，是用于将该值以下的信号作为噪声而舍弃的设定值。在图10所示的频带强度信息显示区域400上进行截止值的设定。截止值能够针对各频带设定不同的值，通过点击表示各频带的信号强度的平均值的长方形的条411上的想要设定截止值的点来设定其值。在设定的截止值的位置显示虚线413。当在某一个曲线上设定截止值时，在其它曲线的相同位置也显示表示截止值的虚线413即可。用于这些截止值的设定的画面控制、通过用户设定的截止值的读入，由截止值设定单元280进行，所设定的截止值存储在存储单元210中。

截止值需要设定为尽可能舍弃噪声成分，并且尽量不舍弃想要测量的信号。如上所述，针对每个校准试样用曲线形式显示各频带的强度的平均值、波动（标准偏差），使得能够在该曲线上进行截止值设定，由此能够辅助最佳的截止值设定。

接着，在步骤S170中计算测定精度评价信息并将结果显示在显示单元240中。各校准试样的各粒子的各频带的强度以某范围分布。此时，如前所述，各校准试样的频带强度分布，分布的宽度小，并且分布的中心间的距离越短，测定时的误差越小。因此，将校准试样的频带强度分布视为概率分布，将各分布间的重叠的大小作为精度评价信息来计算。分布间的重叠越小，可以进行精度越高的测定。

使用图12、图13说明计算分布间的重叠的原理。在图12中，横轴501、纵轴502分别表示频带1、2的强度。另外，点划线503、504分别表示对频带1、2的强度设定的截止值。另外，椭圆505、506分别表示根据校准试样1、2中包含的粒子的荧光计算出的各频带的强度分布的宽度。此时，分布的重叠的区域成为从椭圆505、506的重叠除去通过截止值而被舍弃的区域以外的区域507。

实际计算重叠的大小时，将用椭圆505、506表示的区域作为概率分布来表现。为了简化说明，在图13中表示将频带设为1种（例如选择频带1）时的两个分布的概率分布的重叠的情形。横轴501表示频带1的强度，纵轴510表示概率。曲线511、512分别表示校准试样1、2的概率分布，点划线513表示对频带1的强度设定的截止值。此时，作为这两个分布的重叠，求出从两个分布重叠的区域中除去通过截止值舍弃的区域的区域514的面积。实际上为多维分布，因此求出多维的体积。

参照图11说明基于上述原理的步骤S180中的详细处理的例子。此外，图11所示的处理由图6中的测定精度评价信息计算单元270进行。此外，以下说明使用m种校准试样的情况。

在步骤S301～S305的处理中，针对校准用的各试样求出表示频带强度的分布的概率分布并且求出舍弃率。所谓舍弃率，是通过截止值作为噪声而被舍弃的粒子的比例。首先，在步骤S301中，在表示校准试样的种类的变量i中代入1，进行初始化。在步骤S302中计算用于将从校准试样i的粒子的荧光而得到的各频带的强度分布应用于概率分布的参数。例如，作为概率分布而使用多维正态分布的情况下，求出方差协方差矩阵。但是，在此使用的概率分布不限于正态分布。能够利用其它各种概率分布。也能够利用多个概率分布，由用户选择。此外，在此计算出的参数存储在存储单元210中。

接着，在步骤S303中计算舍弃率。舍弃率可以根据通过校准试样测定的实际的数据，作为通过截止值舍弃的粒子相对于全部粒子的比例而计算出。另外，可以利用在S302中求出的概率分布，作为各频带强度的截止值以上的区域的概率分布的积分值而求出。在此求出的舍弃率存储在存储单元210中。

在步骤S304中，通过将i与m比较，判定是否针对全部的校准试样实施了S302、S303的处理。在针对全部的校准试样处理结束（i=m）的情况下，将处理转移到步骤S306。在处理未结束的情况下（i<m），在步骤S305中在i上加1后，执行步骤S302以后的处理。

在步骤S306～S312中，计算2种校准试样间的概率分布的重叠的大小。在步骤S306中，在表示用于计算重叠的一方的校准试样的种类的变量i中代入1，进行初始化。另外，在步骤S307中，在表示另一方的校准试样的种类的变量j中代入i+1，进行初始化。

在步骤S308中，使用在步骤S302中求出的概率分布，根据使用图12、图13说明的原理计算校准试样i和j的强度分布的重叠的大小。计算结果存储在存储单元210中。在步骤S309中，通过将j与m比较，判断针对校准试样i的步骤S308的全部处理是否结束。在全部处理结束（j＝m）的情况下，将处理转移到步骤S311。在还剩余处理的情况下（j<m），在步骤S310中在j上加1后，执行步骤S308以后的处理。

在步骤S311中，通过将i与m-1比较，判断是否针对校准试样的全部的组合执行了求出分布的重叠的处理。如果实施了全部的处理（i=m-1），则将处理转移到S313。如果剩余处理，则在步骤S312中在i上加1后，执行步骤S307以后的处理。

在步骤S313中，将计算出的分布间的重叠、舍弃率作为测定精度评价信息显示在显示单元240中。图14表示测定精度评价信息的显示例。成为矩阵形式的显示，“试样i”的行和“试样j”的列交叉的单元的值表示试样i和j的概率分布的重叠的大小。另外，在最下行中显示舍弃率。

接着，在图5的步骤S180中，用户参照测定精度评价信息，研究是否再设定截止值。如果判断为需要再设定则返回步骤S160，再设定截止值。在不再设定截止值的情况下，在步骤S190中研究是否需要波长频带的再设定。如果判断为需要再设定则返回步骤S130，再设定频带。在不需要再设定的情况下，在步骤S104中决定测定用的波长频带。

此外，测定精度评价信息优选平均荧光光谱显示区域300、频带强度信息显示区域400同时显示在显示单元240中。通过显示测定精度评价信息，用户能够将频带的设定的优劣，作为分布的重叠来定量掌握，辅助用于准确的测定的最佳的频带的设定。

在这些图5所示的步骤中，设为用户可以按照测定的条件或必要的精度来选择各步骤即可。另外，在各步骤中作为计算对象的荧光或检测器的选择、或者计算方法，也设为能够按照用户的测定条件或精度来选择即可。

接着，参照图12详细说明步骤S105中的检体的测定中的处理流程。当进行检体的测定时，首先，用户将预先进行了荧光标识的检体设置在装置上，指示测定的开始。测定开始的指示，例如使用与信号处理单元106连接的键盘来进行。当指示测定开始时，信号处理单元106读入从A/D变换器输出的PMT的信号强度数据（步骤S505），判断有无检测出荧光（步骤S510）。例如对于PMT的全部通道预先设定了阈值，当至少一个通道的输出值比阈值大时判断为检测出了荧光。在未检测出荧光的情况下将处理返回步骤S505，再次读入PMT的信号强度。

在步骤S510中检测出荧光的情况下，在步骤S515中将信号强度变换为频带强度。具体来说，从存储单元210读入在步骤S104中用户设定的频带，按照设定内容将多个通道的信号强度相加，设为频带强度。另外，此时可以从存储单元210读入在步骤S160中用户设定的截止值，舍弃全部频带强度比截止值小的粒子。在进行这种舍弃的情况下不进行步骤S520以后的处理，再次从步骤S505进行处理。另外，也可以不进行使用截止值的舍弃处理。在这种情况下，在存储单元中存储了各粒子的频带强度，可以在测定结束后使用别的软件进行基于截止值的舍弃处理或荧光修正处理。

在步骤S520中表示对于在步骤S515中计算出的频带强度进行荧光修正处理的例子。在步骤S515中计算出的频带强度和实际的检体中的粒子的强度分布的关系，例如如图20（A）所示。即，同一检体中的粒子的频带强度分布，在将频带强度设为轴的空间中具有某斜率地分布。在步骤S520的荧光修正中，进行将该斜率方向设为新的轴的变换。具体来说，通过多变量分析求出各分布的扩展方向，进行将该方向设为轴的坐标变换处理。此时，为使在变换后的坐标系中表示的各粒子的频带强度不成为负数，还进行各坐标轴的平行移动。

图22表示荧光修正后的试样中的2种粒子的频带强度的分布的示意图。横轴1001、纵轴1002分别表示荧光修正后的新的频带强度Λ1’和Λ2’。记号1003、1004分别表示检体中包含的不同种类的粒子发出的荧光的频带强度。

这样，当进行荧光修正，成为图22的状态时，可以设（频带Λ1’的强度）＝（试样1（荧光染料1）的发光强度），可以用一个强度代表一种荧光染料的发光。

根据本发明，能够进行最佳的通道选择、截止值的设定，不同种类的频带强度的分布的重叠的区域变小。其结果，能够进行高精度的测定。

在步骤S525中判定测定是否结束，在继续进行测定的情况下将处理返回步骤S505。此外，测定结束的判断，根据从开始起的经过时间来判断，在从开始起经过了一定时间的情况下结束测定。另外，可以监视检体的余量，在余量变为一定值以下时结束。另外，也可以监视所测定的检体的量，在测定的检体量超过预先设定的量的情况下结束测定。

在以上所述的流式细胞仪中，通过计算并显示校准试样的光谱，当设定测定时的频带时，考虑了自身荧光或峰值移位等的影响的恰当的频带的设定成为可能。另外，通过针对设定的频带计算并提示与每个频带的信号强度的分布相关的信息，在进行检体的测定之前能够得到关于测定精度的信息，能够辅助符合目的的最佳频带的选择、以及截止值的设定。而且，关于所设定的频带，通过计算并提示校准试样的分布的重叠，用户能够定量地掌握测定时的精度，能够辅助最佳的频带的选择。

实施例2

在实施例2中说明在实施例1中说明的图5的步骤S140中的波长频带的测定强度信息的计算、显示方式的别的实施方式。其它处理与实施例1相同，因此省略说明。

在步骤S140中，针对每种校准试样，针对检测出的全部粒子计算设定的各频带的强度。各频带的强度作为频带中包含的波长的强度（通过PMT的1通道测定的强度）的和来计算。计算出的各频带的强度存储在存储单元210中。

接着，在显示单元240的频带强度信息显示区域400中显示图17所示的画面。在该画面中，在将任意2种频带设为纵轴、横轴的坐标平面上，从存储装置210读出并显示所选择的校准试样的频带强度的分布。

803是选择在横轴上设定的频带的编号的列表框，804是选择在纵轴上设定的频带的编号的列表框。用户通过列表框803、804选择想要确认分布的频带强度的编号。在图17所示的例子中，在横轴801上设定了频带1，在纵轴802上设定了频带2。807是选择在坐标上显示分布的校准试样的编号的复选框。用户通过点击鼠标选择想要确认分布的校准试样。在图17所示的例子中选择了试样1和试样2。

通过以上的操作，在坐标上显示所选择的试样的频带强度的分布。在图17所示的例子中，在将横轴801设为频带1的强度，将纵轴802设为频带2的坐标上显示了校准试样1的频带强度的分布805和试样2的分布806。

另外，在本实施例中，在图17所示的画面上进行图5的步骤S160中的截止值的设定。用户通过点击横轴801、纵轴802的想要设定截止值的位置，将该位置的值作为截止值来设定。而且，在坐标上显示与设定的截止值相当的线。在图17所示的例子中，点划线809表示对频带1的强度设定的截止值，点划线810表示对频带2的强度设定的截止值。

在以上所述的第二实施例中，在坐标轴上显示频带强度的分布，由此能够在视觉上掌握各校准试样的频带强度分布的形状或宽度、与其它试样的分布的重叠等，可以容易地判定所设定的频带的优劣，并且也容易设定截止值。

实施例3

在实施例3中说明在实施例1中说明的图5的步骤S170中的测定精度评价信息计算、显示方式的别的实施方式。其它处理与实施例1相同，因此省略说明。

图18中表示本实施例的步骤S170的详细的处理流程。此外，图18所示的处理由图6中的测定精度评价信息计算单元270进行。此外，以下使用m种类的校准试样来进行说明。

在步骤S401～S405的处理中，针对校准用的各试样求出频带强度的分布的主轴，并且求出舍弃率。所谓舍弃率，是通过截止值作为噪声而被舍弃的粒子的比例。首先，在步骤S401中，在表示校准试样的种类的变量i中代入1，进行初始化。在步骤S402中，求出由校准试样i的粒子的荧光而得到的各频带的强度分布的主轴。所谓主轴，是表示将强度分布设为多维正态分布时的最具有宽度的方向的直线，可以通过多变量分析来求出。求出的主轴存储在存储单元210中。

接着，在步骤S403中计算舍弃率。舍弃率，可以根据通过校准试样测定的实际的数据，作为通过截止值舍弃的粒子相对于全部粒子的比例而计算。在此求出的舍弃率存储在存储单元210中。

在步骤S404中，通过将i与m比较，判定是否针对全部的校准试样实施了S402、S403。在针对全部校准试样结束了处理时（i=m），将处理转移到步骤S406。在处理未结束时（i<m），在步骤S405中在i上加1后，执行步骤S402以后的处理。

在步骤S406～步骤S412中计算某校准试样的强度对其它校准试样的强度值造成的影响。在步骤S406中，在表示用于计算重叠的一方的校准试样的种类的变量i中代入1，进行初始化。另外，在步骤S407中在表示另一方的校准试样的种类的变量j中代入1，进行初始化。

在步骤S408中，使用在步骤S402中求出的主轴计算校准试样i的频带强度分布的、向校准试样j的强度分布的主轴方向的投影成分，求出投影成分的分布。例如求出投影成分的平均值和标准偏差。图20表示投影成分的计算的原理。横轴901和纵轴402分别表示频带1、2的强度。图20（A）中，记号903表示试样i的各粒子发出的荧光的频带1、2的强度，记号904表示试样j的各粒子的荧光强度。另外，直线905表示在步骤S402中求出的试样i的频带强度分布的主轴，直线906表示试样j的频带强度分布的主轴。此时，如图20（B）所示，从试样i的频带强度分布的各点向试样j的强度分布的主轴906所引的垂线907的足表示投影成分。即，垂线和主轴906的交点与原点的距离成为投影成分。针对试样i的各粒子计算主轴906的投影成分，求出得到的投影成分的分布。曲线908表示求出的分布的形状。例如，求出该分布的平均值和标准偏差。

计算结果存储在存储单元210中。在步骤S409中，通过将j与m比较，判断是否结束了针对校准试样i的步骤S408的全部处理。在结束了全部处理时（j＝m），将处理转移到步骤S411。在还剩余处理时（j<m），在步骤S410中在j上加1后，执行步骤S408以后的处理。

在步骤S411中，通过将i与m比较，判断是否针对校准试样的全部的组合实施了求出分布的重叠的处理。如果实施了全部的处理（i=m），则将处理转移到S413。如果剩余处理，则在步骤S412中在i上加1后，执行步骤S407以后的处理。

在步骤S413中，将计算出的向主轴的投影分布、舍弃率作为测定精度评价信息显示在显示单元240中。图19表示测定精度评价信息的显示例。成为矩阵形式的显示，“试样i”的行和“试样j”的列交叉的单元的值表示试样i的强度分布的向试样j的分布主轴的投影的分布形状。例如，以平均值±标准偏差的形式显示投影成分的分布形状。另外，在最下行中显示舍弃率。

校准试样的强度分布的主轴方向的成分，表示对该试样添加的荧光染料的发光强度。因此，其它校准试样的强度分布的相同方向的成分，在多重染色的测定时作为荧光强度的误差成分而产生影响。在本实施例中，可以定量地掌握校准相互的对投影成分的影响，能够预先估计通过多重染色进行测定时的相互的误差。因此，能够辅助测定开始前的最佳的频带的选择。

符号的说明

101：激光光源

102：流量计

103：分光单元

104：光电倍增管（PMT）

105：A/D变换器

106：信号处理单元

111：表示荧光强度的轴

112：表示波长的轴

113：表示荧光光谱的曲线

114：表示荧光光谱的曲线

115：频率范围Λ1

116：频率范围Λ2

121：表示波长λ3的强度的轴

122：表示波长λ14的强度的轴

123：表示荧光染料A发光时测定的信号的分布的记号

124：表示荧光染料B发光时测定的信号的分布的记号

125：表示波长频带Λ1的强度的轴

126：表示波长频带Λ2的强度的轴

127：表示荧光染料A发光时测定的信号的分布扩展的方向的虚线

128：表示荧光染料B发光时测定的信号的分布扩展的方向的虚线

210：存储单元

220：荧光光谱数据取得单元

230：光谱信息计算单元

240：显示单元

250：频带设定单元

260：波长频带强度计算单元

270：测定精度评价信息计算单元

280：截止值设定单元

300：平均荧光光谱显示区域

301：试样1中的粒子的平均荧光光谱

302：试样2中的粒子的平均荧光光谱

303：试样3中的粒子的平均荧光光谱

311：表示标准偏差的条

320：频带设定区域

321：表示频带1的范围的箭头

322：表示频带2的范围的箭头

323：表示频带3的范围的箭头

400：频带强度信息显示区域

401：表示各频带的荧光强度的轴

402：表示频带的轴

411：表示各频带中的荧光强度的平均值的条

412：表示各频带中的荧光强度的标准偏差的条

413：表示截止值的虚线

501：表示频带1的信号强度的轴

502：表示频带2的信号强度的轴

503：表示对频带1的强度设定的截止值的点划线

504：表示对频带2的强度设定的截止值的点划线

505：表示校准试样1的频带强度分布范围的椭圆

506：表示校准试样2的频带强度分布范围的椭圆

507：表示分布的重叠的区域

510：表示概率的轴

511：校准试样1的概率分布

512：校准试样2的概率分布

513：表示对频带1的强度设定的截止值的点划线

514：表示分布的重叠的区域

610：被荧光染色的试样

620：鞘液

630：流量计

640：电信号处理部

650：激光

660：分色镜

670：带通滤波器

680：光电倍增管（PMT）

690：专用软件

700：表示荧光强度的轴

705：表示波长的轴

710：表示荧光光谱的曲线

720：表示荧光光谱的曲线

730：表示荧光光谱的曲线

740：表示荧光光谱的重叠的区域

750：通过现有方式设定的检测波长频带

760：使用分光器和多检测器设定的检测波长频带

770：通过一个检测器检测出的波长频带

801：表示频带强度的轴

802：表示频带强度的轴

803：选择频带的编号的列表框

804：选择频带的编号的列表框

805：表示试样1的频带强度的分布的记号

806：表示试样2的频带强度的分布的记号

807：选择试样的种类的复选框

809：表示截止值的点划线

810：表示截止值的点划线

901：表示频带1的信号强度的轴

902：表示频带2的信号强度的轴

903：表示试样1的频带强度的分布的记号

904：表示试样2的频带强度的分布的记号

905：试样1的信号强度分布的主轴

906：试样2的信号强度分布的主轴

907：从试样1的信号强度向试样2的信号强度分布主轴引的垂线

908：表示试样1的信号强度的、向试样2的信号强度分布主轴的投影部分的分布形状的曲线

1001：表示荧光修正后的频带强度的轴

1002：表示荧光修正后的频带强度的轴

1003：表示检体中的粒子发出的荧光的、荧光修正后的频带强度分布的记号

1004：表示检体中的粒子发出的荧光的、荧光修正后的频带强度分布的记号

Claims (15)

1.一种分析装置，其特征在于，

具备：

光源；

使接收来自所述光源的光而发光的试样流过的流量计；

对从所述试样发出的光进行分光的分光单元；

具备针对每个不同波长检测从所述分光单元输出的光的多个检测器的检测部；

对通过所述检测部检测出的光的信号进行信号处理的处理单元；

接受对所述信号处理的指示输入的输入单元；

存储所述信号处理的结果的存储部；以及

显示处理的结果的输出部，

所述存储部针对多个不同试样，按所述多个检测器的每个检测器存储检测出的光信号，针对所述光信号，将所述多个检测器中的强度按每个所述不同试样显示在所述输出部上，并且具有通过所述输入单元设定所述多个检测器中的至少一个检测器检测出的波长频带的频带设定单元。

2.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，

具有波长频带强度计算单元，其计算通过所述频带设定单元设定的波长频带的光信号的强度，并按所述多个不同试样中的每个试样存储在所述存储部中。

3.根据权利要求2所述的分析装置，其特征在于，

具有截止值设定单元，其将通过所述波长频带强度计算单元存储在存储装置中的所述多个不同试样的每个试样的所述波长频带的光信号的强度输出到所述输出部，通过所述输入单元设定用于舍弃一定强度以下的信号的强度值，并将所设定的强度值存储在所述存储部中。

4.根据权利要求3所述的分析装置，其特征在于，

具有测定精度评价计算单元，其计算通过所述截止值设定单元的设定而被舍弃的比例并存储在所述存储部中，针对通过所述频带设定单元设定的波长频带，除去所述波长频带的舍弃部分，计算出所述多个不同试样中的第一试样和第二试样中的频带强度分布的重叠，并输出到所述输出部。

5.根据权利要求2所述的分析装置，其特征在于，

所述输入单元具有从通过所述频带设定单元设定的波长频带中选择两个波长频带的波长频带选择单元和选择所述多个不同试样中的至少一个试样的试样选择单元，从所述存储部取出通过所述波长频带选择单元和所述试样选择单元选择的波长频带中的试样的光信号的强度，并将所述强度在所述波长频带中的分布显示在所述输出部上。

6.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，

所述处理单元计算所述多个不同试样中的第一试样的主轴，计算所述多个不同试样中的第二试样的频带强度分布向所述第一试样的主轴方向的投影成分的分布并存储在所述存储部中，

所述输出部输出所述投影成分的分布。

7.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，

所述试样是通过相同染料标识的多个粒子，

所述处理单元计算来自多个粒子的光的信号的平均光谱和标准偏差，显示在所述输出部上。

8.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，

所述多个不同试样是通过不同染料来分别标识的试样。

9.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，

所述试样是粒子。

10.根据权利要求1所述的分析装置，其特征在于，

所述试样是细胞或液珠。

11.一种分析方法，其使用了光源、使试样流过的流量计、对通过来自所述光源的光而从流过所述流量计的试样发出的光进行分光的分光单元、针对每个不同波长检测从所述分光单元输出的光的多个检测器、对通过所述检测器检测出的光信号进行处理的处理单元、数据的存储部、进行向所述处理单元的输入的输入单元、输出处理结果的输出部，所述分析方法的特征在于，

具有以下过程：

所述存储部按所述多个检测器中的每个检测器存储针对在流量计中流过的多个不同的试样分别检测出的光信号，将所述多个检测器中的光信号的强度，按每个所述不同试样显示到所述输出部；

通过输入单元设定所述多个检测器中的至少一个检测器检测的波长频带；

将所述设定的波长频带存储在所述存储部中；

通过所述检测器检测来自在所述流量计中流动的检体的光；以及

使用所述设定的波长频带将所述检体的信号输出到所述输出部。

12.根据权利要求11所述的分析方法，其特征在于，

具有以下过程：

按所述多个不同试样的每个试样，将所述设定的波长频带中的光信号的强度输出到输出部；以及

通过输入单元输入用于舍弃所输出的光信号中一定强度以下的信号的强度值并存储在所述存储部中。

13.根据权利要求12所述的分析方法，其特征在于，

具有以下过程：

所述处理单元计算根据所述用于舍弃一定强度以下的信号的强度值而被舍弃的比例，针对所述设定的波长频带，除去所述波长频带的舍弃部分，计算多个不同试样的第一试样和第二试样中的频带强度分布的重叠并输出到所述输出部。

14.根据权利要求11所述的分析方法，其特征在于，

具有以下过程：

计算所述多个不同试样中的第一试样的主轴，计算所述多个不同试样中的第二试样的频带强度分布向所述第一试样的主轴方向的投影成分的分布，并存储在所述存储部中；以及

将所述投影成分的分布输出到所述输出部。

15.根据权利要求11所述的分析方法，其特征在于，

所述试样是通过相同染料标识的多个粒子，

具有以下过程：

所述处理单元计算来自所述多个粒子的光的信号的平均光谱和标准偏差；以及

将所述平均光谱和标准偏差显示在所述输出部上。

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