JP2020134341A - 測定成否判定方法および試料測定装置 - Google Patents
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Abstract
【課題】試料中に含まれる希少な粒子を標的粒子とした場合であっても、試料の測定が正しく行われたか否かを判定可能な測定成否判定方法および試料測定装置を提供する。【解決手段】測定試料に含まれる標的粒子の測定における測定成否判定方法は、検出工程S1と、測定の成否の判定工程S2と、を含む。測定成否判定方法は、検出工程S1において、測定試料中の標的粒子および標的粒子以外の他の粒子を検出する。また、測定成否判定方法は、測定の成否の判定工程S2において、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定する。【選択図】図1
Description
本発明は、測定成否判定方法および試料測定装置に関する。
近年、様々な目的で、試料に含まれる粒子の測定が行われている。たとえば、血液試料等に含まれる細胞は生体の様々な状態を反映しているため、被検者の疾患の状態などを把握することを目的として被検者から採取した検体中の細胞の測定が行われている。特許文献1には、末梢血中に含まれる血中循環腫瘍細胞(Circulating Tumor Cell:CTC)を撮像するための粒子撮像装置400が記載されている(図22参照)。CTCは、腫瘍の原発巣等から血液中に遊離した腫瘍細胞であり、がん患者の体内では微量の腫瘍細胞が血流に乗って循環していることが知られている。
特許文献1に記載の粒子撮像装置400では、粒子検出部410における粒子の検出結果に基づいて試料に含まれる粒子のうちCTCの可能性が低い粒子は、粒子選別部420により外側に設けられた流路430に流される。粒子検出部410における粒子の検出結果に基づいてCTCの可能性が高い粒子は中心に設けられた流路440に流され、粒子撮像部450により粒子の画像が撮像される。
ここで、試料中に含まれる標的粒子の数を正確に測定したい場合に、粒子の検出中に種々の不具合が生じて一定期間の間粒子の検出ができない状況となると、検出結果から試料中に含まれる標的粒子の数を正確に評価することができなくなる。たとえば、CTCのように、試料中の希少な粒子を標的粒子として検出する場合、標的粒子をもれなく検出できるように、試料を全量測定することが重要となる。しかしながら、もし検出に不具合が生じ粒子の検出漏れが生じた場合であっても、試料に含まれる標的粒子が実際に少ないために検出された標的粒子の数が少ないのか、検出の不具合により試料の全量が測定できておらず検出された標的粒子の数が少ないのかを測定結果から判別できない。このため、粒子の検出結果に基づいて被検者の状態を適正に評価するためには、まずは粒子の検出自体が正しく行われたか否かということを把握することが必要となる。
そこで、本発明は、試料中に含まれる希少な粒子を標的粒子とした場合であっても、試料の測定が正しく行われたか否かを判定可能な測定成否判定方法および試料測定装置を提供することを目的とする。
本発明の第1の態様は、測定試料に含まれる標的粒子の測定における測定成否判定方法に関する。本態様に係る測定成否判定方法は、測定試料中の標的粒子および標的粒子以外の他の粒子を検出し、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定する。
発明者らは、測定試料に含まれる希少粒子を標的粒子とする場合に、標的粒子以外の他の粒子の検出結果が、標的粒子に対する測定の成否の状態を反映することを見いだした。したがって、本態様に係る測定成否判定方法によれば、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて標的粒子の成否を判定できる。
また、このように測定の成否を判定できると、測定試料に含まれる標的粒子が実際に少ないために検出された標的粒子の数が少なかったのか、検出の不具合により検出された標的粒子の数が少なかったのかを判別できる。したがって、測定の成否に基づいて、測定試料に含まれる標的粒子を適正に評価できる。これにより、たとえば疾患の状態の判断において、不適正な測定によって標的粒子の数が誤って少なくなるために生じる偽陰性を抑制できる。
また、検出の不具合は測定ごとに都度発生することがあるが、本態様に係る測定成否判定方法によれば、実際に行う測定における検出結果に基づいて測定の成否が判定される。したがって、測定試料の測定ごとに測定が正しく行われたかを判定できる。
本態様に係る測定成否判定方法は、測定の成否の判定において、粒子の検出において検出した標的粒子および他の粒子の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。測定試料には、標的粒子以外の他の粒子だけでなく、標的粒子も含まれる。したがって、標的粒子および他の粒子の両方の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。
本態様に係る測定成否判定方法は、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて、測定において検出された標的粒子の検出率に関する値を算出し、測定の成否の判定において、検出率に関する値に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。標的粒子の検出率に関する値は、測定試料の測定において測定試料に含まれる標的粒子がどの程度の割合で検出できたかを反映した数値であればよく、たとえば、測定試料に含まれる粒子全体の検出率や、標的粒子ではない他の粒子のみの検出率でもよい。
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子の数に基づいて、測定において検出が期待される少なくとも他の粒子の数に関する推定値を算出し、推定値と、測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数と、に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。この場合の推定値は、少なくとも測定において検出が期待される他の粒子の数を含んでいればよく、測定において検出が期待される標的粒子の数を含んでいてもよい。
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、推定値と、測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数と、の比に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。
あるいは、本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、推定値に対する測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数の割合に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。
本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子の数に基づいて、測定において検出される少なくとも他の粒子の数の時間的変化を近似する近似式を算出し、近似式に基づいて、測定において検出が期待される少なくとも他の粒子の数に関する推定値を算出してもよい。
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、近似式の算出において、検出された少なくとも他の粒子が所定数以下の時間帯を除外し、近似式を算出してもよい。
本態様に係る測定成否判定方法は、測定試料を測定した全時間帯のうち所定タイミング以前の時間帯を除外し、近似式を算出してもよい。こうすると、測定開始直後に意図せず不具合が生じたような場合でも検出の不具合を判定できる。
本態様に係る測定成否判定方法は、測定試料を測定した全時間帯のうち所定タイミング以降の時間帯を除外し、近似式を算出してもよい。こうすると、意図せず粒子沈降が生じたような場合でも検出の不具合を判定できる。
本態様に係る測定成否判定方法は、測定の成否の判定において、検出率に関する値を所定の閾値と比較し、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、使用者の入力に応じて所定の閾値を変更してもよい。こうすると、病院の要望や検査施設の運用等に合わせて閾値を設定できる。
図2を参照し、本態様に係る測定成否判定方法は、測定の成否の判定結果を表示部(13)に表示してもよい。こうすると、オペレータは、表示部に表示された判定結果を参照して、測定の成否を円滑に把握できる。
この場合に、本態様に係る測定成否判定方法は、測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数の時間的変化を示すグラフを表示部(13)に表示してもよい。こうすると、オペレータは、表示部に表示されたグラフを参照して、測定の状況を把握できる。
本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子から得られる検出信号の値に基づいて、測定において検出が期待される検出信号の値に関する推定値を算出し、推定値と、測定において実際に検出された検出信号の値と、に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。
本態様に係る測定成否判定方法は、検出率に関する値の算出において、単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子の数が所定数以上の時間および/または単位時間ごとに検出した少なくとも他の粒子の数が所定数以下の時間の情報に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。
本態様に係る測定成否判定方法は、標的粒子および他の粒子の検出において、測定試料を流路(111)に流し、流路(111)を流れる測定試料中の標的粒子および他の粒子を検出してもよい。
図5を参照し、本態様に係る測定成否判定方法は、標的粒子および他の粒子の検出において、フローセル(110)に形成された流路(111)に測定試料を流し、流路(111)を流れる測定試料に光を照射し、測定試料から生じた光を検出してもよい。
本態様に係る測定成否判定方法は、標的粒子および他の粒子の検出において、複数の画像に基づいて測定試料に含まれる標的粒子および他の粒子を検出し、検出率に関する値の算出において、画像ごとに検出した少なくとも他の粒子の数に基づいて、測定において検出が期待される少なくとも他の粒子の数に関する推定値を算出し、推定値と、測定において実際に検出された少なくとも他の粒子の数と、に基づいて、検出率に関する値を算出してもよい。こうすると、たとえば、蛍光顕微鏡を用いて検出を行う場合に、測定成否判定方法により測定の成否を判定できる。
本態様に係る測定成否判定方法において、標的粒子および他の粒子は、たとえば細胞である。
本態様に係る測定成否判定方法において、測定試料中の標的粒子の数は、測定試料中の他の粒子の数より少なくてもよい。
本態様に係る測定成否判定方法において、たとえば、標的粒子は血中循環腫瘍細胞であり、他の粒子は白血球である。
本態様に係る測定成否判定方法において、血中循環腫瘍細胞および白血球を大きさの違いに基づいて、血液中に含まれる白血球の一部を除外することで測定試料を調製し、測定の成否の判定において、測定試料の調製において除去されなかった白血球の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。
図2を参照し、本態様に係る測定成否判定方法は、標的粒子の数に関する値を表示部(13)に表示してもよい。こうすると、医師等は、標的粒子の数に関する値を参照することにより、被検者に対する診断を行うことができる。
本発明の第2の態様は、測定試料に含まれる標的粒子を測定する試料測定装置に関する。本態様に係る試料測定装置(10)は、測定試料中の標的粒子および標的粒子以外の他の粒子を検出する検出部(100)と、少なくとも他の粒子の検出結果に基づいて、標的粒子の測定の成否を判定する制御部(11)と、を備える。
検出部は、たとえば、フローセルに設けられた流路を流れる測定試料に対して光を照射し、測定試料から生じた光を撮像または測定する光学式の検出部や、流路を流れる測定試料に対して電流を流し、電気抵抗の変化に基づいて粒子を測定する電気抵抗方式の検出部などを含む。
本態様に係る試料測定装置によれば、第1の態様と同様の効果が奏される。
本発明の第3の態様は、測定成否判定方法に関する。本態様に係る測定成否判定方法は、測定試料中の粒子を検出し、単位時間ごとに検出した粒子の数に基づいて、測定において検出が期待される粒子の数に関する推定値を算出し、推定値と、測定において実際に検出された粒子の数と、に基づいて、検出率に関する値を算出し、検出率に関する値に基づいて、粒子の測定の成否を判定する。
本態様に係る測定成否判定方法によれば、検出率は、測定試料の測定において測定試料に含まれる粒子がどの程度の割合で検出できたかを反映した数値となる。したがって、本態様に係る測定成否判定方法によれば、検出率に関する値に基づいて粒子の測定の成否を判定できる。
本発明によれば、試料に含まれる希少な標的粒子の測定において、試料の測定が正しく行われたか否かを判定できる。
図1を参照して、本発明の測定成否判定方法の概要について説明する。以下、末梢血から調製された測定試料に含まれるCTCを標的粒子として測定する例を用いて説明している。また、この測定において、測定試料に含まれる白血球を標的粒子以外の他の粒子とし、少なくとも白血球の検出結果に基づいて標的粒子の測定の成否を判定している。
検出工程S1において、測定試料中の標的粒子および標的粒子以外の他の粒子が検出される。これにより、粒子の画像の撮像または粒子から生じた光等に基づく検出信号のデータの取得が行われる。
続いて、測定の成否の判定工程S2において、検出工程S1で取得されたデータに基づいて、標的粒子の測定の成否が判定される。測定の成否の判定工程S2では、たとえば、以下のような工程が行われる。
まず、検出工程S1で得られた検出信号のデータから取得が期待される推定値が算出され、たとえば、測定において実際に検出された粒子の数や検出信号の値などの実測値と、実測値として本来取得が期待される推定値との比に基づいて、標的粒子の検出率に関する値が算出される。標的粒子の検出率に関する値の算出の詳細については、追って後述する。そして、標的粒子の検出率に関する値が所定の閾値と比較され、標的粒子の測定の成否が判定される。たとえば、標的粒子の検出率に関する値が推定値に対する実測値の割合である場合、標的粒子の検出率に関する値が閾値よりも大きいと、測定試料中の粒子が十分に検出できたものとして、標的粒子の測定が適正であったと判断できる。
ここで、血液等から調製された測定試料には、CTC等の分析対象となる標的粒子だけでなく、白血球等の標的粒子以外の他の粒子も含まれる。たとえば標的粒子が希少細胞であり測定試料に含まれる標的粒子が少ない場合でも、測定試料に含まれる粒子の数は、他の粒子を含めることによりある程度の数量となる。これにより、測定が適正であった場合と、測定が不適正であった場合とで、標的粒子の数によらず測定の成否に応じて標的粒子の検出率に関する値が増減するため、標的粒子の検出率に関する値を用いて標的粒子の測定の成否を適正に判断できる。
なお、測定成否判定方法は試料測定装置を用いて行われることが想定されるが、各工程の一部または全部が手技によりオペレータにより行われてもよい。
<実施形態1>
(試料測定装置10の構成)
図2は、試料測定装置10の構成を示すブロック図である。
(試料測定装置10の構成)
図2は、試料測定装置10の構成を示すブロック図である。
試料測定装置10は、制御部11と、記憶部12と、表示部13と、入力部14と、検出部100と、を備える。
制御部11は、CPUにより構成される。制御部11は、記憶部12に記憶されたプログラムに基づいて各種の処理を行う。制御部11は、試料測定装置10内の各部に接続されており、各部からの信号を受信すると共に、各部の動作を制御する。記憶部12は、RAM、ROM、ハードディスク等により構成される。表示部13は、液晶ディスプレイ、プラズマディスプレイ、CRT(Cathode Ray Tube)ディスプレイ等により構成される。入力部14は、マウスやキーボード等により構成される。なお、表示部13と入力部14は、タッチパネル式のディスプレイにより一体的に構成されてもよい。検出部100は、前処理により調製された測定試料中の粒子を検出するための光学ユニットである。検出部100の詳細は後述する。
図3は、試料測定装置10に供される測定試料を調製するための前処理の手順を示すフローチャートである。
なお、検体が全血試料であり、標的粒子が全血試料中のCTCである場合について説明しているが、測定試料の前処理は検体の種類や標的粒子等により適宜設定されるものであり、以下の方法に限られるものではない。被検者から採取される検体は、全血に限らず、分析に対応する標的粒子を含む検体であればよく、たとえば尿や骨髄液などでもよい。標的粒子は、被検者由来の希少細胞であり、CTCに限らず、血管内皮細胞(Circulating Endothelial Cell:CEC)、造血幹細胞(Hematopoietic Stem Cell:HSC)、胎児赤芽球などの細胞でもよいし、エキソソームやマイクロパーティクル等の粒子であってもよい。
検体の採取工程S11において、被検者から検体として全血が、たとえば5mL採取される。被検者から採取された全血は、赤血球、血小板、白血球、およびCTCを含む。赤血球の溶血工程S12において、被検者から採取された全血対して、界面活性剤等を含む所定の試薬を用いて赤血球が溶血される。続いて、第1遠心分離工程S13において、赤血球が溶血された試料が遠心分離器により遠心分離され、上清が除去される。これにより、赤血球がほぼなくなった試料が取得される。
続いて、他の粒子の除去工程S14において、赤血球がほぼなくなった試料を渦巻き状の流路に流すことにより、粒子の大きさの違いに基づいて、標的粒子であるCTCと、CTC以外の粒子が分離される。すなわち、第1遠心分離工程S13で取得された試料から、白血球および血小板等の他の粒子が除去され、CTCの濃度が増した試料が取得される。
他の粒子の除去工程S14においてCTCの濃度が増した試料を取得する際には、たとえば、図4(a)に示すチップ500が用いられる。
図4(a)は、チップ500の構成を示す模式図である。
チップ500に設けられたマイクロ流路510に、第1遠心分離工程S13で取得された試料が流されることにより、チップ500は、第1遠心分離工程S13で取得された試料を、第1試料と第2試料とに分離する。
チップ500は、マイクロ流路510と、入力端部520と、出力端部530と、を備える。マイクロ流路とは、一般的に、深さおよび幅が10μm〜1000μmの範囲の流路のことである。チップ500は、たとえば、マイクロ流路510、入力端部520、および出力端部530に対応する溝が形成された薄い板状部材に、他の板状部材を重ね合わせることにより構成される。他の粒子の除去工程S14は、Dean Flow Fractionationと呼ばれる分離原理に基づくものである。
マイクロ流路510は、渦巻き形状の曲線部511と、2つの直線部512、513と、を有する。曲線部511の形状は、チップ500に垂直な方向に見た場合に円弧状になっている。2つの直線部512、513の形状は、チップ500に垂直な方向に見た場合に直線状になっている。入力端部520は、マイクロ流路510の渦巻き形状の中心側の端部に設けられており、出力端部530は、マイクロ流路510の入力端部520とは反対側の端部に設けられている。入力端部520は、直線部512を介して曲線部511と繋がっており、出力端部530は、直線部513を介して曲線部511と繋がっている。
入力端部520は、2つの入口521、522を備える。2つの入口521、522は、チップ500を構成する部材に設けられた孔により構成される。入口521は、マイクロ流路510の渦巻き形状の外周側において、直線部512を介して曲線部511に接続されている。入口522は、マイクロ流路510の渦巻き形状の内周側において、直線部512を介して曲線部511に接続されている。出力端部530は、2つの出口531、532を備える。2つの出口531、532は、チップ500を構成する部材に設けられた孔により構成される。出口531は、マイクロ流路510の渦巻き形状の内周側において、直線部513を介して曲線部511に接続されている。出口532は、マイクロ流路510の渦巻き形状の外周側において、直線部513を介して曲線部511に接続されている。
入口521に、第1遠心分離工程S13で取得された試料が注入され、入口522に、試料を流すためのシース液が注入される。入口521に注入される試料の量は、たとえば4mLであり、入口522に注入されるシース液の量は、たとえば45mLである。そして、2つの入口521、522にチューブを介して接続されたポンプ540により、2つの入口521、522に陽圧が加えられる。これにより、入口521に注入された試料と、入口522に注入されたシース液とが、マイクロ流路510内を出力端部530に向かって流れる。出口531から取得される第1試料の量は、たとえば10mLであり、出口532から取得される第2試料の量は、たとえば39mLである。
図4(b)は、図4(a)に示すマイクロ流路510のA−A’断面図である。図4(b)において、右側が渦巻き形状の外周側であり、左側が渦巻き形状の内周側である。
第1遠心分離工程S13で取得された試料がマイクロ流路510に流されると、マイクロ流路510内において、図4(b)に示すように、流路の向きに直交する方向に粒子の流れる位置を変化させる力が生じる。具体的には、粒子の径に応じて異なる大きさの揚力FLとディーン抗力FDとが生じる。一般的に、マイクロ流路においては、流路の断面中心の速度が大きく壁近傍の速度が小さくなるように流速が分布する。渦巻き状のマイクロ流路510においては、さらに上記の流速分布に起因して、図4(b)において楕円状の矢印に示すように、ディーン渦と呼ばれる二次流が発生する。ディーン抗力FDと揚力FLは、以下の式(1)、(2)により表すことができる。
試料内の粒子は、マイクロ流路510に沿って押し流されながら、揚力FLとディーン抗力FDにより、マイクロ流路510内において径の値に応じて分布するようになる。
図4(c)は、マイクロ流路510の出力端部530側の端部を示す模式図である。
マイクロ流路510においてディーン渦が発生すると、図4(c)に示すように、マイクロ流路510の出力端部530側の端部において、径の値に応じて粒子が分布する。こうして、出口531から、所定の径以上の粒子を含む第1試料が取得され、出口532から、所定の径未満の粒子を含む第2試料が取得される。
大半の白血球の直径は、10μm〜15μm付近の値以下であり、大半のCTCの直径は、10μm〜15μm付近の値以上である。したがって、第1遠心分離工程S13で取得された試料から、CTC以外の他の粒子として白血球、血小板、および溶血されずに残った赤血球を除去する際には、10μm〜15μm付近の値をカットオフ値として、カットオフ値より小さい直径の粒子が除去され、カットオフ値以上の直径の粒子が取り出されるように、チップ500におけるマイクロ流路の形状を設定する。
ここで、血液中に循環しているCTCは極微量であり、がん患者であっても、一般的に血液10mL中に数個から千個程度しか存在しないといわれている。したがって、第1試料に含まれるCTCも極微量となる。上記のチップ500を用いることにより、CTC以外の他の粒子を含む第2試料が除去されるが、白血球は、CTCと同程度の大きさを有するものも多数存在するため、第1試料には依然としてある程度の白血球が残っている。
なお、上述の例では、溶血剤を用いて赤血球の除去を行ったがこれに限らず、渦巻き状の流路により、CTCと赤血球との直径の違いに基づいてCTCと赤血球とを分離してもよい。
図3に戻り、CTCの蛍光標識工程S15において、他の粒子の除去工程S14で取得された第1試料において、CTCの標的部位が蛍光標識される。たとえば、蛍光標識の対象となる標的部位は、核、Her2遺伝子、および17番染色体のセントロメア領域(CEP17)である。なお、蛍光標識される標的部位は、細胞の部位であればよい。標的部位は、遺伝子や核に限らず、たとえば、細胞のタンパク質、細胞質、細胞膜、細胞膜上の表面抗原でもよい。標的部位の蛍光標識は、インサイチュハイブリダイゼーションや特異的な染色に基づいて行われることに限らず、抗原抗体反応に基づく免疫染色によって行われてもよい。標的部位が遺伝子の場合、Her2遺伝子やCEP17に限らず、他の遺伝子領域であってもよい。このように標的部位が蛍光標識されると、後述する図7に記載の試料測定装置10における分析工程S26において、測定試料に含まれる標的粒子を識別して分析できる。
続いて、第2遠心分離工程S16において、標的部位が蛍光標識されたCTCを含む試料に対して、遠心分離等の処理が行われ、遠心分離後の上清が除去される。これにより、試料に含まれるCTCが残存した状態で液量が低下し、CTCの濃度が増加する。こうして、試料測定装置10に供するための測定試料が得られる。
上述したように、赤血球は、赤血球の溶血工程S12および第1遠心分離工程S13によりほぼ除去され、血小板および溶血されずに残った赤血球は、他の粒子の除去工程S14においてほぼ除去される。一方、白血球は、他の粒子の除去工程S14を経ても試料中に残存することとなる。具体的には、CTCは、測定試料中に数個〜数百個程度含まれることに対し、白血球は、測定試料中に1万弱〜20万個程度含まれる。このように、前処理によって得られる測定試料には、他の粒子として多数の白血球が含まれる。
ここで、以降の分析において、CTCは分析の対象となる標的粒子であることに対し、白血球は分析対象ではない他の粒子である。したがって、白血球は、分析の観点からすれば本来は不要な粒子である。しかしながら、図7を参照して説明する測定の成否の判定工程S25においては、本来は分析に不要である白血球の計数値を用いて、試料測定装置10による標的粒子の測定が適正に行われたか否かが判定される。測定の成否の判定については、追って図7を参照して説明する。
図5は、検出部100の構成を示す模式図である。
検出部100は、フローセル110と、4つの光源121〜124と、7つの集光レンズ131〜137と、3つのダイクロイックミラー141〜143と、光学格子151と、光検出器152と、反射ユニット160と、撮像部170と、を備える。図5には、互いに直交するXYZ軸が示されている。
フローセル110の流路111には、測定試料がZ軸正方向に流される。4つの光源121〜124は、フローセル110を流れる測定試料に光を照射する。4つの光源121〜124は、半導体レーザ光源により構成される。4つの光源121〜124から出射される光は、それぞれ、波長λ11、λ12、λ13、λ14の互いに異なる波長のレーザ光である。4つの集光レンズ131〜134は、それぞれ、4つの光源121〜124から出射された光を集光する。ダイクロイックミラー141は、波長λ11の光を透過させ、波長λ12の光を反射する。ダイクロイックミラー142は、2つの波長λ11、λ12の光を透過させ、波長λ13の光を反射する。こうして、3つの波長λ11、λ12、λ13の光は、流路111を流れる測定試料に対してX軸正方向に照射される。波長λ14の光は、流路111を流れる測定試料に対してY軸正方向に照射される。
ここで、核と2つの遺伝子をそれぞれ標識する蛍光色素は、波長λ11の励起光が照射されることにより波長λ21の蛍光を生じる蛍光色素、波長λ12の励起光が照射されることにより波長λ22の蛍光を生じる蛍光色素、波長λ13の励起光が照射されることにより波長λ23の蛍光を生じる蛍光色素、の中から選択される。3つの波長λ21、λ22、λ23の蛍光がそれぞれ撮像されることにより、標的部位である核と2つの遺伝子に関する蛍光画像を取得できる。
フローセル110を流れる測定試料に3つの波長λ11、λ12、λ13の光が照射されると、CTCの標的部位を標識している蛍光色素から蛍光が生じる。また、フローセル110を流れる測定試料に波長λ14の光が照射されると、この光は細胞を透過する。細胞を透過した波長λ14の光は、明視野画像の生成に用いられる。集光レンズ135は、測定試料から生じた4つの波長λ21、λ22、λ23、λ14の光を集光する。
ここで、フローセル110には測定試料とともに、参照粒子を含む参照液が流される。参照粒子は、測定試料に含まれる粒子とは異なり、流路111内の流速を監視するために用いられる非生物粒子である。参照粒子は、たとえば、ラテックス等の重合体や、無機物などである。参照粒子は、光が照射された場合に、測定試料に含まれる細胞等の他の粒子よりも強い散乱光を生じる光学特性を有する。
測定試料とともに流路111を流れる参照粒子に、波長λ11の光が照射されると、参照粒子から散乱光が生じる。ダイクロイックミラー143は、参照粒子から生じた波長λ11の散乱光を反射し、波長λ11以外の波長帯の光を透過する。光学格子151は、Z軸方向に透明部分と不透明部分とが交互に配置された格子構造を備える。波長λ11の散乱光が光学格子151に入射すると、散乱光の強度は、光学格子151により変調される。集光レンズ136は、光学格子151で生じた変調光を集光する。光検出器152は、集光レンズ136により集光された変調光を受光する。光検出器152は、たとえば、光電子増倍管やフォトダイオードにより構成される。制御部11(図2参照)は、光検出器152の検出信号に基づいて、フローセル110をZ軸方向に流れる測定試料の流速を算出する。
反射ユニット160は、4枚のダイクロイックミラーが組み合わせられた構成を有する。反射ユニット160の4枚のダイクロイックミラーは、4つの波長λ21、λ22、λ23、λ14の光を互いに僅かに異なる角度で反射し、撮像部170の受光面上において分離させる。集光レンズ137は、反射ユニット160で反射された光を集光する。
撮像部170は、TDI(Time Delay Integration)カメラにより構成される。撮像部170は、3つの波長λ21、λ22、λ23の蛍光と波長λ14の光とを、参照粒子に基づいて得られる流速に基づいて撮像し、測定試料中の粒子の画像として、3つの波長λ21、λ22、λ23の蛍光にそれぞれ対応した蛍光画像と、波長λ14の光に対応した明視野画像とを生成する。制御部11は、撮像部170により生成された蛍光画像および明視野画像を記憶部12に記憶させる。
ここで、撮像部170は、TDIカメラにより構成される。撮像部170の受光面で受光した光を、光検出器152を用いて算出した流速に基づいて積算して蛍光画像および明視野画像を生成する。これにより、蛍光画像および明視野画像の品質を高めることができる。また、撮像部170により撮像画像が取得されると、後段の分析工程S26(図7参照)において、撮像画像を用いて測定試料に含まれる粒子を精度よく分析できる。
図6は、フローセル110に測定試料、参照液およびシース液を流すための検出部100の構成を示す模式図である。
検出部100は、図5で示した構成に加えて、第1の送液ユニット210と、第2の送液ユニット220と、第3の送液ユニット230と、チャンバ240と、5つの流路251〜255と、を備える。
第1の送液ユニット210は、測定試料をフローセル110に送液するための構成である。第1の送液ユニット210は、シリンジ211と、作動子212と、駆動機構213と、を備える。作動子212は、シリンジ211に挿入され、プランジャーやピストンなどにより構成される。駆動機構213は、作動子212を移動させ、モーターなどにより構成される。
第2の送液ユニット220は、参照粒子を含む参照液をフローセル110に送液する。第2の送液ユニット220も、第1の送液ユニット210と同様に構成され、シリンジ221と、作動子222と、駆動機構223と、を備える。第3の送液ユニット230は、フローセル110に対して2つ設けられており、シース液をフローセル110に送液する。第3の送液ユニット230も、第1の送液ユニット210と同様に構成され、シリンジ231と、作動子232と、駆動機構233と、を備える。シース液の送液の際、2つの第3の送液ユニット230は交互にシース液を送液し、一方の第3の送液ユニット230がシース液を送液している間、他方の第3の送液ユニット230はシリンジ231にシース液を充填する。これにより、シース液が途切れることなくフローセル110に送液される。
なお、第1の送液ユニット210、第2の送液ユニット220、および第3の送液ユニット230は、ダイヤフラムポンプであってもよく、コンプレッサーなどの圧力源に接続された電空変換器で発せられる気圧を用いて液体を移送してもよい。
チャンバ240には、前処理工程において調製された測定試料が収容される。流路251は、第1の送液ユニット210と接続点256とを接続する。流路252は、第2の送液ユニット220と接続点256とを接続する。流路253は、第3の送液ユニット230とフローセル110とを接続する。流路254は、チャンバ240と接続点256とを接続する。流路255は、接続点256とフローセル110とを接続する。
検出部100による検出の際には、第1の送液ユニット210が、2つの流路251、254を介して、チャンバ240内の測定試料を、接続点256と第1の送液ユニット210の間まで引き込む。続いて、2つの第3の送液ユニット230のいずれか一方が、流路253を介してフローセル110にシース液を送液し、第2の送液ユニット220が、2つの流路252、255を介してフローセル110に参照粒子を含む参照液を送液する。制御部11(図2参照)が、光検出器152(図5参照)の検出信号に基づいて、フローセル110の流路111内の流速が所定の値になったと判定すると、第1の送液ユニット210は、流路251に引き込んだ測定試料を、2つの流路251、255を介してフローセル110に送液する。そして、上述したように、フローセル110の流路111を流れる測定試料に、4つの波長λ11、λ12、λ13、λ14の光が照射される。
(試料測定装置10の動作)
図7は、実施形態1の試料測定装置10の動作を示すフローチャートである。図7に示す各工程は、オペレータが試料測定装置10に指示を入力し、試料測定装置10が入力された指示に応じて各工程を実行することにより行われる。図7に示す各工程は、試料測定装置10により自動的に行ってもよいし、図7に示す工程の一部または全部をオペレータが手動で行ってもよい。
図7は、実施形態1の試料測定装置10の動作を示すフローチャートである。図7に示す各工程は、オペレータが試料測定装置10に指示を入力し、試料測定装置10が入力された指示に応じて各工程を実行することにより行われる。図7に示す各工程は、試料測定装置10により自動的に行ってもよいし、図7に示す工程の一部または全部をオペレータが手動で行ってもよい。
検出工程S21において、図2に記載の試料測定装置10の制御部11は、図5に記載の検出部100を駆動して、前処理で調製された所定量の測定試料をフローセル110の流路111に流し、流路111を流れる測定試料に含まれる粒子を検出する。具体的には、図5に記載の撮像部170は、一定の検出期間の間に、流路111を流れる測定試料に含まれる各粒子から蛍光画像および明視野画像を撮像する。図2に記載の制御部11は、撮像された蛍光画像および明視野画像を、撮像された時間に関連する情報とともに記憶部12に記憶する。
ここで、上述したように、測定試料に含まれる白血球は、1万弱〜20万個程度であり、測定試料に含まれるCTCは、数個〜数百個程度である。このように、測定試料中の粒子のうち白血球が大部分を占めているため、検出工程S21で検出される粒子の大半は白血球である。
計測工程S22において、制御部11は、時間に関連する情報とともに記憶部12に記憶された明視野画像に基づいて、フレーム毎に粒子の数を計測し、フレーム毎の粒子数を取得する。1フレームは、単位時間に相当し、たとえば20秒である。明視野画像を用いることにより、精度よく粒子数を計測できる。また、実施形態1では、検出工程S21で検出される粒子の大半は白血球であるため、計測工程S22で取得される計数値は、ほぼ白血球に基づくものである。
なお、所定量の測定試料とは、前処理で調製された測定試料の一部または全部を示す。実施形態1では、希少細胞であるCTCが分析の対象であるため、測定試料の全量をフローセル110に流し、検出部100により検出することが好ましい。また、実施形態1の検出部100は、フローセル110に設けられた流路111を流れる測定試料に対して光を照射し、測定試料から生じた光を測定する光学式の検出部であったが、これに限らず、流路を流れる測定試料に対して電流を流し、電気抵抗の変化に基づいて粒子を検出する電気抵抗方式の検出部でもよい。
図8(a)は、計測工程S22において単位時間ごとに検出された粒子の数を模式的に示す計測粒子数のグラフである。各グラフにおいて、横軸は測定時間における経過時間を示し、縦軸は、各単位時間において計測された粒子数を示す。
計測工程S22において、制御部11は、撮像部170により取得された明視野画像に基づいて、単位時間ごとに粒子数を計測する。グラフ上の1つのプロットは、単位時間である20秒の間に計測された粒子数を示している。また、図8(a)に示すように、測定試料の送液は、グラフの左端に位置するTminにおいて開始され、グラフの右端に位置するTmaxで終了している。言い換えれば、Tmin〜Tmaxの期間で測定試料の全量の検出が完了している。図8(a)に示す例では、安定的に粒子が検出されている時間帯があるものの、一部の時間帯Ta31、Ta32において粒子の検出が行われておらず、検出に不具合が生じている可能性がある。
このような検出の不具合は、たとえば、図6に記載のシース液を送液する2つの第3の送液ユニット230が切り替えられたことによりシース液に送液の乱れが生じた場合に生じることがある。また、検出の不具合は、図5に記載の撮像部170のフォーカスずれにより粒子が識別されなかった場合、参照粒子に基づいて得られる流速とTDIカメラの積算速度が適正に同期できなかった場合、光源124から適正に光が出射されなかった場合、撮像部170において適正に明視野画像が生成されなかった場合、などに起こり得る。
なお、図8(b)、(c)は、図8(a)のグラフに基づくグラフである。図8(b)、(c)のグラフについては、追って推定値の取得工程S23および検出率の取得工程S24において説明する。
図7に戻り、推定値の取得工程S23において、制御部11は、計測工程S22において単位時間ごとに取得した粒子数に基づいて、検出工程S21において検出が期待される粒子の数に関する推定値を取得する。
推定値の取得工程S23において、制御部11は、計測粒子数のグラフに対応する測定データから近似式を算出し取得する。図8(a)に示す計測粒子数のグラフの場合、制御部11は、検出に不具合が生じている可能性のある時間帯を除外し、図8(b)に示すように、除外後のその他の時間帯における計測粒子数に基づいて、計測粒子数の近似式を取得する。近似式は、検出された粒子の数の時間的変化を近似する直線である。そして、制御部11は、近似式に基づいて推定値を取得する。
図9は、推定値の取得工程S23の詳細を示すフローチャートである。
平均値の算出工程S101において、制御部11は、図8(a)のグラフに対応する測定データに基づいて、単位時間における計測粒子数が1以上である期間の計測粒子数の平均V1を算出する。続いて、1SDの値の算出工程S102において、制御部11は、単位時間における計測粒子数が1以上である期間における計測粒子数の1SDの値V2を算出する。続いて、閾値の算出工程S103において、制御部11は、平均値の算出工程S101で算出した平均V1から1SDの値の算出工程S102で算出した値V2を減算して、閾値Nthを算出する。図8(b)に示す破線の細い直線は、閾値Nthを示している。
ここで、平均V1は、検出に不具合が生じていないと判断される時間帯において、単位時間にどれだけの計測粒子数が取得されるかを示す値である。また、値V2は、検出に不具合が生じていないと判断される時間帯において、計測粒子数が平均V1に対してどの程度ばらついているかを示す値である。したがって、平均V1−値V2により算出される閾値Nthは、検出に不具合が生じていないと判断される時間帯における、計測粒子数の値の範囲の1SDの下限を示していることになる。計測粒子数が閾値Nth以上であれば、対象となる時間帯において粒子が検出されたと判断し、計測粒子数が閾値Nth未満であれば、対象となる時間帯において粒子が検出されなかったと判断する。
続いて、近似式の取得工程S104において、制御部11は、図8(a)のグラフから閾値Nth以上の計測粒子数のみを図8(b)のグラフに示すように抽出し、図8(b)に示すグラフに対応するデータに基づいて、計測粒子数の一次線形回帰式を近似式として取得する。破線の太い直線は、一次線形回帰式を示している。このように、一次線形回帰式は、測定において粒子が検出されなかったと判断された時間帯を除外して求められる。具体的には、この近似式は、T秒〜T+20秒の20秒間で検出が期待される粒子の数を表している。
なお、ここで、近似式の算定に一次線形回帰式を用いたが、これに限られず、たとえば、多項式近似を行ってもよい。また、検出に不具合が生じている可能性のある時間帯を除外するための閾値Nthは、上記のような算出手順により算出されることに限らない。
続いて、推定値の算出工程S105において、制御部11は、図8(b)に示すような近似式で規定される粒子の総数を推定値として取得する。この推定値は、今回の測定において、検出が期待される粒子の数の推定値、すなわち検出の不具合がなければ取得されたであろう総粒子数の推定値を意味している。
具体的には、制御部11は、近似式の取得工程S104で取得した近似式を、TminからTmaxまで積分して推定値を算出する。ここで、図8(b)のグラフ上の1つのプロットは、20秒間に検出された粒子の数を示している。したがって、近似式を積分する場合には、あらかじめ近似式を縦軸方向に1/20に縮小する必要がある。たとえば、横軸方向の時間をT、縦軸方向の計測粒子数をNとすると、近似式はN=−aT+bとして表される。この場合、近似式を縦軸方向に1/20に縮小すると、新たに設定される近似式はN=(−aT+b)/20となる。制御部11は、このように1/20に縮小した近似式をTminからTmaxにわたって積分して推定値を算出する。
なお、グラフ上にプロットされる計測粒子数は、標的粒子の計測粒子数と他の粒子の計測粒子数とを含んでいる。したがって、推定値の算出工程S105において算出される推定値は、測定において検出が期待される標的粒子の数と、測定において検出が期待される他の粒子の数との和である。このように、推定値は、少なくとも測定において検出が期待される他の粒子の数を含んでいればよく、測定において検出が期待される標的粒子の数を含んでいてもよい。
また、この推定値は、近似式と、時間Tminに対応する縦方向の直線と、時間Tmaxに対応する縦方向の直線と、計測粒子数=0に対応する横方向の直線とに囲まれた四角形の面積Aに対応する。面積Aは、検出に不具合がない場合に、測定において検出されることが予想される粒子の数であり、測定試料中の総粒子数を反映する推定値である。こうして、推定値の取得工程S23における推定値の取得が終了する。
図7に戻り、検出率の取得工程S24において、制御部11は、推定値の取得工程S23で取得した推定値と、検出工程S21において実際に検出された粒子の数と、に基づいて検出率を取得する。
図10は、検出率の取得工程S24の詳細を示すフローチャートである。
実測値の算出工程S111において、制御部11は、測定において実際に検出された粒子の数(実測値)を算出する。測定において実際に検出された粒子の数は、単位時間ごとの計測粒子数の合計である。図8(c)に示す例では、単位時間ごとの計測粒子数の合計は、面積A1+A2+A3+A4に対応する。
続いて、検出率の算出工程S112において、制御部11は、測定試料中の総粒子数(推定値)と、実測値の算出工程S111で算出した、測定において実際に検出された粒子の数(実測値)と、の比に基づいて、検出率を算出する。測定試料中の総粒子数として、図7に示した推定値の取得工程S23で取得した推定値が用いられる。具体的には、制御部11は、実際に検出された粒子の数(実測値)を、不具合がない場合に予想される計測粒子数(推定値)で除算して、検出率を取得する。図8(a)〜(c)に示す例では、検出率は、(A1+A2+A3+A4)/Aに対応する。こうして、検出率の取得工程S24における検出率の取得が終了する。
なお、検出率の算出工程S112において、演算に用いられる推定値および実測値は、標的粒子と他の粒子の両方に基づく値であるため、算出される検出率は、測定試料に含まれる粒子全体の検出率である。しかしながら、これに限らず、検出率の算出工程S112で算出される検出率は、標的粒子の検出率に関する値、すなわち測定試料の測定において測定試料に含まれる標的粒子がどの程度の割合で検出できたかを反映した数値であればよい。たとえば、検出率の算出工程S112で算出される検出率は、他の粒子のみの検出率でもよい。
ここで、図11(a)、(b)および図12(a)、(b)を参照して、実際に発明者らが測定成否判定方法の検証で取得したグラフに基づいて検出率を取得した手順について説明する。
図11(a)、(b)および図12(a)、(b)は、計測工程S22において単位時間ごとに検出された粒子の数を示すグラフである。図11(a)に示すグラフでは、破線で示す閾値Nthの直線よりも上側に位置する大部分の時間帯において、安定的に150個前後の細胞が計測されている。図12(a)に示す例では、破線で示す閾値Nthの直線よりも下側に位置する時間帯が長く、全体として検出に不具合が生じている可能性がある。なお、測定試料の送液は、グラフの左端に位置する0秒において開始され、グラフの右端に位置する4500秒で終了している。
図11(a)に示す計測粒子数のグラフの場合、計測粒子数が1以上である計測粒子数の平均V1は、144.2であった。計測粒子数が1以上である計測粒子数の1SDの値V2は、30.7であった。閾値Nthは、平均V1−値V2に基づいて算出し、113.4とした。図11(b)のグラフは、図11(a)のグラフから閾値Nth以上の計測粒子数のみを抽出したものである。図11(b)のグラフにおいて、太い直線に示すように、計測粒子数の一次線形回帰式を取得した。この場合、一次線形回帰式はy=0.0024x+146.92であり、決定係数は0.0236であった。
続いて、図11(b)に示す近似式で規定される粒子の総数が推定値として取得される。近似式に基づく直線と、時間=0に対応する縦方向の直線と、時間=4500に対応する縦方向の直線と、計測粒子数=0に対応する横方向の直線とに囲まれた四角形に基づいて面積が算出される。図11(b)のグラフでは、推定値に相当する面積は34269.2となった。また、図11(a)のグラフにおいて、全時間帯における計測粒子数の合計は31140であった。したがって、検出率は、31140/34269.2=90.9%となった。
図12(a)に示す計測粒子数のグラフの場合、計測粒子数が1以上である計測粒子数の平均V1は、25.1であった。計測粒子数が1以上である計測粒子数の1SDの値V2は、11.3であった。閾値Nthは、平均V1−値V2に基づいて算出し、13.8とした。図12(b)のグラフは、図12(a)のグラフから、閾値Nth以上の計測粒子数のみを抽出したものである。図12(b)のグラフにおいて、太い直線に示すように、計測粒子数の一次線形回帰式を取得した。この場合、一次線形回帰式はy=−0.0015x+33.732であり、決定係数は0.0749であった。
続いて、図12(b)に示す近似式で規定される粒子の総数が推定値として取得される。図12(b)のグラフでは、推定値に相当する面積は6827.92となった。また、図12(a)のグラフにおいて、全時間帯における計測粒子数の合計は3409であった。したがって、検出率は、3409/6827.92=49.9%となった。
図7に戻り、測定の成否の判定工程S25において、制御部11は、検出率と、判定のための閾値Rthとを比較することにより、標的粒子の測定の成否を判定する。
図13は、測定の成否の判定工程S25の詳細を示すフローチャートである。
閾値の読み出し工程S121において、制御部11は、閾値Rthを記憶部12(図2参照)から読み出す。閾値Rthは、どの程度の粒子を検出する必要があるかに基づいて決められる。たとえば、検出率の目標値として80%を設定した場合、検出率が80%の−2SD以上、すなわち64%以上であることが好ましいと考えられため、閾値Rthは64%に設定される。なお、閾値Rthは、目標値の−2SD以上に限らず、目標値の−1SD以上であってもよい。また、閾値Rthは、試料測定装置10を使用する施設の運用などによって異なるため、制御部11は、オペレータによる入力部14(図2参照)を用いた入力に応じて、閾値Rthを変更してもよい。これにより、病院の要望や検査施設の運用等に合わせて閾値Rthを設定できる。
判定工程S122において、制御部11は、図7に示した検出率の取得工程S24で取得した検出率が、閾値の読み出し工程S121で読み出した閾値Rth以上であるか否かを判定する。検出率が閾値Rth以上である場合、適正判定工程S123において、制御部11は、図7に示した検出工程S21で行われた検出が適正であったとして、標的粒子の測定が適正であったと判定する。他方、検出率が閾値Rth未満である場合、不適正判定工程S124において、制御部11は、図7に示した検出工程S21で行われた検出が不適正であったとして、標的粒子の測定が不適正であったと判定する。
閾値Rthが64%に設定された場合、図11(a)、(b)に示す例では、検出率は90.9%であったため、制御部11は、標的粒子の測定が適正であったと判定する。一方、図12(a)、(b)に示す例では、検出率は49.9%であったため、制御部11は、標的粒子の測定が不適正であったと判定する。
このように標的粒子の測定の成否を判定できると、測定試料に含まれる標的粒子が実際に少ないために検出された標的粒子の数が少なかったのか、検出の不具合により検出された標的粒子の数が少なかったのかを判別できる。したがって、測定試料に含まれる標的粒子の数が取得される際に、あわせて標的粒子の測定の成否が得られると、測定の成否に基づいて、測定試料に含まれる標的粒子を適正に評価できる。たとえば、標的粒子が希少細胞であり、標的粒子の数に基づいて疾患の状態が判断される場合、測定が適正に行われた場合に標的粒子の数に基づいて疾患の状態を適正に判断できる。これにより、たとえば疾患の状態の判断において、不適正な測定によって標的粒子の数が誤って少なくなるために生じる偽陰性を抑制できる。
また、検出の不具合は検出ごとに都度発生することがあるが、実施形態1では、実際に行う測定における検出結果に基づいて測定の成否が判定される。したがって、測定試料の測定ごとに測定が正しく行われたかを判定できる。
また、測定の成否の判定工程S25では、測定試料の大半を占める白血球の計数値に基づく検出率を用いて、試料測定装置10による測定が適正に行われたか否かが判定される。このように、実施形態1では、本来は分析の対象ではない他の粒子を利用して、標的粒子の測定の成否の判定が行われる。
なお、図10に示した検出率の算出で算出される検出率は、推定値と、測定試料の測定において実際に検出された粒子の数と、に応じた値であればよく、上記のように、推定値に対する測定試料の測定において実際に検出された粒子の数の割合に限らず、たとえば、測定試料の測定において実際に検出された粒子の数に対する推定値の割合でもよい。この場合、検出率が小さいほど測定が適正と判定できる。したがって、この場合、制御部11は、検出率が閾値Rth以下であれば、図7に示した検出工程S21で行われた検出が適正であったと判定して測定が適正であったと判定し、検出率が閾値Rthより大きければ、図7に示した検出工程S21で行われた検出が不適正であったと判定して測定が不適正であったと判定する。また、検出率は、割合に限らず、推定値と、測定試料の測定において実際に検出された粒子の数と、の差に応じた値であってもよい。
図7に戻り、分析工程S26において、制御部11は、検出工程S21で取得した検出結果、すなわち記憶部12に記憶した蛍光画像に基づいて、標的粒子であるCTCの分析を行う。
具体的には、制御部11は、Her2遺伝子を標識する蛍光色素から生じた蛍光画像と、CEP17を標識する蛍光色素から生じた蛍光画像において、輝点を抽出する。制御部11は、細胞ごとに、Her2遺伝子に基づく輝点数をCEP17に基づく輝点数で除算し、算出した値が1より大きい場合に、この細胞においてHer2遺伝子が増幅していると判定する。そして、制御部11は、Her2遺伝子が増幅している陽性細胞をCTCとして判定する。そして、制御部11は、判定したCTCの数や、撮像部170により撮像された全細胞に対するCTCの割合などを取得する。
なお、標的粒子が血管内皮細胞(CEC)である場合、分析工程S26において、CECに含まれるタンパク質であるNFκBの、細胞内における局在が解析される。具体的には、前処理において、CECは、CECに発現する抗体に特異的に結合するCD146の標識抗体を介して蛍光標識され、NFκBは、NFκBに特異的に結合する標識抗体を介して蛍光標識される。検出工程S21において、CECに基づく蛍光が撮像され、NFκBに基づく蛍光が撮像される。そして、分析工程S26において、蛍光画像に基づいてCECが検出され、シグナル分子であるNFκBが核内に局在しているか否かが判定され、CECの活性化の有無が判定される。また、標的粒子が肺がん由来のCTCであり、標的部位がサイトケラチンである場合、分析工程S26において、サイトケラチンが細胞質内に存在している量に基づいてCTCの検出が行われ、CTCの数やCTCの割合が取得される。
表示工程S27において、制御部11は、検出工程S21で取得した画像と、測定の成否の判定工程S25で取得した判定結果と、分析工程S26で取得した分析結果などを表示部13に表示する。
図14、15は、表示工程S27において表示部13に表示される画面300の構成を示す模式図である。
図14、15に示すように、画面300は、分析結果領域310と、細胞画像領域320と、グラフ領域330と、判定結果領域340と、を備える。図14には、図11(a)、(b)のグラフに示す測定試料について表示される画面300が例示されている。図15には、図12(a)、(b)のグラフに示す測定試料について表示される画面300が例示されている。
図14、15に示す例では、標的粒子の測定の成否の判定結果が異なっている。以下、図14、15を参照して画面300の構成を説明する。
分析結果領域310は、分析工程S26で取得されたCTC数やCTCの割合などの、CTCの数に関する値を表示する。細胞画像領域320は、図7に示した検出工程S21で取得された蛍光画像を表示する。医師等は、分析結果領域310に表示されたCTCの数に関する値と、細胞画像領域320に表示された細胞の画像とを参照することにより、検体が採取された被検者に対する診断を行うことができる。
グラフ領域330は、計測粒子数のグラフ331、332を表示する。グラフ331、332は、検出された粒子の数の時間的変化を示すグラフである。グラフ331は、単位時間ごとの計測粒子数のグラフである。グラフ331には、近似式の生成において粒子を除外するための閾値Nthが破線で示されている。グラフ332は、グラフ331から閾値Nth以上の計測粒子数のみが残されたグラフである。グラフ332には、グラフ332上の計測粒子数に基づいて生成された近似式が示されている。このように、グラフ331、332が表示部13に表示されると、オペレータは、グラフ331、332を参照して、検出結果を把握できる。
判定結果領域340は、実際に検出された粒子の数と、推定値と、検出率と、判定で用いられた閾値Rthと、標的粒子の測定の成否の判定結果と、を表示する。図14に示す例では、検出率が閾値Rth以上であるため、制御部11は、標的粒子の測定が適正であったと判定し、「測定が正しく行われました。」とのメッセージを判定結果領域340に表示している。この場合、オペレータは、測定結果の信頼性が高いことを把握できる。一方、図15に示す例では、検出率が閾値Rth未満であるため、制御部11は、標的粒子の測定が不適正であったと判定し、「測定が正しく行われませんでした。」とのメッセージを判定結果領域340に表示している。この場合、オペレータは、測定結果の信頼性が低いことを把握できる。このように、標的粒子の測定の成否の判定結果が表示部13に表示されると、オペレータは、判定結果を参照して標的粒子の測定の成否を円滑に把握できる。
また、医師等は、測定の成否の判定結果を参照することにより、標的粒子の測定が正しく行われた場合に、分析結果領域310と細胞画像領域320に基づく診断を行うことができ、標的粒子の測定が正しく行われなかった場合に、分析結果領域310と細胞画像領域320に基づく診断を保留できる。
なお、標的粒子の測定が不適正であったと判定した場合には、表示工程S27において表示部13に表示される画面300において、分析結果領域310および細胞画像領域320に分析結果および細胞の画像を表示しない構成としてもよい。これにより、標的粒子の測定が不適正であった場合に、医師等が不適切な結果に基づいて被検者に対する診断を行うことを防止できる。
実施形態1の測定試料は、標的粒子であるCTCに加えて、CTCよりも数の多い白血球を他の粒子として含んでいる。このように、実施形態1では、測定試料がある程度の数の他の粒子を含んでいるため、上記のような測定の成否の判定が可能となる。したがって、たとえば、測定試料が、希少細胞であるCTCのみを含む場合など、全体として僅かな粒子しか含まない場合は、測定試料に例えばビーズ等の他の粒子を混合して、測定試料中の粒子数をある程度増やすのが好ましい。測定試料中の粒子数が増えると、図7に示した検出工程S21で検出される粒子の数が増えるため、上記のような測定の成否の判定が可能となる。
<測定成否判定方法の第1の検証>
次に、発明者らが行った測定成否判定方法の第1の検証について説明する。第1の検証では、上記の実施形態1の手順に基づいて取得した検出率を用いて、真の検出率であるデータ取得率と比較して、測定の成否をどの程度適正に判定できるかを検証した。第1の検証は、以下に示す手順1−1、1−2、1−3、1−4、1−5からなる。
次に、発明者らが行った測定成否判定方法の第1の検証について説明する。第1の検証では、上記の実施形態1の手順に基づいて取得した検出率を用いて、真の検出率であるデータ取得率と比較して、測定の成否をどの程度適正に判定できるかを検証した。第1の検証は、以下に示す手順1−1、1−2、1−3、1−4、1−5からなる。
1−1.測定試料の調製
CTCモデル細胞株から得られたCTCを、所定の試薬により染色した。そして、CTCが18000個含まれるようにCTCをPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に添加し、測定試料を調製した。CTCのカウントは、血球計算盤を用いて顕微鏡により行われた。このような測定試料を8種類調製した。なお、この場合の測定試料は、CTC以外の白血球などの血球を含まない。
CTCモデル細胞株から得られたCTCを、所定の試薬により染色した。そして、CTCが18000個含まれるようにCTCをPBS(リン酸緩衝生理食塩水)に添加し、測定試料を調製した。CTCのカウントは、血球計算盤を用いて顕微鏡により行われた。このような測定試料を8種類調製した。なお、この場合の測定試料は、CTC以外の白血球などの血球を含まない。
1−2.粒子数の計測
手順1−1で調製した8種類の測定試料をそれぞれ試料測定装置10(図2参照)に供給し、試料測定装置10において測定試料を測定した。ここでは、測定試料の全量を測定し、測定時間は4500秒とした。測定によって取得された明視野画像に基づいて、20秒ごとの計測粒子数を取得した。ここで、8種類の測定試料のうちいくつかの測定試料を測定する際に、フローセル110を流れる測定試料に対してフォーカスをずらすことにより、意図的に検出に不具合を生じさせた。
手順1−1で調製した8種類の測定試料をそれぞれ試料測定装置10(図2参照)に供給し、試料測定装置10において測定試料を測定した。ここでは、測定試料の全量を測定し、測定時間は4500秒とした。測定によって取得された明視野画像に基づいて、20秒ごとの計測粒子数を取得した。ここで、8種類の測定試料のうちいくつかの測定試料を測定する際に、フローセル110を流れる測定試料に対してフォーカスをずらすことにより、意図的に検出に不具合を生じさせた。
1−3.データ取得率の算出
8種類の測定試料ごとに、手順1−2の測定で得られた計測粒子数の合計を、元の18000個で除算することにより、データ取得率を算出した。粒子数の18000は、上述したように、測定試料中の粒子を実際にカウントして取得された値であり、試料測定装置10に実際に供給された粒子数である。このように、あらかじめ試料測定装置10に供給された粒子の真の個数が分かると、算出されたデータ取得率は、試料測定装置10により検出された粒子の検出率を真に反映した値となる。したがって、データ取得率は、測定の成否を確実に判定できる真の検出率と言える。
8種類の測定試料ごとに、手順1−2の測定で得られた計測粒子数の合計を、元の18000個で除算することにより、データ取得率を算出した。粒子数の18000は、上述したように、測定試料中の粒子を実際にカウントして取得された値であり、試料測定装置10に実際に供給された粒子数である。このように、あらかじめ試料測定装置10に供給された粒子の真の個数が分かると、算出されたデータ取得率は、試料測定装置10により検出された粒子の検出率を真に反映した値となる。したがって、データ取得率は、測定の成否を確実に判定できる真の検出率と言える。
1−4.検出率の算出
8種類の測定試料ごとに、上述した実施形態1の手順と同様にして、検出率を算出した。
8種類の測定試料ごとに、上述した実施形態1の手順と同様にして、検出率を算出した。
具体的には、上述したように、計測粒子数が1以上である計測粒子数の平均V1を算出し、計測粒子数が1以上である計測粒子数の1SDの値V2を算出した。そして、平均V1−値V2を閾値Nthとして、閾値Nth以上の計測粒子数のみを残して計測粒子数のグラフを生成した。そして、生成されたグラフの計測粒子数に基づいて、近似式を取得した。そして、実施形態1の手順と同様にして、近似式を、0秒から4500秒まで積分して推定値を算出した。そして、手順1−2の測定で得られた計測粒子数の合計を推定値で除算することにより、検出率を取得した。
1−5.散布図の作成
図16は、手順1−3で取得したデータ取得率と手順1−4で取得した検出率との散布図である。散布図には、8種類の測定試料について、データ取得率と検出率からなる点がプロットされている。図16の散布図において、上述したようにいくつかの測定試料を測定する際に意図的に検出に不具合を生じさせたため、いくつかの測定試料においてデータ取得率が低くなっている。作成した散布図に基づいて、一次線形回帰式と決定係数を算出した。一次線形回帰式はy=1.0469x−0.0224であり、決定係数は0.9727であった。
図16は、手順1−3で取得したデータ取得率と手順1−4で取得した検出率との散布図である。散布図には、8種類の測定試料について、データ取得率と検出率からなる点がプロットされている。図16の散布図において、上述したようにいくつかの測定試料を測定する際に意図的に検出に不具合を生じさせたため、いくつかの測定試料においてデータ取得率が低くなっている。作成した散布図に基づいて、一次線形回帰式と決定係数を算出した。一次線形回帰式はy=1.0469x−0.0224であり、決定係数は0.9727であった。
以上の手順を経て作成された散布図において、決定係数が1に近い値であることから、8種類の測定試料についてプロットされた点は概ね一次線形回帰式に沿って並んでおり、データ取得率と検出率との間には高い相関関係があると言える。
ここで、手順1−4の検出率の算出に用いられる推定値は、近似式に基づく値であり、試料測定装置10に供給されたと推定される粒子の個数である。本来、試料測定装置10においてどれだけの粒子が検出されたかを確実に取得するためには、測定前に測定試料に対して目視等を行って、測定試料に含まれる粒子の真の個数を取得する必要がある。しかしながら、図16に示すように、推定値に基づく検出率は、測定の成否を確実に反映したデータ取得率との間で相関関係があることが示された。このことから、測定の成否を判定する際にデータ取得率に代えて検出率を用いたとしても、測定の成否を適正に判定できることが示された。
さらに、図16に示すように、データ取得率と検出率との間に相関関係があることから、検出率に基づいて測定の精度を評価できることが分かった。たとえば、図16に示す例の場合、所望のデータ取得率を達成するためには、検出率は、少なくとも所望のデータ取得率と同程度の値以上であるのが好ましいことが分かる。よって、図7に示した測定の成否の判定工程S25によれば、検出率が所定の閾値Rthよりも大きいか否かに基づいて測定の成否を判定できることが示された。
<測定成否判定方法の第2の検証>
次に、発明者らが行った測定成否判定方法の第2の検証について説明する。第2の検証では、検出率による測定の成否の判定が、計測粒子数のグラフを人目で確認することにより判断される測定の成否に対して一致するか否かを検証した。また、第2の検証では、検出率に基づく測定の成否の判定により、CTCが適正に検出できたか否かを判定できることを検証した。第2の検証は、以下に示す手順2−1、2−2、2−3、2−4、2−5からなる。
次に、発明者らが行った測定成否判定方法の第2の検証について説明する。第2の検証では、検出率による測定の成否の判定が、計測粒子数のグラフを人目で確認することにより判断される測定の成否に対して一致するか否かを検証した。また、第2の検証では、検出率に基づく測定の成否の判定により、CTCが適正に検出できたか否かを判定できることを検証した。第2の検証は、以下に示す手順2−1、2−2、2−3、2−4、2−5からなる。
2−1.測定試料の調製
CTCモデル細胞株から得られたCTCを、所定の試薬により染色した。そして、CTCの数をカウントした上で、CTCを健康人の血液に添加し、測定試料を調製した。CTCのカウントは、顕微鏡を用いて行われた。このような測定試料を54種類調製した。なお、この場合の測定試料は、CTC以外の白血球などの血球を含む。
CTCモデル細胞株から得られたCTCを、所定の試薬により染色した。そして、CTCの数をカウントした上で、CTCを健康人の血液に添加し、測定試料を調製した。CTCのカウントは、顕微鏡を用いて行われた。このような測定試料を54種類調製した。なお、この場合の測定試料は、CTC以外の白血球などの血球を含む。
2−2.粒子数の計数
手順2−1で調製した54種類の測定試料をそれぞれ試料測定装置10(図2参照)に供給し、試料測定装置10において測定試料を測定した。ここでは、測定試料の全量を測定し、測定時間は4500秒とした。測定によって取得された明視野画像に基づいて、20秒ごとの計測粒子数を取得した。なお、上述した図11(a)、(b)および図12(a)、(b)に、54種類の測定試料を代表して2つの測定試料の結果をグラフに示している。
手順2−1で調製した54種類の測定試料をそれぞれ試料測定装置10(図2参照)に供給し、試料測定装置10において測定試料を測定した。ここでは、測定試料の全量を測定し、測定時間は4500秒とした。測定によって取得された明視野画像に基づいて、20秒ごとの計測粒子数を取得した。なお、上述した図11(a)、(b)および図12(a)、(b)に、54種類の測定試料を代表して2つの測定試料の結果をグラフに示している。
2−3.検出率の算出
54種類の測定試料ごとに、上述した実施形態1の手順、および、第1の検証の手順1−4と同様にして、検出率を算出した。
54種類の測定試料ごとに、上述した実施形態1の手順、および、第1の検証の手順1−4と同様にして、検出率を算出した。
2−4.検出率の分布図の作成
図17は、測定成否判定方法の検証において作成された分布図である。図17に示すように、54種類の測定試料に基づいて取得された検出率をプロットすることにより、分布図が作成された。
図17は、測定成否判定方法の検証において作成された分布図である。図17に示すように、54種類の測定試料に基づいて取得された検出率をプロットすることにより、分布図が作成された。
ここで、上述したように、検出率と比較する閾値Rthは、どの程度の粒子を検出する必要があるかに基づいて決められる。たとえば、検出率の目標値として80%を設定した場合、検出率が80%の−2SD以上、すなわち64%以上であることが好ましいとして、閾値Rthを64%に設定してもよい。あるいは、検出率が80%の−1SD以上、すなわち72%以上であることが好ましいとして、閾値Rthを72%に設定してもよい。このような閾値Rthの設定は、病院の要望や検査施設の運用等によって異なる。
図17の分布図において、閾値Rthが64%と72%のいずれに設定された場合も、49種類の測定試料において測定が適正であったと判定され、5種類の測定試料において測定が不適正であったと判定された。発明者らは、測定が適正と判定された測定試料について計測粒子数のグラフを確認したところ、図11(a)、(b)と同様に、計測粒子数が極端に少ない時間帯が短いことが分かった。また、発明者らは、測定が不適正と判定された測定試料について計測粒子数のグラフを確認したところ、図12(a)、(b)と同様に、計測粒子数が極端に少ない時間帯が長いことが分かった。
以上のように、測定成否判定方法によれば、測定の成否を適正に判定できることが示唆された。
2−5.CTC回収率の算出
図18(a)、(b)は、54種類の測定試料のうち、図11(a)、(b)および図12(a)、(b)に示す2つの測定試料とは別の測定試料について取得された計測粒子数のグラフである。ここで、閾値Rthを72%とした場合、図18(a)の場合は、検出率が88.2%であるため検出は適正に行われたと判定され、図18(b)の場合は、検出率が68.4%であるため検出は適正に行われなかったと判定された。
図18(a)、(b)は、54種類の測定試料のうち、図11(a)、(b)および図12(a)、(b)に示す2つの測定試料とは別の測定試料について取得された計測粒子数のグラフである。ここで、閾値Rthを72%とした場合、図18(a)の場合は、検出率が88.2%であるため検出は適正に行われたと判定され、図18(b)の場合は、検出率が68.4%であるため検出は適正に行われなかったと判定された。
ここで、図18(a)、(b)のそれぞれの測定試料に対して、図7に示した分析工程S26と同様にして、CTCの数を取得した。また、図18(a)、(b)のそれぞれの測定試料に対して、手順2−5で取得したCTCの数を、手順2−1でカウントしたCTCの数で除算することにより、CTC回収率を算出した。図18(a)の場合は、CTC回収率は36.7%であり、図18(b)の場合は、CTC回収率は28%であった。
図18(a)に示すように測定が適正と判定された場合に、CTC回収率が高く、図18(b)に示すように測定が不適正と判定された場合に、CTC回収率が低くなった。したがって、上記のような測定の成否の判定が行われた場合に、測定の成否とCTC回収率との間に相関関係があることが示唆された。
<実施形態2>
実施形態1では、推定値の取得工程S23(図7参照)において、撮像部170(図5参照)が撮像した撮像画像に基づく計測粒子数により推定値を生成した。これに対し、実施形態2では、推定値の取得工程S23において、図5に示すような4つの光検出器152が受光した光に基づく検出信号の値に基づいて推定値を算出する。
実施形態1では、推定値の取得工程S23(図7参照)において、撮像部170(図5参照)が撮像した撮像画像に基づく計測粒子数により推定値を生成した。これに対し、実施形態2では、推定値の取得工程S23において、図5に示すような4つの光検出器152が受光した光に基づく検出信号の値に基づいて推定値を算出する。
実施形態2では、計測工程S22(図7参照)において、制御部11(図2参照)は、明視野光に対応する波長λ14の光を受光した光検出器の検出信号を単位時間ごとに積分して、検出信号の値を取得する。推定値の取得工程S23(図7参照)において、制御部11は、単位時間ごとに検出された検出信号の値の時間的変化を近似する近似式を求め、近似式で規定される検出信号の値の総和を推定値として取得する。検出率の取得工程S24(図7参照)において、推定値に対する、測定において実際に検出された検出信号の値の総和の割合を検出率として取得する。実施形態2のその他の構成は、実施形態1と同様である。
図19(a)〜(c)を参照して、実施形態2の推定値および検出率の取得について説明する。
実施形態2では、波長λ14の光に基づく検出信号が単位時間ごとに積分され、単位時間ごとに検出信号の値が取得される。図19(a)において、横軸は経過時間を示し、縦軸は、各単位時間における検出信号の値を示す。図19(a)上の1つのプロットは、単位時間において積分された光検出器の検出信号、すなわち単位時間における検出信号の値である。
制御部11は、図19(a)の各プロットに対応するデータに基づいて、実施形態1と同様にして、推定値および検出率を取得する。
具体的には、制御部11は、図19(a)に対応するデータに基づいて閾値Nthを生成し、図19(b)に示すように、閾値Nth以上の検出信号の値に基づいて近似式を取得する。そして、制御部11は、近似式を、TminからTmaxまで積分して推定値を算出する。なお、この場合も、単位時間ごとに検出信号の値が取得されているため、制御部11は、縦軸方向に1/20に縮小した近似式をTminからTmaxにわたって積分して推定値を算出する。このように算出された推定値は、今回の測定において、期待される検出信号の合計の推定値、すなわち検出の不具合がなければ取得されたであろう検出信号の合計の推定値を意味している。なお、この推定値は、図19(b)に示す面積Aに対応する。
また、制御部11は、測定において実際に取得された検出信号の値(実測値)を算出する。測定において実際に取得された検出信号の値は、単位時間ごとの検出信号の値の合計である。図19(c)に示す例では、単位時間ごとの検出信号の値の合計は、面積A1+A2+A3+A4に対応する。そして、制御部11は、期待される検出信号の合計(推定値)と、測定において実際に取得された検出信号の値の合計(実測値)と、の比に基づいて、検出率を算出する。たとえば、制御部11は、実測値に対応する面積を推定値に対応する面積で除算して、検出率を取得する。図19(a)〜(c)に示す例では、検出率は(A1+A2+A3+A4)/Aに対応する。
実施形態2においても、検出率と閾値Rthとを比較することにより、標的粒子の測定の成否を判定できる。これにより、測定試料に含まれる粒子が実際に少ないために検出された粒子の数が少なかったのか、検出の不具合により検出された粒子の数が少なかったのかを判別できる。
<実施形態3>
図6を参照し、実施形態3では、実施形態1と比較して、第1の送液ユニット210が、チャンバ240の底部から測定試料を引き込むのではなく、チャンバ240の上側から測定試料を引き込むよう構成されている。実施形態3では、測定試料内の粒子が沈降することにより、フローセル110に送られる測定試料中の粒子の数が減少し、時間の経過とともに計測粒子数が減少する不具合が起こり得る。この場合、実施形態1の測定成否判定方法によれば、推定値が低くなることにより検出率が高くなるため、測定が不適正にもかかわらず、適正と判定されてしまうおそれがある。
図6を参照し、実施形態3では、実施形態1と比較して、第1の送液ユニット210が、チャンバ240の底部から測定試料を引き込むのではなく、チャンバ240の上側から測定試料を引き込むよう構成されている。実施形態3では、測定試料内の粒子が沈降することにより、フローセル110に送られる測定試料中の粒子の数が減少し、時間の経過とともに計測粒子数が減少する不具合が起こり得る。この場合、実施形態1の測定成否判定方法によれば、推定値が低くなることにより検出率が高くなるため、測定が不適正にもかかわらず、適正と判定されてしまうおそれがある。
たとえば、図20(a)に示すような計測粒子数のグラフが取得された場合、このグラフに基づいて近似式を生成すると、図20(b)のような近似式が生成される。この場合、時間帯Ta11において計測粒子数が低下しているため、近似式で規定される面積すなわち推定値が小さくなる。このため、図20(a)の計測粒子数の合計を推定値で除算することにより得られる検出率が高くなり、測定が不適正にもかかわらず、適正と判定されてしまう。
そこで、実施形態3では、全時間帯のうち、粒子沈降が進んでいると判断できる所定タイミング以降の時間帯を除外して近似式が求められる。粒子沈降が進んでいると判断できる所定タイミングは、たとえばストークスの式等、粒子沈降に関する理論式に基づいて決められる。なお、実施形態3のその他の構成は、実施形態1と同様である。
図20(c)に示すように、実施形態3では、所定タイミング以降の時間帯Ta11の計測粒子数を除外し、所定のタイミングより前の時間帯Ta12の計測粒子数に基づいて近似式が生成される。これにより、図20(c)の近似式は、図20(b)で生成された近似式よりも平行に近付けられるため、近似式で規定される面積すなわち推定値は、図20(b)の場合よりも大きくなる。そして、実施形態3では、図20(a)の計測粒子数の合計を、図20(c)の近似式に基づいて取得された推定値で除算することにより検出率が求められる。この場合の検出率は、図20(b)の比較例に比べて小さくなる。したがって、実施形態3によれば、実施形態1と同様に検出率と閾値Rthを比較することにより、意図せず粒子沈降が生じた場合でも検出の不具合を判定できる。
なお、実施形態3では、全時間帯のうち所定タイミング以降の時間帯を除外して近似式が求められたが、これに限らず、全時間帯のうち不具合が前半に生じることが予想される場合は、所定タイミング以前の時間帯を除外して近似式が求められてもよい。また、全時間帯のうち不具合が所定の時間帯に生じることが予想される場合は、所定の時間帯を除外して近似式が求められてもよい。
<実施形態4>
実施形態4では、計測粒子数のグラフにおいて、全時間帯に対する、粒子が適正に検出された時間帯の割合が検出率として取得される。実施形態4のその他の構成は、実施形態1と同様である。
実施形態4では、計測粒子数のグラフにおいて、全時間帯に対する、粒子が適正に検出された時間帯の割合が検出率として取得される。実施形態4のその他の構成は、実施形態1と同様である。
たとえば、図21(a)に示すような計測粒子数のグラフが取得される場合、制御部11(図2参照)は、実施形態1と同様にして、図21(b)に示すように、検出に不具合が生じている可能性を判断するための閾値Nthを取得する。そして、制御部11は、計測粒子数が閾値Nth以上の時間帯の合計時間を取得する。図21(a)、(b)に示す例では、計測粒子数が閾値Nth以上の時間帯の合計時間は、Ta21+Ta22+Ta23である。そして、制御部11は、計測粒子数が閾値Nth以上の時間帯の合計時間を、測定試料の測定における全時間帯の合計時間で除算することにより、検出率を取得する。図21(a)、(b)に示す例では、全時間帯の合計時間は、Ta20である。したがって、この場合の検出率は、(Ta21+Ta22+Ta23)/Ta20となる。
以上のように、実施形態4においても、全時間帯に対する、検出が適正に行われたと判断される時間帯の割合が検出率として取得されるため、実施形態1と同様に、標的粒子の測定の成否を判定できる。
なお、制御部11は、計測粒子数が閾値Nth未満の時間帯の合計時間を、全時間帯の合計時間で除算することにより、検出率を取得してもよい。図21(a)、(b)に示す例では、この場合の検出率は、{Ta20−(Ta21+Ta22+Ta23)}/Ta20となる。この場合、検出率が閾値Rth以下であれば、測定が適正であると判定され、検出率が閾値Rthより大きければ、測定が不適正であると判定される。また、検出率は、(Ta21+Ta22+Ta23)/{Ta20−(Ta21+Ta22+Ta23)}でもよい。また、上記の検出率の算出式において、分母と分子が逆でもよい。
また、全血から測定試料が調製される場合には、測定試料に含まれる粒子の数は、測定試料ごとに極端に異なることは少ない。このように測定試料に含まれる粒子の数が大きく変化しない場合には、実施形態3のように時間の比率に基づく検出率により、標的粒子の測定の成否を判定してもよい。これに対し、測定試料に含まれる粒子の数が大きく変化する場合、および、標的粒子の測定の成否をより正確に判断したい場合には、実施形態1のように粒子数の比率に基づく検出率により、標的粒子の測定の成否を判定するのが好ましい。
10 試料測定装置
11 制御部
13 表示部
100 検出部
110 フローセル
111 流路
331、332 グラフ
11 制御部
13 表示部
100 検出部
110 フローセル
111 流路
331、332 グラフ
Claims (26)
- 測定試料に含まれる標的粒子の測定における測定成否判定方法であって、
前記測定試料中の前記標的粒子および前記標的粒子以外の他の粒子を検出し、
少なくとも前記他の粒子の検出結果に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する、測定成否判定方法。 - 前記測定の成否の判定において、
前記粒子の検出において検出した前記標的粒子および前記他の粒子の検出結果に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する、請求項1に記載の測定成否判定方法。 - 少なくとも前記他の粒子の検出結果に基づいて、前記測定において検出された前記標的粒子の検出率に関する値を算出し、
前記測定の成否の判定において、
前記検出率に関する値に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する、請求項1または2に記載の測定成否判定方法。 - 前記検出率に関する値の算出において、
単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数に基づいて、前記測定において検出が期待される少なくとも前記他の粒子の数に関する推定値を算出し、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数と、に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項3に記載の測定成否判定方法。 - 前記検出率に関する値の算出において、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数と、の比に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項4に記載の測定成否判定方法。 - 前記検出率に関する値の算出において、
前記推定値に対する前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数の割合に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項4に記載の測定成否判定方法。 - 前記検出率に関する値の算出において、
前記単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数に基づいて、前記測定において検出される少なくとも前記他の粒子の数の時間的変化を近似する近似式を算出し、
前記近似式に基づいて、前記測定において検出が期待される少なくとも前記他の粒子の数に関する推定値を算出する、請求項4ないし6の何れか一項に記載の測定成否判定方法。 - 前記近似式の算出において、検出された少なくとも前記他の粒子が所定数以下の時間帯を除外し、前記近似式を算出する、請求項7に記載の測定成否判定方法。
- 前記測定試料を測定した全時間帯のうち所定タイミング以前の時間帯を除外し、前記近似式を算出する、請求項7または8に記載の測定成否判定方法。
- 前記測定試料を測定した全時間帯のうち所定タイミング以降の時間帯を除外し、前記近似式を算出する、請求項7ないし9の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
- 前記測定の成否の判定において、
前記検出率に関する値を所定の閾値と比較し、前記標的粒子の測定の成否を判定する、請求項3ないし10の何れか一項に記載の測定成否判定方法。 - 使用者の入力に応じて前記所定の閾値を変更する、請求項11に記載の測定成否判定方法。
- 前記測定の成否の判定結果を表示部に表示する、請求項1ないし12の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
- 前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数の時間的変化を示すグラフを前記表示部に表示する、請求項13に記載の測定成否判定方法。
- 前記検出率に関する値の算出において、
単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子から得られる検出信号の値に基づいて、前記測定において検出が期待される検出信号の値に関する推定値を算出し、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された検出信号の値と、に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項3に記載の測定成否判定方法。 - 前記検出率に関する値の算出において、
単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数が所定数以上の時間および/または前記単位時間ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数が所定数以下の時間の情報に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項3に記載の測定成否判定方法。 - 前記標的粒子および前記他の粒子の検出において、
前記測定試料を流路に流し、前記流路を流れる前記測定試料中の前記標的粒子および前記他の粒子を検出する、請求項1ないし16の何れか一項に記載の測定成否判定方法。 - 前記標的粒子および前記他の粒子の検出において、
フローセルに形成された流路に前記測定試料を流し、
前記流路を流れる前記測定試料に光を照射し、前記測定試料から生じた光を検出する、請求項1ないし17の何れか一項に記載の測定成否判定方法。 - 前記標的粒子および前記他の粒子の検出において、複数の画像に基づいて前記測定試料に含まれる前記標的粒子および前記他の粒子を検出し、
前記検出率に関する値の算出において、前記画像ごとに検出した少なくとも前記他の粒子の数に基づいて、前記測定において検出が期待される少なくとも前記他の粒子の数に関する推定値を算出し、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された少なくとも前記他の粒子の数と、に基づいて、前記検出率に関する値を算出する、請求項3に記載の測定成否判定方法。 - 前記標的粒子および前記他の粒子は、細胞である、請求項1ないし19の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
- 前記測定試料中の前記標的粒子の数は、前記測定試料中の他の粒子の数より少ない、請求項1ないし20の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
- 前記標的粒子は血中循環腫瘍細胞であり、前記他の粒子は白血球である、請求項1ないし21の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
- 前記血中循環腫瘍細胞および前記白血球を大きさの違いに基づいて、血液中に含まれる前記白血球の一部を除外することで前記測定試料を調製し、
前記測定の成否の判定において、前記測定試料の調製において除去されなかった白血球の検出結果に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する、請求項22に記載の測定成否判定方法。 - 前記標的粒子の数に関する値を表示部に表示する、請求項1ないし23の何れか一項に記載の測定成否判定方法。
- 測定試料に含まれる標的粒子を測定する試料測定装置であって、
前記測定試料中の前記標的粒子および前記標的粒子以外の他の粒子を検出する検出部と、
少なくとも前記他の粒子の検出結果に基づいて、前記標的粒子の測定の成否を判定する制御部と、を備える、試料測定装置。 - 測定試料中の粒子を検出し、
単位時間ごとに検出した前記粒子の数に基づいて、測定において検出が期待される前記粒子の数に関する推定値を算出し、
前記推定値と、前記測定において実際に検出された前記粒子の数と、に基づいて、検出率に関する値を算出し、
前記検出率に関する値に基づいて、前記粒子の測定の成否を判定する、測定成否判定方法。
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