CN102943117A - 大豆内生细菌多样性的pcr-dgge分析方法 - Google Patents

Abstract

大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，涉及一种大豆内生细菌多样性的分析方法。是要解决传统培养方法不能全面、准确反映大豆内生细菌的种群结构、细菌多样性的问题。方法：一、大豆根表面的清理及灭菌；二、提取的大豆根的总DNA；三、大豆根总DNA的纯化；四、以大豆根总DNA为模板，进行第一次PCR扩增，纯化得产物A；五、以产物A为模板，进行第二次PCR扩增，纯化得产物B；六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，确定变性剂浓度梯度为30％～70％；七、水平电泳，电泳结束后染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法。用于分析大豆内生细菌多样性。

Description

大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法

技术领域

本发明涉及一种大豆内生细菌多样性的分析方法。

背景技术

植物内生细菌是植物微生态系统中的天然组成成分，人们发现健康植物体内存在细菌，并且已经认识到植物内生细菌具有促进宿主或周围其他植物的生长、增强宿主植物的抗性等作用。随着越来越多的细菌从不同植物体内分离到，有关内生细菌的研究才逐渐引起人们的广泛关注。植物内生细菌作为生防因子在预防植物病虫害方面具有广泛的应用前景，它们不仅能够减轻和防治植物病害，而且能够减少因使用化学农药带来的环境污染等问题。

人们对植物内生细菌的研究多数采用传统培养方法，对其生物学功能进行研究。但是，由于人们对内生细菌的生长条件尚不清楚，所用分离培养基不能满足所有内生细菌的营养需求，仅有很少一部分内生细菌能够被分离到。因此，传统培养方法不能全面客观的反映植物内生细菌的种群结构、细菌多样性等信息。

发明内容

本发明是要解决传统培养方法不能全面、准确反映大豆内生细菌的种群结构、细菌多样性的问题，提供大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法。

本发明大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，按以下步骤进行：

一、大豆根表面的清理及灭菌；

二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA；

三、大豆根总DNA的纯化；

四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；

五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段，然后以产物A为模板，采用添加了GC碱基片段的引物968F和1378R为引物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B；

六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向DGGE胶的加样孔中加入200μL产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30％～70％；

七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30％～70％，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向每个加样孔加入10μL产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物1492R  序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT  -3’；步骤五中引物968F  序列为5’-AACGCGAAGAACCTTAC  -3’，引物1378R  序列为5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物968F的5’端加上的碱基片段为CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

本发明的有益效果：

本发明方法能全面、准确反映大豆内生细菌的种群结构、细菌多样性。与传统的培养方法相比该方法具有操作简便、快速、重复性好等优势，在24小时内即可获得结果，在快速同时还能对比分析大量样品，因此它可以对比分析大豆不同组织部位的内生细菌群落的差异，也可以研究同一部位的不同生长时期的变化过程。

此外，该方法可以对胶片中的单一条带进行分析：直接从胶中回收DNA，然后构建其克隆文库，再对其中的克隆进行测序，分析种属多样性等。

附图说明

图1为具体实施方式五步骤二中提取的大豆根的总DNA的电泳图；图2为具体实施方式五步骤四获得的产物A的电泳图；图3为具体实施方式五步骤五获得的产物B的电泳图；图4为具体实施方式五步骤六中垂直电泳；图5为具体实施方式五步骤七中水平电泳图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，按以下步骤进行：

一、大豆根表面的清理及灭菌；

二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA；

三、大豆根总DNA的纯化；

四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；

五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段，然后以产物A为模板，采用添加了GC碱基片段的引物968F和1378R为引物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B；

六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向DGGE胶的加样孔中加入200μL产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30％～70％；

七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30％～70％，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向每个加样孔加入10μL产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物1492R  序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT  -3’；步骤五中引物968F  序列为5’-AACGCGAAGAACCTTAC  -3’，引物1378R  序列为5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物968F的5’端加上的碱基片段为CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

具体实施方式二：本实施方式是对具体实施方式一所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法的步骤一做进一步的说明，步骤一中大豆根表面的清理及灭菌的具体步骤为：用自来水冲洗大豆根表面土壤，滤纸吸干，按照以下顺序处理：无菌水冲洗3次，体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡3min，体积浓度为2.5％次氯酸钠溶液浸泡3min，体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干。

具体实施方式三：本实施方式是对具体实施方式一所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法的步骤四做进一步的说明，步骤四中第一次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸8min，4℃保温。

具体实施方式四：本实施方式是对具体实施方式一所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法的步骤五做进一步的说明，步骤五中第二次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，前14个循环为94℃变性1min，68-55℃复性45s，72℃延伸1min，其中每个循环后复性温度下降1℃，后16个循环为94℃变性1min，55℃复性45sec，72℃延伸1min；最终72℃延伸8min，4℃保温。

具体实施方式五：本实施方式选取3个不同生长时期的大豆根进行分析，本实施方式大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，按以下步骤进行：

一、大豆根表面的清理及灭菌：用自来水冲洗大豆根表面土壤，滤纸吸干，按照以下顺序处理：无菌水冲洗3次，体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡3min，体积浓度为2.5％次氯酸钠溶液浸泡3min，体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干；

二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA；

三、大豆根总DNA的纯化：将提取的大豆根总DNA于0.8％琼脂糖凝胶电泳，使用胶回收试剂盒进行纯化；

四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；

五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段，然后以产物A为模板，采用添加了GC碱基片段的引物968F和1378R为引物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B(以产物B为变性梯度凝胶电泳的上样样品)；

六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向DGGE胶的加样孔中加入200μL产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30％～70％；

七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30％～70％，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向每个加样孔加入10μL产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物1492R  序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT  -3’；步骤五中引物968F  序列为5’-AACGCGAAGAACCTTAC  -3’，引物1378R  序列为5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物968F的5’端加上的碱基片段为CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

本实施方式所述胶回收试剂盒为购买自TIANGEN公司的Universal DNA PurificationKit，按说明书操作。

本实施方式步骤二中采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA的具体步骤为：

1、取1g灭菌后的大豆根，置于无菌的研钵中，用液氮研磨成粉末；

2、将粉末转移至10mL无菌离心管中，加入1.8mL CTAB抽提缓冲液颠倒混匀，60℃水浴45min，期间颠倒混匀数次；其中CTAB抽提缓冲液由1％CTAB(W/V)、100mMTris.HCl(pH 8.0)、1.5M NaCl、100mM EDTA和1％PVP40(W/V)组成；

3、加入200μL 10％SDS(W/V)，60℃水浴1h，期间颠倒混匀数次；

4、加入等体积酚/氯仿/异戊醇，充分混匀，于4℃，13500rpm离心10min；

5、将上清转移至一新的无菌离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇，充分混匀，于4℃，13500rpm离心10min。

6、将上清转移至一新的无菌离心管中，加入2倍体积-4℃无水乙醇，充分混匀，20℃放置30min，然后于4℃，13500rpm离心10min。

7、弃上清，加入1mL75％乙醇溶液洗涤DNA沉淀，于4℃，13500rpm离心10min；

8、弃上清，超净工作台中干燥，用20μL TE缓冲液溶解DNA沉淀。

步骤四中第一次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸8min，4℃保温。

步骤五中第二次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，前14个循环为94℃变性1min，68-55℃复性45s，72℃延伸1min，其中每个循环后复性温度下降1℃，后16个循环为94℃变性1min，55℃复性45sec，72℃延伸1min；最终72℃延伸8min，4℃保温。

步骤七中染色方法为：

(1)DGGE胶用固定液(由体积浓度为10％的乙醇溶液和体积浓度为0.5％冰醋酸组成)固定15min，去离子水冲洗两次；

(2)银染液(由质量浓度为0.2％硝酸银和质量浓度为0.15％甲醛组成)染色15min，去离子水冲洗两次；

(3)显色液(由质量浓度为1.5％氢氧化钠和质量浓度为0.5％甲醛组成)显色5-7min；

(4)最后用终止液(由体积浓度为10％乙醇和体积浓度为0.5％冰醋酸组成)终止反应。

本实施方式步骤二中提取的大豆根的总DNA的电泳图如图1所示，图1中M为Marker，泳道1和泳道2为大豆根的总DNA；步骤四获得的产物A的电泳图如图2所示，图2中M为Marker，泳道1产物A；步骤五获得的产物B的电泳图如图3所示，图3中M为Marker，泳道1、泳道2和泳道3产物A；步骤六中垂直电泳图如图4所示，通过垂直胶电泳时条带呈现“S”型，可以得到实验样品在0-100％的变性胶中的变性范围(图4中从左到右变性剂浓度为10％～100％)，从而计算出适合该样品的变性范围为30％-70％。步骤七中水平电泳图如图5所示，图5中3个泳道为3个不同生长时期的大豆根的上样样品，从左到右分别为幼苗期、花芽分化期和开花结荚期，由图看出不同生长时期的大豆根的内生细菌菌群有很大差异，针对特异性条带可以做胶回收，然后测序对其种属做进一步确定。

Claims (4)

1.大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、大豆根表面的清理及灭菌；

二、采用CTAB法提取灭菌后的大豆根的总DNA；

三、大豆根总DNA的纯化；

四、以纯化后的大豆根总DNA为模板，以799F和1492R为引物，进行第一次PCR扩增，将第一次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物A；

五、在引物968F的5’端加上40bp含GC碱基的片段，然后以产物A为模板，采用添加了GC碱基片段的引物968F和1378R为引物，进行第二次PCR扩增，将第二次PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用胶回收试剂盒进行纯化，得产物B；

六、使用变性梯度凝胶电泳装置进行垂直电泳，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向DGGE胶的加样孔中加入200μL产物B，在180V电压下，电泳3h，最终确定变性剂浓度梯度为30％～70％；

七、使用变性梯度凝胶电泳装置进行水平电泳，选择变性剂浓度梯度为30％～70％，先将电泳缓冲液预热至60℃，以180V电压预电泳10min，然后向每个加样孔加入10μL产物B，在180V电压下，电泳6h，电泳结束后对DGGE胶进行染色，拍照，即完成大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法；其中步骤四中第一次PCR扩增所用引物799F序列为5’-AACAGGATTAGATACCCTG-3’，引物1492R  序列为5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’；步骤五中引物968F序列为5’-AACGCGAAGAACCTTAC-3’，引物1378R序列为5’-CGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACG-3’，引物968F的5’端加上的碱基片段为CGCCCGCCGCGCGCGCGGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG。

2.根据权利要求1所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤一中大豆根表面的清理及灭菌的具体步骤为：用自来水冲洗大豆根表面土壤，滤纸吸干，按照以下顺序处理：无菌水冲洗3次，体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡3min，体积浓度为2.5％次氯酸钠溶液浸泡3min，体积浓度为75％的乙醇溶液浸泡30s，无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干。

3.根据权利要求1所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤四中第一次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃变性1min，52℃复性1min，72℃延伸1min，共30个循环，再72℃延伸8min，4℃保温。

4.根据权利要求1所述的大豆内生细菌多样性的PCR-DGGE分析方法，其特征在于步骤五中第二次PCR扩增的反应体系为50μL反应体系，由下列成分组成：

PCR扩增条件为：94℃预变性5min，前14个循环为94℃变性1min，68-55℃复性45s，72℃延伸1min，其中每个循环后复性温度下降1℃，后16个循环为94℃变性1min，55℃复性45sec，72℃延伸1min；最终72℃延伸8min，4℃保温。

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