CN102942551A - 含有3-硝基丙酰基的黄烷醇和含其的药物组合物及其在制药中的应用 - Google Patents

Abstract

提供结构式（1）所示的具有抗肝细胞损伤作用的含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3（化合物1)，其制备方法，含有该类化合物的药物组合物，该类化合物及其药物组合物在制备抗肝细胞损伤作用的药物和在制备保肝药物中的应用。

Description

含有3-硝基丙酰基的黄烷醇和含其的药物组合物及其在制药中的应用

技术领域：

本发明属于药物领域，具体地，涉及式（1）中含有3-硝基丙酰基的黄烷醇 (HQM-3, 1)化合物，以其为药物活性成分的药物或组合物，其制备方法与抗肝细胞损伤作用，以及在制备保肝药物中的应用。

背景技术：

血人参又名铁刷子、山红花、红苦刺，为豆科木蓝属植物茸毛木蓝（Indigofera stachyoides Lindl.）的根，广泛分布贵州中西部各苗乡。此外，云南、广西等地也有。目前，现有技术中未有从血人参中提取出的化合物含有3-硝基丙酰基的黄烷醇(HQM-3,1)的报道。

发明内容：

本发明的目的在于提供式（1）的含有3-硝基丙酰基的黄烷醇(HQM-3,化合物1)，以该化合物为保肝活性成分组成的药物组合物，其制备方法与抗肝细胞损伤作用，以及在保肝药物研制中的应用。

本发明的上述目的是通过下面的技术方案加以实现的：

结构式（1）所示的含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3，

。

药物组合物，含有式（1）所示的含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3及可药用载体或赋形剂。

式（1）含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3的制备方法，取血人参干燥根，经粉碎成粗品后，用95%的乙醇回流提取3次，合并提取液，回收乙醇得浓稠浸膏，用适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得3部分萃取物；其中，乙酸乙酯萃取物以粗硅胶60-80目)1:1拌样，200-300目硅胶装柱，氯仿/甲醇95:5→50:50梯度洗脱，分为8个组分A→H；其中，组分C经反相柱层析甲醇/水梯度洗脱、氯仿-丙酮-甲酸反复硅胶柱层析、凝胶色谱Sephadex LH-20甲醇/水洗脱和重结晶纯化，分离鉴定得到含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3即化合物1。

式（1）化合物含有3-硝基丙酰基的黄烷醇在制备抗肝细胞损伤作用的药物中和在制备保肝药物中的应用。

含有式（1）含有3-硝基丙酰基的黄烷醇化合物以及可药用载体或赋形剂组成的药物组合物在制备抗肝细胞损伤作用的药物中和保肝药物中的应用。

本发明从采自贵州六枝的血人参中分离鉴定了罕见的含有3-硝基丙酰基的黄烷醇 (HQM-3, 1)，经抗肝细胞损伤活性筛选，发现该化合物具有显著的保护肝细胞的作用。

本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1—99%，优选为0.5-90%的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。

所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物组合物以单位重服用量的形式使用，采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂（注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等）、固体制剂（片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等）、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射（静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射）和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径用于抗肝细胞损伤。

附图说明:

图1为本发明化合物含有3-硝基丙酰基的黄烷醇(HQM-3)即化合物1的分离制备流程图。

具体实施方式：

下面结合本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但不以此来限定本发明。

实施例1：

含有3-硝基丙酰基的黄烷醇 (HQM-3)即化合物1的分离制备：

取血人参干燥根10.0 kg， 经粉碎成粗品后，用95%的乙醇回流提取3次 (4 h,4 h, 3 h)，合并提取液，回收乙醇得浓稠浸膏。用适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得3部分萃取物。其中，乙酸乙酯萃取物 (290 g) 以粗硅胶 (60 ~ 80 目) 1:1拌样，200~ 300目硅胶装柱，氯仿 - 甲醇 (95:5→50:50) 梯度洗脱，分为8个组分 (A→H)。其中，组分C (16.5 g) 经反相柱层析(甲醇– 水梯度洗脱)、反复硅胶柱层析(氯仿-丙酮-甲酸梯度洗脱)、凝胶色谱 Sephadex LH-20（甲醇 – 水洗脱）分离鉴定得到化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′ - tetrahydroxyflavan (化合物1, 23.2 mg)。

结构式如下：

结构数据为：

3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′ - tetrahydroxyflavan (2): 红色油状(MeOH); [α] ²⁰ _D－48.4^° ( c0.14, MeOH); UV spectrum (MeOH, λ_max, nm): 204, 281(log ε 4.65; 3.48); IR spectrum (KBr, ν, cm^-1): 3426, 1609, 1557, 1518, 1466; ¹H NMR (400 MHz, CD₃OD)δ: 4.95 (1H, s, H-2), 5.40 (1H, s, H-3), 2.79 (1H, m, H-4a), 2.93 (1H, m, H-4b), 5.92 (1H, d, J= 1.8 Hz, H-6), 5.95 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8), 6.75 (1H, brs, H-2′), 6.75 (1H, brs, H-5′), 6.91 (1H, brs, H-6′), 2.81(1H, m, H-3＂a), 2.89 (1H, m,H-3＂b), 4.54 (1H, t, J = 5.9 Hz, H-4＂). ¹³C NMR(100 MHz, CD₃OD) δ: 78.0 (C-2), 70.7 (C-3), 26.5 (C-4), 157.8 (C-5), 95.7 (C-6), 157.9 (C-7), 96.5 (C-8), 157.0 (C-9), 99.0 (C-10), 131.1 (C-1′), 119.0 (C-2′), 146.0 (C-3′), 146.0 (C-4′), 116.0 (C-5＇),114.8 (C-6′), 171.0 (C-2＂), 31.8 (C-3＂), 70.5 (C-4＂); ESI-MS m/z 391 [M + H] ⁺; HR-ESI-MS m/z 414.0796 [M + Na] ⁺ (calc. for C₁₈H₁₇N0₉, 414.0801).

实施例2：

化合物1对CCl₄所致肝细胞损伤的保护作用测定：

1. 实验材料

1.1样品

实验样品为从血人参(Indigofera stachyodes)中分离得到的单体化合物化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′- tetrahydroxyflavan 即HQM-3 (1)（由实施例1所制得的化合物1）。

1.2材料

改良型1640培养基（赛默飞世尔生物化学制品有限公司），无支原体胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司），青链霉素混合液、胰酶（北京索莱宝科技有限公司），MTS细胞增殖和毒性检测试剂盒（上海杰美基因医药科技有限公司），四氯化碳(CCl₄)为分析纯(AR，重庆北碚精细化工厂生产)，NaCl, KCl, KH₂PO_4,  NaHCO_3, Na₂HPO₄·12H₂O，二甲基亚砜(DMSO)均购自上海振兴化工一厂，双蒸水自制。

对照药物：双环醇片（北京协和药厂），联苯双酯滴丸（浙江万邦药业有限公司）。

2.实验方法

2.1样品处理

将一定量的待筛样品和对照药物加入一定量的二甲基亚砜中，使浓度为100 mg/ml（100 μg/μl)，作为母液，用1640培养基分别稀释母液至6、2、0.6、0.2、0.06、0.02 μg/μl, 备用。

2.2 培养液的配制

1640培养基、胎牛血清、青链霉素混合液分别以89%、10%、1%的比例加入已消毒烘干的培养瓶中密闭，4℃保存，培养人肝HL-7702细胞。

2.3 D-Hanks的配制

称取NaCl 8 g ，KCl 0.4 g ，KH₂PO₄ 0.06 g，NaHCO₃ 0.35 g ，Na₂HPO₄·12H₂O 0.132 g，加入双蒸水1000ml，高压灭菌后4℃保存。

2.4 胰酶的配制

取0.25 g胰酶，加入100 ml D-Hanks中，4℃保存过夜，第二日晨低速搅拌30 min后以0.22 μm滤膜过滤，分装在已去酶的EP管中（第二日的所有操作均在冰浴上进行）。-20℃保存。

2.5 筛选方法

镜下观察培养瓶中的人肝HL-7702细胞长至80%-90%时，倒尽培养液，吸取约6 ml D-Hanks冲洗，3次。然后加入约2 ml胰酶，迅速拧紧瓶盖，镜下观察到细胞间隙变大时倒尽胰酶停止消化，再加入15-20 ml培养液，吸管吹打约30次，吸取吹打后的细胞混悬液10ml至培养皿中，再加入96孔板中（边加边轻轻摇晃培养皿），每孔90 μl。24 h后分别给予不同浓度的待筛选样品以及阳性对照药物联苯双酯（DDB）、双环醇，继续培养16 h后，用CCl₄ 3 μl造成肝损伤，每一种药物均设两个平行对照孔。应用MTS法在酶联免疫检测仪490 nm测定吸光度(OD值)，计算细胞存活率，分析不同浓度的不同样品对CCl₄所致肝细胞毒性的保护作用。

2.6 数据处理

各给药组、正常对照组、CCl₄模型组的平均OD值及细胞平均存活率测定结果见表1，其中细胞平均存活率(%)＝给药组或模型组平均OD值/正常组平均OD值。

表1 待筛样品对CCl₄所致肝细胞损伤的保护作用

Table 1 Protective effect of samples against liver cells damage caused by CCl₄

注：CCl₄模型组与正常组相比，^★表示有显著性差异(P< 0.05)；给药组与模型组相比， ^▲表示有显著性差异(P< 0.05)， ^▲▲表示有显著性差异(P< 0.01)。

2.7 结果分析

从表1可以看出CCl₄模型组对肝细胞造成明显损伤，而应用药物、DDB、双环醇的肝细胞存活率与模型组细胞存活率具有显著性差异。应用药物HQM-3与DDB、双环醇均显著提高模型组细胞的存活率，对人肝HL-7702细胞具有明显的保护作用。

实施例3：

按实施例1的方法先制备得化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′ - tetrahydroxyflavan 即HQM-3(1)，按常规加注射用水，精滤，灌封灭菌制成注射液。

实施例4：

按实施例1的方法先制得化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′ - tetrahydroxyflavan 即HQM-3(1)，将其溶于无菌注射用水中，搅拌使溶，用无菌抽滤漏斗过滤，再无菌精滤，分装于2安瓿中，低温冷冻干燥后无菌熔封得粉针剂。

实施例5：

将所分离得到的化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7,3′, 4′ - tetrahydroxyflavan 即HQM-3(1)与赋形剂重量比为9:1的比例加入赋形剂，制成粉剂。

实施例6：

按实施例1的方法先制得化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′ - tetrahydroxyflavan 即HQM-3(1)，按其与赋形剂重量比为1:5-1:10的比例加入赋形剂，制粒压片。

实施例7：

按实施例1的方法先制得化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′ - tetrahydroxyflavan 即HQM-3(1)，按常规口服液制法制成口服液。

实施例8：

按实施例1的方法先制得化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′ - tetrahydroxyflavan 即HQM-3(1)，按其与赋形剂重量比为5:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

实施例9：

按实施例1的方法先制得化合物3-O-[3-nitropropanoyl]-2, 3-cis-5, 7, 3′, 4′ - tetrahydroxyflavan 即HQM-3(1)，按其与赋形剂重量比为3:1的比例加入赋形剂，制成胶囊或颗粒剂或冲剂。

Claims (7)

1.结构式（1）所示的含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3，

。

2.药物组合物，含有式（1）所示的含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3及可药用载体或赋形剂。

3.权利要求1所述的式（1）含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3的制备方法，取血人参干燥根，经粉碎成粗品后，用95%的乙醇回流提取3次，合并提取液，回收乙醇得浓稠浸膏，用适量水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得3部分萃取物；其中，乙酸乙酯萃取物以粗硅胶60-80目1:1拌样，200-300目硅胶装柱，氯仿/甲醇95:5→50:50梯度洗脱，分为8个组分A→H；其中，组分C经反相柱层析甲醇/水梯度洗脱、氯仿-丙酮-甲酸反复硅胶柱层析、凝胶色谱Sephadex LH-20甲醇/水洗脱和重结晶纯化，分离鉴定得到含有3-硝基丙酰基的黄烷醇即化合物HQM-3即化合物1。

4.权利要求1所述的式（1）含有3-硝基丙酰基的黄烷醇在制备抗肝细胞损伤作用的药物中的应用。

5.权利要求1所述的式（1）含有3-硝基丙酰基的黄烷醇在制备保肝药物中的应用。

6.权利要求2所述的药物组合物在制备抗肝细胞损伤作用的药物中的应用。

7.权利要求2所述的药物组合物在制备保肝药物中的应用。

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