CN102939091A - 药物组合物及其在制备用于治疗呼吸疾病的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了包括针对呼吸炎症的病理因素的嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)-靶向剂的组合物。NE-靶向剂主要破坏NE和Syn-1脱落的胞外域之间的结合，导致NE被蛋白酶抑制剂或抗弹性蛋白酶所抑制。非抗凝剂肝素衍生物或片段是示例性NE-靶向剂。组合物优选包括有助于活性剂的递送的载体，如干粉制剂中的壳聚糖或乳糖。本发明还公开了所述组合物在制备用于治疗呼吸疾病的药物中的用途。

Description

药物组合物及其在制备用于治疗呼吸疾病的药物中的应用

技术领域

本申请总体涉及针对复发性气道炎症(recurrent airway inflammation)中的未被抑制的(unopposed)嗜中性白细胞弹性蛋白酶(neutrophil elastase)的活性的组合物，和它们用于治疗呼吸疾病中这种病症(ailments)的方法。

相关申请

本申请要求2010年2月26日提交的U.S.S.N. 61/308,597的优先权。

发明背景

慢性呼吸炎症(CPI)是一种全球范围的常见疾病，造成了沉重的经济负担。对炎症控制不佳是许多呼吸病症包括支气管扩张症(bronchiectasis)和慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)中组织破坏和肺功能下降的根本原因。COPD是一种进行性炎症性病症，其特征为气道和肺泡中弹性降低，肺泡之间的壁的炎症并恶化。这导致较少的空气流入和流出肺部及各种症状，包括粘液形成增加、气喘、呼吸短促和胸闷。虽然烟草吸食被公认为主要危险因素，仅仅约10％的吸烟者发展慢性呼吸炎症，这表明暴露于其它污染物、遗传因素和儿童感染史也可能导致疾病的发展。世界卫生组织(World Health Organization)预测，到2030年COPD将从全球第五位最常见死亡原因上升至第四位最常见的。预计这种增长在发展中国家尤为突出。

目前，慢性呼吸炎症的治疗主要是控制症状，但在停止疾病的进展上收效甚微。常规处方的抗生素用以控制细菌定植(bacterial colonization)，并给予支气管扩张剂以减轻气流限制。虽然这些干预措施有助于控制恶化并改善症状，但它们没有显著影响根本的致病机制，所以不能停止肺功能的下降和其它与疾病进展相关的恶化。其他治疗选择包括粘液溶解剂(mucolytics)、抗炎剂和支气管肺的卫生治疗(bronchopulmonary hygiene therapy)，然而，这些治疗的好处是不清楚的，并且它们的效果的临床研究是矛盾的。因此，迫切需要针对致病因素用于有效治疗慢性呼吸炎症的药物。

因此，本发明的目标是提供减少、治疗、抑制或缓解呼吸病症如慢性呼吸炎症的一种或多种症状的方法和组合物。

发明概述

本发明提供了包括抑制呼吸炎症的致病因素的嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)-靶向剂(targeting agent)的组合物。 NE-靶向剂主要破坏NE和Syn-1脱落的胞外域(shed ectodomains)之间的结合，导致NE被蛋白酶抑制剂或抗弹性蛋白酶所抑制。非抗凝剂肝素衍生物或片段是典型的NE-靶向剂。组合物优选包括有助于活性剂的递送的载体，如干粉制剂中的壳聚糖或乳糖。本发明还提供了制备非抗凝剂肝素的方法。

本发明还公开了施用公开的组合物以治疗呼吸疾病和病症的方法。方法包括将有效量的包括NE-靶向剂的药物组合物施用于其需要的受试者以降低嗜中性白细胞弹性蛋白酶活性。在优选的方法中，将有效量的药物组合物施用于其需要的受试者以降低、抑制或缓解慢性呼吸炎症的一种或多种症状。在最优选的实施方案中，将该组合物作为干粉经过鼻内或通过吸入而施用。本发明还提供了包括NE-靶向剂的试剂盒。

本发明还公开了公开的组合物在制备用于治疗呼吸疾病和病症的药物中的用途。

附图简要说明

图1是描述通过类肝素酶– III(heparitinase-III)片段化并通过凝胶过滤分离的肝素糖类的洗脱模式的图。将在232 nm处的样品吸光度(- ? -)和氯化十六烷基吡啶(CPC)的浊度试验(- ■-)绘制为级分数的函数。峰I-IV分别代表八肝素糖类、六肝素糖类、四肝素糖类和二肝素糖类。V₀ =空体积，V_t =总体积。

图2 A是描述作为浓度(μM) 的函数的商售的未消化的肝素(猪肠道产品)(- ? -)以及八糖( - ■ - )、六糖( - ▲ - )、四糖( - ○ - )、和二糖(- · -)糖片段对因子Xa活性的抑制(吸光度)的图。图2 B是描述作为浓度(μM) 的函数的商售的未消化的肝素(- ? -)以及八糖( - ■ - )、六糖( - ▲ - )、四糖( - ○ - )和二糖( - · - )糖片段对因子IIa活性的抑制(吸光度)的图。

图3是描述施用壳聚糖(左手，白色条)或Hp-壳聚糖(右手，白色条)的假空气组(白色条)和施用壳聚糖(左手，黑色条)或Hp-壳聚糖(右手，黑色条)的香烟烟雾组(黑色条)中嗜中性白细胞的数量(支气管肺泡灌洗液(BALF)中发现的总细胞的百分比)的条状图。* = P小于0.001。

图4是描述施用壳聚糖的假空气组(垂直影线)、施用Hp-壳聚糖的假空气组(水平影线)、施用壳聚糖的吸烟组(实心黑色)和施用Hp-壳聚糖的吸烟组(斜线影线)中的嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)的浓度(nM)的条状图。* = P小于0.001。

图5是描述施用壳聚糖(左手，白色条)或Hp-壳聚糖(右手，白色条)的假空气组(白色条)和施用壳聚糖(左手，黑色条)或Hp-壳聚糖(右手，黑色条)的香烟烟雾组(黑色条)中的α-1-抗胰蛋白酶(α₁AT)与嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)摩尔比的条状图。**= P小于0.01。

图6是描述施用壳聚糖(左手，白色条)或Hp-壳聚糖(右手，白色条)的假空气组(白色条)和施用壳聚糖(左手，黑色条)或Hp-壳聚糖(右手，黑色条)的香烟烟雾组(黑色条)中的髓过氧化物酶(MPO)的活性(mU/ml)的条状图。这些单位测量大鼠支气管肺泡灌洗液中的MPO活性的条状图。MPO活性的一个单位被定义为在37℃，每分钟降解1微摩尔过氧化物的活性。* = P小于0.001。

图7是描述施用壳聚糖(左手，白色条)或Hp-壳聚糖(右手，白色条)的假空气组(白色条)和施用壳聚糖(左手，黑色条)或Hp-壳聚糖(右手，黑色条)的香烟烟雾组(黑色条)中的以平均线性截距(Lm(μm))衡量的空间扩大。* = P小于0.001。**= P小于0.01。

发明的详细说明

I．定义

关于公开的疾病的术语“有效量”或“治疗有效量”是指足以减少、防止或抑制一种或多种与呼吸疾病或病症如慢性肺部炎症相关的生化指标或症状，或另外提供所需的药理和/或生理作用的剂量。这些术语也可与结合多配体蛋白聚糖-1(syndecan-1)的嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)的减少，或NE活性降低使用。精确的剂量将根据多种因素而变化，如受试者依赖性的变量(例如，年龄、免疫系统健康等)、疾病和受影响的治疗。

术语“个体”、“受试者”和“患者”在此处可互换使用，是指哺乳动物，包括，但不限于，啮齿动物、类人猿、人类、哺乳类家畜、哺乳类运动动物和哺乳类宠物。

此处所用的术语“肝素衍生物”包括，但不限于，从沿天然肝素或其片段的直链的修饰而获得的物质以及天然肝素的片段。

此处所用的术语“多配体蛋白聚糖-1(Syn-1)”共同地是指多配体蛋白聚糖-1和多配体蛋白聚糖-1的脱落的胞外域。

II．组合物

A. 嗜中性白细胞弹性蛋白酶靶向剂

嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)(也称为白细胞弹性蛋白酶，ELA2(弹性蛋白酶2，嗜中性白细胞))是一种具有广泛底物特异性的丝氨酸蛋白酶。气道感染/炎症过程中嗜中性白细胞分泌NE，NE破坏细菌，当未被抑制时，破坏宿主组织。然而，当在包括支气管扩张和慢性阻塞性肺病(COPD)的慢性呼吸炎症疾病中表达异常时，持续的NE活性引起广泛的组织损伤和复发性炎症。在发炎的气道中，发现NE与脱落的多配体蛋白聚糖-1(Syn-1)结合，后者是由于慢性炎症造成的释放到气道的细胞表面硫酸肝素蛋白聚糖(cell surface heparan sulfate proteoglycan)(Chan等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 41(5):620-8 (2009))。该结合防止内源性NE抑制剂的作用。 因此NE仍然有活性，消化气道中的结构组分并造成肺损伤。

在健康个体中，α₁-抗胰蛋白酶有效控制了嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)的活性。未调节的NE引起广泛的组织损伤和复发性炎症。本发明提供了包含NE-靶向剂的用于抑制或降低NE活性的组合物。NE-靶向剂可以直接抑制NE的活性，如通过阻断酶的活性位点。另外，NE-靶向剂可以破坏NE和多配体蛋白聚糖-1或其脱落的胞外域之间的结合。NE和Syn-1之间结合的破坏允许蛋白酶抑制剂或抗弹性蛋白酶如α₁-抗胰蛋白酶(α₁-抗胰蛋白酶或α₁AT)抑制NE的活性。典型的NE-靶向剂包括，但不限于，糖胺聚糖(glycosaminoglycans)、肽、抗体或小分子。在优选的实施方案中，NE-靶向剂是肝素，或其衍生物、类似物或片段。在更优选的实施方案中，肝素、肝素衍生物或其片段表现出抗凝血活性的降低。在最优选的实施方案中，NE-靶向剂是破坏NE和Syn-1之间结合的非抗凝剂肝素衍生物。

在某些实施方案中，NE-靶向剂是小分子，例如，约500道尔顿的分子。可以通过筛选化合物文库获得用于结合并降低结合于Syn-1的NE的活性的小分子。这种筛选技术是本领域常规且已知的。

天然肝素是分子量在3 kDa到50 kDa范围的聚合物，虽然大多数商售肝素制剂的平均分子重量是在12 kDa至15 kDa的范围内。肝素是碳水化合物糖胺聚糖(glycosaminoglycan)家族(其包括密切相关的分子硫酸肝素)的成员并且主要由高度硫酸化的重复(己糖醛酸酯(hexuronate)-己糖胺)二糖单元的结构域组成。氨基糖是比N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)更常见的N-硫酸葡糖胺(GlcNS)，己糖醛酸是比葡糖醛酸(GlcA)更常见的艾杜糖醛酸(IdoA)。其他的修饰可以在肝素的直链上发现。葡糖胺残基可以是N-硫酸化的，可能是N-未被取代的。此外，可以在IdoA的C2和葡糖胺的C6，并可能在GlcNS 的C3和GlcA的C2上发现O-硫酸化作用。

肝素的抗凝剂活性归因于五糖序列：GlcNAc,6S-GlcA-GlcNS,3S,6S-IdoA2S-GlcNS,6S。该五糖序列结合并激活抗凝血酶(AT)，其依次抑制凝血级联反应，并防止血液凝结。

在优选的实施方案中，与天然肝素相比，肝素衍生物具有降低的抗凝活性，同时保持其作为NE-靶向剂起作用的能力。当与治疗性抗凝剂肝素相比，肝素、肝素衍生物或其片段的抗凝活性低至少80％，更优选90％，还更优选95％。在最优选的实施方案中，肝素不具有抗凝血活性。优选使用非抗凝肝素衍生物使肝素的出血性副作用的可能性最小化。如下面的实施例1中所示，可以通过测试如活化部分凝血活酶时间(aPTT)、凝血酶原时间(PT)、肝素抗因子Xa测试和肝素抗因子IIa测试确定治疗性肝素或它的衍生物的抗凝血活性。

在优选的实施方案中，治疗性肝素、肝素衍生物、或其片段的平均分子量为1kD到10kD，更优选为1.5kD至6 kD，还更优选2kD至5kD。肝素片段可以是2-4个二糖单元(四糖到八糖)。下面的实施例1中描述了优选片段。在优选的实施方案中，片段是肝素或肝素衍生物的四糖、六糖或八糖。在另一个实施方案中，肝素或肝素衍生物的片段是根据片段中的葡糖醛酸(GlcA)残基数量定义的。在一个实施方案中，GlcA残基的数量为1-10，优选在1-5之间。组合物可以由具有均匀长度的片段或具有各种长度的链的混合物组成。因此，该组合物可包含具有均匀序列或序列混合物的治疗性肝素、肝素衍生物或片段。

在最优选的实施方案中，NE-靶向剂是可以破坏或解离NE和Syn-1之间的相互作用的非抗凝肝素的一个或多个片段。破坏此结合可使内源性或外源性蛋白酶抑制剂或抗弹性蛋白酶降低NE的活性。用于确定肝素衍生物或片段是否可以破坏或解离NE和Syn-1之间结合的方法在本领域中是已知的，包括竞争试验如表面等离子共振。例如，见Chan等, Am. J. Respir. Cell Mol. Biol., 41(5):620-8 (2009)。

肝素、肝素衍生物和其片段可以来自任何合适的商售肝素或肝素盐。亲本肝素(parent heparin)可分馏或者不分馏。亲本肝素可以从天然来源，例如从动物，中分离。肝素可从动物如猪、牛、鲨鱼和鱿鱼，从组织如表达硫酸肝素蛋白聚糖(heparin sulfate proteoglycans)的皮肤、肺、肠黏膜和软骨中获得。或者，亲本肝素可以通过被工程化以表达硫酸肝素蛋白聚糖的细胞或通过化学合成而合成。

非抗凝肝素衍生物或片段可以通过片段化或解聚作用从亲本肝素中产生。使用酶如类肝素酶I、类肝素酶II和类肝素酶III，或化学品如亚硝酸，来实现片段化或解聚作用。尤其优选通过类肝素酶III消化，因为酶选择性裂解肝素链的高度硫酸化的区域，其中存在结合抗凝血酶五糖序列。因此，所得到的消化产物将不可能结合抗凝血酶并且不具有抗凝活性。非抗凝肝素也可以通过化学修饰例如乙酰化、O-脱硫和N-脱硫而产生。或者，非抗凝肝素、肝素衍生物或其片段可以通过化学合成制备。

B.  制剂

公开的NE-靶向剂可以作为活性剂单独施用或更优选地与适合用于施用模式的药物载体结合施用。术语“药学上可接受的”是指不干扰活性成分的生物活性的效率的无毒材料。术语“药学上可接受的载体”是指用于施用于人或其他脊椎动物的一种或多种相容的固体或液体填充剂、稀释剂或封装物质。术语“载体”是指天然的或合成的有机或无机成分，可以将活性成分与其相结合来促进应用。通过施用的具体组合物以及通过用于施用组合物的具体方法部分地确定药学上可接受的载体。

可以用一种或多种生理上可接受的载体以常规的方式配制药物组合物，所述载体包括便于将活性化合物加工为可以药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。可以将组合物与一种或多种生理上或药学上可接受的载体、盐、缓冲剂、乳化剂、稀释剂、赋形剂、螯合剂、填充料、干燥剂、抗氧化剂、抗菌剂、防腐剂、结合剂、填充剂、二氧化硅、增溶剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、助溶剂、粘合剂、粘度和吸收促进剂以及能够调节制剂渗透压的试剂组合施用。合适的制剂取决于所选择的给药途径。如果需要，组合物还可以包含少量无毒的辅助物质如润湿剂或乳化剂、染料、pH缓冲剂或防腐剂。因此，存在各种各样的包括此处所述的NE-靶向剂的药物组合物的适当制剂。

在优选的实施方案中，载体用来促进公开的NE-靶向剂递送。例如，肝素、肝素衍生物及其片段是聚阴离子，因此可能形成聚集物。因此，载体、赋形剂或其他材料用于改善通过吸入的有效递送。优选的载体是生物可降解的、无毒的、并且不影响NE-靶向剂的活性。该载体可以采用任何形式，例如，脂质体、支架、胶团、胶囊、珠子、球体或液滴。载体可由材料如碳水化合物、糖蛋白、聚氨基酸或生物相容的生物降解聚合物如壳聚糖、聚(L-赖氨酸)、聚(乙二醇)和聚丙交酯-乙交酯(polylactide-glycolide)中的一种或其组合制成。载体在施用前用NE-靶向剂装载，一旦到达目标位点后会释放NE-靶向剂。

在优选的载体中，通过从pH 4-5.5，更优选pH 4.5-5.0，还更优选pH 4.7-4.9的pH到pH7-8.5，更优选pH7.2-8.2，还更优选pH7.5-8.0的更高的pH值的变化来控制释放。 NE-靶向剂的释放可能在1至48小时内，更优选在6至36小时内，甚至更优选在12至24小时内发生。载体将最终由机体降解并清除。

在优选的实施方案中，载体是壳聚糖或壳聚糖衍生物。壳聚糖是由随机分布的β-(1-4)连接的D-葡糖胺(脱乙酰基化单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)组成的直链聚糖。它是用于NE-靶向剂递送的优选载体，因为它是生物相容性的、可生物降解的、生物粘附的，并表现出良好的理化性质(Lee等, Respir. Res., 7(112):1-10 (2006))。Wang等, J. Control. Release, 106(1-2):62-75 (2005)中描述了用于通过膜乳化来制造壳聚糖颗粒的方法。可以通过利用不同孔径的膜来制备大小均匀的微球或珠子。如美国专利申请20080202513中描述，壳聚糖可配制用于以吸入方式的干粉递送。平均直径在0.5μm至11μm范围之内的颗粒材料具有进入肺部的适当大小。平均直径小于0.5μm的颗粒一般太小以至于，如果吸入，它们可能不能停留在肺内而是可能被呼出。具有的平均直径大于13μm的颗粒通常太大而不能进入肺部的上呼吸道。因此，一部分包括平均直径为0.5至11μm的颗粒的干粉组合物被视为可吸入部分(respirable fraction)。微球和珠子优选的大小范围是平均直径为2至10μm，更优选为4至8μm，甚至更优选为4.5到5.5μm。最优选的实施方案中，载体将具有5μm的流体直径，其将药物靶向至下呼吸道。可以选择载体的大小将NE-靶向剂递送到任何期望的位置，从上呼吸道到肺部。

本发明公开了包括适用于鼻腔或肺部递送的有效量的NE-靶向活性剂的药物组合物。在优选的实施方案中，制剂是用于干粉。可以包括物质，例如，该物质用于将粉末稀释到适合从特定目的的粉末吸入器递送的量；用于促进该制剂的加工；用于改善制剂的粉末特性；用于改善制剂稳定性，如通过抗氧化剂或pH调节化合物的方式；或用于将味道加入制剂中。任何添加剂不应对NE-靶向剂的稳定性产生不利影响，或不利地干扰NE-靶向剂的吸收。它也应该是稳定的、不吸湿的，具有良好的粉末特性，并且在气道中没有副作用。添加剂的例子包括，但不限于单糖、二糖和多糖类，糖醇及其他多元醇，例如乳糖、葡萄糖、棉子糖、松三糖、乳糖醇、麦芽糖醇、海藻糖、蔗糖、甘露醇和淀粉。根据使用的吸入器，这种添加剂的总量可以在很宽的范围内变化。

可按常规的方式使用一种或多种生理上可接受的载体配制药物组合物，该载体包括有助于将活性化合物加工为可以药学上使用的制剂的赋形剂和助剂。组合物可与一种或多种生理上或药学上可接受的载体、盐、缓冲剂、乳化剂、稀释剂、赋形剂、螯合剂、填充料、干燥剂、抗氧化剂、抗菌剂、防腐剂、结合剂、填充剂、二氧化硅、增溶剂、稳定剂、表面活性剂、增稠剂、助溶剂、粘合剂、粘度和吸收促进剂和能够调节制剂渗透压的试剂组合施用。合适的制剂取决于所选择的给药途径。如果需要，组合物还可以包含少量无毒的辅助物质如润湿剂或乳化剂、染料、pH缓冲剂或防腐剂。

在优选的实施方案中，载体用来促进NE-靶向剂的递送。例如，肝素、肝素衍生物、以及其片段是高度阴离子化的，因此可能形成聚集物。因此载体、赋形剂或其他材料用于改善以吸入方式的有效递送。优选的载体是生物可降解的、无毒的、并且不影响NE-靶向剂的活性。该载体可以采用任何形式，例如，脂质体、支架、胶团、胶囊、珠子、球体或液滴。载体可由材料如碳水化合物、糖蛋白、聚氨基酸或生物相容的生物降解的聚合物如壳聚糖、聚(L-赖氨酸)、聚(乙二醇)和聚丙交酯-乙交酯的一种或组合制成。载体在施用前用NE-靶向剂装载，一旦到达目标位点后会释放NE-靶向剂。

干粉制剂(DPF's)作为用于肺部递送的气雾剂制剂正获得增加的兴趣。生产的用于吸入疗法的干粉气雾剂一般平均几何直径主要在小于5μ的范围内。具有大粒径的干粉制剂已经显示出具有改善的流动性特征，如更低聚集、更易雾化和潜在的更少吞噬作用。可用来将干粉制剂递送到肺部的吸入设备包括非呼吸激活或“多级”设备。在这些设备中，药物制剂首先由不依赖于病人呼吸的能量分散，然后被吸入。吸入器的其他例子包括SPINHALER?(Fisons, Loughborough, U. K.)和ROTAHALER?(Glaxo-Wellcome, Research Triangle Park, N. C.)。喷雾器，如Cipolla等人所描述的 (Cipolla等. Respiratory Drug Delivery VII, Biological, Pharmaceutical, Clinical and Regulatory Issues Relating to Optimized Drug Delivery by Aerosol, Conference held May 14-18, 2000, Palm Springs, Fla.)，也被用于肺部递送中。

颗粒剂可包括赋形剂，如缓冲盐、葡聚糖、多糖类、乳糖、海藻糖、环糊精、蛋白质、聚阳离子的配位剂、肽、多肽、脂肪酸、脂肪酸酯、无机化合物、磷酸盐、脂类、鞘脂、胆固醇、表面活性剂、聚氨基酸、多糖类、蛋白质、盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮(polyvinylpyrridolone)。

此处所用的术语“表面活性剂”是指优先吸附两个不混溶相之间的界面，例如水和有机聚合物溶液之间的界面，水/空气界面或有机溶剂/空气的界面的任何试剂。表面活性剂一般具有亲水部分和亲脂部分，这样，当吸附至微粒时，它们倾向于将部分呈现到不吸引相似包被的颗粒的外部环境，从而减少颗粒聚集。表面活性剂还可以促进治疗剂或诊断剂的吸附并增加试剂的生物利用度。合适的表面活性剂包括但不限于十六烷醇；脂肪醇，如聚乙二醇(PEG)、聚氧乙烯-9-十二烷-l醚；表面活性脂肪酸，如棕榈酸或油酸；甘胆酸盐；表面活性素；泊洛沙姆；山梨糖醇酐脂肪酸酯，如山梨醇三油酸酯(Span 85)、Tween 80和泰洛沙泊(tyloxapol)。适合递送到人体的磷脂包括酰胆碱二棕榈酰卵磷脂(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)，或其任何组合。授予Hanes等的美国专利No. RE 37,053和5,985,309公开了制备和施用包括表面活性剂，特别是磷脂的颗粒的方法。

具有小于约0.4 g/cm³的振实密度的颗粒此处被称为“空气动力学光粒子(aerodynamically light particles)”。更优选的是振实密度小于约0.3 g/cm³，小于约0.2 g/cm³的粒子，最优选小于约0.1 g/cm³的颗粒。振实密度可以使用USP Bulk Density and Tapped Density, United States Pharmacopeia convention, Rockville, Md., 10th Supplement, 4950-4951, 1999的方法来测量。本领域技术人员已知的测量振实密度的仪器包括Dual Platform Microprocessor Controlled Tap Density Tester (Vankel, N.C.)或GeoPyc instrument (Micrometrics Instrument Corp., Norcross, Ga. 30093)。振实密度是包裹质量密度(envelope mass density)的标准衡量。各向同性颗粒(isotropic particle)的包裹质量密度被定义为颗粒的质量除以可以它可以包围的最小球面包裹体积。可以对低振实密度有贡献的特征包括不规则的表面纹理和多孔结构。

空气动力学光粒子具有优选尺寸，例如，大于约5微米的体积中位数几何直径(volume median geometric diameter , VMGD)。在一个实施方案中，VMGD是从大于约5μ至约30μ。在其它实施方案中，颗粒具有大于约5μ例如从大于约5μ到约30μ的中位数直径，质量中位数直径(MMD)，质量中位数包裹直径(MMED)，或质量中位数几何直径(MMGD)。喷雾干燥颗粒的直径，例如，VMGD，可以使用激光衍射仪(例如Helos, 由Sympatec, Princeton, N.J. 制造)测量。用于测量粒径的其他仪器在本领域中是众所周知的。在样品中的颗粒直径范围的取决因素为，如颗粒组成和合成方法。可选择样品中粒子大小的分布以允许其最佳沉积到呼吸道内的目标位点。

在优选的载体中，通过从pH 4-5.5，更优选pH 4.5-5.0，还更优选pH 4.7-4.9的pH到pH7-8.5，更优选pH7.2-8.2，还更优选pH7.5-8.0的更高的pH值的变化来控制释放。 NE-靶向剂的释放可能在1至48小时内，更优选在6至36小时内，甚至更优选在12至24小时内发生。载体将最终由机体降解并清除。

在优选的实施方案中，载体是壳聚糖或壳聚糖衍生物。壳聚糖是由随机分布的β-(1-4)-连接的D-葡糖胺(脱乙酰基化单元)和N-乙酰基-D-葡糖胺(乙酰化单元)组成的直链聚糖。它是用于NE-靶向剂递送的优选载体，因为它是生物相容性的、可生物降解的、生物粘附的，并表现出良好的理化性质(Lee等, Respir. Res., 7(112):1-10 (2006))。Wang等, J. Control. Release, 106(1-2):62-75 (2005)中描述了用于通过膜乳化来制造壳聚糖颗粒的方法。可以通过利用不同孔径的膜来制备大小均匀的微球或珠子。如美国专利申请20080202513中描述，壳聚糖可配制用于以吸入方式的干粉递送。平均直径在0.5μm至11μm范围之内的颗粒材料具有进入肺部的适当大小。平均直径小于0.5μm的颗粒一般太小以至于，如果吸入，它们可能不能停留在肺内而是可能被呼出。具有的平均直径大于13μm的颗粒通常太大而不能进入肺部的上呼吸道。因此，一部分包括平均直径为0.5至11μm的颗粒的干粉组合物被视为可吸入部分(respirable fraction)。微球和珠子优选的大小范围是平均直径为2至10μm，更优选为4至8μm，甚至更优选为4.5到5.5μm。最优选的实施方案中，载体将具有5μm的流体直径，其将药物靶向至下呼吸道。可以选择载体的大小将NE-靶向剂递送到任何期望的位置，从上呼吸道到肺部。

对于通过上呼吸道的施用，组合物还可以被配制溶液，例如，水或等渗盐水，缓冲或未缓冲的，或作为悬浮液，在适当的浓度下作为滴剂或作为喷雾剂用于鼻内施用。优选地，这样的溶液或悬浮液相对于鼻腔分泌物是等渗的，约是相同的pH值，范围例如，从约pH4.0到约pH7.4，或从pH6.0至pH 7.0。缓冲液应是生理上相容的并且包括，简单举例，磷酸盐缓冲液。例如，代表性的鼻血管收缩药被描述为缓冲到pH约为6.2 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Ed. Arthur Osol, page 1445 (1980))。本领域技术人员可以容易地确定用于鼻和/或上呼吸道施用的无害水溶液的合适的盐含量和pH。

粘膜制剂可任选地包括一种或多种用于增强递送通过鼻粘膜的试剂。用于增强粘膜递送的试剂在本领域内是已知的，例如参见Eddington的美国专利申请No. 20090252672，和Touitou的美国专利申请No. 20090047234。试剂包括，但不限于钙螯合剂(EDTA)、鼻酶抑制剂(硼亮氨酸，抑肽酶)、黏膜纤毛清除抑制剂(防腐剂)、鼻膜增溶剂(环糊精，脂肪酸，表面活性剂)和胶束形成(表面活性剂，如胆汁酸、月桂醇聚醚9(Laureth 9)和夫西地脱氢牛磺酸(taurodehydrofusidate, STDHF))。

单独或与其他合适成分组合的组合物，可以“雾化”后通过吸入施用。气雾制剂可放入可接受加压的推进剂中。对于吸入给药，化合物可以使用适当的推进剂从加压容器或喷雾器中以气雾喷雾形式方便地传送。

可以通过一种或多种聚合物将药物装入胶囊，或与一种或多种聚合物形成基质。聚合物包括合成的和天然的不可生物降解的或可生物降解的，水溶的或不水溶的聚合物。代表性的合成聚合物包括聚乙二醇(“PEG”)、聚乙烯吡咯烷酮、聚甲基丙烯酸酯、聚赖氨酸、泊洛沙姆、聚乙烯醇、聚丙烯酸、聚环氧乙烷、以及polyethyoxazoline。代表性的天然聚合物包括白蛋白、藻酸盐、明胶、阿拉伯胶、壳聚糖、纤维素葡聚糖、聚蔗糖、淀粉、羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟基丙基甲基纤维素、透明质酸、羧乙基纤维素、羧甲基纤维素、去乙酰基壳聚糖、葡聚糖硫酸酯及其衍生物。优选的聚合物包括PEG、聚乙烯吡咯烷酮、泊洛沙姆、羟丙基纤维素和羟乙基纤维素。根据各种因素如聚合物的分子量，聚合物的亲水性，和聚合物的固有粘度(inherent viscosity)选择用于特定药物的基质制剂中的聚合物。聚合物可用作填充剂，在非晶体状态下用作药物的抗结晶剂，在结晶状态下用作药物的晶体生长抑制剂，或用作润湿剂。

当作为填充剂使用时，基于药物基质的重量，在药物基质中的聚合物量是小于约95％，更优选小于约80％。当在非晶体状态下作为药物的抗结晶剂或在结晶状态下作为药物的晶体生长抑制剂使用时，基于药物基质的重量，在药物基质中的聚合物量是小于约50％，更优选小于约40％。当作为湿润剂使用时，基于药物基质的重量，在药物基质中的聚合物量是小于约30％，更优选小于约20％。

可用于药物基质中的代表性糖包括甘露醇、山梨醇、木糖醇、葡糖醇、卫矛醇(ducitol)、肌醇、阿拉伯糖醇、阿拉伯糖醇、半乳糖醇、艾杜糖醇、蒜糖醇、果糖、山梨糖、葡萄糖、木糖、海藻糖、阿洛糖、葡萄糖、阿卓糖、古洛糖、艾杜糖、半乳糖、塔罗糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、来苏糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、岩藻糖、鼠李糖、松三糖、麦芽三糖、和棉子糖。糖可以用作填充剂或在非晶体状态用作药物的抗结晶剂，或在结晶状态用作药物的晶体生长抑制剂，或提供多孔药物基质或药物基质中微粒的润湿性。当作为填充剂使用时，基于药物基质重量，药物基质中的糖量通常是小于约95％，更优选小于约80％，当在非晶体状态用作药物的抗结晶剂，或在结晶状态用作药物的晶体生长抑制剂时，基于药物基质重量，糖的量小于约50％，更优选小于约40％。当作为药物基质中的润湿剂使用时，基于药物基质重量，药物基质中的糖量小于约30％，更优选小于约20％。

可用于药物基质中的代表性氨基酸包括天然存在的和非天然存在的氨基酸。氨基酸可以是疏水性的或亲水性的，可以是D氨基酸、L氨基酸或外消旋混合物。可以使用的氨基酸包括但不限于：甘氨酸、精氨酸、组氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、赖氨酸、丙氨酸、谷氨酰胺。氨基酸可作为填充剂或在非晶体状态的药物中作为抗结晶剂，或在结晶状态的药物中作为晶体生长抑制剂，或作为湿润剂。疏水性氨基酸，如亮氨酸、异亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、色氨酸，作为抗结晶剂或晶体生长抑制剂更可能是有效的。此外，氨基酸可以用来使基质具有pH依赖性，该依赖性可用来影响基质的药物性质如溶解性、溶解或润湿率。当作为填充剂使用时，基于药物基质重量，药物基质中的氨基酸的量是小于约95％，更优选小于约80％。当在非晶体状态作为药物的抗结晶剂，或在结晶状态作为药物的晶体生长抑制剂使用时，基于药物基质重量，药物基质中的氨基酸的量是小于约50％，更优选小于约40％。当作为润湿剂使用时，基于药物基质重量，药物基质中的氨基酸的量是小于约30％，更优选小于约20％。

防腐剂如对羟基苯甲酸酯或苯甲酸，可以直接用于抑制微生物的生长。优选的对羟基苯甲酸酯包括对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丁酯。此外，防腐剂可用于与药物相互作用来抑制晶体形成或生长。当在非晶体状态作为药物的抗结晶剂，或在结晶状态作为药物的晶体生长抑制剂使用时，基于药物基质的重量，药物基质中的防腐剂的量小于约50％，更优选小于约40％。

为了促进溶解，可使用润湿剂促进水进入到基质并润湿药物颗粒。润湿剂的代表性的例子包括明胶、酪蛋白、卵磷脂(磷脂)、阿拉伯树胶、胆固醇、黄芪胶、硬脂酸、苯扎氯铵、硬脂酸钙、单硬脂酸甘油酯、十八醇十六醇、西土马哥乳化蜡(cetomacrogol emulsifying wax)、山梨糖醇酯、聚氧乙烯烷基醚(例如，聚乙二醇醚，如西土马哥1000(cetomacrogol 1000))、聚氧乙烯蓖麻油衍生物、聚氧乙烯山梨醇酐脂肪酸酯(例如，吐温?)、聚乙二醇、聚氧乙烯硬脂酸酯、胶体二氧化硅、磷酸盐、十二烷基硫酸钠、羧甲基纤维素钙、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟乙基纤维素、羟基丙基纤维素、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素(hydroxypropylmethylcellulose phthlate)、非结晶性纤维素、硅酸铝镁、三乙醇胺、聚乙烯醇、和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。泰洛沙泊(一种非离子型液体的烷基芳基聚醚醇类的聚合物，也称为superinone或triton)是另一种有用的湿润剂。这些润湿剂中大部分是已知的药用赋形剂，并在由American Pharmaceutical Association and The Pharmaceutical Society of Great Britain (The Pharmaceutical Press, 1986)共同出版的Handbook of Pharmaceutical Excipients中有详细描述。两种或更多的润湿剂可以组合使用。基于药物基质重量，药物基质中的湿润剂量小于约30％，更优选小于约20％。

多孔的药物颗粒可通过在挥发性溶剂和喷雾干燥中溶解药物和赋形剂形成。溶剂的选择取决于药物。在优选的实施方案中，溶剂是具有挥发性，沸点相对较低，或可以在真空中除去，并且是可以微量施用给人类的的有机溶剂。代表性的溶剂包括乙酸、乙醛缩二甲醇、丙酮、乙腈、氯仿、氯氟烃、二氯甲烷、二丙基醚、二异丙醚、N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、甲酰胺、二甲基亚砜(DMSO)、二恶烷、乙醇、乙酸乙酯、甲酸乙酯、乙烯基乙醚、甲基乙基酮(MEK)、丙三醇、庚烷、己烷、异丙醇、甲醇、异丙醇、丁醇、三乙胺、硝基甲烷、辛烷、戊烷、四氢呋喃(THF)、甲苯、1,1,1 - 三氯乙烷、1,1,2 - 三氯乙烯、水、二甲苯、和其组合。通常，药物溶解在挥发性溶剂中以形成药物溶液，所述药物溶液具有0.01％和80％重量/体积(w/v)之间，更优选在0.025和30％(w/v)之间的浓度。当药物是水溶性药物时，水溶剂或水和有机溶剂的混合物，例如水–乙醇混合物，可以用于溶解药物。

成孔剂(Pore forming agents)是在基质中产生孔隙率的过程中所用的挥发性物质。成孔剂可以是易挥发固体或易挥发液体。液态成孔剂必须在与药物相容的加工条件下与药物溶剂不混溶且易挥发。为影响孔形成，成孔剂首先与药物溶剂乳化。然后，同时或依次使用蒸发、真空干燥、喷雾干燥、流化床干燥、冷冻干燥或这些技术的组合来进一步处理乳液以去除药物溶剂和成孔剂。液体成孔剂的选择将取决于药物溶剂。代表性的液体成孔剂包括水；二氯甲烷；醇类，如乙醇、甲醇或异丙醇；丙酮；乙酸乙酯；甲酸乙酯；二甲亚砜；乙腈；甲苯；二甲苯；二甲基甲酰胺；醚类如THF，乙二醚或二氧杂环己烷；三乙胺；甲酰胺(foramide)；乙酸；甲乙酮；吡啶；己烷；戊烷；呋喃；水；和环己烷。液体成孔剂的使用量为药物溶剂乳剂的1％至50％(v/v)，优选5至25％(v/v)。

固体成孔剂在不损害的药物组合物的加工条件下必须是易挥发的。固体成剂可以是(i)溶于药物溶液中，(ⅱ)溶解在与药物溶剂不混溶的溶剂中以形成溶液，然后该溶液与药物溶液乳化，或(iii)作为固体颗粒添加到药物溶液中。随后同时或依次使用蒸发、喷雾干燥、流化床干燥、冷冻干燥、真空干燥或这些技术的组合进一步处理药物溶液中成孔剂的溶液、乳液或悬浮液，以去除药物溶剂，成孔剂，和，如果合适，成孔剂的溶剂。固体成孔剂是挥发性的盐，如结合挥发性酸的挥发性碱的盐。挥发性盐是使用增加的热和/或真空可以从固体或液体转化到气体状态的材料。挥发性碱的例子包括氨、甲胺、乙胺、二甲胺、二乙胺、甲基乙基胺、三甲胺、三乙胺和吡啶。挥发性酸的例子包括碳酸、盐酸、氢溴酸、氢碘酸、甲酸、乙酸、丙酸、丁酸和苯甲酸。优选的挥发性的盐包括碳酸氢铵、醋酸铵、氯化铵、苯甲酸铵和其混合物。其他固体成孔剂的例子包括碘、苯酚、苯甲酸(作为酸不作为盐)，和萘。使用固体成孔剂的量为药物的5和1000％(w / w)之间，优选10和600％(w / w)之间，更优选10和200％(w / w)之间。

多孔药物基质优选是通过如下制备(ⅰ)在挥发性溶剂中溶解药物，优选具有低水溶解度的药物，形成药物溶液，(ⅱ)将至少一种成孔剂与药物溶液结合以形成乳液、悬浮液，或第二溶液，及(iii)从乳液、悬浮液，或第二溶液中除去挥发性溶剂和成孔剂。在优选的实施方案中，使用喷雾干燥，任选随后通过冷冻干燥或真空干燥，以除去溶剂和成孔剂。成孔剂的去除，可以与为了以凝固液滴而除去足够的溶剂同时或在其之后进行。生产可以使用连续、间歇或半连续过程进行。首先，选择的药物被溶解在适当的溶剂中。所得的药物溶液中的药物浓度通常是在约0.01和80％(w/v)之间，优选在约0.025和30％(w/v)之间。接着，典型的在混合条件下，药物溶液与成孔剂或其溶液相组合。如果使用液体成孔剂，它首先与药物溶液乳化，形成分散在整个的药物溶液的成孔剂的液滴。如果使用固体成孔剂，它或者可以直接溶解在药物溶液中形成药物/成孔剂的溶液，或者它首先溶解在与药物溶液不混溶的第二溶剂中以形成溶液，随后该溶液与药物溶液乳化形成分散在药物溶液中的成孔剂液滴。接着，通过进一步处理所得到的悬浮液，例如，使用本领域已知的均匀化或超声技术，可减小固体成孔剂的粒径。在优选的实施方案中，赋形剂在成孔剂之前，同时或之后加入到乳液、悬浮液或第二溶液中。同时或依次使用蒸发、喷雾干燥、流化床干燥、冷冻干燥、真空干燥，或这些技术的组合进一步处理溶液、乳液或悬浮液以除去药物溶剂和成孔剂。在优选的实施方案中，将溶液、乳液或悬浮液喷雾干燥。如此处所用，“喷雾干燥”是指雾化溶液、乳液或悬浮液，以形成(具有分散于其中的固体或液体成孔剂的药物溶液的)液滴的微细雾沫，该雾沫立即进入干燥室(例如，容器，罐，管，或线管)，其中它们接触干燥气体。溶剂或成孔剂从液滴蒸发到干燥气体以凝固液滴，同时在整个固体中形成孔。然后固体(通常以粉末，微粒形式)从干燥气体中被分并收集。

在至少一种成孔剂与药物溶液结合以形成乳液的实施方案中，可以添加表面活性剂或乳化剂提高乳液的稳定性。各种表面活性剂可以并入此过程，优选地含量在0.1和5％重量之间。可以使用的典型的乳化剂或表面活性剂包括生理上最可接受的乳化剂，例如蛋黄卵磷脂或大豆卵磷脂，或合成的卵磷脂如饱和合成卵磷脂，例如，二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱或二硬脂酰磷脂酰胆碱或不饱和的合成卵磷脂，如二油基磷脂酰胆碱或二聚亚油醇磷脂酰胆碱。其它疏水性或两性化合物可用于代替磷脂，例如，胆固醇。乳化剂还包括表面活性剂，如游离脂肪酸，脂肪酸与聚氧化烯化合物如聚氧丙二醇(polyoxpropylene glycol)和聚乙二醇的酯，脂肪醇与聚氧化烯乙二醇的醚；脂肪酸与聚氧烷基化山梨糖醇(polyoxyalkylated sorbitan)的酯；皂；甘油-聚亚烷基硬脂酸酯；甘油-聚氧乙烯蓖麻醇酸酯；聚亚烷基二醇的均聚物和共聚物；聚乙氧基化大豆油和蓖麻油，以及氢化衍生物；蔗糖或其他碳水化合物与脂肪酸、脂肪醇的醚类和酯类，它们任选被聚氧烷基化; 饱和或不饱和的脂肪酸的单甘油酯、二甘油酯和三甘油酯，豆油和蔗糖的甘油酯。其他的乳化剂包括天然的和合成的形式的胆盐或胆汁酸，与氨基酸共轭和非结合的，如牛磺脱氧胆酸盐和胆酸。

C．有效剂量

此处所用的术语“治疗有效量”是指对需要治疗，预防或诊断的受试者呼吸道施用时为达到所需的治疗或诊断效果或疗效的所需的量。药物的实际有效量可以根据所使用的特定化合物的生物活性；所使用的特定药物或其组合；配制的特定组合物；施用方式；患者的年龄、体重和情况；被治疗的症状或状况的性质和严重度；治疗的频率；其它疗法的施用；和所期望的效果而变化。对于特定患者的剂量可以由本领域普通技术人员使用常规的考虑，(例如，通过适当的，常规的药理学规程)来确定。例如，医生可能会首先开出相对低的剂量，随后增加剂量直至获得合适的响应。根据应用，给个体施用的剂量随着时间足以影响个体的有益治疗响应，或者，例如，足以减少症状，或其他适当的活性。剂量由特定制剂的疗效，使用的NE-靶向剂的活性和稳定性，和个人状况，以及被治疗个体的体重或表面积来确定。剂量的大小也根据伴随对特定个体施用特定载体、制剂，或类似物的任何不良副作用的存在、性质和程度而确定。

制剂给药的速率取决于有关制剂的半数致死量(LD₅₀)，和/或组合物在不同的浓度的任何副作用的观察，例如，应用到个体的质量和整体健康。可以通过一次或分次剂量完成施用。所公开的组合物的必要的剂量通常会由医生根据疾病严重度，患者的病史，和可能存在的其他并发症来决定。在一个实施方案中，规定的肝素、肝素衍生物或其片段的剂量可能是从0.01mg至5g，更优选为从0.05mg至1g，还更优选为0.1mg至1mg。这些剂量通常每天一次、两次或三次给予，优选每2天，更优选每周给予。治疗长度范围可以是两周，一个月，六个月，一年或更长。在一些情况下，受试者持续延长的时间期间维持给药。治疗方案可以根据状况的严重度和进展进行调整。

D．联合治疗

所公开的组合物可以单独给药，或与一种或多种附加的治疗剂、预防剂或诊断剂组合。一种或多种附加的治疗剂可以一起使用或依次使用。在优选的实施方案中，组合物辅以用以治疗包括支气管扩张症、COPD、细菌和病毒感染或其症状的慢性呼吸炎症的常规治疗。用于控制COPD症状的常规疗法包括，但不限于，蛋白酶抑制剂、抗弹性蛋白酶、抗炎药、粘液溶解剂、抗生素、抗病毒药、支气管扩张药，如β2受体激动剂(例如，沙丁胺醇(salbutamol)、沙丁胺醇(albuterol)、特步他林(terbutaline))、抗胆碱能药(例如，异丙托溴铵??)和茶碱和皮质类固醇。在优选的实施方案中，该制剂与蛋白酶抑制剂或抗弹性蛋白酶，如α-1-抗胰蛋白酶(α₁AT)组合施用。如果NE-靶向剂导致结合于与Syn-1的NE的破坏或解离，这可能是特别可取的。外源性蛋白酶抑制剂或抗弹性蛋白酶的加入可以加速嗜中性白细胞弹性蛋白酶的抑制或降解。公开的组合物也可以与其他的治疗性干预如辅助供氧、常规肺康复(pulmonary rehabilitation)、营养调整相组合施用，或作为手术的辅助。

E. 储存和试剂盒

对于存储和运送，所公开的制剂可以溶解在合适的溶剂中(例如，水介质如无菌水，并且在使用前存放很长一段时间)。优选地，包括NE-靶向剂的制剂作为干粉被存储。例如，肝素或其片段也可以溶解在水中，冷冻保存并解冻用于使用，例如，在雾化器中。

本发明公开了包含制剂的试剂盒。试剂盒包含一种或多种公开的组合物，并任选地包括以下中的一种或多种：生物活性剂、介质、赋形剂，和无菌容器。制剂也可在溶液中或干燥的(例如，作为干燥粉末)。试剂盒的组分可以是单独包装的并且是无菌的。可以在容器中以剂量形式提供组合物，该容器包括但不限于，用于溶液的有刻度的存储容器，或用于干粉的吸塑包装。用于鼻内和呼吸系统施用的试剂盒可任选地包含用于促进递送的递送装置，如鼻喷雾器、定量雾化吸入器(MDI)，或喷雾器。通常在容器中提供试剂盒，例如，适用于商售的塑料、纸板或金属容器。任何试剂盒可以包括使用说明书。

III． 使用方法

A. 施用方法

此处描述的NE-靶向剂制剂的递送对于范围广泛的呼吸系统和肺部疾病具有预防和治疗应用。通常可以在不需要医疗干预(自行给药)的情况下完成呼吸系统施用，避免了常常与注射疗法相关的疼痛，并且口服疗法常常遇到的酶的量和pH介导的生物活性剂的降解也显著减少。

呼吸道是空气和血流之间气体交换涉及的结构。肺是最终以发生气体交换的肺泡结束的分支结构。在呼吸系统中肺泡表面积是最大的，并且在这里发生药物吸收进入循环的血液中。肺泡被无纤毛或粘液的薄上皮组织覆盖，并且分泌表面活性剂磷脂(J.S. Patton & R.M. Platz. Adv. Drug Del. Rev. 8:179-196 (1992))。不希望药物被吸收到血液循环，但将药物靶向至气道上皮的炎症部位。

呼吸道包含上呼吸道，包括口咽部和喉部，然后是下呼吸道，其包括随后分岔到支气管和细支气管的气管。上部和下部气道被称为传导性气道。然后，终端细支气管分成呼吸细支气管，然后直至呼吸区、肺泡或肺部深处(在Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313 (1990)中的Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic an diagnostic agents to the respiratory tract,")。

吸入性气雾剂已用于治疗包括哮喘和囊胞性纤维症的本地肺部疾病(Anderson等, Am. Rev. Respir. Dis., 140: 1317-1324 (1989))，并且也有可能用于肽和蛋白质的全身性递送(Patton和Platz, Advanced Drug Delivery Reviews, 8:179-196 (1992))。设计改善吸入疗法的效率的治疗性气雾剂吸入器已引起了相当多的关注 (Timsina等, Int. J. Pharm., 101: 1-13 (1995);和Tansey, I. P., Spray Technol. Market, 4: 26-29 (1994))。

可以选择气雾剂剂量、制剂和递送系统用于特定的治疗应用中，如，例如，在Critical Reviews in Therapeutic Drug Carrier Systems, 6:273-313, 1990中的Gonda, I. "Aerosols for delivery of therapeutic and diagnostic agents to the respiratory tract,"; 和在Aerosols in Medicine, Principles, Diagnosis and Therapy, Moren, et al., Eds. Esevier, Amsterdam, 1985中的Moren, "Aerosol dosage forms and formulations,"中所述。此处所用的术语气雾剂是指任何可以在溶液或悬浮液中粒子的细雾的制剂，不论是否使用推进剂生产。气雾剂可以使用标准技术，如超声或高压处理生产。

在优选的实施方案中，化合物以如液体颗粒和/或固体颗粒的形式通过吸入施用。合适的例子包括但不限于，干粉、气雾剂、喷雾(nebula)、气雾、雾化的样品，和液滴。可用于施用于人体的典型装置包括定量雾化吸入器(MDI)、喷雾器，和滴注技术。以有效治疗或预防炎症疾病特别是慢性呼吸炎症的一种或多种症状或临床表现的量给药。在最优选的实施方案中，使用干粉吸入器将任选包括载体的NE-靶向剂作为干粉施用，其中颗粒溶解在呼吸道中，例如在肺分泌物中。

可用于将颗粒施用于病人的呼吸道的各种合适的吸入装置和方法是本领域已知的。喷雾器从溶液或悬浮液产生了由病人吸入的细雾。可以使用Lloyd等的美国专利No.5709202中描述的设备。MDI通常包括具有限量阀的加压罐，其中该罐充满溶液或悬浮液和推进剂。溶剂本身可以用作推进剂，或者组合物可以与推进剂，如氟利昂组合。当由于压力释放从罐中释放时，组合物是细雾。由于压力下降，推进剂和溶剂可以全部或部分蒸发。

优选以导致有效剂量的NE-靶向剂的递送的药代动力学模式将组合物递送进呼吸道中。正如通常此处所用的，NE-靶向剂的“有效量”是指与未接受该组合物的匹配受试者相比，能够减少或治疗一种或多种炎症疾病的症状、逆转一种或多种炎症疾病症状的进展、停止一种或多种炎症疾病症状的进展、预防一种或多种炎症疾病症状的发生、减少疾病的表现的量。在优选的实施方案中，炎性疾病是慢性呼吸炎症。使用有效量的公开的组合物治疗慢性呼吸炎症可改善症状，包括但不限于，炎症、气流受限、慢性咳嗽、咳痰产生、咯血、呼吸困难、空气滞留、气喘、胸痛和复发性肺部感染。在优选的实施方案中，组合物还降低NE活性和炎症细胞数，和改善肺组织的完整性。

如上所述，药物的实际有效量可以根据使用的特定药物或其组合、配制的特定组合物、施用方式，和患者的年龄、体重、状况，以及被治疗的症状或状况的严重度。

可以将这些化合物中的一种或多种施用于动物(例如，人)，以调节NE的活性。例如，医生可以首先使用相对较低的剂量，随后增加剂量直至获得适当的响应。此外，应该理解，对于任何特定受试者的特定剂量水平将取决于多种因素，包括使用的特定化合物的活性，受试者的年龄、体重、总体健康、性别和膳食、施用时间、施用途径、排泄速率、任何药物组合，和待调节的表达或活性的程度。

B. 待治疗的患者和疾病

将组合物施用于需要预防或治疗以异常表达NE为特征的炎症疾病或病症的患者。在优选的实施方案中，疾病或病症的特征是慢性呼吸炎症，例如支气管扩张症、肺气肿或慢性阻塞性肺病。组合物可以施用于动物或人类。炎症疾病可以是呼吸道或肺部感染、间隙组织(interstitium)疾病，或气道疾病。如此处所用，“肺癌”是指或者原发性肺肿瘤(例如，支气管原癌(bronchogenic carcinoma)或支气管类癌(bronchial carcinoid))或者来自于另一个器官或组织(例如，乳腺、结肠、前列腺、肾、甲状腺、胃、子宫颈、直肠、睾丸、骨，或黑素瘤)的原发性肿瘤转移。如此处所用，“呼吸道或肺感染”是指呼吸系统的任何部分的任何细菌、病毒、真菌或寄生虫感染。如此处所用，“间隙组织疾病”包括任何间隙组织病症，包括纤维化(例如，间质性肺纤维化、间质性肺炎、间质性肺疾病、朗格汉斯细胞肉芽肿病、结节病，或自发性肺含铁血黄素沉着症)。如此处所用，“气体交换或血液循环病症”，是指任何影响气体向/从血液和肺的分布和/或交换的异常(例如，肺水肿、肺栓塞、呼吸衰竭(例如，由于肌肉无力)、急性呼吸窘迫综合征或肺动脉高压)。如此处所用，“气道疾病”包括正常呼吸模式的任何疾病，包括遗传性病症和环境病因(例如，哮喘、慢性支气管炎、毛细支气管炎、囊胞性纤维化、支气管扩张症、肺气肿、慢性阻塞性肺病、弥漫性泛细支气管炎，或淋巴管肌瘤病)。

治疗或预防至少一种呼吸疾病的症状的代表性呼吸疾病，包括，但不限于，继发于胶原血管疾病的肺部疾病，如系统性红斑狼疮；类风湿性关节炎；硬皮病；皮肌炎；混合结缔组织病症；血管炎相关性肺疾病，如韦格纳肉芽肿(Wegener granulomatosis)和肺出血肾炎综合症(Good-pasture's Syndrome)；肉状瘤病；和急性肺损伤综合症/急性呼吸窘迫综合征。这些疾病的炎性成分涉及一定程度的自身免疫，但是公开的治疗并没有解决自身免疫反应。

在优选的实施方案中，将包括一种或多种NE靶向剂的组合物施用于患有或具有向慢性呼吸道炎症发展的风险的受试者。包括支气管扩张和COPD的许多疾病的特征是慢性呼吸炎症。由于慢性呼吸炎症是进行性疾病，受试者可以在疾病的任何阶段使用公开的制剂治疗。受慢性呼吸炎症影响的受试者可能会表现出以下一种或多种特征或症状：延长的和异常的炎症、永久扩张支气管、气流受限、慢性咳嗽、咳痰产生、咯血、呼吸困难、空气滞留、气喘、胸痛和复发性肺部感染。除了临床特征，可借助胸部CT扫描、胸部X射线、痰培养、支气管镜检和肺的功能测试来鉴定具有慢性呼吸炎症的受试者。

受试者可以是现在或以前吸烟者。在某些情况下，受试者可能已经暴露于二手烟。此外，受试者可能暴露于其他污染物，如工业厂房和工厂排放的微粒，来自矿山和建筑施工场所的灰尘，和汽车排放的废气。受试者可能有遗传性病症，如α-1抗胰蛋白酶缺乏症，这倾向于发展慢性呼吸炎症。受试者也可能有严重的呼吸系统感染病史。

需要公开的组合物的受试者的肺部和气道可能有增加的数量的炎症细胞，主要是嗜中性白细胞。受试者具有相对于α-1抗胰蛋白酶的升高的NE水平，例如NE的摩尔增加。受试者相对正常受试者可能有升高的髓过氧化物酶活性或表现出空间扩大。其他炎症细胞也可能存在或升高，包括巨噬细胞、嗜碱性粒细胞和嗜酸性粒细胞。介质和化学引诱剂，如肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-8(IL-8)的水平可能在慢性呼吸道炎症的受试者中水平升高。也可发现蛋白酶，如金属蛋白酶、弹性蛋白酶和组织蛋白酶的水平增加。因此，以公开的组合物的治疗将可优选降低、抑制或减少以下一种或多种：NE的活性，炎症细胞的数目和炎症。

本发明将通过引用以下非限制性实施例而被进一步理解。

实施例

实施例1：生成非抗凝剂肝素

用肝素酶-III将市售的猪粘膜肝素消化成较小的肝素片段。然后根据通过凝胶过滤的流体动力学大小(图1)将酶消化产物分类。得到四个峰，并确定为包含二糖、四糖、六糖和八糖，分别如下表1所示。通过总肝素浓度(通过232 nm吸光度测定)除以葡糖醛酸(GlcA)的浓度(通过咔唑法测定)来确定测定肝素糖类的长度。

表 1: 肝素酶-III消化后的肝素低聚糖的表征

	肝素低聚糖浓度 (mM)	GlcA浓度 (mM)	每条链的GlcA数(GlcA 浓度/肝素低聚糖浓度)	肝素低聚糖长度
					峰 I	13.2	65.3	4.9	八糖和更高的糖(Octa & higher )
峰 II	34.1	106.2	3.1	六糖(Hexa)
					峰III	36.0	94.3	2.6	四糖(Tetra)
峰 IV	97.8	194.6	0.9	二糖(Di)

当在Xa因子(图2A)和因子IIa(图2B)检测中与全长肝素比较时，所有肝素片段表现出可忽略不计的抗凝活性(图2)，因为它们诱导出极少的凝血因子Xa和IIa抑制。

实施例2：装载有肝素片段的壳聚糖珠子的制备

通过Wang等, J Control. Release 106:62-75 (2005)描述的SPG膜乳化技术制备五微米(5 μm)壳聚糖珠子。简要地说，通过将1.6％壳聚糖溶解到1％(w/v)乙酸和5％(w/v)氯化钠中制备成壳聚糖溶液。然后将2ml壳聚糖溶液倒入特氟隆罐(Teflon tank)中作为分散相(水相)，并在压力(16Kpa)下，以600rpm允许通过SPG膜(孔径为5μm)到用4％(w/v)Tween? 80作为乳化剂的连续油相中2小时以形成W/O型乳液。通过添加含有100μl 10M NaOH、100μl Tween? 80和4ml油的氢氧化钠混合物而固化壳聚糖珠子。然后收集壳聚糖珠子，并用1％Tween 80洗涤2次，随后用蒸馏水洗涤3次。然后空气干燥壳聚糖珠子并室温储存。 通过在37℃、pH 4.8下将肝素片段(10 μg/ml，在峰I中包含八糖和更高的糖类的产物)与壳聚糖珠子(50mg)孵育18小时而将9.8 ng肝素片段装载到1mg壳聚糖珠子上。

实施例3：肝素衍生物装载的壳聚糖处理降低暴露于香烟烟雾中的大鼠的免疫反应

材料和方法

吸烟大鼠模型

将Sprague-Dawley大鼠分为两组，香烟烟雾组和假空气组。在香烟烟雾组(8只大鼠)在通风的吸烟室中暴露于11支香烟的烟雾(每天1hr，持续4周)。假空气组(8只)被放置在装置内相同的时间期间，相反暴露于室内空气。香烟烟雾或假空气暴露4周后，每组中的4只大鼠分别用2mg肝素衍生物装载的壳聚糖(HP-壳聚糖)处理。每只大鼠约400g。用戊巴比妥麻醉大鼠，使用DP-4干粉insufflator?设备(PennCentury Inc., Philadelphia, Pennsylvania, USA)通过气管内施用2mg HP-壳聚糖/大鼠。各组剩下的四只大鼠分别给予与载体对照相似剂量的纯壳聚糖球子。让大鼠从麻醉药中恢复。72小时后，使用过量戊巴比妥处死大鼠。收集和分析支气管肺泡灌洗液(BALF)和肺组织。

BALF中的细胞分析

将BALF中的细胞稀释到2×10⁵个细胞/ ml的浓度。然后使用Cytospin 2细胞离心机(Shandon Instruments, Sewickley, PA)将0.2 ml细胞悬浮液在1000 rpm下离心5 min离心到聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。固定玻片并用姬姆萨方法(May–Giemsa method)染色。然后在显微镜下计数玻片上的细胞。

测定组织完整性

组织的完整性由空间扩大(airspace enlargement)确定，使用Chan等. Respir Med. 103: 1746-1754 (2009) 中所述的修改后的方法测定。以x40放大率随机捕捉每个肺部切片的10个视野的图像。通过平均线性截距(mean linear intercept, Lm)确定每个组织切片中空间扩大的定量。以随机通过肺部切片的100x100μm网格的方式进行Lm的测定。每一行的网格的总长度除以肺泡截距的数量得到Lm。

结果

当与来自假空气组的大鼠比较时，暴露于香烟烟雾的大鼠的总细胞数显著增加。据认为，这是由于响应于香烟烟雾的炎症细胞的大规模迁移。在炎症细胞中，巨噬细胞和嗜中性白细胞的百分比尤其增加。这些细胞受到刺激后释放出强有力的酶，该酶可以导致局部环境中的组织损伤，尤其是当其没有被它们的抑制剂充分抑制时。Hp-壳聚糖处理有效降低了总细胞数。

表 2: 在处理组和对照组中对于暴露于香烟烟雾和假空气的大鼠的气管肺泡灌洗液(BALF)中收集的细胞的分析

	假空气+壳聚糖	假空气+Hp-壳聚糖	烟雾+壳聚糖	烟雾+Hp-壳聚糖
					总细胞  (105/ml)	2.55 ± 0.13	2.73 ± 0.33	9.13 ± 0.43	5.35 ± 0.24
嗜中性白细胞 (%)	7.73 ± 0.22	7.38 ± 0.17	19.58 ± 0.75	11.85 ± 0.52
					嗜酸性粒细胞 (%)	2.55 ± 0.13	2.95 ± 0.57	0.75 ± 0.13	1.00 ± 0.18
淋巴细胞 (%)	24.53 ± 2.86	23.70 ± 3.90	8.73 ± 1.44	18.98 ± 1.96
					巨噬细胞 (%)	65.18 ± 2.73	65.25 ± 2.02	70.95 ± 0.70	68.18 ± 1.95
蛋白质 (mg/ml)	0.14 ± 0.04	0.14 ± 0.07	1.08 ± 0.61	0.71 ± 0.12

如在表2(上面)和图3中所示，Hp-壳聚糖有效降低嗜中性白细胞的平均百分比。嗜中性白细胞是二级宿主防御系统的关键参与者。他们通过释放活性氧、抗微生物肽(antimicrobial peptides)和蛋白酶来吞噬和降解微生物。正如姬姆萨染色所显示的，通过嗜中性白细胞的多裂核(multi-lobed nuclei)在形态上鉴定了嗜中性白细胞。与假空气组相比，香烟烟雾组的大鼠的BALF中的其他类型中的嗜中性白细胞的平均百分比显着增加。以HP-壳聚糖处理，暴露于香烟烟雾的大鼠比那些接受空载体的大鼠表现出低得多百分比的嗜中性白细胞(P小于0.001)。

如图4中所示，在Hp-壳聚糖处理的暴露于香烟烟雾的大鼠中观察到未被抑制的嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)浓度的 降低。NE是嗜中性白细胞释放的强效的蛋白酶。它消化范围广泛的底物，包括许多在气道和肺中发现的结构蛋白。因此，如果其活性没有受到抑制剂的适当控制，NE可以造成大规模损伤。在0.2M Tris-HCl、0.5M NaCl，pH8.0中使用NE特异性底物 2mM MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide测定支气管肺泡灌洗液的NE浓度。NE催化对-硝基苯胺的水解释放，然后使用分光光度计在410 nm 37℃(E410= 8800)的吸光度测定对-硝基苯胺。然后根据纯化的商售NE活性测定 BALF的NE活性，其中活性通过活性位点滴定(active site titration)而确定。相比那些假空气组的大鼠，观察到香烟烟雾组的大鼠的总NE浓度急剧增加。存在的大多数NE是未被抑制，这意味着NE抑制剂的作用是不够的。然而，以Hp-壳聚糖的处理，总的和未被抑制的NE浓度都有效地降低了(P小于0.001)。

Hp-壳聚糖处理部分缓解了α-1-抗胰蛋白酶(α₁-AT)相对于NE的摩尔过量(图5)。在健康的气道和肺中，α₁AT和NE之间的摩尔比为约1:1，以至于在没有过多生产α₁AT的情况下NE活性被有效地控制。然而，在慢性呼吸炎症的患者，以及香烟烟雾组大鼠中，α₁AT/ NE比值非常增高。这是由于NE的难接近性，这种难接近性由与称为多配体蛋白聚糖-1的糖蛋白的配对(partnering)所导致的，正如Chan等, Am J Respir Cell Mol Biol. 41: 620-628 (2009)中所述。身体通过生产更多α₁AT来响应持续的NE活性。然而，尽管α₁AT压倒性的过量，NE仍然活性很高。因此，NE连续地作用于气道和肺环境中的蛋白质，从而造成损伤。正如图5中所示，Hp-壳聚糖处理导致α₁AT/ NE比值降低(P小于0.01)。因此认为它可以，至少部分地，将NE回复到接近α₁AT的状态。

HP壳聚糖也降低了香烟组大鼠BALF中的髓过氧化物酶(MPO)活性(图6)。MPO是嗜中性白细胞中发现的过氧化物酶。它产生用于消除微生物的自由基。在含有0.167mg/ml邻联茴香胺二盐酸盐的50mmol/L磷酸盐缓冲液中用0.0005%过氧化氢作为底物在37℃、pH 7.0下分光光度法测定BALF中的髓过氧化物酶(MPO)活性。用分光光度计测定在460nm处的吸光度变化。然后参照纯化的商售MPO测定MPO活性，其活性经过活性位点滴定验证。与假空气组的那些大鼠相比，暴露于香烟烟雾的大鼠的BALF中的MPO活性显著更高。正如图6中所示，当用Hp壳聚糖处理暴露于香烟烟雾的大鼠时，可观察到MPO活性下降(P小于0.001)。

经以HP-壳聚糖处理的暴露于香烟烟雾的大鼠的空间扩大(组织完整性的衡量)降低了(图7)。当与假空气对照大鼠相比时，在暴露于香烟烟雾的大鼠中观察到如上所述测定的更显著的空间扩大。暴露于烟雾的大鼠的平均线性截距(Lm)显着高于假空气组大鼠的平均线性截距(Lm)(27.25±2.3 μm比17.71±0.5 μm)(P小于0.001)。正如图7中所示，当用Hp壳聚糖处理暴露于香烟烟雾的大鼠时，可观察到Lm的降低(27.25±2.3 μm比22.98±1.6 μm)(P小于0.01)。

HP-壳聚糖处理降低了香烟烟雾组大鼠的肺标本中的NE染色。通过免疫组织化学分析香烟烟雾组和假空气对照的大鼠的石蜡包埋肺切片。当与假空气组的切片相比，暴露于香烟烟雾的大鼠的肺切片显示出更强烈的NE-染色和较差的组织完整性。经过 Hp-壳聚糖处理，NE-阳性细胞数量和空间大小下降了。当与既没有接受装载的载体也没有接受空载体的动物的样品比较时，在假空气组中，接受壳聚糖和HP-壳聚糖的那些大鼠表现出一定的NE染色。认为这是由于气管内施用过程引起的炎症反应。

实施例4：在支气管扩张症患者中α₁-AT对多配体蛋白聚糖-1核心蛋白的亲和力

气管扩张症是一种慢性肺疾病，其特征是发炎并有细菌定植的支气管不可逆的扩张。受影响的病人患有慢性痰产生和复发加重。进行性的支气管损伤和恶化最终以呼吸衰竭为结局。剧烈但局部的炎症由嗜中性白细胞控制，在气道中细胞活化、吞噬作用或细胞死亡后，嗜中性白细胞经历脱颗粒(degranulation)。嗜中性白细胞弹性蛋白酶(NE)作为脱颗粒产物中的一种29 kD活性酶而释放。在气道中，NE受到支气管上皮粘膜下层腺体局部产生的分泌性的白细胞蛋白酶抑制剂的抵制。如果局部产生的分泌性白细胞蛋白酶抑制剂过量，血浆来源的α₁-AT变为主要的抗蛋白酶防御措施。α₁-AT缺乏被认为是患有慢性阻塞性肺病、肺气肿和囊肿性纤维化的患者的气道中蛋白酶/抗蛋白酶失衡的原因。关于NE活性仍然未被抑制，如支气管扩张症中，的炎症环境了解很少。在支气管分泌物中，与多配体蛋白聚糖(Syn)-1复合的NE对丝氨酸蛋白酶抑制剂变得难以接近。同样，在体外研究表明，当NE结合聚阴离子，如DNA和多糖时，NE的α₁-AT失活是有限的。

多配体蛋白聚糖是完整的膜蛋白聚糖，其在核心蛋白的胞外域具有硫酸肝素(HS)和硫酸软骨素(CS)部分。HS部分主要由GlcA和GlcNAc的直链二糖重复组成，被N-硫酸化和O-硫酸化不同程度的修饰。不清楚如何调节HS生物合成以导致沿二糖重复序列点缀着低硫酸化结构域的高度硫酸化的结构域。然而，结构的多样性提供了对于结合伴侣具有范围广泛的亲和力的HS部分。结果是，HS部分在膜结合的Syn的胞外域上赋予了在细胞周围活动的调节的重要作用。

如细胞培养和小鼠模型中所示，可以通过金属蛋白酶(TIMP)-3-敏感性金属蛋白酶和细菌蛋白酶的组织抑制剂介导多配体蛋白聚糖胞外域脱落。发炎的气道和皮肤伤口的分泌物表明与脱落的Syn-1的超分子复合物中的NE和抗弹性蛋白酶。鉴于脱落的胞外域上剩余的HS部分共有肝素和DNA的聚阴离子特征，据推测，Syn-1的HS部分结合NE，并调节抗弹性蛋白酶在炎症环境中的作用。为了证明HS部分负责NE结合，检测了在复合物中的类肝素酶(HS^ase)可接近位点的HS裂解后从痰复合物上NE的释放。利用重组人Syn(rhSyn)1来证明结合NE的Syn足以干扰NE活性的α₁-AT抑制，这模仿了痰复合物上所作的观察。连同NE-HS亲和力的测定，数据验证了Syn-1的HS部分结合NE，以及该结合干扰慢性支气管炎症中丝氨酸蛋白酶抑制剂的抗弹性蛋白酶功能。

材料和方法

受试者和痰液标本

从Bronchiectasis Clinic, The University of Hong Kong, Queen Mary Hospital招募患有支气管扩张的患者。入选标准为：高分辨率的胸部计算机断层扫描所证明的支气管扩张；支气管扩张症的特发性病因；慢性咳痰产生，每天痰液大于10ml；没有哮喘(根据美国胸科协会(American Thoracic Society)的指南)和其他主要的肺诊断；定义为过去3周病人记录的症状没有变化的稳定状态。排除标准为：具有明确病因(如结核病后，原发性纤毛运动障碍；常见变异性免疫缺陷)的支气管扩张症；维持使用口服或喷雾的抗生素；前3周之内使用抗生素的。没有进行发汗实验来排除囊胞性纤维症，因为已知在中国人中罕见囊胞性纤维化并且在任何患者中缺乏多系统疾病。本研究获得香港大学伦理委员会通过；病人在收集痰液之前提供知情同意。

NE活性/浓度测定

通过活性位点滴定评价了痰溶胶中未被抑制的NE活性的等价摩尔浓度。使用在0.2MTris-HCl，0.5MNaCl(pH 8.0)中作为底物的MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-p-nitroanilide估计痰溶胶中的NE活性；随后在37℃，410nm处(在410 nm处的摩尔消光系数=8800)水解释放对硝基苯胺。纯化的人NE(Sigma, St. Louis, MO)的等价活性用浓度逐渐增加的不可逆抑制剂MeO-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-CMK (Calbiochem, La Jolla, CA)进行滴定，并且测定了残余活性。将残余活性对抑制剂的摩尔浓度的图外推到零活性产生了活性位点滴定的NE的浓度。将α₁-AT(人体胎盘；Sigma)的浓度针对活性位点滴定的人NE进行标准化。这形成了用于在用于NE活性的抑制的痰Syn-1或rhSyn-1存在的情况下抗弹性蛋白酶至活性位点滴定的NE孵育物中的标准添加的基础。

痰溶胶中的总NE浓度的测定

根据制造商的说明，使用定量夹心酶联免疫吸附法(ELISA)试剂盒(Bender MedSystems， Austria)测定痰溶胶中的NE总蛋白水平。

α₁-AT浓度含量测定

用微量滴定板的孔中固定羊抗人α₁-AT(Sigma)进行对于痰溶胶中的α₁-AT水平的夹心酶联免疫吸附法(ELISA)。用3％牛血清白蛋白封闭非特异性结合。以100μl/孔应用痰溶胶的已知稀释液，培养(1h，37℃)以产生α₁-AT。被捕获的抗原依次与一级抗体，兔抗人α₁-AT(1:400稀释, Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN)(50μl)、二级抗体、过氧化物酶偶联的羊抗兔IgG(1:1000稀释; Roch)(50μl)和底物(邻苯二胺，Sigma)孵育(1小时，37℃)用于彩色显影。在孵育之间用PBS-Tween?20洗涤孔。用酶标仪(Molecular Devices Corporation, Sunnyvale, CA)读出490nm处的吸光度。实验一式两份进行。用参照α₁-AT(人体胎盘；Sigma)的系列稀释物制备标准曲线。将参照α₁-AT标准添加到试验痰溶胶的确定稀释物中导致在标准曲线中平行上移，这表明在与痰标本孵育过程中α₁-AT损失极小。

Syns去糖基化

使用粘液溶解还原剂，DTT(5mM; Sigma)处理(30min，24℃)痰溶胶使NE失活，针对PBS透析(16h，4℃)以除去DTT，然后与HS^ase I和II(每个0.01单位; Seikagaku, Tokyo, Japan) 或者软骨素酶ABC(0.01单位; Seikagaku)孵育(16h，37℃)。在相关的但没有指示酶的孵育缓冲液(产品表; Seikagaku)中进行对照处理。消化产物进行Western印迹(Western blot)和Western配体印迹(Western ligand blot)分析。重组Syn-1进行类似处理，去糖基化，并进行分析，但没有用DDT前处理。

Western印迹和Western配体印迹分析

如上所述，痰溶胶样品用DTT处理，然后在非还原条件下在10％凝胶中进行SDS-PAGE。凝胶电泳图被电印迹到聚偏氟乙烯膜上和在检测对于感兴趣的表位的印迹之前，用5％脱脂干奶封闭(1小时，24℃)非特异性结合。使用的一级抗体是针对如下的那些：α₁-AT(1:200稀释，兔抗人α₁-AT; Sigma)；Syn-1(1:200稀释，小鼠抗人CD138; Serotec，Raleigh，NC)；Syn-4(1:200稀释，小鼠抗人Syn-4；Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)，NE(1:200稀释，小鼠抗人NE ；Dako，Glostrup，Denmark)；10E4(1 ：400稀释，小鼠抗-HS；Seikagaku);和CS-56(1:300稀释，小鼠抗-CS；Sigma)。二级抗体与辣根过氧化物酶偶联。孵育之间用PBS-Tween?20洗涤膜。使用增强化学发光试剂盒(Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)来增强显色。在用另一种一级抗体重新检测之前，通过用100mM 2-巯基乙醇，2％SDS，62.5mM Tris-HCl(pH6.7)孵育(30min，50℃)而从膜上洗脱结合的抗体。或者，封闭Western印迹，然后用作为测试配体的人NE或人α₁-AT(Sigma)与之孵育(1h，4℃)。使用相关的一级和二级抗体对于测试配体检测Western配体印迹并如上文所述进行显色。

人Syn-1的分子克隆

使用RNeasy Mini试剂盒(Qiagen，Valencia, CA)从人支气管上皮细胞(Clonetics，San Diego，CA)中提取总RNA。使用SuperScript II逆转录酶(Invitrogen, San Diego, CA)从总RNA生成oligo-dT起始的第一条链cDNA。在PCR中，cDNA作为模板来扩增人类Syn-1的全长编码序列(NM_002997; GenBank, National Center for Biotechnology Information, Bethesda, MD)，并在PCR产物中引入Hind III和Xba I位点。正向引物和反向引物分别为5'-GCAAGCTTGAGAGCATCGAGC-3'(Hind III位点为粗体)和5'-GCTCTA GACTCCCGCGTCAGG-3'(Xba I位点为粗体)。在95℃(12min)，然后30个循环的94℃(1 min)，55℃(1min)，和72℃(2min)，最后72℃(10min)进行PCR反应 。凝胶纯化的PCR产物克隆到pGEM-T Easy载体(Promega, Madison, WI)中，然后用Model 373A DNA 测序仪(Applied Biosystems Inc., Foster City, CA)检测正确序列。人多配体蛋白聚糖(hSyn)-1序列从pGEM-T Easy载体上被切出，然后用Hind III和Xba I.将其克隆到表达载体pcDNA3.1(Invitrogen)中。使用限制性图谱分析重组质粒以确定pcDNA3.1-hSyn-1的有义方向。

在稳定的ARH-77转化株中重组人Syn-1的表达

根据制造商的说明，使用FuGENE 6 Transfection Reagent (Roche Molecular Bio-chemicals, Indianapolis, IN)用pcDNA3.1–hSyn-1转染ARH-77细胞(人B-淋巴细胞细胞系，CRL-1621；American Type Culture Collection, Rockville, MD)中。在高浓度G418(500 mg/ml; Sigma)选择稳定克隆，并在补充5％FBS、青霉素(100U/ml)、链霉素(100 mg/ml)和G418(400 mg/ml)的RPMI1640中维持。使用针对人Syn-1的单克隆抗体CD138通过斑点印迹和免疫细胞化学对Syn-1的表达进行分析，如在线附录中所述。然后，纯化重组蛋白质产物，rhSyn-1。

细胞离心和免疫细胞化学

转染的ARH-77细胞(2×10⁴个细胞)首先在PBS中洗涤两次，然后使用Cytospin? 3细胞离心机(Shandon, Pittsburgh, PA, USA)将细胞离心(400 rpm，5min)到聚-L-赖氨酸包被的载玻片上。将细胞固定在4％(w/v)多聚甲醛中，并用0.01％(v/v)Triton X-100通透。载玻片首先与针对多配体蛋白聚糖-1的一级抗体(1:100稀释，小鼠抗人CD138; Serotec, Raleigh, NC)孵育，随后生物素化的二级抗体(1:200稀释，Dako，CA)和碱性磷酸酶偶联的链霉亲和素(1:50稀释，Dako)孵育。通过将载玻片与硝基四氮唑蓝(NBT)和5-溴-4- 氯-3-吲哚基-磷酸盐(BCIP)孵育进行显色。用Gel/mount^TM (Biomeda, CA)滴在载玻片上，然后在Olympus IX71显微镜系统(Olympus, CA)下观察。在细胞离心涂片制备物上进行的免疫细胞化学表明多配体蛋白聚糖-1转染株是CD138阳性的，但不是非转染的宿主细胞。

NE-HS 结合的表面等离子共振分析

使用BIAcore 2,000光学生物传感器(BIAcore, Uppsala, Sweden)分析HS和NE的相互作用。在LiOH处理后从rhSyn-1回收的HS链在还原性末端生物素化(68 nmol生物素/mg HS，由Quant*Tag Biotin 试剂盒;Vector Laboratories, Peterborough, UK确定)。通过以10ml/min的流速将10mM Hepes(pH 7.4)，0.15M NaCl和0.005％P20表面活性剂(HBS-P; BIACORE)中的50 mg/ml生物素化HS 2min注射到链霉亲和素(SA)传感器芯片(Biacore)上，250个共振单位的增加表明了HS成功固定在传感器芯片上。将HBS-P缓冲液中浓度逐渐增加的NE依次灌注到HS-SA传感器芯片上(以10 ml/min，共2 min)，每次随后用缓冲液灌注以促进解离。在25℃监测反应。用2 M NaCl/HBS-P的灌注再生传感器芯片。用BIAevaluation 3.0 软件(BIAcore)对从传感图获得的共振数据进行了评估，得到结合(ka)、解离(kd)和平衡解离常数(Kd)的速率常数。对于竞争试验，以10ml/min将HBS-P缓冲液中与确定浓度(250-2,000ng/ml)的竞争性糖胺聚糖-软骨素 4-硫酸盐(C4S)以1:1(v/v)预先混合的NE(2,000 nm)、肝素和化学修饰的肝素(N-去硫酸化的再-N-乙酰化的，完全去硫酸化的再-N-乙酰化的，或2-O和6-O去硫酸化的和N-硫酸化的；Seikagaku)以30分钟，4℃注射到HS-SA传感器芯片上。解离和再生过程如上所述。进行只有NE(没有竞争性糖胺聚糖)的对照以确保试验运行之间可比较的结果。所有实验均一式两份进行。将从传感图上获得的共振数据作为相对于没有竞争性糖胺聚糖所获得数据的抑制百分率作图。使用统计程序，PRISM(GraphPad, Inc., San Diego, CA))测定以50％干扰NE与HS-SA传感器结合的竞争性糖胺聚糖的浓度。

呼吸量测定法

肺功能测试包括用力肺活量(forced vital capacity, FVC)和1秒内的用力呼气量(FEV1)的呼吸量测定。用 Sensor-Medics 2200肺功能实验室系统(SensorMedics, Yorba Linda, CA) (E1)进行呼吸量测定。

支气管扩张患者的痰液样本在无菌锅中收集最多4小时。服用吸入支气管扩张剂或吸入糖皮质激素的患者已被告知在收集痰前停用这些药物至少12小时。在光学显微镜下检测咳出的痰标本；平均10个区域，每个区域≥10个口腔鳞状上皮细胞的存在(×100放大率)表示唾液起源。这种样品从进一步处理中被排除。还将痰标本送去用于使用标准技术进行微生物学检验。大部分收集的痰样品立即在50,000 g离心1.5小时(4℃)；收集每份样品的上清溶胶相，等分并存储在-80℃直至使用。

统计分析

数据表示为平均值(平均±SD)。使用INSTAT (GraphPad, Inc., San Diego, CA) 和 PRISM统计软件包。采用用Bonferroni事后检验(Bonferroni post hoc test)或Mann-Whitney U检验(Mann-Whitney U test)的单因素ANOVA(one-way ANOVA)分析数据。P值小于0.05的差异被认为在统计学上显著。

结果

尽管痰溶胶中的a1-AT过量，NE仍未被抑制

对于这项研究，招募经过胸部高分辨率计算机断层扫描证实的患有非囊性纤维化支气管扩张的12名受试者。通过活性位点滴定确定痰溶胶样品中未被抑制的NE浓度，并且根据ELISA测定，这些与总NE浓度没有显著不同。这表明，在大多数情况下，NE以生理的抗弹性蛋白酶不可接近的形式存在。在这方面，发现痰溶胶样品中a₁-AT的浓度以平均16：1的摩尔比过量于未被抑制的NE浓度。因此，结果显示尽管患有支气管扩张症的患者的支气管分泌物中存在过量的a₁-AT，NE活性仍未被抑制。

痰复合物中的未被抑制的NE活性涉及Syn-1，不涉及Syn-4

超分子复合物中未被抑制的NE和复合物中NE与Syn-1的结合干扰了也与复合物有关的α₁-AT的抗弹性蛋白酶作用。发现Syn-4的免疫反应性在分子质量范围为31-50 kD中，而不是与内源性NE共定位。这与其中观察到与内源性NE共定位的100-250 kD的高分子质量范围中的Syn-1免疫反应性形成对比。用纯化NE的Western配体印迹表明Syn-4阳性区结合NE的能力。因此，可溶形式的Syn-1和-4都存在于痰液溶胶样品中，两种形式都显示了结合NE的能力。然而，在高分子质量的痰复合物中内源性NE选择性结合Syn-1的观察表明，当嗜嗜中性白细胞通过发炎的支气管上皮时被激活时，NE遇到脱落的Syn-1。

从痰液Syn-NE复合物中释放NE

为了证明HS部分对于结合的重要性，首先用还原粘液溶解剂DTT处理痰溶胶样品以抑制NE活性，然后用HS^ase I和II处理以裂解HS。未处理的对照样品的Western 印迹分析表明在250-100 kD的名义分子大小范围内作为对于Syn-1、HS、CS和NE免疫阳性的模糊条带(smear)的复合物形式。DDT处理之后，观察到迁移率方面的小变化，表明对NE结合至复合物的很小作用。以HS^ase I和II的处理导致Syn-阳性的模糊条带迁移到较低的大小范围150-80 kD，HS表位完全丧失，以及NE-阳性的模糊条带迁移到较低的大小范围(30-20kD)。用软骨素酶ABC对照处理的样品没有导致迁移，正如对于Syn、HS和NE表位检测的印迹所示，但是损失了CS表位。因此，结果表明HS分子是痰复合物中负责NE与Syn-1的结合。

来自 ARH-77转染株的rhSyn-1具有 HS 和 CS 部分

为了获得足够量的纯化的Syn-1用于研究NE结合和抗弹性蛋白酶作用，构建了具有pcDNA3.1-hSyn-1构建体的ARH-77细胞的稳定转染。用针对人Syn-1的单克隆抗体CD138检测的斑点印迹表明源自稳定转染株的细胞株、而非空白细胞株或未转染细胞中的免疫阳性。细胞离心涂片制备物上进行的免疫细胞化学表明Syn-1转染株是CD138阳性的，但未转染的宿主细胞却不是。因此得到rhSyn-1的细胞来源。

然后分析纯化的rhSyn-1的CS和HS部分。Western印迹分析表明了在200-97 kD的名义分子大小中对于Syn-1、CS和HS免疫阳性的模糊条带。用HS^ase I及II处理导致Syn-1阳性的模糊条带迁移到97-70 kD，但HS-阳性的模糊条带减小到约70 kD的条带。用软骨素酶ABC处理导致Syn-1阳性条带迁移到180-90 kD，并且损失了CS表位。用酶连续处理后，耐HS^ase的HS表位仍与Syn-1核心蛋白在一起。因此，结果表明CS和HS部分存在于rhSyn-1制备物中。

HS部分结合NE并且Syn核心蛋白结合α1-AT

为了检测NE结合Syn事实上是否由HS部分介导，通过Western印迹分析rhSyn-1，首先检测Syn-1，再检测HS，然后进一步检测Western配体印迹中NE结合。Western印迹表明，HS^ase I和II处理后，Syn-1/HS-阳性的模糊条带的移动迁移和HS表位的明显损失。Western配体印迹显示NE结合具有完整HS的rhSyn-1，但是在rhSyn-1的对HS^ase敏感的HS部分被裂解后，则不能结合。因此，结果表明NE结合Syn-1是由对HS^ase敏感的HS部分介导的。

为了检测α₁-AT是否结合Syn，对于α₁-AT结合，在Western配体印迹中重复Western印迹的实验步骤。Western印迹表明了用肝素酶和软骨素处理的预期的移动迁移。Western配体印迹表明，α₁-AT与去聚糖化的rhSyn-1核心蛋白结合，而不与聚糖化的rhSyn-1核心蛋白结合。总之，结果表明，在天然Syn-1可以进行各种去聚糖化的炎症环境中，天然Syn-1的HS部分对NE的亲和力不同，然而，核心蛋白对α₁-AT的亲和力不同。

为了表征NE-HS相互作用，将从纯化的rhSyn-1回收的HS部分固定在传感器芯片上用于表面等离子共振分析。NE(50-1,500nM)灌注HS传感器芯片的传感图产生了14.17 nM的平衡解离常数(K _d )，显示了NE对固定的HS的高亲和力。表3表示了与1:1 Langmuir结合模型(1:1 Langmuir binding model)适应的动力学数据和结合数据。这些数值与报道的NE与Syn-1的胞外域相互作用的数值在相同的范围内。为了评估NE对肝素硫酸化变体的亲和力，在溶液-表面竞争实验中使用之前，变体与NE进行预混合。与1,000 nM NE和1,000 ng/ml竞争性糖胺聚糖，竞争效力以肝素(竞争95％)、N-脱硫酸化的和再-N-乙酰化肝素(竞争约75％)、2-0和6-0脱硫酸化的和N-硫酸化的肝素(竞争约60％)的次序下降。完全脱硫酸化的和再-N-乙酰化的肝素以及C4S不能在竞争中超过NE与固定在传感器芯片上的HS的结合。对于肝素、其硫酸化变体和CS，以50%干扰HE结合HS-SA传感器的竞争性糖胺聚糖的相应浓度值反应了亲和力上相同的等级。结果表明，对NE的结合是HS特异性的，亲和力取决于沿HS链上的O-和N-硫酸化结构域。

NE结合Syn-1的HS部分限制了α1-AT的抗弹性蛋白酶作用

为了测试NE结合Syn-1的HS部分是否限制α₁-AT的抗弹性蛋白酶作用，将经过或没有经过HS^ase I和II预先处理的rhSyn-1与一定浓度的NE结合，该浓度与在患者的痰液标本中发现的未被抑制的NE活性相当(2mM，通过活性位点滴定测定)。在标准增加测试抑制剂α₁-AT或水蛭抑制剂C到反应混合液中后，对NE活性的抑制进行了评估。抑制效果与在12位招募患者的DDT预处理过的痰液溶胶样品上进行的平行试验的抑制效果相比较。抑制剂效果与在12个新招募患者的DTT预处理的痰溶胶样品上进行的平行操作所得效果进行比较。在所有的情况下， NE活性的抑制随反应混合物中的抑制剂浓度增加。然而，抑制百分比随使用的抗弹性蛋白酶而变化。

用2mM外源性α₁-AT(活性-位点-滴定的NE的1:1摩尔当量)，在与rhSyn-1或DTT处理的痰样品的孵育中，44-46％的NE活性被抑制；甚至用20mM外源性α₁-AT(活性-位点-滴定的NE的10倍摩尔当量)，在上述任何一种情况下抑制只能达到63-65％。相反，对于与HS^ase I和II处理过的样品的孵育，2和20mMα₁-AT都达到了NE活性的完全抑制。连同通过Syn-1的HS^ase I和II处理的HS裂解抑制NE结合这一发现，这些结果表明，NE结合HS/Syn-1限制了α₁-AT的接近和对NE的完全抑制。

然而，在与rhSyn-1和用HS^ase I和II预先处理或没有预先处理的痰样品的孵育中，将水蛭抑制剂C(NE-特异性的四肽抑制剂)加入反应混合物中导致NE活性的完全抑制。这与当Syn-1-结合的NE与α₁-AT共存时所看到的差别抑制形成对比。因此，结果表明，结合于Syn-1的HS部分的NE容易被肽类所抑制，但不容易被大分子大小蛋白如生理抗弹性蛋白酶α₁-AT所抑制。

NE的持续主导的活性是气道疾病的蛋白酶-抗蛋白酶假说的核心。在患有支气管扩张患者的炎症性分泌物中，未被抑制的NE活性的发现强化了这个概念。在分泌物中已经发现了摩尔过量于未被抑制的NE的α₁-AT。由于在痰样品的超分子复合物中NE结合于Syn-1的HS部分，α₁-AT的抗弹性蛋白酶作用被限制了。通过纯化的NE与rhSyn-1或DTT处理的痰复合物孵育与和HS^ase-处理的相对应物质的孵育的比较而再现该现象，这确认了HS对于NE结合是重要的，因此对于未被抑制的NE活性是关键的。虽然Syn-1和-4都存在于痰溶胶样品中，并且都具有结合NE的HS部分，数据强化了如下概念，即，在发炎的支气管环境中，内源性NE的天然结合伴侣是Syn-1的HS部分。

表面等离子体共振数据显示NE对于rhSyn-1的HS部分的高亲和力(K _d ，14.17 ± 2.12 nM)，这与对于NE结合于纯化的Syn-1胞外域所报道的数据相似。显示了肝素，但是非CS，对NE的有效竞争。竞争NE的效力以N-脱硫酸化的肝素>完全脱硫酸化的但再-N-硫酸化的肝素>>完全脱硫酸化的并再-N-乙酰化的肝素的次序下降。这证实了肝素从痰溶胶样品中的超分子复合物中取代了NE，并进一步表明，痰复合物中的结合NE的HS部分没有肝素的硫酸化程度高。DTT处理的痰复合物的HS部分容易受到特异性作用于低硫酸化结构域的细菌HS^ase的影响并且HS裂解伴随着NE从痰复合物中的释放的观察证实了该结论。值得注意的是，循环嗜中性白细胞表达包含具有对于NE的亲和力的HS部分的完整的膜蛋白聚糖。这些部分有助于在嗜中性白细胞迁移和渗出过程中由控制的脱颗粒释放的NE的定位。在发炎的气道中，HS部分可能被激活的嗜中性白细胞释放的类肝素酶的内切糖苷酶的活性所修饰，正如人皮肤伤口液体中所显示的。然后，据推测，患者的炎症性分泌物中的脱落的Syns上残余的HS结构域是低硫酸化种类。因此，不仅Syn-1的HS部分结合NE，如结果所示，而且数据也支持HS的硫酸化结构域中的变化决定对NE的结合亲和力。

在细菌定植和炎症反应反复发生的支气管扩张的气道内，激活的嗜中性白细胞依赖于核膜解体和完整的细胞膜内的颗粒分解的程序。一旦膜片段化和细胞死亡，染色质和颗粒内容物形成“嗜中性白细胞细胞外网(neutrophil extracellular traps)”以束缚NE。考虑到NE-多核苷酸的亲和力(K _d ，4 mM到21 nM)低于NE-HS/Syn-1的亲和力，预期NE已经从嗜中性白细胞细胞外网转移到炎症环境中的脱落的HS/Syn-1。重要的是，痰复合物中结合HS/Syn-1的NE保持蛋白水解的活性。该数据加强了尽管α₁-AT摩尔过量但NE活性持续这一概念。

α₁-AT对Syn-1核心蛋白的亲和力的新发现表明，在发炎支气管环境中，各种去聚糖化形式的脱落的Syn-1结合α₁-AT，并限制其发挥其抗弹性蛋白酶作用。即使在HS部分被细菌HS^ases实验性裂解从而允许α₁-AT抑制NE的情况下，NE活性的抑制百分比对应于标准添加外源性α₁-AT。响应曲线向左侧的迁移表明，内源性α₁-AT在其中包括痰溶胶样品的孵育物中NE的抑制中起部分作用，然而，没有观察到该迁移。因此，数据表明了Syn-1核心蛋白在结合α₁-AT并因此限制α₁-AT抑制NE中的新功能。NE结合，如在患有支气管扩张患者的痰溶胶样本中的，脱落的Syn-1的HS部分复合了这种限制。

表 3. 用于嗜中性白细胞弹性蛋白酶结合到固定的硫酸肝素的LANGMUIR 1:1 模型

结合常数                                  平均值±标准偏差

k _a  x 10⁴ M^- 1s^- 1                                                        3.31 + 0.14

k _d  x 10^-4s^- 1                                                                  4.69 + 0.21

K _d , nM                                            14.17 + 2.12

缩写的定义：k _a ，结合常数生成速率 ; k _d ，解离常数生成速率；K _d ，平衡解离常数。

除非另有定义，此处所用的所有技术和科学术语具有所公开的本发明所属的领域的技术人员通常理解的相同的含义。此处引用的出版物和被引用的材料是通过引用而特异性并入。

仅仅使用常规实验，本领域技术人员将会认识到或能够明确许多与此处描述的发明的具体实施方案的等同物。这些等同物将包括在下面的权利要求中。

Claims (21)

1.用于施用于呼吸道或肺部的药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的试剂，所述试剂的量可有效降低需要该组合物的受试者中的嗜中性白细胞弹性蛋白酶活性，减少、防止或抑制一种或多种与呼吸疾病或病症相关的生化指标或症状。

2.权利要求1的药物组合物，进一步包含用于肺部或鼻腔施用的药学上可接受的载体。

3.权利要求1的药物组合物，其中所述试剂破坏或防止嗜中性白细胞弹性蛋白酶结合多配体蛋白聚糖-1。

4.权利要求1的药物组合物，其中所述试剂是糖胺聚糖。

5.权利要求4的药物组合物，其中所述糖胺聚糖选自不具有抗凝活性的肝素或肝素衍生的片段及其组合。

6.权利要求5的药物组合物，其中所述肝素衍生的片段是四糖、六糖或八糖。

7.权利要求5的药物组合物，其中所述肝素或肝素衍生的片段及其组合包含1到10个葡糖醛酸残基。

8.权利要求2的药物组合物，其被配制为颗粒剂、气雾剂或喷雾剂的形式。

9.权利要求2的药物组合物，其中所述载体是壳聚糖或壳聚糖衍生物。

10.权利要求9的药物组合物，其中所述壳聚糖为直径为1μm到10μm之间的微球上的涂层形式。

11.权利要求1-10中任一项的药物组合物，进一步包含第二种治疗剂，所述第二种治疗剂选自蛋白酶抑制剂、抗弹性蛋白酶、抗炎药、粘液溶解剂、抗生素、抗病毒药、支气管扩张剂、β2激动剂、抗胆碱能药、茶碱和皮质类固醇。

12.治疗呼吸疾病或病症的方法，包括将权利要求1-11中任一项的组合物施用于需要该治疗的受试者。

13.权利要求12的方法，其中施用所述试剂的量可以有效减少、治疗、抑制或减轻慢性呼吸炎症的一种或多种症状。

14.权利要求12的方法，其中将所述试剂施用于患有慢性呼吸炎症的个体。

15.权利要求14的方法，其中所述慢性呼吸炎症是支气管扩张、肺气肿或慢性阻塞性肺病。

16.权利要求13的方法，其中所述症状是延长的或异常的炎症、永久扩张支气管、气流受限、慢性咳嗽、咳痰产生、咯血、呼吸困难、空气滞留、气喘、胸痛或复发性肺部感染。

17.权利要求1-11中任一项的药物组合物在制备用于治疗呼吸疾病或病症的药物中的用途。

18.权利要求17的用途，其中所述药物用于减少、治疗、抑制或减轻慢性呼吸炎症的一种或多种症状。

19.权利要求17的用途，其中所述药物用于治疗患有慢性呼吸炎症的个体。

20.权利要求19的用途，其中所述慢性呼吸系统疾病是支气管扩张、肺气肿或慢性阻塞性肺病。

21.权利要求18的用途，其中所述症状是延长的，并包括异常的炎症，永久扩张支气管、气流受限、慢性咳嗽、咳痰产生、咯血、呼吸困难、空气滞留、气喘、胸痛或复发性肺部感染。

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