CN102924559A - 菝葜皂苷元衍生物及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗老年痴呆疾病的天然药物知母菝葜皂苷元结构衍生物的合成方法和医药用途。以高纯度的知母皂苷元为前体药物，对其进行构型翻转、氧化、氨化、不同程度和位置的开环等结构修饰法增加其成药性，药理证明具有抗老年痴呆活性。通过药理活性开发知母皂苷元及其衍生物在制备抗老年痴呆药物中的新用途。

Description

菝葜皂苷元衍生物及其制备和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及菝葜皂苷元衍生物及其制备方法和应用，具体涉及菝葜皂苷元衍生物在抗老年性痴呆，抗抑郁药物中的应用。

背景技术

阿尔茨海默病（Alzheimer's disease）即所谓的老年痴呆症。是一种进行性发展的致死性神经退行性疾病，临床表现为认知和记忆功能不断恶化，日常生活能力进行性减退，并有各种神经精神症状和行为障碍。

它是一组病因未明的原发性退行性脑变性疾病。多起病于老年期，潜隐起病，病程缓慢且不可逆，临床上以智能损害为主。病理改变主要为皮质弥漫性萎缩，沟回增宽，脑室扩大，神经元大量减少，并可见老年斑，神经原纤维结）等病变，胆碱乙酰化酶及乙酰胆碱含量显著减少。起病在65岁以前者旧称老年前期痴呆，或早老性痴呆，多有同病家族史，病情发展较快，颞叶及顶叶病变较显著，常有失语和失用。 

阿尔茨海默病主要表现为脑细胞的广泛死亡，特别是基底节区的脑细胞。正常情况下，基底节区发出的纤维投射到大脑与记忆和认知有关的皮质，它释放乙酰胆碱。短期记忆的形成必须有乙酰胆碱的参与，患者与正常人相比乙酰胆碱转移酶的含量比正常人减少90%。 

经解剖发现，患者脑中有广泛的神经元纤维缠结，轴突缠结形成老年斑。老年斑中含有坏死的神经细胞碎片、铝、异常的蛋白，阿尔茨海默病患者脑内β –淀粉样蛋白过度积聚。 

目前公认的发病机制主要有两种： 

1.由于淀粉样前蛋白的异常导致蛋白成分漏出细胞膜，导致神经元纤维缠结和细胞死亡，基因位于21号染色体。 

2．与载脂蛋白E（APO-E4）的基因有关，APO-E4的增多能对抗APO-E2或APO-E3的功能。APO-E4使神经细胞膜的稳定性降低，导致神经元纤维缠结和细胞死亡。APO-基因纯合子比杂合子患病几率高。

现在，业内对老年痴呆症的治疗主要还是以西药为主，包括胆碱能药物、脑细胞代谢激活剂、脑血循环促进剂等，但这些药物在具有疗效的同时也伴随着肝毒性和胃肠反应等副作用。

虽然目前医学界对痴呆，尤其是AD 的发病机制以及治疗方法仍存在诸多争议，但随着发病机制的研究获得进展，一些药物的开发仍然在这争议之上获得前进。当前已经有10个以上被开发用于治疗AD和VD 等痴呆的益智药处于研发后期（Ⅲ期临床及之后）阶段，其中研究相对较为成熟的乙酰胆碱酯酶抑制剂类药物占据了5个席位，但其它几个在研药物却具有各自不同的作用机制，一定程度上也反映了这一领域的药物开发正在向多方位针对痴呆病因的方向发展，为后来药物的开发思路提供了更广阔的天地。

我国药用生物资源十分丰富，其生理活性物质是研究和发现新药的先导化合物，是开发新药的天然宝库，从天然产物中提取活性物质，开发成安全性好、毒性低的新药具有重要应用价值和广阔发展前景。

知母皂苷是中药知母中有效成分之一，含量约为6％，知母皂苷元（结构式如下ZMS）是知母皂苷水解后去掉结合糖基的产物。药效实验证明知母皂苷元及其衍生物是一种新型的能显著改善学习记忆功能的药物，它不同于目前已知的胆碱脂酶抑制剂或 M受体的激动剂、拮抗剂。ZMS及其衍生物改善学习记忆功能的机理在于能使降低的脑M受体密度提高到接近正常水平，在体内需要一个较长期的调整过程，作用缓慢而持久。由于脑M受体降低是老年痴呆症(AD)等疾病时的一个重要病理变化，ZMS及其衍生物显然有改善病理变化的作用，不是单纯改善症状。

知母皂苷元及其衍生物的新药研发情况：

（1）知母皂苷元(菝葜皂苷元)用于治疗卢伽雷氏症（Amyotrophic Lateral Sclerosis），已进行到I期临床试验（phase I）,作用机制作为神经营养剂作用于神经营养因子（Neurotrophic Factor）菝葜皂苷元临床I期实验用于治疗ALS(Code Name：PYM-50018)。在体外，PYM-50018显示有保护神经免受损伤，阻止神经细胞凋亡。2004年， PYM-50018授予快车道药物称号治疗ALS。2008年， PYM-50018作为孤儿药用于治疗ALS。

（2）菝葜皂苷元衍生物用于治疗老年痴呆进行到生物学测试阶段的是：菝葜皂苷元3位乙酰酯化衍生物（Sarsasapogenin Acetate）。

（3）知母皂苷A-III(Timosponin A3) 作为神经营养剂治疗疾病（Type II Diabetes）已进行到临床试验前期实验。

发明内容

   本发明的一个目的在于知母皂苷元（菝葜皂苷元）3个系列衍生物的制备方法。另一个目的在于提供菝葜皂苷元衍生物的抗老年痴呆活性筛选结果及在制备抗老年痴呆新药方面的新用途。

本发明是通过如下技术方案实现的：

菝葜皂苷衍生物结构通式如下：

式（Ⅰ）中，

当2、3之间键未断裂时，R为H，=O，OH，-NHR₁，-N(R₁)₂，SO₄，SO_nR₁，O-C(O)-R₁，R₁CONH-，-N(R₁)₂，-CONR₁，

，

，，

，含氮生物碱及其盐，R'、R''为OH，F，C1，Br，I；

当2、3之间键断裂时，R''为H，R、R'为COOR₁，OH，F，C1，Br，I，SO₄，SO_nR₁，O-C(O)-R₁，R₁CONH-，-N(R₁)₂；

式（Ⅱ）中，R、R'为H，=O，OH，F，C1，Br，I，-NHR₁，-N(R₁)₂，SO₄，SO_nR₁，O-C(O)-R₁，R₁CONH-，-CONR₁，

，，

，

，含氮生物碱及其盐；

式（Ⅲ）中，R、R'、R''为H，=O，OH，F，C1，Br，I，-NR₁，-N(R₁)₂，SO₄，SO_nR₁，O-C(O)-R₁，R₁CONH-，-CONR₁，

，

，

，

，含氮生物碱及其盐；R'''为H，OH，=O；

注：R₁为C_mH_2m+1 (m=1-10, 优选1-3)

    n=2、3

菝葜皂苷元制备方法(CN101531697)：

1、按知母药材于20-80%的乙醇的重量份数比例1:4-1:6向知母药材中加入乙醇，常温浸泡12-24小时，然后加热至沸腾，保持沸腾1-4小时，之后滤渣取液；按知母药材于20-80%的乙醇的重量份数比例1:6-1:8向知母药材中加入乙醇，常温浸泡12-24小时，然后加热至沸腾，保持沸腾1-4小时，之后滤渣取液；按知母药材于20-80%的乙醇的重量份数比例1:8-1:10向知母药材中加入乙醇，常温浸泡12-24小时，然后加热至沸腾，保持沸腾1-4小时，之后滤渣取液。

2、将分别通过上述操作的提取液混合一起后，减压浓缩，直至不再有乙醇流出活无乙醇味为止。

3、将浓缩过的液体通过活化的极性或非极性大孔吸附树脂柱，使液体中的皂苷吸附到树脂上，并弃去流出液，再用水清洗树脂柱，直至流出颜色变浅，并弃去流出液，继续用20-90%的乙醇清洗树脂柱，直至树脂柱上的皂苷全部被洗脱下来为止，并收集洗脱液。

4、按洗脱液的重量份数与矿酸（如盐酸、硫酸等）的比例10:1-1:1向洗脱液中加入酸，然后加热至沸腾，保持沸腾1-4小时，取出放凉。抽滤得固体物，将其放干，待用。

5、将无水乙醇与氯仿或二氯甲烷等非极性溶剂（两溶剂比例任意）的混合液加入至上述干燥固体中，使其全部溶解，让其自然析出晶体，抽滤得晶体，按同样方法多次重结晶，最后得到白色晶体。mp 194-195℃,Molish反应阳性，Liebermann-Burchard反应阳性。

6、将样品在减压条件下加热干燥。

本发明通过对菝葜皂苷元进行构型翻转、氧化、氨化、酯化、不同程度和位置的开环等结构修饰法增加其活性及溶解性。

具体实施方式

实施例1   表菝葜皂苷元的制备

    （1）250ml茄型瓶加入菝葜皂苷元（4.16g，10mmol），苯甲酸（2.44g，20mmol），Ph₃P(5.24g，20mmol)，干燥的THF 50ml，室温搅拌状态下滴加用20ml干燥THF 溶解的DIAD(4.04g，20mmol)，滴加完毕室温反应24h。反应完毕减压蒸干，加水，搅拌，抽滤，上硅胶柱，石油醚冲杂质，石油醚：乙酸乙酯（80:1）冲洗得中间体产物，结构鉴定数据如下：

m/z：[M+H]⁺=521.3620, ¹H-NMR (300MHz, CDCl₃)： δ 8.05(2H, m, H-2',6'), 7.54 (1H, m, H-4'), 7.43 (2H, m, H-3',5'), 4.98 (1H, m, H-3), 4.42 (1H, m, H-26), 3.96 (1H, dd, J=2.52 Hz, J=11.04 Hz, H-26), 3.31 (1H, d, J=11.04 Hz H-16), 1.08 (3H, d, J=7.11Hz, CH₃-21), 1.00 (3H, d, J=6.72 Hz, CH₃-27), 0.98 (3H, s, CH₃-19), 0.77 (3H, s, CH₃-18)。

（2）50ml茄型瓶中加入中间体产品（0.2g，），NaOH(1g，)，甲醇：THF：H₂O（1:1:1）6ml，室温搅拌反应12h，反应完毕加水，搅拌，抽滤，得固体，上硅胶柱得表菝葜皂苷元（2.24g，产率约50%）结构鉴定数据如下：[M+H]⁺=417.3355,¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.41,( 1H,m,J=7.50Hz,J=14.82Hz,H-26),3.95(1H,dd,J=2.58Hz,J=10.98Hz,H-26),3.63(1H,m,H-3),3.30(1H,d,J=11.04Hz,H-16)1.08(3H,d,J=7.05Hz,CH₃-21),0.99(3H,d,J=6.66Hz,CH₃-27),0.94(3H,s,CH₃-19),0.75(3H,s,CH₃-18)¹³C-NMR(300MHz,CDCl₃)δ30.5(C-1),27.8(C-2),71.9(C-3),33.5(C-4)36.5(C-5),27.1(C-6),27.1(C-7)35.3(C-8),39.8(C-9),35.3(C-10),20.7(C-11),39.8(C-12),40.3(C-13),56.4(C-14),33.5(C-15),81.1(C-16),62.1(C-17),16.1(C-18),23.6(C-19),42.1(C-20),14.4(C-21),109.8(C-22),26.0(C-23),26.7(C-24),27.8(C-25),65.3(C-26),16.7(C-27)。

实施例2   知母皂苷元的3位氨化

(1) 在50ml茄形瓶中加入0.8g(0.0045mol)NBS，5ml二氯甲烷（或THF，室温下，氮气保护下滴加用5ml二氯甲烷(或THF）溶解的三苯基膦，滴加完毕，在0-30℃下搅拌0.5h，然后滴加10ml二氯甲烷(或THF）溶解的菝葜皂苷元1.2g（0.003mol）10-30℃下搅拌反应至反应完全。加饱和食盐水用二氯甲烷萃取（×2），有机层减压浓缩，得固体，上硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯100：1-50:1冲洗产品得白色固体（1.1g，产率78%）[M+H]⁺=479.25。

（2）50ml茄形瓶中加入白色固体0.96g（0.002mol），10ml DMF(或乙腈、丙酮等)，1.62g二甲胺盐酸盐，60℃到回流反应12h。加水抽滤，得白色固体，硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯（20:1）加三乙胺冲产品，得白色固体B（0.25g 产率约30%）[M+H]⁺=472.4147,¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ4.41,(1H,m,J=7.26Hz,J=14.40Hz,H-26),3.95(1H,d,J=10.08Hz,H-26),3.30(1H,d,J=10.92Hz,H-16),2.60(4H,br.s,N-2CH₂),1.08(3H,d,J=7.02Hz,CH₃-21),0.99(3H,d,J=6.78Hz,CH₃-27),0.93(3H,s,CH₃-19),0.75(3H,s,CH₃-18)。

实施例3   知母皂苷元的3位氨化

50ml茄形瓶中加入0.96g A （0.002mol），10ml DMF(或乙腈、丙酮等)，1.7g六氢吡啶，60℃到回流反应12h。加水抽滤，得白色固体，硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯（20:1）加三乙胺冲产品，得白色固体C（0.38g 产率约40%）[M+H]⁺=484.4151,¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)δ4.4 0(1H,m,J=7.5Hz,J=14.7Hz,H-26),3.96(1H,dd,J=2.58Hz,10.98Hz,H-26),3.30(1H,d,J=10.92Hz,H-16),2.34(4H,br.s,N-2CH₂),2.17(1H,br.s,H-3),1.08(3H,d,J=7.08Hz,CH₃-21),0.99(3H,d,J=6.9Hz,CH₃-27),0.95(3H,s,CH₃-19),0.76(3H,s,CH₃-18)。

实施例4  知母皂苷元的3位羧基化合物

（1）格氏试剂的制备：100ml茄形瓶中加入0.21g镁条（打磨光亮），5ml干燥THF,再加入1-2粒碘，边加热边滴加用25ml干燥THF溶解的样品A(3.82g，0.008mol)，滴加缓慢，待反应发生后停止加热，室温反应，滴加完毕室温反应至反应结束。[M+H]^-=475.2918.

（2）羧酸的制备：冰浴下向反应液中通入二氧化碳，反应结束后，将反应液倒入冰水中，搅拌，抽滤，固体过硅胶柱，石油醚乙酸乙酯系统冲洗得产品D（2.3g，产率约65%）[M-H]^-=443.3128, ¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.40,( 1H,m,J=7.50Hz,J=14.82Hz,H-26),3.96(1H,dd,J=2.58Hz,J=10.98Hz,H-26),2.38(1H,m,H-3),3.30(1H,d,J=11.04Hz,H-16)1.08(3H,d,J=7.05Hz,CH₃-21),0.99(3H,d,J=6.66Hz,CH₃-27),0.94(3H,s,CH₃-19),0.75(3H,s,CH₃-18)。

实施例5  知母皂苷元F开环氨化化合物

  （1）250ml茄形瓶中加入4.16g（0.01mol）皂苷元，0.48g（0.02mol）NaH(2-10倍量) ，40mlDMF（或乙腈、丙酮）室温搅拌状态下加入3.42g溴化苄，0-80℃搅拌反应至反应完全。反应完全后加1-10倍量的水，搅拌，抽滤，得固体，乙醇重结晶得白色固体E(4.3g 产率为85%)[M+H]⁺=507.3823,¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.34(2H,m,H-2',6'),7.33(2H,m,H-3',5'),7.28(1H,m,H-4'),4.48(2H,d,J=1.8Hz,O-CH₂),4.41(1H,m,J=6.81Hz,13.29Hz,H-26),3.95(1H,dd,J=2.61Hz,10.98Hz,H-26),3.70(1H,s,H-3),3.32(1H,d,J=10.95Hz,H-16),1.08(3H,d,J=7.05Hz,CH₃-21),1.00(3H,d,J=6.87Hz,CH₃-27),0.97(3H,s,CH₃-19),0.76(3H,s,CH₃-18)。

（2）无水条件下，向50ml茄形瓶中加入1.12g（0.002mol） 菝葜皂苷元，1.06g（0.008mol）无水AlCl₃和10mL无水乙醚，冰浴搅拌，滴入溶有0.08gLiAlH₄（0.002mol）的5mL无水乙醚，反应结束后，冰浴下加入10%的硫酸萃取分离有机层，水层用醚多次萃取，合并有机液，过无水碳酸钠干燥除水，减压蒸出溶剂，柱色谱分离，以石油醚-乙酸乙酯梯度洗脱得到白色固体F (0.64g，产率63.5%)[M+H]⁺=509.3979,¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ7.35(2H,m,H-2',6'),7.33(2H,m,H-3',5'),7.28(1H,m,H-4'),4.48(2H,d,J=1.05Hz,O-CH₂),4.29(1H,m,H-22),3.70(1H,s,H-3),3.48(2H,m,H-26),3.31(1H,m,H-16),1.08(3H,d,J=6.75Hz,CH₃-21),0.93(3H,d,J=6.54Hz,CH₃-27),0.97(3H,s,CH₃-19),0.78(3H,s,CH₃-18)。

（3）（4）参考实施例1

（5）50ml茄形瓶中加入0.54g K（0.001mol），10%Pd-C 0.05g，无水乙醇-醋酸8ml+0.4ml，氢气下反应10-24h。抽滤，减压蒸干溶剂，过硅胶柱，石油醚：乙酸乙酯加少许三乙胺冲洗产品，丙酮重结晶得白色固体L（0.4g产率90%）[M+H]⁺=486.4310,¹H-NMR(600MHz,CDCl  ₃)δ4.28(1H,m,H-22),4.10(1H,s,H-3),3.30(1H,m,H-16),2.30(4H,m,N-CH₂),0.99(3H,d,J=6.66Hz,CH₃-21),0.98(3H,s,CH₃-19),0.90(3H,d,J=6.54Hz,CH₃-27),0.78(3H,s, CH₃-18)。

。

实施例6  知母皂苷元A环2位羟基3位羰基化合物

 (1) 向50ml茄形中加入0.83g（0.002mol）菝葜皂苷元，10mL丙酮，氩气保护下搅拌，冰浴温度滴加NBA640mg。反应后加入 Na₂SO₃水溶液，加入过量的水使其沉淀，过滤得产物。柱色谱分离，以石油醚-丙酮梯度洗脱得到羟基氧化的菝葜皂苷元衍生物M (0.64g，收率77.4%)。

(2)50ml茄形瓶中加入用5mlTHF溶解的0.8g（0.002mol）样品M，1g(0.0025mol)用8mlTHF溶解的PTAP，0-30℃反应，反应完全过硅胶柱，石油醚乙酸乙酯系统洗脱，得产品N（0.6g，产率约63%）。

(3)50ml茄形瓶中加入0.2g（0.39mol）样品N，K₂CO₃，(1.0g，7.2mol)，丙酮和水（15ml+5ml），45℃反应15h，反应完毕加水，抽滤，固体过硅胶柱，石油醚乙酸乙酯系统洗脱得产品O（0.13g，产率约80%）[M+H]⁺=447.3020, ¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.40,( 1H,m, J=7.27Hz,J=14.62Hz,H-26),3.96(1H,dd,J=2.62Hz,J=10.98Hz,H-26),3.63(1H,m,H-2),3.30(1H,d,J=11.04Hz,H-16),2.34(1H,m,H-3),1.08(3H,d,J=7.05Hz,CH₃-21),0.99(3H,d,J=6.66Hz,CH₃-27),0.94(3H,s,CH₃-19),0.75(3H,s,CH₃-18)。

实施例7  知母皂苷元开环后硫酸酯化

在50ml茄形瓶中加入1.08g（0.0025mol）甲基保护菝葜皂苷元，2.5g（0.01mol）DCC，再加入8mlDMF，室温搅拌下滴加用4mlDMF溶解的浓H₂SO₄，室温下反应，TLC检测反应。反应结束后加水搅拌，抽滤，残渣过硅胶柱，石油醚乙酸乙酯系统洗脱得白色固体（0.76g收率约60%）[M+H]⁺544.2938,¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.29(1H,m,H -22),3.49(1H,s,H-3),3.48(2H,m,H-26),3.32(1H,m,H-16),3.28(3H,s,O-CH₃),0.98(3H,d,J=6.75Hz,CH₃-21),0.94(3H,s,CH₃-19),0.93(3H,d,J=6.66Hz,CH₃-27),0.77(3H,s,CH₃-18)。

实施例8  知母皂苷元的5、6开环

100ml茄形瓶中加入1.04g（0.0025mol）菝葜皂苷元，4.6g（0.09mol）锌粉，40ml 85%的乙醇，搅拌状态下滴加40ml浓盐酸，1h滴加完毕，滴加完毕后回流反应1h，停止反应。抽滤，将滤液倒入冰水中搅拌，抽滤，固体用乙酸乙酯重结晶，得化合物Q（0.58g，产率约55%）[M+Na]⁺=443.3490.¹H-NMR(300MHz,CDCl₃)δ4.10(1H,s,H-3),3.48(2H,m,H-26),3.31(1H,m,H-16),0.99(3H,d,J=7.21Hz,CH₃-21),0.98(3H,s,CH₃-19),0.93(3H,d,J=6.54Hz,CH₃-27),0.78(3H,s,CH₃-18)。

实施例9菝葜皂苷元衍生物对东莨菪碱诱导小鼠学习记忆障碍的影响

   菝葜皂苷元衍生物B（实施例2）和C（实施例3）对东莨菪碱诱导学习记忆障碍小鼠自发活动的影响

一、 实验动物与材料

1. 实验动物

SPF级KM小鼠，雄性，体重18-22 g，共50只。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。许可证号：SCXK京2009-6004。

2. 药物与试剂

化合物B 和C  0.5%的CMC-Na溶液溶解；

东莨菪碱：Sigma美国，批号：077K1164，临用前用生理盐水配制；

盐酸多奈哌齐：卫材（中国）药业有限公司，批号：090922A，0.5%的CMC-Na溶液溶解；生理盐水：吉林科伦康乃制药，批号：100411。

3. 实验仪器

自发活动视频分析系统：上海吉量软件科技开发公司；

行为学实验装置：水迷宫、避暗装置均为自制。

二、实验方法

将50只小鼠随机分为5组：空白组、模型组、化合物B和C 在50、100 mg/kg组及盐酸多奈哌齐0.65 mg/kg组，每组10只。

给药组小鼠连续灌胃给药9天，每天1次，空白组、模型组小鼠每天灌胃给予同体积的0.5%的CMC-Na溶液。给药组和模型组小鼠第1天到第7天每日给药后腹腔注射东莨菪碱溶液1.0 mg/kg ，第8天给药后腹腔注射东莨菪碱溶液1.5 mg/kg，空白组给予同体积的生理盐水。第2天进行自主活动检测；第3天到第7天进行水迷宫实验；第8天到第9天进行避暗实验。以上行为学实验均在每日给予东莨菪碱后10-15分钟内开始。

2．统计方法

实验数据用mean±SD表示，使用SPSS17.0软件进行组间资料的单因素方差分析，使用stat view软件进行组间资料的双因素方差分析。

三、 实验结果

实验结果表明：与模型组比较，各组小鼠自发活动总路程及平均速度未见显著性差异（表1），提示本实验条件下的化合物B和C,不会通过改变大脑皮层兴奋性而影响学习记忆行为学实验结果。

实施例10：菝葜皂苷元衍生物B和C对东莨菪碱诱导学习记忆障碍小鼠水迷宫游泳时间的影响

一、 实验动物与材料

1. 实验动物

SPF级KM小鼠，雄性，体重18-22 g，共50只。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。许可证号：SCXK京2009-6004。

2. 药物与试剂

化合物B和C 0.5%的CMC-Na溶液溶解；

东莨菪碱：Sigma美国，批号：077K1164，临用前用生理盐水配制；

盐酸多奈哌齐：卫材（中国）药业有限公司，批号：090922A，0.5%的CMC-Na溶液溶解；

生理盐水：吉林科伦康乃制药，批号：100411。

3. 实验仪器

自发活动视频分析系统：上海吉量软件科技开发公司；

行为学实验装置：水迷宫、避暗装置均为自制。

二、实验方法

将50只小鼠随机分为5组：空白组、模型组、化合物B 50、100 mg/kg 和化合物C 50、100 mg/kg组及盐酸多奈哌齐0.65 mg/kg组，每组10只。给药组小鼠连续灌胃给药9天，每天1次，空白组、模型组小鼠每天灌胃给予同体积的0.5%的CMC-Na溶液。给药组和模型组小鼠第1天到第7天每日给药后腹腔注射东莨菪碱溶液1.0 mg/kg ，第8天给药后腹腔注射东莨菪碱溶液1.5 mg/kg，空白组给予同体积的生理盐水。第2天进行自主活动检测；第3天到第7天进行水迷宫实验；第8天到第9天进行避暗实验。以上行为学实验均在每日给予东莨菪碱后10-15分钟内开始。

2．统计方法

实验数据用mean±SD表示，使用SPSS17.0软件进行组间资料的单因素方差分析，使用stat view软件进行组间资料的双因素方差分析。

三、 实验结果

实验结果表明：自第二天起，与空白组比较，模型组小鼠游泳时间显著延长；与模型组相比，化合物B 50、100 mg/kg组和C 50、100 mg/kg组及盐酸多奈哌齐0.65 mg/kg组小鼠游泳时间显著缩短，且化合物B呈现剂量依赖性，而化合物C则无剂量依赖性（见表2）。

实施例11：菝葜皂苷元衍生物D（实施例4）和L（实施例5）对东莨菪碱诱导学习记忆障碍小鼠避暗潜伏期的影响

一、 实验动物与材料

1. 实验动物

SPF级KM小鼠，雄性，体重18-22 g，共70只。由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。许可证号：SCXK京2009-6004。

2. 药物与试剂

化合物D和L：0.5%的CMC-Na溶液溶解；

东莨菪碱：Sigma美国，批号：077K1164，临用前用生理盐水配制；

盐酸多奈哌齐：卫材（中国）药业有限公司，批号：090922 A，0.5%的CMC-Na溶液溶解；

生理盐水：吉林科伦康乃制药，批号：100411。

3. 实验仪器

自发活动视频分析系统：上海吉量软件科技开发公司；

行为学实验装置：水迷宫、避暗装置均为自制。

二、实验方法

将50只小鼠随机分为5组：空白组、模型组、化合物D 50、100 mg/kg 和化合物L 50、100 mg/kg组及盐酸多奈哌齐0.65 mg/kg组，每组10只。给药组小鼠连续灌胃给药9天，每天1次，空白组、模型组小鼠每天灌胃给予同体积的0.5%的CMC-Na溶液。给药组和模型组小鼠第1天到第7天每日给药后腹腔注射东莨菪碱溶液1.0 mg/kg ，第8天给药后腹腔注射东莨菪碱溶液1.5 mg/kg，空白组给予同体积的生理盐水。第2天进行自主活动检测；第3天到第7天进行水迷宫实验；第8天到第9天进行避暗实验。以上行为学实验均在每日给予东莨菪碱后10-15分钟内开始。

2．统计方法

实验数据用mean±SD表示，使用SPSS17.0软件进行组间资料的单因素方差分析，使用stat view软件进行组间资料的双因素方差分析。

三、 实验结果

实验结果表明：与空白组相比，模型组小鼠避暗潜伏期显著缩短；与模型组比较，化合物D 50、100 mg/kg组和L 50、100 mg/kg组显著增长避暗潜伏期（见表3）。

实施例12：菝葜皂苷元衍生物O,Q,P和K（实施例5-8）对东莨菪碱致小鼠记忆获得障碍的影响。

一、 实验动物与材料

1. 实验动物

ICR小鼠, 清洁级，由扬州大学比较医学中心提供，动物质量合格证号：SCXK(苏)2007-0001。体重：18-22g，性别：雌雄各半，各组动物数: 10只/组

2. 药物与试剂

名称：化合物O,Q,P和K 溶剂：0.5% CMC-Na; 配制方法：给药前用水0.5% CMC-Na分别配制成1.67mg/ml和3.33mg/ml溶液。阳性对照药：石杉碱甲片（huperzine A tablets，0.05mg），上海复旦复华药业有限公司 批号：091101。

3. 主要试剂与仪器

1、药品与试剂：石杉碱甲片：上海复旦复华药业有限公司 批号：091101；氢溴酸东莨菪碱注射液（scopolamine hydrobromide injection，1ml:0.3mg），上海禾丰制药，批号：090303。

 2、主要仪器：Morris水迷宫：上海吉量软件科技有限公司； Sartorius分析天平：北京多利斯天平有限公司; TLS- 2000A型电子秤：常熟双杰测试仪器厂。

4. 试验主要步骤

小鼠按体重随机分为5组：正常对照组，阴性对照组，石杉碱甲组，化合物O,Q,P和K中剂量组和高剂量组，每组10只，雌雄各半。连续灌胃给药7天，并腹腔注射东莨菪碱（0.8mg/kg，0.2ml/10g），正常对照组动物腹腔注射等容积的生理盐水。水迷宫试验为期5天，前4天为定位航行试验，第5天为空间搜索试验。水迷宫试验期间继续每天灌胃给药，并予试验开始前10-15min腹腔注射东莨菪碱。

①定位航行试验：将水迷宫平台置于第4象限，放入25°C左右水至没过平台5mm。分别从1、2、3、4四个象限（4个入水点）将小鼠面向池壁放入水中，使其自由游泳90s，90s内小鼠找到平台并上台停留10s后将其从平台上取下休息，计算机监测并记录动物从入水开始寻找至爬上平台的路线、所需的时间（潜伏期）及游泳速度等。若90s内动物未找到平台，则将小鼠引到平台，并停留30s，这时潜伏期记为90s。

②空间搜索试验：试验第5天撤除平台，任选一象限将各组小鼠依次从该象限面向池壁放入水中，使其自由游泳90s，记录小鼠在第4象限停留的时间占总时间的百分比以及跨越原平台所在位置的次数。数据采集和处理均由图像自动监视和处理系统完成。

5.统计学处理

所有数据均用均值±标准差（±s）表示。采用SPSS11.5软件进行分析,数据比较采用单因素方差分析。P﹤0.05表示有显著性差异，P﹤0.01表示有极显著性差异。

6. 剂量设置  

化合物OⅠ组（AⅠ组）：50mg/kg

化合物OⅡ组（AⅡ组）：100mg/kg

化合物QⅠ组（AⅠ组）：50mg/kg

化合物QⅡ组（AⅡ组）：100mg/kg

化合物PⅠ组（AⅠ组）：50mg/kg

化合物PⅡ组（AⅡ组）：100mg/kg

化合物KⅠ组（AⅠ组）：50mg/kg

化合物KⅡ组（AⅡ组）：100mg/kg

阳性对照药：石杉碱甲0.08mg/kg 

给药容量为0.3ml/10g

7. 给药方法  

    灌胃给药

8. 试验对照  

正常对照组：给予与阳性对照等体积的0.5% CMC-Na溶液

阴性对照组：给予与阳性对照等体积的0.5%CMC-Na溶液

阳性对照组：给予石杉碱甲溶液（2.67×10^-3mg/ml），0.3ml/10g

9. 试验结果

定位航行试验结果显示, 与阴性对照组相比，正常对照组、阳性对照组、化合物O,Q,P和KⅠ、Ⅱ组小鼠第3天和第4天潜伏期与阴性对照组有显著或极显著差异（P<0.05,P<0.01），结果见表4。空间搜索试验显示, 与阴性对照组相比，正常对照组、阳性对照组、化合物O,Q,P和KⅠ、Ⅱ组小鼠在第4象限停留时间占总时间的百分比与阴性对照组有显著差异（P<0.05）结果见表5。

10. 结论

化合物O 50mg/kg~100mg/kg剂量范围内对东莨菪碱所致的小鼠学习记忆获得障碍有一定改善作用。化合物Q 100mg/kg对东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍有一定改善作用。化合物P 50mg/kg~100mg/kg剂量范围内对东莨菪碱所致的小鼠学习记忆获得障碍有一定改善作用。化合物K 50mg/kg对东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍有显著改善作用。

实施例13：菝葜皂苷元衍生物片剂的制备

菝葜皂苷元衍生物40g，制成1000片

    菝葜皂苷元衍生物40g，过80目筛，与淀粉混匀，加淀粉浆制成软材，用14目筛制粒后置70-80℃干燥，用12目筛整粒，加入淀粉及硬脂酸镁混匀，压片即得。

实施例14：菝葜皂苷元衍生物胶囊剂的制备

菝葜皂苷元衍生物40g，制成1000粒

菝葜皂苷元衍生物40g过80目筛加10%的淀粉浆制成软材后，过14目尼龙筛制粒，于70℃干燥至含水量在3%以下，填入空胶囊中，即得。

实施例15：菝葜皂苷元衍生物丸剂的制备

菝葜皂苷元衍生物  1份         PEG6000  9份

取PEG60000在油浴上加热至约200℃，加入菝葜皂苷元衍生物细粉，不断搅拌使其全部熔融，趁热过滤，置贮液瓶中，200℃下保温，用关口内外径分别为9.0mm、9.8mm的滴管滴制，滴速80滴/分钟，滴入含43%煤油的液体石蜡冷却液中，冷凝成丸，以液体石蜡洗丸，至无煤油味，用毛边纸吸去黏附的液体石蜡，即得。

实施例16：菝葜皂苷元衍生物颗粒剂的制备

菝葜皂苷元衍生物20g

菝葜皂苷元衍生物20g加适量75%乙醇溶解，搅匀，静止过夜，过滤，滤液减压回收乙醇，浓缩汁膏状，加入5倍量的糖粉，混合均匀，加入70%的乙醇少许，制成软材，过14目尼龙筛制粒，湿颗粒于60℃干燥，干颗粒过14目筛整粒，再过4号筛（65目）筛去细粉，分装，密封，包装即得。

实施例17：菝葜皂苷元衍生物注射剂的制备

菝葜皂苷元衍生物100g

在配制容器中，加注射用水1000ml，通CO₂饱和，加菝葜皂苷元衍生物溶解后，分次缓慢加入碳酸氢钠，搅拌使其完全溶解，加入预先配制好的依地酸二钠溶液和亚硫酸氢钠溶液，搅拌均匀，调节药液pH6.0～6.2，添加二氧化碳饱和的注射用水至足量。用垂熔玻璃漏斗与膜滤器过滤，溶液中通二氧化碳，并在二氧化碳或氮气流下灌封，最后通100℃流通蒸汽灭菌15min。

实施例18：菝葜皂苷元衍生物口服液的制备

菝葜皂苷元衍生物50g

    菝葜皂苷元衍生物50g加60%乙醇加热回流1h，过滤，乙醇液浓缩至适量加水适量稀释，过滤，加单糖浆50ml与苯甲酸钠适量，加水至200ml，搅匀，灌装，灭菌，经质量检查，贴签即得。

Claims (8)

1.具有如下式（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）所示的菝葜皂苷元衍生物：

式（Ⅰ）中，

当2、3之间键未断裂时，R为H，=O，OH，-NHR₁，-N(R₁)₂，SO₄，SO_nR₁，O-C(O)-R₁，R₁CONH-，-N(R₁)₂，-CONR₁，

，

，

，

，含氮生物碱及其盐，R'、R''为OH，F，C1，Br，I；

当2、3之间键断裂时，R''为H，R、R'为COOR₁，OH，F，C1，Br，I，SO₄，SO_nR₁，O-C(O)-R₁，R₁CONH-，-N(R₁)₂；

式（Ⅱ）中，R、R'为H，=O，OH，F，C1，Br，I，-NHR₁，-N(R₁)₂，SO₄，SO_nR₁，O-C(O)-R₁，R₁CONH-，-CONR₁，

，，，

，含氮生物碱及其盐；

式（Ⅲ）中，R、R'、R''为H，=O，OH，F，C1，Br，I，-NR₁，-N(R₁)₂，SO₄，SO_nR₁，O-C(O)-R₁，R₁CONH-，-CONR₁，

，

，

，，含氮生物碱及其盐；R'''为H，OH，=O；

R₁为C_mH_2m+1  ， m=1-10的整数，优选1-3的整数，n=2、3。

2.根据权利要求1所述的衍生物，其特征在于，所述的衍生物是从知母中提取得到。

3.  权利要求1的衍生物，选自如下化合物：

 

  。

4.一种药物组合物，包含权利要求1或2或3所述的衍生物和药学上可接受的载体。

5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物与药学上可接受的赋形剂制成临床可接受的制剂。

6.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的制剂为片剂、胶囊剂、颗粒剂、口服液、丸剂、注射剂。

7.权利要求1或2或3所述的菝葜皂苷元衍生物在制备治疗抗老年性痴呆疾病药物中的应用。

8.权利要求3-5中任何一项所述的组合物在制备治疗抗老年性痴呆疾病药物中的应用。