CN104383052B - 黄皮果提取物及其在制备用于防治阿尔茨海默病药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及黄皮果提取物及其在制备用于防治阿尔茨海默病药物中的应用。本发明制备的黄皮果提取物可以应用于防治阿尔茨海默病的药物中,作为一种防治阿尔茨海默病的新方法,该药物具有抗氧化、抑制Aβ的生成,减少星形胶质细胞细胞的活化,保护神经元的作用,从而可以有效缓解该病引起的认知功能障碍,对防治阿尔茨海默病有较好的效果。
Description
技术领域
本发明涉及黄皮果提取物新的药物用途,具体地涉及黄皮果提取物的制备及其在制备预防和治疗阿尔茨海默病药物中的应用。
背景技术
阿尔茨海默病(Alzheimer's disease,AD)是一种常见的神经退行性疾病,也是最常见的老年痴呆症之一,临床特点表现为进行性记忆丧失和认知功能损伤,其典型的病理特征为老年斑(Senile plaques,SP)和神经原纤维缠结(Neurofibrillary tangles)的形成及受累脑区的突触和神经元受损。β淀粉样蛋白(Beta-amyloid peptide,Aβ)是老年斑的主要组成成分,研究表明Aβ具有神经毒性,能够诱发神经细胞的损伤甚至死亡。尽管Aβ的神经毒机理目前尚未完全阐明,但由其引发的氧化应激和线粒体功能障碍被认为在Aβ介导的神经细胞凋亡过程中发挥了关键作用。此外,Aβ诱发的氧化应激有助于AD老年斑和神经原纤维缠结的形成,也能促使神经细胞胞内产生氧化应激反应和线粒体能量代谢功能障碍并启动一系列病理反应致使AD病人脑区神经元广泛受损。因此,抑制Aβ生成,减少神经元凋亡和改善认知功能障碍对防治AD的发生和发展具有积极的意义。
芸香科黄皮属植物黄皮(Clausena lansium)具有很高的药用价值,其果、叶、种等均可入药,过去的研究发现黄皮叶和黄皮果核中含有黄皮酰胺类化合物有保肝、促智的作用。但尚无证据表明黄皮果提取物能预防或治疗由AD病引起的认知功能障碍,也没有相关报道指出黄皮果提取物能抑制Aβ的生成和减轻由此引起的神经细胞凋亡。
发明内容
本发明提供一种黄皮果提取物组合物,该组合物具有抗氧化、抑制Aβ的生成,减少星形胶质细胞细胞的活化,保护神经元的作用,可应用于制备防治阿尔茨海默病的药物或保健食品。
本发明还提供了黄皮果提取物在预防与治疗阿尔茨海默病药物中的应用,开辟了阿尔茨海默病防治的新方法。
本发明还提供了一种防治阿尔茨海默病药物,该药物具有抗氧化、抑制Aβ的生成,减少星形胶质细胞细胞的活化,保护神经元的作用,从而可以有效缓解该病引起的认知功能障碍,对防治阿尔茨海默病有较好的效果。
为了解决上述技术问题,本发明是通过以下技术方案实现的:
本发明所述的黄皮果提取物的总黄酮及有机酸含量≥75%,生物碱含量≥5%。
进一步地,鉴定出该黄皮果提取物包含四种黄酮类化合物,分别是(1).芦丁(rutin),(2).槲皮素(quercetin)-7-O-α-L-吡喃葡萄糖苷,(3).木犀草素(Luteolin)-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,(4).槲皮素,所述黄酮类化合物的含量为≥60%;所述提取物还包括一种生物碱,是(5).黄皮酰胺(Clausenamide),其含量≥5%所述五种化合物的结构式如下:
黄酮类化合物:
化合物(1)
槲皮素-3-O-α-L-鼠李吡喃糖(1–6)β-D-吡喃葡萄糖苷
化合物(2)
槲皮素-7-O-α-L-吡喃葡萄糖苷
化合物(3)
木犀草素-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
化合物(4)
槲皮素
生物碱类化合物
化合物(5)
黄皮酰胺
本发明的另一技术目的是提供一种黄皮果提取物,其通过以下步骤制备而成:
(1).取晒干的黄皮果,去核,粉碎,过40目筛,得到黄皮果粉末;
(2).用乙醇浸泡步骤(1)所得的黄皮果粉末,超声提取5次;
(3).过滤,合并滤液,离心,取上清液浓缩,然后再用石油醚萃取3次,每次石油醚萃取后分去上层萃取液,取下层液体挥去石油醚,再用乙酸乙酯萃取5次,分别合并上层乙酸乙酯萃取液和下层提取液,采用减压蒸馏法进行浓缩,得到乙酸乙酯浸膏和下层提取液浸膏;
(4).分别用3-5倍体积的双蒸水稀释所述步骤(3)获得的乙酸乙酯浸膏和下层提取液浸膏,混悬后分别通过大孔树脂柱吸附,采用5-10倍柱体积的适度乙醇进行梯度洗脱,收集并合并所获得洗脱液减压浓缩至无醇味浸膏,即得所述黄皮果提取物。
进一步地,所述步骤(2)中乙醇的浓度为95%,乙醇的用量是9倍黄皮果粉末重量,浸泡时间为12-14h,超声提取时间是每次1.5h。
进一步地,所述步骤(3)中离心的转速为3000rpm/min,离心的时间为10min。
更进一步地,所述步骤(3)中上清液浓缩至相对密度1.20-1.45。
进一步地,所述步骤(4)中洗脱的乙醇依次采用的是10%乙醇,30%乙醇和60%乙醇,乙酸乙酯浸膏部分需要收集的洗脱液是30%和60%的乙醇洗脱液,下层提取液浸膏部分需要收集的洗脱液是60%的乙醇洗脱液。
作为一种应用,本发明所述的黄皮果提取物在制备用于治疗和治疗阿尔茨海默病的药物中的应用。
一种用于防治阿尔茨海默病的药物,包括药物成分和制药辅料,所述药物成分选用上述的黄皮果提取物。
进一步地,所述防治阿尔茨海默病的药物,其剂型为医学上认可的任一种剂型,例如片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液。
本发明的有益效果是:
本发明首次公开了黄皮果提取物在防治阿尔茨海默病的新用途,及该提取物化合物的指纹特征,为防治阿尔茨海默病提供了一种新方法。采用本发明的黄皮果提取物及由该黄皮果提取物制成的药物,可以有效缓解该病引起的认知功能障碍,对防治阿尔茨海默病有较好的效果。
本发明通过模势动物研究并确证了黄皮果提取物能有效改善痴呆动物的认知功能障碍,并能抑制Aβ的生成,进一步明确其用于防治AD的活性成分。
说明书附图
图1是黄皮果提取物对酒精所致慢性损伤小鼠大脑海马齿状回HE染色图(200X):其中,A代表空白对照组,B代表酒精模型组,C代表黄皮果提取物低剂量组,D代表黄皮果提取物高剂量组。
图2是黄皮果提对各组小鼠大脑皮层HE染色图(200X):其中A代表模型组,B代表黄皮果提取物高剂量组,C代表黄皮果提取物低剂量组,D代表空白对照组。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和优点更加明确,下面对本发明的优选实施例进行详细的描述。
实施例1黄皮果提取物的制备
取黄皮果干品5.00kg,去核,粉碎,过40目筛,备用。加入9倍药材重量的95%乙醇浸泡12-14h,超声提取5次,每次超声提取的时间是1.5h,过滤,合并滤液,3000rpm/min离心10min,取上清液浓缩至相对密度1.20-1.45,用等体积石油醚萃取3次,分去上层萃取液(石油醚萃取部分),下层液体挥去石油醚后,再用等体积乙酸乙酯萃取5次,分别合并上层乙酸乙酯萃取液和下层提取液,减压浓缩,,,干燥,分别得乙酸乙酯浸膏74.60g和下层提取物浸膏160.70g。分别用0.4L和0.8L双蒸水稀释所获得乙酸乙酯浸膏和下层提取物浸膏,分别混悬后过HP-20大孔树脂柱,依次用8L10%乙醇、8L 30%乙醇、8L 60%乙醇洗脱,乙酸乙酯浸膏部分收集30%和60%乙醇洗脱液,即洗脱液A,下层提取物浸膏部分收集60%乙醇洗脱液即洗脱液B,合并所述洗脱液A、洗脱液B,并减压浓缩至无醇味浸膏,得棕黄色的黄皮果提取物16.32g。
实施例1通过分光光度法测得的黄皮果提取物中的总黄酮(以芦丁计)和有机酸(以没食子酸计)总含量为≥75%,生物碱(以黄皮酰胺计)含量为≥5%,其中总黄酮含量≥65%。将所得黄皮果提取物利用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析及制备型反相HPLC等多种色谱学分离手段,得到5种化合物,其中4种黄酮类化合物,分别是芦丁、槲皮素-7-O-α-L-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素,另外1种生物碱成分则是黄皮酰胺。
实施例2对实施例1所得5种化合物的理化特性及化学结构的定性鉴定
化合物1:芦丁
黄色固体粉末(甲醇),在254nm处有紫外吸收,硫酸香草醛液显淡黄色。ESI-MS(positive)给出准分子离子峰m/z 633[M+Na]+提示分子量为610。结合1H和13C NMR推测分子式为C27H30O16,计算不饱和度为12。
在1H NMR(400MHz,DMSO-d6)中,δH:3.05-5.14(sugar protons),0.99(3H,d,J=6.4Hz,H-6”’),5.27(1H,brs,H-1”’),5.34(1H,d,J=7.6Hz,H-1”),6.19(1H,d,J=2.0Hz,H-6),6.39(1H,d,J=1.6Hz,H-8),6.84(1H,d,J=7.6Hz,H-5’),7.54(2H,d,J=10.0Hz,H-2’,6’)。13C-NMR(DMSO-d6,100MHz)δC:177.4(C-4),164.2(C-7),161.2(C-5),156.4(C-9),156.4(C-2),148.5(C-3’),144.8(C-4’),133.5(C-3),121.6(C-6’),121.2(C-1’),116.0(C-5’),115.1(C-2’),104.0(C-10),101.2(C-1”),l00.7(C-l”’),98.7(C-6),93.6(C-8),76.5(C-5”),75.9(C-3”),74.1(C-2”),71.9(C-4”’),70.6(C-4”),70.4(C-2”’),70.0(C-3”’),68.2(C-5”’),67.0(C-6”),17.7(C-6”’)。经文献检索,其核磁数据和文献[李燕,郭顺星,王春兰,杨峻山,肖培根。新疆雪莲黄酮类化学成分的研究。中国药学杂志。2007,42(8):575-577.]中的芦丁对照一致,故该化合物鉴定为槲皮素-3-O-α-L-鼠李吡喃糖(1–6)β-D-吡喃葡萄糖苷(即芦丁)。
化合物2:槲皮素-7-O-α-L-吡喃葡萄糖苷
黄色固体粉末(甲醇),在254nm处有紫外吸收,硫酸香草醛液显淡黄色。ESI-MS(positive)给出准分子离子峰m/z 487[M+Na]+提示分子量为464。结合1H和13C NMR推测分子式为C21H20O12,计算不饱和度为12。
在1H NMR(400MHz,DMSO-d6)中,δH:3.17-5.41(sugar protons),5.38(1H,d,J=4.4Hz,H-1”),6.42(1H,d,J=1.6Hz,H-6),6.76(1H,d,J=1.2Hz,H-8),6.90(1H,d,J=8.8Hz,H-5’),7.55(1H,dd,J=8.4,1.6Hz,H-6’),7.72(1H,s,H-2’)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δC:147.9(C-2),136.1(C-3),176.1(C-4),160.4(C-5),99.9(C-6),162.7(C-7),94.3(C-8),155.7(C-9),104.7(C-10),121.8(C-1’),115.6(C-2’),145.1(C-3’),147.7(C-4’),115.4(C-5’),120.1(C-6’),98.9(C-1”),73.1(C-2”),76.4(C-3”),69.6(C-4”),77.2(C-5”),60.7(C-6”)。经文献检索,其核磁数据和文献[K.R.Markham,B.Ternai,R.Stanley,H.Geiger,and T.J.Mabry.Tetrahedron,34,1389(1978).]中的槲皮素-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的苷元对照一致,根据碳氢谱上糖残基的化学位移,可以确定该化合物糖基部分是葡萄糖,结合异头碳上氢的耦合常数J=4.4Hz,确定糖残基为α-L-吡喃葡萄糖苷。故该化合物鉴定为槲皮素-7-O-α-L-吡喃葡萄糖苷。
化合物3:木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷
黄色固体粉末(甲醇),在254nm处有紫外吸收,硫酸香草醛液显淡黄色。ESI-MS(positive)给出准分子离子峰m/z 471[M+Na]+提示分子量为448。结合1H和13C NMR推测分子式为C21H20O11,计算不饱和度为12。
在1H NMR(400MHz,DMSO-d6)中,δH:3.07-4.71(sugar protons),5.08(1H,d,J=7.2Hz,H-1”),6.21(1H,s,H-6),6.42(1H,s,H-8),6.76(1H,s,H-3),6.90(1H,d,J=9.2Hz,H-5’),7.54(1H,dd,J=8.8,2.0Hz,H-6’),7.72(1H,s,H-2’)。经文献检索,其核磁数据和文献[Markham KR,Ternail B,Stanley R,Geiger H,Mabry TJ.Carbon-13NMR studies offlavonoids-III:Naturally occurring flavonoid glycosides and their acylated derivatives.Tetrahedron,1978,34(9),1389-1397.]中的木犀草素-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对照一致,故该化合物鉴定为木犀草素-4’-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。
化合物4:槲皮素
黄色粉末状结晶(甲醇),ESI-MS(positive)给出准分子离子峰m/z 325[M+Na]+提示分子量为302。结合1H和13C NMR推测分子式为C15H10O7,计算不饱和度为11。
在1H-NMR(DMSO-d6,400MHz)δ:12.48(1H,s,5-OH),10.80(1H,s,7-OH),9.61(1H,s,3'-OH),9.36(1H,s,3-OH),9.32(1H,s,4'-OH),7.65(1H,d,J=2.0Hz,H-2'),7.51(1H,d,J=2.0,8.5Hz,H-6'),6.87(1H,d,J=8.5Hz,H-5'),6.39(1H,d,J=2.0Hz,H-8),6.17(1H,d,J=2.0Hz,H-6)。以上数据与文献(杨文强,王红程,王文婧,等.槟榔化学成分研究.中药材,2012,35(3):400-403.)报道槲皮素基本一致,故鉴定该化合物为槲皮素。
化合物5:黄皮酰胺
白色针状结晶(甲醇),碘化铋钾反应显阳性。ESI-MS(positive)给出准分子离子峰m/z320[M+Na]+提示分子量为297。结合1H和13C NMR推测分子式为C18H19NO3,计算不饱和度为10。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz)δH:3.82(1H,dd,J=11.2,6.4Hz,H-3),3.51(1H,dd,J=10.8,8.8Hz,H-4),4.30(1H,dd,J=8.4,2.4Hz,H-5),3.01(3H,s,H-6),4.64(1H,t,J=3.2Hz,H-7),5.39(1H,d,J=6.4Hz,-OH),5.45(1H,d,J=4.0Hz,-OH),6.65-7.26(10H,m,Ar-CH);13C NMR(DMSO-d6,100MHz)δC 174.2(C-2),68.6(C-3),49.2(C-4),65.0(C-5),30.3(C-6),71.9(C-7),136.3(C-1’),140.8(C-1”),126.3-128.7(Ar-C).以上数据与文献(张瑞明,万树青,赵冬香.黄皮的化学成分及生物活性研究进展.天然药物研究与开发.2012.24(88),118-123.)报道的黄皮酰胺一致,故鉴定化合物5为黄皮酰胺。
实施例3黄皮果提取物中化合物的成分比例范围分析
采用HPLC对黄皮果提取物进行检测,液相系统:Agilent 1200,色谱柱:ThermoSyncronis RP-C18(250×4.6mm,5μm),流速:1.0mL/min,检测波长:254nm,柱温:30℃,色谱分析时间:100min,色谱条件:甲醇:水梯度洗脱,见下表1
表1 HPLC对黄皮果提取物进行检测时甲醇、水梯度洗脱时的浓度变化
经HPLC定量分析,发现上述5种成分的含量之和占黄皮果提取物的60%以上,分别是黄酮类化合物(1).芦丁,(2).槲皮素-7-O-α-L-吡喃葡萄糖苷,(3).木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷,(4).槲皮素。生物碱类化合物是(5).黄皮酰胺。这5种化合物的含量比例依次为10:9:9:4:1。
实施例4.黄皮果提取物对慢性酒精中毒所致小鼠记忆获得性障碍的改善作用
长期大量摄入酒精,可使机体释放促炎症细胞因子,并能抑制神经元的产生,从而导致神经产生退行性病变。此外,在酒精的作用下,导致各种炎症因子的生成大幅增加,具有营养神经元作用的星形胶质细胞被激活分化为反应性胶质细胞,使神经元失去营养来源而凋亡,进而使中枢神经系统产生功能障碍。本发明的黄皮果提取物能有效减少因炎症物质释放所引起的星形胶质细胞活化,从而起到保护神经元并改善由此引起的功能性障碍。
4.1实验方法
4.1.1实验动物分组及模型建立
取60只3月龄ICR小鼠随机分为5组,每组10只,分别为:空白对照组、模型组、黄皮果提取物高剂量组10g/kg、低剂量组5g/kg。空白对照组和模型组给予蒸馏水,其余各组给予相应药物灌胃,灌胃剂量为0.1ml/10g在给予相应药物4小时以后,空白对照组灌以相应的生理盐水量,其余各组分别用50%(v/v)乙醇溶液12ml/kg灌胃,1次/d,连续60天。末次给药后,小鼠禁食不禁水24小时后全部摘眼球取血,常规制备血清,留取脑脏组织标本,检测相关指标。
4.1.2实验动物水迷宫行为学测试
水迷宫空间学习记忆能力检测,采用Morris水迷宫法。水迷宫为直径150cm,高50cm的圆形水池。以4个等距离点将水池分为4个象限,每个象限贴有不同标志物,在目标象限(设为第三象限)放置逃生平台。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机,同步记录小鼠运动轨迹。
行为学试验包括两方面:(1)定位航行实验(place navigation),主要用于检测小鼠对学习和记忆的获取能力。实验历时60d,上午训练。训练时分别把小鼠面向池壁放到各象限的水中,设定最长游动时间为90s,用秒表计时,记录小鼠找到平台所需要的时间,记做潜伏期,若小鼠在90s内未找到平台,则将潜伏期记做90s。实验观察各记录小鼠寻找直到爬上平台的路线及所需时间;(2)空间搜索实验(spatial probe test),主要用于检测学会寻找平台后,对平台空间位置记忆的保持能力。定位航行实验结束后,撤去平台,选择与平台相对的象限中作为同一入水点,记录90s内小鼠为搜索平台而穿过平台放置区域的时间与总游泳时间的比例,以及穿过平台放置区域的次数。数据采集和处理由Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成。
4.1.3脑组织学指标
脑组织石蜡切片HE染色,观察病理脑形态改变。
4.1.4免疫组化染色测定脑组织组织GFAP的表达
脑组织石蜡包埋,切片,二甲苯透明,常规脱蜡至水,3%过氧化氢孵育15min,PBS洗3次,每次3min,微波修复15min;加人正常山羊血清封闭液,37℃孵育15min,然后加入一抗(1:100稀释),4℃过夜,PBS洗3次,每次3min;加入二抗,37℃孵育15min,PBS洗3次,每次3min;最后加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(SABC)工作液,37℃孵育15min,PBS洗3次,每次3min;DAB显色,显微镜下控制显色时间,自来水冲洗,苏木紫复染,中性树胶封片。每组均用PBS代替一抗作为阴性对照。脑组织中GFAP免疫组织化学染色图像,用Image-Pro Plus6.0分析软件进行图像分析,每张切片取5个视野测定GFAP蛋白阳性产物的积分光密度(integrated optical density,IOD)值,取平均值表示GFAP表达水平。IOD值越大表示目的蛋白表达越强。
4.1.5数据处理
应用SPSS18.0软件对空间探索学习记忆实验和其它实验数据均采用单因素方差分析,结果以示,以P<0.05为差异有统计学意义。
4.2实验结果
4.2.1黄皮果提取物对酒精引起小鼠空间学习记忆障碍的影响
通过长达60天的行为学测试,我们发现,从第40天开始,各组小鼠的逃避潜伏期开始出现差异,酒精模型组小鼠的逃避潜伏期较对照组小鼠显著延长(P<0.01),但与黄皮果提取物其它各组相比,差异无统计学意义。从第45天~60天,黄皮果高剂量组和黄皮果低剂量组小鼠的逃避潜伏期均显著低于酒精模型组小鼠,差异有统计学意义(P<0.05);在实验结束的第60d,黄皮果提取物各剂量组小鼠与酒精模型组小鼠相比,穿越平台的次数显著上升(P<0.05),组间比较差异不明显(结果见表2)。
表2.黄皮果提取物对酒精引起小鼠空间学习记忆障碍的影响(n=10)
a P<0.01,与空白对照组相比较;ab P<0.05,b P<0.01,与模型组相比较.
4.2.2黄皮果提取物对酒精致小鼠脑损伤的保护作用
由图1可见,空白对照组小鼠海马齿状回区域内细胞细胞间隙小,细胞排列整齐,锥体细胞层神经元密集,胞体呈锥体形,界线清晰,胞浆内尼氏体丰富,呈粗大的斑块状,细胞形态完整,细胞核未见明显空泡化;与空白对照组比较,酒精模型组模型组海马的神经细胞数量减少,细胞间隙较大,细胞排列稀疏,胞体形态不规则,部分细胞坏死,着色浅等现象。与酒精模型组比较,黄皮果提取物各组均不同程度的改善了慢性酒精中毒模型小鼠脑组织海马齿状回神经细胞组织形态,细胞排列较为紧密,分布较均匀,细胞形态较为完整。以上结果说明:黄皮果提取物在一定程度上减轻长期给与酒精所致小鼠海马齿状回区域神经细胞病理改变作用。
4.2.3黄皮果提取物对酒精致小鼠脑内星形胶质细胞的影响
光镜下可见GFAP免疫组化阳性细胞(星形胶质细胞)表现胞核不着色,胞质及突起染成棕褐色,阳性产物随细胞突起分布。空白对照组小鼠海马CA2区域内,GFAP免疫阳性细胞分布稀疏,细胞数目少,细胞体积小。与空白照组比较,酒精模型组小鼠CA2区域GFAP免疫阳性细胞明显增多,细胞体积较大,胞浆丰富,且多数细胞的分支增粗、增长,细胞整体覆盖面积大,免疫组化染色为深染,可以认为在大量酒精干预下,脑内的巨噬细胞大量活化,用于修复酒精可能造成的脑神经元受损。而黄皮果提取物高、低剂量组的小鼠GFAP阳性细胞数目明显少于酒精模型组,而且细胞体积小,细胞分支细小,包体覆盖面积小。由表2可见,空白对照组海马的200倍镜下平均光密度值和IOD值均明显小于模型组(P<0.01),而黄皮果提取物高、低剂量组的平均光密度值和IOD值也小于模型组(P<0.05或P<0.01)(结果见表3)。
表3各组小鼠海马区GFAP平均光密度和IOD的结果(n=10)
a P<0.01,与空白对照组相比较;ab P<0.05,b P<0.01,与模型组相比较。
结论,黄皮果提取物能够通过减轻慢性酒精中毒小鼠大脑的星形胶质细胞的肥大和增生程度,降低神经纤维的传导和突触的构建所受损伤,保护神经元细胞,使模型小鼠的认知功能障碍得到改善。
实施例5.黄皮果提取物对APP/PS1双重转基因AD模型小鼠认知能力障碍的改善作用
5.1实验方法
5.1.1实验动物分组及模型建立
取4月龄的C57BL/6小鼠8只及有C57BL/6遗传背景的APP/PS1双转基因小鼠24只。以C57BL/6小鼠为空白对照组,将24只APP/PS1小鼠随机分成三组:模型组(APP/PS1小鼠组)、黄皮果提取物低剂量组(APP/PS1小鼠组+黄皮果提取物5g/kg),黄皮果提取物高剂量组(APP/PS1小鼠组+黄皮果提取物10g/kg)。具体给药方法如下:各黄皮果提取物处理组的APP/PS1小鼠每天灌相应剂量的黄皮果提取物,连续灌胃28周。APP/PS1模型组小鼠与C57BL/6对照组小鼠每天灌胃等量的双蒸水一次,连续灌胃28周。每周灌胃5天,休息2天。全部小鼠每日均给予标准鼠饲料常规喂养。
5.1.2实验动物水迷宫行为学测试
水迷宫空间学习记忆能力检测,采用Morris水迷宫法。水迷宫为直径150cm,高50cm的圆形水池。以4个等距离点将水池分为4个象限,每个象限贴有不同标志物,在目标象限(设为第三象限)放置逃生平台。迷宫上方安置连接显示系统的摄像机,同步记录小鼠运动轨迹。
行为学试验包括两方面:(1)定位航行实验(place navigation),将小鼠面对池壁放入迷宫中,入水点分别为Ⅱ、Ⅳ象限的中点,实验过程中随机固定入水点顺序,每只小鼠每次测试连续训练2次,每次从水池的相对象限入水,每次90s,记录90s内大鼠找到平台并停留2s的潜伏期;若90s内没有找到,潜伏期为90s,并由操作者引导其在平台停留15s。观察小鼠逃避潜伏期的变化情况。(2)空间搜索实验(spatial probe test),实验过程的最后一天,撤去平台,其他条件不变,进行空间探索实验,将小鼠从第I,III象限中点各入水一次,持续90s。记录小鼠穿越平台次数等指标的变化情况。数据采集和处理由Morris水迷宫图像自动监视处理系统完成。
5.1.3血清学指标
实验过程的最后一天水迷宫试验结束后,24小时禁食,只喂与水,摘眼球取血后,血液经3000r/min离心10min,分离血清,-20℃冷冻保存,待测。采用分光光度法分别检测并记录各组小鼠血清。
5.1.4脑组织学指标
小鼠摘眼球取血后迅速于冰上断头取脑,用4℃预冷的生理盐水洗去血液,吸干多余水分,左半脑组织用10%福尔马林固定,石蜡切片,HE染色及免疫组化,观察病理脑形态改变。并于冰上分离出右半脑海马区组织,放入EP管内,加入1ml的冷PBS,匀浆,于4℃,3000r/min离心10min,取上清液,分装,样品保存于-80℃备用。按Aβ1-42 ELISA检测试剂盒说明书进行操作测定海马组织Aβ1-42的蛋白含量。
5.1.5免疫组化染色测定脑组织组织GFAP的表达
脑组织石蜡包埋,切片,二甲苯透明,常规脱蜡至水,3%过氧化氢孵育15min,PBS洗3次,每次3min,微波修复15min;加人正常山羊血清封闭液,37℃孵育15min,然后加入一抗(1:100稀释),4℃过夜,PBS洗3次,每次3min;加入二抗,37℃孵育15min,PBS洗3次,每次3min;最后加入辣根过氧化物酶标记链霉卵白素(SABC)工作液,37℃孵育15min,PBS洗3次,每次3min;DAB显色,显微镜下控制显色时间,自来水冲洗,苏木紫复染,中性树胶封片。每组均用PBS代替一抗作为阴性对照。脑组织中GFAP免疫组织化学染色图像,用Image-Pro Plus6.0分析软件进行图像分析,每张切片取5个视野测定GFAP蛋白阳性产物的积分光密度(integrated optical density,IOD)值,取平均值表示GFAP表达水平。IOD值越大表示目的蛋白表达越强。
5.1.6数据处理
应用SPSS18.0软件对空间探索学习记忆实验和其它实验数据均采用单因素方差分析,结果以x±s示,以P<0.05为差异有统计学意义。
5.2实验结果
5.2.1黄皮果提取物对APP/PS1模型小鼠空间学习记忆障碍的保护作用
从第20w开始至实验结束的第28W,各组小鼠的逃避潜伏期开始拉开距离,模型组小鼠的逃避潜伏期显著高于其它各组小鼠(P<0.01),且出现随饲养时间的增加而延长的趋势。黄皮果提取物各剂量组小鼠的逃避潜伏期均显著低于模型组小鼠(P<0.05)。从小鼠搜索平台的情形来看,与模型组小鼠相比较,黄皮果提取物各剂量组小鼠会在原平台位置附近反复搜索多次,穿越平台次数明显增加,表现出寻找水下平台的目的性、针对性很强(结果见表4)。
表4.黄皮果提取物对APP/PS1模型小鼠空间学习记忆障碍的影响(n=8)
a P<0.01,与空白对照组相比较;ab P<0.05,b P<0.01,与模型组相比较。
5.2.2黄皮果提取物对APP/PS1模型小鼠皮层神经元的保护作用
由图2可见,A:模型组B:黄皮果提取物高剂量组C:黄皮果提取物低剂量组D:空白对照组200X。空白对照组小鼠皮层区域内细胞,细胞间隙小,细胞排列整齐,细胞形态完整,细胞核未见明显空泡化,少有神经细胞坏死;与空白对照组比较,APP/PS1模型组皮层区域内神经细胞坏死数量较多,胞体形态不规则,多数神经元细胞核呈固缩状等现象。与模型组比较,黄皮果提取物各剂量组一定程度上程度的改善了APP/PS1双转基因模型小鼠脑组织皮层区域神经细胞组织形态,细胞排列较为紧密,分布较均匀细胞形态较为完整,少有神经细胞坏死。说明黄皮果提取物能在一定程度上减轻APP/PS1小鼠皮层区域神经细胞病理情况。
5.2.3黄皮果提取物对APP/PS1模型小鼠海马区Aβ1-42蛋白含量的影响
表5结果显示,APP/PS1模型小鼠海马组织匀浆中Aβ1-42含量明显增加,与对照组相比差异有统计学意义(P<0.05);经黄皮果提取物干预后,海马组织中Aβ1-42含量有明显降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。
表5.各组小鼠海马CA2区GFAP平均光密度和IOD的结果(n=8)
a P<0.01,与空白对照组相比较;ab P<0.05,b P<0.01,与模型组相比较。
5.2.4黄皮果提取物对APP/PS1模型小鼠脑内星形胶质细胞的影响
光镜下GFAP免疫组化阳性细胞(星形胶质细胞)有较强的亮绿色荧光信号,显示出细胞类似星状的轮廓。空白对照组小鼠海马区域内,GFAP免疫阳性细胞分布稀疏,细胞数目少,细胞体积小,荧光信号较弱。与空白照组比较,酒精模型组小鼠海马区域GFAP免疫阳性细胞明显增多,细胞体积较大,胞浆丰富,且多数细胞的分支增粗、增长,细胞整体覆盖面积大,荧光信号强,可以认为APP/PS1小鼠脑内的星状胶质细胞大量活化,用于修复可能的脑神经元受损。而黄皮果提取物高、低剂量组的小鼠GFAP阳性细胞数目明显少于模型组,荧光信号较弱。由表5可见,空白对照组与黄皮果提取物干预组海马区的平均光密度值和IOD值均明显小于模型组(P<0.05或P<0.01)。说明黄皮果提取物能减轻和延缓APP/PS1小鼠大脑的星形胶质细胞的肥大和增生程度,降低神经纤维和突触所受的损伤(结果见表6)。
表6.各组小鼠海马区GFAP平均光密度和IOD的结果(x±s)
a P<0.01,与空白对照组相比较;ab P<0.05,b P<0.01,与模型组相比较。
结论,黄皮果提取物能明显改善APP/PS1转基因小鼠的空间学习记忆障碍,改善记忆能力,提高了APP/PS1转基因小鼠的学习效率。其机制与抑制Aβ的生成和星形胶质细胞增生,降低炎症反应,从而使神经元凋亡减少有关。
综上所述,本发明通过酒精致记忆获得障碍小鼠模型和APP/PS1双转基因拟阿尔茨海默病小鼠模型,证实了所述黄皮果提取物的组合物能通过抑制Aβ生成,降低GFAP阳性表达,减少神经元凋亡,从而改善模型动物产生的认知功能障碍。另外,本发明还开拓了黄皮果提取物新的药物用途,能用于预防或/和治疗阿尔茨海默病提的药物或保健食品。值得一提的是:该黄皮果提取物所制备的预防和/或治疗阿尔茨海默病提的药物或保健食品,其给药剂型可用药学上可接受的辅料及常规制剂方法而制成片剂、颗粒剂、胶囊剂或口服液等剂型。
最后应说明的是:以上仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,尽管参照实施例对本发明进行了详细的说明,对于本领域的技术人员来说,其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分技术特征进行等同替换,但是凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种黄皮果提取物,其特征在于,所述黄皮果提取物中的总黄酮及有机酸含量为≥75%,生物碱含量为≥5%。
2.根据权利要求1所述的黄皮果提取物,其特征在于,所述提取物包括四种黄酮类化合物:芦丁、槲皮素-7-O-α-L-吡喃葡萄糖苷、木犀草素-4'-O-β-D-吡喃葡萄糖苷和槲皮素,其总黄酮含量≥60%;所述生物碱包括黄皮酰胺,其含量≥5%。
3.根据权利要求1所述的黄皮果提取物,其特征在于,其通过以下步骤制备而成:
(1).取晒干的黄皮果,去核,粉碎,过40目筛,得到黄皮果粉末;
(2).用乙醇浸泡步骤(1)所得的黄皮果粉末,超声提取5次;
(3).过滤,合并滤液,离心,取上清液浓缩,然后再用石油醚萃取3次,每次石油醚萃取后分去上层萃取液,取下层液体挥去石油醚,再用乙酸乙酯萃取5次,分别合并上层乙酸乙酯萃取液和下层提取液,采用减压蒸馏法进行浓缩,得到乙酸乙酯浸膏和下层提取液浸膏;
(4).分别用3-5倍体积的双蒸水稀释所述步骤(3)获得的乙酸乙酯浸膏和下层提取液浸膏,混悬后分别通过大孔树脂柱吸附,采用5-10倍柱体积的适度乙醇进行梯度洗脱,收集并合并所获得的洗脱液,然后减压浓缩至无醇味浸膏,即得所述黄皮果提取物;
其中,所述步骤(4)中洗脱的乙醇依次采用的是10%乙醇,30%乙醇和60%乙醇,乙酸乙酯浸膏部分需要收集的洗脱液是收集30%和60%的乙醇洗脱液,下层提取液浸膏部分需要收集的洗脱液是60%的乙醇洗脱液。
4.根据权利要求3所述的黄皮果提取物,其特征在于,所述步骤(2)中乙醇的浓度为95%,乙醇的用量是9倍黄皮果粉末重量,浸泡时间为12-14h,超声提取时间是每次1.5h。
5.根据权利要求3所述的黄皮果提取物,其特征在于,所述步骤(3)中离心的转速为3000r/min,离心的时间为10min。
6.根据权利要求3所述的黄皮果提取物,其特征在于,所述步骤(3)中上清液浓缩至相对密度1.20-1.45。
7.如权利要求3-6中任意一项所述的黄皮果提取物在制备用于治疗与预防阿尔茨海默病的药物中的应用。
8.一种用于防治阿尔茨海默病的药物,其特征在于,包括药物成分和制药辅料,所述药物成分选用权利要求1-6中任意一项所述的黄皮果提取物。
9.根据权利要求8所述的药物,其特征在于,所述药物的给药剂型为片剂、颗粒 剂、胶囊剂或口服液。
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