CN102907320A - 一种油棕体细胞胚的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种油棕体细胞胚的培养方法，是切取油棕母株茎干生长点上的油棕茎段，然后取油棕嫩叶修剪成片样，接种到愈伤组织诱导培养基、胚性愈伤组织培养基中进行培养得到胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织转接到胚状体培养基中培养，每2个月继代一次，培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面会出现白色的胚状体组织；所述胚状体培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加2,4-D、水解胳蛋白、椰子水、葡萄糖、琼脂。本发明采用改良的培养基，可有效的促进油棕胚性愈伤组织诱导油棕胚状体的发生过程，得到优质的油棕胚状体，提高发生率，为油棕大规模无性繁殖提供重要的技术支撑，是一条提高油棕组培苗产量的有效途径。
Description
技术领域
本发明属植物组织培养技术领域，涉及一种油棕体细胞胚的培养方法。
背景技术
油棕（Elaeis guineensis Jacq.）属多年生单子叶植物，是热带木本油料作物，其果肉、果仁含油丰富，是世界第一大油料作物，经济寿命25～30年，单位面积产油量可达到6吨/公顷，被誉为“世界油王”。 棕榈油被广泛用于餐饮业、食品制造业和油脂化工业等，产业市场前景极为广阔。
油棕组织培养技术是一种油棕新型繁育技术，通过油棕组织培养技术培育的油棕优良无性系具有产量高、抗逆性强等优良性状，具有良好的市场应用前景。目前，油棕组织培养技术中，主要采用油棕嫩叶和花序作为外植体材料，由于棕榈属植物本身的生物学特性，外植体材料中含多酚类等物质含量高，因此通过组织培养途径获得离体再生植株比较困难，而其中体细胞胚的诱导和再生是整个油棕组培技术体系的难点和重点，目前体细胞胚平均诱导率水平为4%，因此如何提高油棕体细胞胚的诱导率是油棕无性快繁的重要核心技术之一。
发明内容
本发明的目的是提供一种油棕体细胞胚的培养方法，采用改良的培养基，可有效的促进油棕胚性愈伤组织诱导油棕胚状体的发生过程，提高发生率，为油棕大规模无性繁殖提供重要的技术支撑，是一条提高油棕组培苗产量的有效途径。
本发明所采用的技术方案：
一种油棕体细胞胚的培养方法，其步骤如下：
1、外植体的选取
选取树龄8～10年的油棕母株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，经表面除杂、清洗后进行消毒处理，然后将晾干后的外植体转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。油棕母株的切面在外植体采集后，对切面进行防护处理，待恢复生长后可以重新取样。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织转接到胚状体培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50%～65%，每2个月继代一次。培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面会出现白色的胚状体组织。所述胚状体培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加2,4-D 0.01～0.2mg/L、水解胳蛋白200～2000mg/L、椰子水30～80ml/L、葡萄糖20～40g/L、琼脂7g/L。
所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整其中的肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L，并添加精氨酸50～300mg/L、天冬氨酸50～300mg/L、谷氨酸50～300mg/L。
本发明中，胚状体培养基中添加的2,4-D、水解胳蛋白、椰子水、葡萄糖、琼脂的添加量优选为：2,4-D 0.1mg/L、水解胳蛋白1000mg/L、椰子水40ml/L、葡萄糖20～40g/L、琼脂7g/L。
本发明采用改良的培养基，可有效的促进油棕胚性愈伤组织诱导油棕胚状体的发生过程，得到优质的油棕胚状体，提高发生率，为油棕大规模无性繁殖提供重要的技术支撑，是一条提高油棕组培苗产量的有效途径。
附图说明
图1是油棕胚性愈伤组织培养8个月后获得的初生胚状体。
图2是油棕胚性愈伤组织培养10个月后获得的次生胚状体。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例一
1、外植体的选取
选取树龄8年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到胚状体培养基（改良MS培养基+2,4-D 0.01mg/L+水解胳蛋白200～2000mg/L+椰子水30～80ml/L+葡萄糖20～40g/L+琼脂7g/L）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50%～65%，每2个月继代一次。培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面出现白色的胚状体组织，所得结果见表1。
所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整其中的肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L，并添加精氨酸50～300mg/L、天冬氨酸50～300mg/L、谷氨酸50～300mg/L。
实施例二
1、外植体的选取
选取树龄9年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到胚状体培养基（改良MS培养基+2,4-D 0.05mg/L+水解胳蛋白200～2000mg/L+椰子水30～80ml/L+葡萄糖20～40g/L+琼脂7g/L）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50%～65%，每2个月继代一次。培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面出现白色的胚状体组织，所得结果见表1。
实施例三
1、外植体的选取
选取树龄10年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到胚状体培养基（改良MS培养基+2,4-D 0.1mg/L+水解胳蛋白200～2000mg/L+椰子水30～80ml/L+葡萄糖20～40g/L+琼脂7g/L）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50%～65%，每2个月继代一次。培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面出现白色的胚状体组织，所得结果见表1。
实施例四
1、外植体的选取
选取树龄9年的油棕高产优质母株5株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，将得到的油棕茎干除去表面杂质后，在油棕茎干表面喷涂75%的酒精进行杀菌，晾干，然后将晾干的油棕茎干转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶。
2、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，获得胚性愈伤组织。
3、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织在超净工作台上及无菌条件下，转接到胚状体培养基（改良MS培养基+2,4-D 0.2mg/L+水解胳蛋白200～2000mg/L+椰子水30～80ml/L+葡萄糖20～40g/L+琼脂7g/L）中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50%～65%，每2个月继代一次。培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面出现白色的胚状体组织，所得结果见表1。
对照：
在相同的培养条件下，采用MS培养基、B5培养基、N6培养基对油棕胚性愈伤组织进行培养（在培养基中分别添加2,4-D），所得结果见表1。
表1不同浓度2,4-D在不同培养基中胚状体的诱导率
从结果可以看出，在不同浓度2，4-D下，经过改良的MS培养基可以明显提高油棕胚状体的诱导率，而在同一培养基条件下，2，4-D浓度为0.1mg/L时油棕的胚状体诱导率最高。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (2)
1.一种油棕体细胞胚的培养方法，其特征在于，其步骤如下：
1）、外植体的选取
选取树龄8～10年的油棕母株，切取茎干生长点上15cm至95cm处的油棕茎段，经表面除杂、清洗后进行消毒处理，然后将晾干后的外植体转入超净工作台，剥除外层的老叶片，得到无菌的油棕嫩叶；
2）、愈伤组织的诱导培养
将油棕嫩叶修剪至大小为1cm×2cm的片样，接种到愈伤组织诱导培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下进行暗培养，得到愈伤组织；将得到的愈伤组织转接入胚性愈伤组织培养基中，在温度为25～28℃，湿度为50%～65%的条件下暗培养，获得胚性愈伤组织；
3）、体细胞胚的培养
将胚性愈伤组织转接到胚状体培养基中培养，培养条件：光照强度为1500～20001x，每日光照时间为12小时，温度为25～28℃，湿度为50%～65%，每2个月继代一次；培养6～12个月后在胚性愈伤组织表面会出现白色的胚状体组织；所述胚状体培养基是以改良MS培养基为基础培养基，并添加2,4-D 0.01～0.2mg/L、水解胳蛋白200～2000mg/L、椰子水30～80ml/L、葡萄糖20～40g/L、琼脂7g/L；
所述改良MS培养基是以MS培养基为基础，在其它成分不变的条件下调整其中的肌醇、盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇和烟酸的含量分别为：0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L、0.1～5mg/L，并添加精氨酸50～300mg/L、天冬氨酸50～300mg/L、谷氨酸50～300mg/L。
2.根据权利要求1所述的油棕体细胞胚的培养方法，其特征在于：所述胚状体培养基中添加的2,4-D、水解胳蛋白、椰子水、葡萄糖、琼脂的添加量为：2,4-D 0.1mg/L、水解胳蛋白1000mg/L、椰子水40ml/L、葡萄糖20～40g/L、琼脂7g/L。
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