CN102876610A - 快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法及其应用。本发明利用蔗糖溶液在室温下经重悬-离心方法处理过夜培养细胞，来制备黄单胞菌高效电转化感受态细胞，全程仅需十五分钟。该方法克服了传统电转化方法的耗时较长，效率偏低，操作复杂等缺点。与现有转化方法相比，本发明方法的转化效率提高了约100倍。本方法可用于可复制质粒与不可复制质粒的高效快速转化。在最佳条件下，可复制质粒的转化效率可达10⁹CFU/μg DNA，不可复制质粒的转化效率达150CFU/μg DNA。因此，本方法简化了黄单胞菌电转化操作，推进了基因敲除的进程。

Description

快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法及其应用

技术领域

本发明属基因工程技术领域，涉及一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法，用于多种质粒的高效转化与染色体基因的敲除。

技术背景

黄单胞菌Xcc 8004是一种具有植物致病性的革兰氏阴性菌，可引起十字花科植物的“黑腐病”，会对农业生产造成极大的影响。黄单胞菌可通过植物的气孔、根系或者伤口感染十字花科植物如：卷心菜、西兰花、花菜及拟南芥等。开展对黄单胞菌质粒转化与基因改造方法的研究有利于提高其DNA转化、基因敲除及染色体修饰的效率，推进其致病机制的研究和防范策略的开发。

因黄单胞菌可分泌多种胞外酶和胞外多糖，其对化学处理十分不敏感，因此电转化方法成为外源DNA进入黄单胞菌的首选方法。但是，已报道的黄单胞菌电转化方法的质粒转化效率远远低于大肠杆菌的电转化效率，主要是黄单胞菌胞外分泌的多种蛋白和多糖的去除效率会直接影响电转化感受态细胞的敏感性，外源DNA难于进入细胞内，因而降低了电转化效率。另一方面，基因改造是开展黄单胞菌致病机制研究的必经步骤。现有的黄单胞菌基因替换方法是利用不可复制质粒，通过与特定的大肠杆菌菌株进行接合，来实现质粒整合与基因重组。这种方法操作复杂，耗时较长，且效率偏低。因此，开发新方法来提高黄单胞菌的质粒转化与基因改造效率，简化黄单胞菌基因修饰过程，具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的，是为了提高黄单胞菌的DNA转化和基因替换效率，简化操作步骤，提供一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法及其应用。

为了实现本发明的目的，本发明采用了以下技术方案：

一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法，包括如下步骤：

a、将黄单胞菌8004菌种在LB固体平板上划线培养，28℃培养48小时；

b、挑取单克隆接种于10ml LB液体培养基中，置于28℃摇床上220rpm/min过夜培养；

c、等分过夜培养物到四个5ml离心管中，室温下以8000rpm/min离心5min，收集细胞；

d、用1ml的250mM蔗糖溶液重悬菌体，室温下以12000rpm/min离心2min，重复上述重悬-离心步骤三次，收集细胞；

e、每管细胞中加入25μl的250mM蔗糖溶液，重悬并合并四管细胞后，分装50μl/管，-80℃冻存，得到细胞终浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml的黄单胞菌电转化感受态细胞。

上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，包括以下步骤：

A、取50μl黄单胞菌电转化感受态细胞，加入相应量的质粒DNA，混匀后转入预冷的电转化杯电击；

B、电击后，迅速在电转化杯中加入1ml LB液体培养基并转移至试管中，28℃摇培1～3小时；

C、将孵育后的培养液涂布于抗性平板上，28℃培养48～72个小时后观察克隆生长情况与计算克隆数目。

上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其中，所述黄单胞菌电转化感受态细胞的细胞浓度OD₆₀₀为0.4-1.2，所述相应量的质粒DNA的量为50ng～1μg，所述电击时的电击强度为10-20KV/cm。

经检测，上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法的最佳条件是，黄单胞菌电转化感受态细胞的细胞浓度OD₆₀₀为0.6-1.0，质粒DNA的量为50ng～1μg，电击时的电击强度为14-18KV/cm，28℃摇培时间为2小时。

上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其中，所述的质粒包括可复制质粒和不可复制质粒，可复制质粒包括pUFR027、pDN19和pRKaraRed；不可复制质粒包括pK18mobsacB-Xc1075和pK18mobsacB-Xc2659；可复制质粒DNA的量为50ng～1μg，不可复制质粒DNA的量为500ng～1μg。

上述黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其中，所述的抗性平板含四环素10μg/ml或卡那霉素10μg/ml。

上述快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法用于可复制质粒与不可复制质粒的高效转化；可复制质粒包括pUFR027、pDN19或pRKaraRed；不可复制质粒包括pK18mobsacB-Xc1075或pK18mobsacB-Xc2659。

本发明利用蔗糖溶液在室温下经重悬-离心方法处理过夜培养细胞，来制备黄单胞菌高效电转化感受态细胞，全程仅需十五分钟。该方法克服了传统电转化方法的耗时较长，效率偏低，操作复杂等缺点。与现有转化方法相比，本发明的方法的转化效率提高了约100倍。本方法可用于可复制质粒与不可复制质粒的高效快速转化。在最佳条件下，可复制质粒的转化效率可达10⁹CFU/μg DNA，不可复制质粒的转化效率约150CFU/μg DNA。因此，本方法简化了黄单胞菌电转化操作，推进了基因敲除的进程。

附图说明

图1、图2、图3为不同条件下Xcc8004感受态细胞的电转化效率。图中所用质粒均为pUFR027，其中：

图1为DNA浓度的影响。DNA浓度为50ng至1μg，其它条件为：OD₆₀₀＝0.8，电击强度为14KV/cm，孵育时间为2小时。

图2为细胞浓度的影响。选用处于不同浓度的细胞制备感受态，细胞浓度为OD₆₀₀＝0.4～1.2，其它条件为：200ng质粒DNA，电击强度为14KV/cm，孵育时间为2小时。

图3为电击强度的影响。电击强度为12KV/cm～20KV/cm，其它条件为：200ng质粒DNA，OD₆₀₀＝0.8，孵育时间为2小时。

上述实验均重复三次，计算平均值后作图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的描述，但本发明的实施不局限于此。

实施例1：可复制质粒的电转化和不同条件下的转化效率检测

一、电转化感受态细胞的制备：

本例中使用Xcc8004作为目标菌株来制备电转化感受态细胞。将Xcc8004菌种在LB固体平板上划线培养，28℃培养48小时。挑取单克隆接种于10ml LB液体培养基中，置于28℃摇床上220rpm/min过夜培养。等分过夜培养物到四个5ml离心管中，室温下以8000rpm/min离心5min，收集细胞。用1ml的250mM蔗糖溶液重悬菌体，室温下以12000rpm/min离心2min。重复该重悬-离心步骤三次。最后每管细胞中加入25μl的250mM蔗糖溶液，重悬并合并四管细胞后，分装50μl/管，-80℃冻存。细胞终浓度为10⁹-10¹⁰CFU/ml。

二、电转化质粒；

本例中使用电转化仪为Bio-Rad GenePulser II，电转化杯为0.1cm电击杯。测定质粒大小、质粒浓度、细胞浓度、电场强度及孵育时间对黄单胞菌电转化效率的影响。在细胞生长至OD₆₀₀介于0.4～1.2时，按照上述方法制备感受态细胞。取50μl感受态细胞，加入不同浓度质粒(50ng～1μg)，混匀后转入预冷的电击杯，以不同电场强度电击(10KV/cm～20KV/cm)。电击后，迅速在电转化杯中加入1ml LB液体培养基并转移至试管中，28℃摇培1～3小时。将孵育后的培养液涂布于抗性平板上，28℃培养48～72个小时后观察克隆生长情况与计算克隆数目。

本例中检测了三种可在黄单胞菌中复制的质粒：pUFR027、pDN19和pRKaraRed，分别对三种质粒进行转化，测定其转化效率，结果见图1、图2、图3。我们选择了以下条件来进行感受态细胞的制备与质粒的电转化：细胞浓度OD₆₀₀＝0.8，200ng的质粒DNA，电击强度14KV/em，孵育时间2小时。结果显示，这三种质粒均可在黄单胞菌中复制，转化克隆数目约为10⁹CFU/μg DNA，转化效率比公开的报道高出约100倍。之后，我们选用质粒pUFR027来检测DNA浓度、细胞浓度、电击强度及复苏时间对电转化效率的影响。结果显示，增加质粒DNA的浓度可显著提高转化效率。当质粒DNA浓度从50ng增加到1μg时，相同条件下的转化效率可从10⁶CFU/μg DNA提高到10⁸CFU/μg DNA(参见图1)。但50-100ng质粒DNA的转化效率即可满足大多数实验的要求。同时，选用不同浓度的细胞来制备感受态细胞，其转化效率存在差异。以细胞浓度在OD₆₀₀＝0.6～1.0时，其转化效率最高(参见图2)。电击强度也会影响电转化的效率，过低或过高的电击强度均会影响转化效率。当电击强度为14～18KV/em时，电转化的效果最好(参见图3)；此时电击时间约为5.0ms。此外，复苏时间对电转化效率具有十分显著的影响。若电击后细胞不经复苏直接涂抗性平板，转化效率仅为10³CFU/μg DNA。然而，若在电击后孵育一到两小时可显著地提高转化效率，参见表1。一小时的复苏培养是提高转化效率所必需的条件，两小时的孵育培养则可基本达到最高转化效率。因此，经过优化，黄单胞菌Xcc8004的感受态制备与电转化最佳条件为：≥50ng可复制质粒DNA或≥500ng不可复制质粒DNA，细胞OD₆₀₀为0.6～1.0，电击强度为14～18KV/cm，电击后培养两小时。

实施例2：不可复制质粒的转化和基因XC_1075、XC_2659的敲除

不可复制质粒主要用于染色体整合、基因修饰和基因敲除。传统的黄单胞菌基因改造方法是通过与大肠杆菌S17-1(λpir)接合来实现的。本例以本发明方法来制备电转化感受态细胞，采用将不可复制质粒直接电击转化到黄单胞菌Xcc8004的方法来实现质粒的整合与基因的敲除。XC_1075和XC_2659两个基因被选为目标基因，编码了黄单胞菌的葡萄糖脱氢酶基因。

引物由Invitrogen公司(上海，中国)合成。PCR反应使用KOD plus聚合酶(TOYOBO，日本)扩增。限制性内切酶与T4连接酶均购自Fermentas公司(加拿大)。质粒DNA的提取与PCR产物纯化均使用试剂盒(Qiagen，德国)。

我们首先利用不可复制质粒pK18mobsacB构建了两个重组质粒pK18mobsacB-Xc1075和pK18mobsaeB-Xc2659。每个基因使用两个引物对来扩增目标基因的上游500bp片段(U500)和下游500bp片段(D500)：

XC1075-U-F：5’-GTAGGAATTCatgactgatcaatcctetaaacgcggg-3’；

XC1075-U-R：5’-ctgaacggcgttgccgcatc-3’

XC1075-D-F：5’-gcagcaagaccaagggctacatg-3’；

XC1075-D-R：5’-GTAGAAGCTTttatttggcgctggcggcc-3’。

XC2659-U-F：5’-GTAGGAATTCatgtcgacattgcttcgtccctccc-3’；

XC2659-U-R：5’-gggcgattgaccacacctgcg-3’；

XC2659-D-F：5’-gtggcgatgecggtggtgc-3’；

XC2659-D-R：5’-GTAGAAGCTTttaccgctgcggcaacgcgtag-3’。

同时，以质粒pEX18Gm为模板，分别PCR扩增两侧带有与XC1075-U500/D500和XC2659-U500/D500片段同源的20bp序列的庆大霉素基因XC1075-accC1和XC2659-accC1，PCR扩增所用引物序列为：

accC1-1075-F：5’-GATGCGGCAACGCCGTTCAGatgttacgcagcagcaacgatgt-3’；

accC1-1075-R：5’-GTAGCCCTTGGTCTTGCTGCttaggtggcggtacttgggt-3’；

accC1-2659-F：5’-GCAGGTGTGGTCAATCGCCCatgttacgcagcagcaacgatgt-3’；

accC1-2659-R：5’-GTGGCGATGCCGGTGGTGCAttaggtggcggtacttgggt-3’。

之后，分别以三个片段XC1075-U500/D500/accC1和XC2659-U500/D500/accC1为模板，利用引物对XC1075-U-F/XC1075-D-R和XC2659-U-F/XC2659-D-R进行重叠PCR扩增，获得融合片段。最后，分别将两个融合片段与质粒pK18mobsacB进行EcoR I/Hind III双酶切，回收酶切片段后用T4DNA连接酶进行连接，获得质粒pK18mobsacB-Xc1075和质粒pK18mobsacB-Xc2659。

我们按照最优的电转化条件进行质粒pK18mobsacB-Xc1075和pK18mobsacB-Xc2659的电转化，即：1000ng质粒DNA，细胞OD₆₀₀为0.6～1.0，电击强度为14～18KV/cm，电击后培养两小时。在抗性平板上筛选后可获得约150个克隆/μg DNA(参见表2)，远高于传统的接合方法中的约30个克隆/μgDNA的转化效率。与可复制质粒的转化相比，不可复制的质粒的有效转化需要至少500ng的DNA才能实现，质粒浓度的增加也可明显提高转化的效率。由于不可复制质粒不能在黄单胞菌中进行复制，因此转化后的抗性筛选获得的克隆均为质粒整合或重组后的结果。因此，该方法可有效地实现不可复制质粒的转化、整合与染色体基因的敲除。

表1可复制质粒转化Xcc8004感受态细胞的效率

表1列出了不同可复制质粒DNA转化Xcc8004感受态细胞的效率。制备感受态细胞与电转化条件：细胞浓度OD₆₀₀＝0.8，200ng可复制质粒DNA，电击强度14KV/cm，孵育时间0-3小时。取50μl感受态细胞加入相应量的质粒后电击；电击后加入1ml LB培养基，细胞经过1-3小时孵育或直接涂布抗性平板，含四环素(10μg/ml)或卡那霉素(10μg/ml)。培养48-72小时后，观察克隆生长情况并计数。上述实验均重复3次，取平均值。所有孵育后的细胞液需稀释105倍后再涂布平板观察计数。

表2不可复制质粒转化Xcc8004感受态细胞的效率

表2列出了不同的不可复制质粒DNA转化Xcc8004感受态细胞的效率。制备感受态细胞与电转化条件：细胞浓度OD₆₀₀＝0.8，1000ng不可复制质粒DNA，电击强度14KV/cm，孵育时间0-3小时。取50μl感受态细胞加入相应量的质粒后电击；电击后加入1ml LB培养基，细胞经过1-3小时孵育或直接涂布抗性平板，含卡那霉素(10μg/ml)。培养48-72小时后，观察克隆生长情况并计数。上述实验均重复3次，取平均信。

Claims (7)

1.一种快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

a、将黄单胞菌8004菌种在LB固体平板上划线培养，28℃培养48小时；

b、挑取单克隆接种于10ml LB液体培养基中，置于28℃摇床上220rpm/min过夜培养；

c、等分过夜培养物到四个5ml离心管中，室温下以8000rpm/min离心5min，收集细胞；

d、用1ml的250mM蔗糖溶液重悬菌体，室温下以12000rpm/min离心2mmin，重复上述重悬-离心步骤三次，收集细胞；

e、每管细胞中加入25μl的250mM蔗糖溶液，重悬并合并四管细胞后，分装50μl/管，-80℃冻存，得到细胞终浓度为10⁹-10¹⁰℃FU/ml的黄单胞菌电转化感受态细胞。

2.根据权利要求1所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

A、取50μl黄单胞菌电转化感受态细胞，加入相应量的质粒DNA，混匀后转入预冷的电转化杯电击；

B、电击后，迅速在电转化杯中加入1ml LB液体培养基并转移至试管中，28℃摇培1～3小时；

C、将孵育后的培养液涂布于抗性平板上，28℃培养48～72个小时后观察克隆生长情况与计算克隆数目。

3.根据权利要求2所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于：所述黄单胞菌电转化感受态细胞的细胞浓度OD₆₀₀为0.4-1.2，所述相应量的质粒DNA的量为50ng～1μg，所述电击时的电击强度为10-20KV/cm。

4.根据权利要求2所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于；所述黄单胞菌电转化感受态细胞的细胞浓度OD₆₀₀为0.6-1.0，所述相应量的质粒DNA的量为50ng～1μg，所述电击时的电击强度为14-18KV/cm，所述28℃摇培时间为2小时。

5.根据权利要求2所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于；所述的质粒包括可复制质粒和不可复制质粒，可复制质粒包括pUFR027、pDN19和pRKaraRed；不可复制质粒包括pK18mobsacB-xc1075和pK18mobsacB-Xc2659；可复制质粒DNA的量为50ng～1μg，不可复制质粒DNA的量为500ng～1μg。

6.根据权利要求2所述的黄单胞菌电转化感受态细胞的高效电转化方法，其特征在于：所述的抗性平板含四环素10μg/ml或卡那霉素10μg/ml。

7.根据权利要求1所述的快速制备黄单胞菌电转化感受态细胞的方法的应用，其特征在于：用于可复制质粒与不可复制质粒的高效转化；可复制质粒包括pUFR027、pDN19或pRKaraRed；不可复制质粒包括pK18mobsacB-Xc1075或pK18mobsacB-Xc2659。

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