CN102220361B - 一种抗烟草病毒RNAi载体 - Google Patents

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本发明属于生物技术领域，提供了一个能介导对我国烟草病毒病抗性的RNAi载体pGEM-PCTRi。通过对我国烟草主要病毒马铃薯Y病毒(PVY)、黄瓜花叶病毒(CMV)和烟草花叶病毒(TMV)群体基因组特性的分析，选取了PVY CP、CMV RNA1和TMV CP基因中的保守且能诱导RNAi的三段有效序列；将三部分嵌合并构建反向重复序列，得到一个RNAi载体pGEM-PCTRi。利用该载体可以在大肠杆菌中大量生产dsRNA，处理烟草后可诱导烟草产生对PVY、CMV和TMV的抗性。本发明有应用于烟草田间生产中预防病毒病的潜力，且具有广谱、高效、不涉及转基因等优势。

Description

一种抗烟草病毒RNAi载体
技术领域
本发明属于分子生物学领域，具体地说，本发明涉及一种RNA干扰(RNAi)载体及其构建方法，特别涉及一种同时抗PVY、CMV、TMV三种病毒的RNAi载体构建方法。
背景技术
病毒病是烟草上普遍发生、危害严重的一大类病害。目前世界上已报道的侵染烟草的病毒达47种，中国有17种，其中分布广、危害严重的有马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)、黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，CMV)和烟草花叶病毒(Tobacco mosaic virus，TMV)等。田间病毒病多混合发生，往往给烟草生产造成严重损失。病害流行的年份，由病毒病造成的烟叶产量损失可达30％～50％，个别地区甚至绝产[1，2]。因此研究抗病毒方法尤其是同时抗多种病毒的方法在生产中显得尤为迫切和重要。
防治烟草病毒病最有效的方法是种植抗病品种，但传统的抗病品种培育方法面临选育周期长、抗病基因与不良农艺性状基因连锁、抗源遗传基础狭窄以致生产上几乎没有能够抗多种病毒的品种以及抗病性容易丧失等问题。
利用基因工程手段转化病毒的序列可以在较短时间内获得能同时抗多种病毒的转基因植株。其中最为成功的基因工程策略为RNA干扰(RNA interference，RNAi)[3，4]。RNAi是真核生物体内发生的、基于核酸序列同源性的一种基因表达调控机制[5]。双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)被Dicer降解为21-26nt的小干扰RNA(small interferingRNA，siRNA)，后者指导对同源RNA进行识别和切割，导致靶标mRNA的降解[6]。
dsRNA形成的有效途径之一是将体外构建的反向重复结构(inverted repeats，IR)转入植株或工程菌转录合成。IR由一段间隔序列连接两段反向互补序列构成，转录后会形成发夹状RNA(hairpin RNA，hpRNA)。hpRNA由茎(stem，是反向互补序列转录的RNA配对形成的双链)和环(loop，是间隔序列转录的RNA单链结构)组成。hpRNA中的茎是诱发序列特异性基因沉默的关键部份，茎的长短影响RNA沉默的效率和稳定性，501000bp的dsRNA同源片段均能高效诱发转录后基因沉默[7]。转基因植株转录形成的dsRNA和体外合成后再导入植物dsRNA，都可以诱导植物降解入侵的病毒RNA[8，9]。但由于生产中不允许种植转基因烟草，因此利用其它方式诱导烟草植株产生对病毒的抗性更为实用。
大肠杆菌可以表达dsRNA，但由于大肠杆菌中的RNaseIII可以将dsRNA切割成大小12-15bp的片段，这些短的dsRNA不能诱发基因沉默[10]。HT115(DE 3)菌株是RNaseIII的缺失体，可利用该菌株生产大量的dsRNA；用大肠杆菌中产生的dsRNA处理植株，可以获得对病毒的抗性[11，12]。
因此如何应用RNA干扰技术应用于烟草病毒，并培养相应的抗病植株，就成为了现在亟待解决的问题之一。
发明内容
基于上述的原因，发明人在分析了PVY、CMV和TMV中国分离物的基因组特点后，选取了PVY-CP、CMV-RNA1、TMV-CP基因中的保守且能高效诱导RNAi的三段序列。通过将这三部分嵌合并构建反向重复序列，得到一个RNAi载体pGEM-PCTRi，在导入HT115菌株后通过IPTG诱导可以大量生产dsRNA，用dsRNA处理烟草，可诱导烟草产生对PVY、CMV、TMV三种病毒的抗性，对于采用RNA干扰技术来获得抗病毒植株的研究，提供了良好的参考借鉴作用。
本发明所提供的RNAi载体，发明人将其命名为pGEM-PCTRi，其是通过将PVY-CP、CMV-RNA1、TMV-CP基因中的保守且能高效诱导RNAi的三段序列嵌合并构建反向重复序列获得的，其序列如Seq ID No：1所示。
其中发明人所选取的PVY-CP、CMV-RNA1、TMV-CP基因中的保守且能诱导RNAi的三段有效序列，其序列分别如Seq ID No：2、Seq ID No：3和Seq ID No：4所示，具体如下表：
Figure BSA00000490390900021
根据上述的三个片段，发明人将这三部分嵌合并构建反向重复序列，得到一个RNAi载体pGEM-PCTRi，在导入HT115菌株后通过IPTG诱导可以大量生产dsRNA，用dsRNA处理烟草，可诱导烟草产生对PVY、CMV、TMV三种病毒的抗性。
综上所述，本发明所提供的RNAi载体pGEM-PCTRi是具备了诱导烟草产生对PVY、CMV、TMV三种病毒的抗性的首次由人工构建而成的载体。利用该载体可以在大肠杆菌中大量生产d sRNA，处理烟草后可诱导烟草产生对PVY、CMV和TMV的抗性。本发明有应用于烟草田间生产中预防病毒病的潜力，且具有广谱、高效、不涉及转基因等优势。
针对该RNAi载体pGEM-PCTRi的应用，发明人将其转化到大肠杆菌中(ECHT115-PCTRi)，并将转化成功获得的菌株进行了生物保藏，以验证其具体应用时的可操作性，具体保藏信息如下：
保藏信息
保藏时间：2010年12月3日
保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC
保藏编号：CGMCC NO.4404
保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
分类命名：大肠埃希氏菌(Escherichia coli)
附图说明
图1为反向重复片段构建示意图；
图2为pGEM-T Easy载体图谱；
图3为单片段的扩增产物电泳图，
其中泳道M为分子量标准，泳道1、2、3分别为PCR扩增得到的PVYCP基因片段(300bp)、CMV RNA1片段(250bp)和TMV CP基因片段(450bp)；
图4为获得的反向片段的电泳图，
其中泳道M为分子量标准，泳道1为质粒pMD18S-RPCT未酶切，泳道2为质粒pMD18S-RPCT经Sal I/Spe I双酶切，泳道2中1000bp的带为获得的反向片段；
图5为正向片段的电泳图，
其中泳道1即PCR扩增得到的800bp正向片段，泳道M为分子量标准；
图6为获得的反向重复片段的电泳图，
其中泳道M为分子量标准，泳道1为未酶切的质粒pGEM-PCTRi，泳道2为pGEM-PCTR i经SalI/EcoRI双酶切，箭头所指的带为获得的反向重复片段；
图7为dsRNA的提取后的电泳图，
其中泳道1、2、3均为IPTG诱导的菌液使用TRIZOL法提取RNA后进行琼脂糖电泳。泳道1为含pGEM-PCTRi的HT115，泳道2为不含pGEM-PCTRi的HT115对照，泳道3为含pGEM-PCTRi的BL21；
图8为对dsRNA效果验证后叶面图，
其中A：含pGEM-FPCT的HT115菌液诱导表达后超声波破碎，喷施叶片24h后接种TMV，
B：含pGEM-PCTRi的HT115菌液诱导表达后超声波破碎，喷施叶片24h后接种TMV，
图为两者接种48h后的症状：用含pGEM-FPCT的HT115菌液处理过的叶片A出现均匀的枯斑，而用含pGEM-PCTRi的HT115菌液处理过的叶片B未任何枯斑，对TMV表现为免疫，图中叶片上的圆形白色斑点即为枯斑；
图9为pGEM-PCTRi载体验证图，
用引物P-1和P-2检测其它任何基因都不会扩增出大小为800bp的片段，如果能扩增出来，则说明利用了本发明中的载体pGEM-PCTRi。
具体实施方式
本发明所提供的实施例，均按照常规实验条件，其中所采用的引物序列如下表：
Figure BSA00000490390900031
实施例1：利用RT-PCR扩增病毒单基因片段
1、总RNA提取
从田间分别采集感染PVY、CMV和TMV的烟草植株，按照TransZol试剂盒(BeijingTransGen Biotech Co.，Ltd)提供的方法，从感病烟草叶片中提取总RNA。
2.RT-PCR反应
以植物总RNA为模板，分别以PVY-R、CMV-R或TMV-R为引物进行反转录。反应体系如下：
Figure BSA00000490390900032
Figure BSA00000490390900041
混匀后42℃孵育50min，70℃孵育15min停止反应。
以所得反转录产物为模板，进行单片段的PCR扩增。
PVY片段PCR扩增体系如下：
Figure BSA00000490390900042
CMV片段PCR扩增体系如下：
Figure BSA00000490390900043
TMV片段PCR扩增体系如下：
Figure BSA00000490390900044
PCR扩增程序如下：
Figure BSA00000490390900051
利用表1中的引物，通过RT-PCR扩增可以获得PVY CP基因约300bp、CMV RNA1约250bp和TMV CP基因约450bp的片段(电泳结果如附图3所示)。
实施例2：反向片段的构建
1、将PVY扩增产物全部进行1％琼脂糖凝胶电泳。切胶，使用EasyPure Quick Gel ExtractionKit(TransGen Biotech，China)进行回收。片段回收产物连接pMD18-T simple载体，4℃过夜，连接体系如下：
Figure BSA00000490390900052
2、连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞；
3、挑取单菌落，37℃含氨苄青霉素的液体LB培养基摇菌；
4、碱裂解法抽提质粒；
5、使用引物PVY-F、PVY-R进行PCR筛选阳性克隆；
6、将鉴定出的阳性重组质粒进行双酶切，酶切体系如下：
Figure BSA00000490390900053
电泳，切胶回收3300bp左右的带；
7、将CMV扩增产物取5.0μL进行1％琼脂糖凝胶电泳，确认扩增得到正确片段。然后将剩余20.0μL产物用BamHI和EcoRI进行双酶切，酶切体系同上；
8、将BamHI和EcoRI双酶切的3300bp质粒DNA与经过同样酶切的CMV片段回收产物按1∶3～1∶10的摩尔比进行连接，连接体系如下：
Figure BSA00000490390900054
9、连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞；
10、挑取单菌落进行摇菌，碱裂解法抽提质粒；
11、使用引物PVY-F、CMV-R进行PCR反应，筛选阳性克隆；
12、将鉴定出阳性重组质粒进行双酶切；
酶切体系如下：
Figure BSA00000490390900055
Figure BSA00000490390900061
13、电泳，切胶回收3600bp左右的带；
14、与同样经过HindIII和EcoRI双酶切的TMV片段回收产物按1∶3～1∶10的摩尔比进行连接，连接体系如下：
Figure BSA00000490390900062
15、连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞。
16、挑取单菌落进行摇菌，碱裂解法抽提质粒。
17、使用引物PVY-F、TMV-R进行PCR筛选出正确的克隆。
18、至此反向片段构建完毕，将片段命名为R-PCT，连有片段的载体为pMD18S-RPCT(电泳结果如附图4)。
实施例3：正向片段的扩增
1、以pMD18S-RPCT为模板，PCR扩增正向片段F-PCT，
体系如下：
Figure BSA00000490390900063
程序如下：
Figure BSA00000490390900064
2、电泳，切胶回收800bp的片段(F-PCT)；
3、将F-PCT回收产物连接pGEM-T easy(Promega，America)载体，4℃过夜，连接体系如下：
Figure BSA00000490390900065
2、连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞；
3、挑取单菌落，37℃含氨苄的液体LB培养基摇菌；
4、碱裂解法抽提质粒；
5、PCR筛选出连入F-PCT的克隆(体系与程序同F-PCT片段的扩增过程)；
6、BamHI/SpeI双酶切鉴定插入克隆的方向。酶切体系如下：
Figure BSA00000490390900071
如果酶切得到约500bp的带，说明插入方向正确；
7、选取外源片段插入方向正确的克隆；正向载体构建完毕，命名为pGEM-FPCT(电泳结果如图5所示)。
实施例4：反向重复片段的构建
1、利用SalI和SpeI对pGEM-FPCT进行酶切，回收约3800bp的片段；利用SalI和SpeI对pMD18S-RPCT质粒进行酶切，回收约1000bp的片段：酶切体系如下：
Figure BSA00000490390900072
2、将两个回收片段连接(摩尔比1∶3～1∶10)，连接体系如下：
3、连接产物通过热激法转化DH5α感受态细胞，
4、挑取单菌落，37℃含氨苄的液体LB培养基摇菌，
5、碱裂解法抽提质粒，
6、双酶切筛选出正确的质粒，酶切体系如下：
7、所获得的正确质粒其电游结果为一条1800bp左右的带(如附图6所示)；该正确的质粒即为目标物，RNAi载体构建完毕，并将其命名为pGEM-PCTR i，其序列如Seq ID No：1所示。
实施例5dsRNA的生产
1、制备HT115感受态：采用CaCl2法制备新鲜的大肠杆菌HT115感受态细胞，一切操作均在严格无菌环境下进行：
1)用灭菌的量筒量取50mL LB培养基(四环素)于250mL三角瓶中，各取1mL培养14-16h的菌液接种于上述三角瓶中，37℃，220-250rpm振荡培养3h；
2)在超净工作台上，将菌液倒入预冷的50mL离心管中，将离心管放入冰上冷冻30min；
3)菌液在4℃，5000rpm，离心5min；
4)小心地移去上清，将菌体重新悬浮于10mL冷的0.1M MgCl2(原体积的1/5)，4℃，5000rpm，离心5min；
5)小心地移去上清，将菌体重新悬浮于25mL冷的0.1M CaCl2(原体积的1/2)，冰上放置20min；
6)4℃，5000rpm，离心5min，小心地移去上清，将菌体用5mL冷的0.1M CaCl2(原体积的1/10)重新悬浮，加入1mL无菌甘油，混匀后分装到1.5mL离心管于-80℃存贮备用；
2、将pGEM-PCTRi载体热激法转化上述获得的HT115感受态细胞；获得转化后的大肠杆菌ECHT115-PCTRi，并对其进行生物保藏；
3、挑单菌落，37℃含四环素与氨苄的LB培养基摇菌，碱裂解法提取质粒；
4、PCR筛选正确的克隆，体系及程序同F-PCT的扩增；
5、将正确的克隆平板划线，从板上挑取单菌落接种于5mL LB液体培养基中(含氨苄青霉素、四环素)，37℃活化过夜，1∶100稀释到10mL含氨苄青霉素与四环素的LB液体培养基中，37℃，220rpm培养3h(OD600达到0.4-1)，加IPTG至终浓度1mmol/L，继续于37℃培养3h；
6、使用TRIZOL(Invitrogene，America)法提取RNA；
7、1.5％琼脂糖凝胶电泳检测诱导出的RNA带分子量大约为850bp(电泳结果如图7所示)。
实施例6dsRNA的应用
1、诱导100mL表达dsRNA的HT115菌液(以含pGEM-FPCT载体的HT115同时进行实验为对照)，进行5-10min超声波破碎(功率300W，破碎3s，间隔9.9s)。
2、使用喷雾器将两组破碎菌液分别直接喷施处理两批三生烟(Nicotiana tabacum cvSamsun)，使菌液完全覆盖叶片。
3、24h后将处理过的叶片接种TMV病毒，25℃温室保存，观察症状，48h后拍照记录。
用含pGEM-FPCT的HT115菌液处理过的叶片出现均匀的枯斑，而用含pGEM-PCTRi的HT115菌液处理过的叶片未出现症状，对TMV表现为免疫。(结果如图8所示)
实施例7pGEM-PCTRi载体的检测
使用引物P-1和P-2作为检测pGEM-PCTRi的特异引物，通过PCR扩增可以得到800bp的片段(所得片段电泳结果如图9所示)。
由于载体pGEM-PCTRi是本发明中首次构建的，自然界中不存在这样的组合序列，用引物P-1和P-2检测其它任何基因都不会扩增出大小为800bp的片段，如果能扩增出来，则说明利用了本发明中的载体。
Figure ISA00000490391100011
Figure ISA00000490391100021
Figure ISA00000490391100031
Figure ISA00000490391100041

Claims (2)

1.一种抗烟草病毒RNAi载体，其特征在于所述载体包含序列表SEQ ID No：1所示的序列片段。
2.如权利要求1所述载体在烟草田间生产中预防烟草花叶病毒病中的应用。
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