CN102870672A - 狼毒不定根的诱导及组织培养的方法 - Google Patents

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邱德有
刘洪伟
杨艳芳
张楠
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Abstract

本发明涉及一种狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的诱导及组织培养的方法，属于细胞工程技术领域。包括(1)种子的萌发：狼毒种子经HgCl2消毒后置于MS固体培养基上，于光照下萌发；(2)愈伤组织的诱导：将步骤(1)获得的小苗置于含2，4-二氯苯氧乙酸、萘乙酸、6-苄氨基腺嘌呤和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成愈伤组织；(3)不定根的诱导：将步骤(2)获得的愈伤组织置于含吲哚丁酸和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成不定根；(4)不定根的培养：将步骤(3)获得的不定根置于含有吲哚丁酸的MS固体培养基上培养。本发明方法简单、有效物质含量高。

Description

狼毒不定根的诱导及组织培养的方法
技术领域
本发明涉及的是一种细胞工程技术领域的方法，特别是涉及一种狼毒不定根的诱导及组织培养的方法。
背景技术
狼毒是我国特有的、贵重中药材之一，含杀虫、杀菌及抗癌等多种生物活性物质。二萜类化合物Prostratin(图1)最早由Cashmore等人从新西兰植物稻花一种(Pimeleaprostrata)中分离得到。近年来，人们在太平洋岛国萨摩亚的Mamala树Homalanthus nutans中也分离到了该二萜类化合物并且发现Prostratin能够激活潜伏的HIV病毒，表现出良好的抗HIV的活性，有望开发成一种新药，但人们经研究发现Mamala树资源很少，其中的Prostratin的含量很低。我国的学者发现狼毒(Euphorbia fischeriana)的根中也含有Prostratin，但其Prostratin的含量也很低。由于狼毒大戟的生长受地理条件的限制，资源十分有限，导致药材供不应求，不能满足医药市场的需求。为解决资源紧缺的问题，研究生物技术培养狼毒的方法成为当务之急。规模化药用植物组织培养可以解决以上问题，通过组织培养方法可以获得有效成分含量高、生产周期短的狼毒组织培养物，从而代替野生或人工土地栽培的狼毒，既可解决占地问题，又可解决狼毒药材的资源问题，具有重要的经济价值、生态效益和社会效益。
不定根培养是上世纪80年代发展起来的一项细胞工程技术。不定根是一种分化的植物器官，是由植物的愈伤组织诱导而来。和悬浮培养细胞相比较，药用植物的不定根其有效成分含量很稳定；和大田人工栽培的植物相比，不仅有效成分含量高而稳定，而且不定根培养不受气候、土地等因素的影响，可以周年大规模生产，适合于药用植物尤其是狼毒这种根类药材的组织培养和规模化生产，以获得狼毒药材的替代物或生产其主要有效成分。
经对现有文献的检索发现，目前除戴传超等人进行了药用植物京大戟(Euphorbiapekinensis)悬浮细胞培养的研究外(见：戴传超、余伯阳、薛菲、蒋继宏，药用植物大戟悬浮细胞的培养，南京林业大学学报(自然科学版)，2005，29(2)：57-60)，尚无狼毒(Euphorbiafischeriana)细胞、组织培养和生产方法的文献报道，也未见有涉及狼毒(Euphorbiafischeriana)不定根诱导及不定根培养体系建立的文献报道。
发明内容
本发明的目的在于针对狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根细胞工程生产技术，提供一种狼毒不定根的诱导及组织培养的方法。使其来自于自大田栽培狼毒植物的种子的无菌小苗在愈伤组织诱导基上诱导形成愈伤组织，并使狼毒愈伤组织在不定根诱导培养基上诱导形成不定根，形成一种规模大、周期短、质量可控、成本低的不定根生产方法。
本发明是通过下述技术方案实现的，包括如下具体步骤：
(1)狼毒无菌小苗的获得：取野生狼毒植株的种子置于MS固体培养基上，于光照培养条件下萌发成无菌小苗；
(2)狼毒愈伤组织的诱导：具体为取步骤(1)获得的3厘米长的狼毒无菌小苗置于含2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)三种植物生长调节剂和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成愈伤组织；
(3)狼毒不定根的诱导：取步骤(2)获得的狼毒愈伤组织置于含吲哚丁酸和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成不定根；
(4)狼毒不定根的培养：取步骤(3)获得的狼毒不定根置于含有吲哚丁酸的MS固体培养基上，于无菌避光条件下培养。
步骤(1)中所述的小苗为诱导自野生狼毒植株的种子。
步骤(2)中所述的愈伤组织，是指源于无菌小苗的愈伤组织。
步骤(1)中所述的培养基，是指不含任何植物生长调节剂的MS固体培养基。
步骤(1)中所述的光照培养条件下，是指于24-26℃、3000勒克斯(lux)光照强度的条件下诱导25-30天。
步骤(2)中所述的培养基，是指含有0.2-2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.1-1mg/L萘乙酸(NAA)、0.02-0.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和2-3ml/L椰子汁的MS固体培养基。
步骤(2)中所述的无菌避光条件下，是指于24-26℃无菌避光条件下诱导25-30天。
步骤(3)中所述的培养基，是指含有5-20mg/L吲哚丁酸和1-2ml/L椰子汁的MS固体培养基。
步骤(3)中所述的无菌避光条件下，是指于24-26℃无菌避光条件下诱导25-30天。
步骤(4)中所述的培养基，是指含有1-2mg/L吲哚丁酸的MS固体培养基。
步骤(4)中所述的无菌避光条件下，是指于24-26℃无菌避光条件下诱导25-30天。
本发明方法简便、效率高，来源于狼毒无菌小苗愈伤组织不定根的诱导率在90.0％以上，狼毒有效物质prostratin含量高，建立了完善的不定根培养体系。
附图说明
图1为狼毒有效物质prostratin的化学结构图。
图2为prostratin标准品的高效液相色谱图。
图3为狼毒不定根样品的高效液相色谱图。
图4为狼毒不定根样品加prostratin标准品后的高效液相色谱图。
具体实施方式
实施例1：狼毒种子的萌发
取野生狼毒植株的种子，经0.2％HgCl2消毒12分钟、用无菌水冲洗3遍后置于不含任何植物生长调节剂的MS固体培养基上，于26℃、3000勒克司(lux)光照条件下培养25天，即可萌发成小苗。
实施效果：狼毒种子的萌发率达5.0％，所萌发成的无菌小苗具有完整的根、茎、叶，生长正常。
实施例2：狼毒愈伤组织的诱导
将实施例1获得的3厘米长的狼毒无菌小苗置于含1mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，0.5mg/L萘乙酸，0.1mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)三种植物生长调节剂和3ml/L椰子汁的MS固体培养基上，于24-26℃无菌避光条件下诱导25天，即得到狼毒的愈伤组织。
实施效果：狼毒愈伤组织诱导率达80.0％。2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)，萘乙酸，6-苄氨基腺嘌呤这三种植物生长调节剂和椰子汁的共同作用促进了愈伤组织的形成和生长。
实施例3：狼毒不定根的诱导
将实施例2获得的狼毒愈伤组织置于含10mg/L吲哚丁酸这种植物生长调节剂和2ml/L椰子汁的MS固体培养基上，于24-26℃无菌避光条件诱导培养25天，即得到狼毒的不定根。
实施效果：不定根诱导率达90.0％，不定根细、短，并侧向分生出细、短的不定根，不定根发生轻微的愈伤化。
实施例4：狼毒不定根固体培养体系的建立
将实施例3获得的狼毒不定根从其母体愈伤组织上分离，将分离到的不定根置于含有2mg/L吲哚丁酸的MS固体培养基上，于24-26℃无菌避光条件诱导培养25天，即得到大量的狼毒的不定根。
实施效果：建立了不定根的体外固体培养体系，侧向分生出大量细长的不定根。经高效液相色谱仪分析，所得狼毒不定根中有效物质prostratin的含量为42.21μg/g干重。

Claims (9)

1.一种狼毒(Euphorbia fischeriana)不定根的诱导及组织培养的方法，其特征在于，包括以下具体步骤：
(1)狼毒无菌小苗的获得：取狼毒的种子置于MS固体培养基上，于光照培养条件下萌发成无菌小苗；
(2)狼毒愈伤组织的诱导：具体为取步骤(1)获得的3厘米长的狼毒无菌小苗置于含2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、萘乙酸(NAA)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)三种植物生长调节剂和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成愈伤组织；
(3)狼毒不定根的诱导：取步骤(2)获得的狼毒愈伤组织置于含吲哚丁酸和椰子汁的MS固体培养基上，于无菌避光条件下诱导形成不定根；
(4)狼毒不定根的培养：取步骤(3)获得的狼毒不定根置于含有吲哚丁酸的MS固体培养基上，于无菌避光条件下培养。
2.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中所述的小苗为诱导自野生狼毒植物的种子。
3.根据权利要求2所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(2)中所述的愈伤组织，是指源于狼毒无菌小苗的愈伤组织。
4.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中所述的培养基，是指不含任何植物生长调节剂的MS固体培养基。
5.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(1)中所述的光照培养条件下，是指于24-26℃、3000勒克斯(lux)光照强度的条件下诱导25-30天。
6.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(2)中所述的培养基，是指含有0.2-2mg/L 2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)、0.1-1mg/L萘乙酸(NAA)、0.02-0.2mg/L 6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)和2-3ml/L椰子汁的MS固体培养基。
7.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(3)中所述的培养基，是指含有5-20mg/L吲哚丁酸和1-2ml/L椰子汁的MS固体培养基。
8.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(4)中所述的培养基，是指含有1-2mg/L吲哚丁酸的MS固体培养基。
9.根据权利要求1所述的狼毒不定根的诱导及组织培养的方法，其特征是，步骤(2)、步骤(3)、步骤(4)中所述的无菌避光条件下，是指于24-26℃无菌避光条件下培养25-30天。
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