CN104855287A - 藏药马尿泡快繁体系的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了藏药马尿泡快繁体系的建立方法，首先获得马尿泡种子无菌苗的获得；对马尿泡种子无菌苗进行芽增殖；获得大量长势一致的丛生芽；对丛生芽生根培养；获得马尿泡快繁苗。本发明将野生种子保存和组织培养生物技术体系有效的结合，创建了藏药马尿泡组培苗及茎段快繁体系，克服了马尿泡种子在自然条件下难萌发、野生材料获得困难、传统组织培养取材受季节限制的难题。
Description
技术领域
本发明属于植物生物技术领域，涉及藏药马尿泡快繁体系的建立方法。
背景技术
马尿泡(Przewalskia tangutica Maxim.)又名矮莨菪，是茄科(Solanaceae)马尿泡属植物，为我国青藏高原特有植物；生长于海拔3200-5000米的高山砾石地及干旱草原。据《晶珠本草》及《藏药志》记载，它是藏药中的常用药，其根和种子及全草均可做药用，具有镇痛、解痉、杀虫、消炎等药效，用于胃肠痉挛疼痛、白喉、炭疽；外用疮疡，皮肤瘙痒。1984年，肖培根等，对茄科中的三分三，唐古特山莨菪，马尿泡等54中植物的托烷类生物碱有效成分进行分析，结果发现马尿泡中托烷类生物碱含量高，可以直接作为工业生产该类药物的原料。
伴随着马尿泡药用价值的发现，大量野生资源被挖掘，一方面造成了马尿泡野生资源濒危，另一方面也造成高原地区脆弱的生态破坏。近年来研究表明，东莨菪碱作为一些药物合成的重要中间原料，也使得该化合物在国际市场上的需求增长很快，是莨菪碱的10倍。选用化学合成的方法存在成本高、生产周期长、合成有效成分的产量较低。因此，对高产东莨菪碱的马尿泡野生资源进行合理的开发研究，了解其高产东莨菪碱的机制，可能是解决东莨菪碱供求矛盾的有效途径，也是间接保护传统藏药资源，保护生态环境的有效办法。
目前，国内外对马尿泡的研究主要集中在细胞学，系统学，植物化学、组织培养等方面。有关马尿泡组织培养的研究主要以野生芽为材料，受季节性限制且野生芽经消毒后不易存活，繁殖速率低等问题，严重限制该植物资源的开发利用。传统的器官再生途径存在遗传变异大，可能会影响其体内生物碱的合成代谢，对后续研究产生影响。因此，建立在种子无菌苗基础上的茎段组织快速繁殖体系能够有效的解决上述问题。本实验在对马尿泡组织培养研究的基础上，分析了马尿泡组培苗各部分的四种生物碱含量变化，一方面为马尿泡种质资源的保存提供了技术参考，另一方面，为利用基因工程对马尿泡进行遗传改造，培育高产东莨菪碱的转基因植株或生物反应器提供了研究基础。
发明内容
本发明的目的在于提供藏药马尿泡快繁体系的建立方法，解决了东莨菪碱产量低的问题。
本发明所采用的技术方案是藏药马尿泡快繁体系的建立方法按照以下步骤进行：
第1步：马尿泡种子无菌苗的获得；将干燥的马尿泡种子放置于三角瓶中，用蒸馏水冲洗三次，每次遗弃漂浮的种子，将筛选好的种子用400ppm赤霉素浸泡24h，用蒸馏水冲洗三次，然后将处理好的种子放于超净工作台中，用乙醇水溶液消毒1min，无菌水冲洗3次，然后用NaClO水溶液消毒20min，无菌水冲洗6次，将经过消毒的马尿泡种子播种在装有30mlMS培养基的三角瓶中，在恒温培养箱中22℃暗培养，待种子发芽后转入光照培养箱培养，培养条件为光照条件：培养温度20℃-24℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养，黑暗条件：培养温度20℃-24℃。在光照培养箱生长25-30d获得长势一致的马尿泡种子无菌苗；
第2步：芽增殖；在超净工作台，将马尿泡种子无菌苗取出，切取带有腋芽的茎段，接种在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L固体培养基中，每瓶接种5个，培养条件：培养温度23℃-27℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养，获得大量长势一致的丛生芽；
第3步：丛生芽生根培养；在超净工作台上，将丛生芽取出，将丛生芽分割成带有1-2个芽体的外植体，然后将分离的芽体接种在MS+0.5mg/L NAA的培养基上，培养条件：培养温度23℃-27℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养，获得马尿泡快繁苗。
进一步，所述MS培养基配置方法：
1.称取NH4NO341.25g，KNO347.50g，KH2PO44.25g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加20mL母液；
2.称取CaCl2·2H2O 22g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
3.称取MgSO4·7H2O 18.50g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
4.称取MnSO4·4H2O 2230mg或MnSO4·H2O 1690mg，ZnSO4·7H2O 860mg，H3BO3620mg，KI 83mg，NaMoO4·2H2O 25mg，CuSO4·5H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O2.5mg，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取5mL母液；
5.称取甘氨酸0.1g，烟酸硫胺素0.005g，烟酸吡哆素0.025g，烟酸0.025g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
6.称取肌醇5g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
7.称取Na2-EDTA 1.865g，FeSO4·7H2O 1.390g，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液。
进一步，所述MS培养基中，蔗糖30g/L，琼脂7g/L。
本发明的有益效果是培育出了高产东莨菪碱的转基因植株或生物。
附图说明
图1是不同消毒试剂、消毒时间对建立马尿泡种子无菌苗繁殖体系的影响示意图。
图2为不同浓度激素对马尿泡芽增殖的影响示意图；
图3为不同浓度NAA对马尿泡茎段生根的影响示意图；
图4为马尿泡组培苗不同组织中四种托烷类生物碱的含量示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明藏药马尿泡快繁体系的建立方法如下步骤：
第1步：马尿泡种子无菌苗的获得；将干燥的马尿泡种子放置于三角瓶中，用蒸馏水冲洗三次，每次遗弃漂浮的种子(水选法)。将筛选好的种子用400ppm赤霉素浸泡24h(小时)，用蒸馏水冲洗三次，然后将处理好的种子放于超净工作台中。用75％(乙醇与水的体积比)乙醇水溶液消毒1min，无菌水冲洗3次，然后50％(NaClO与水体积比)NaClO水溶液消毒20min，无菌水冲洗6次。将经过消毒的马尿泡种子用镊子播种在装有30mlMS培养基的三角瓶中。在恒温培养箱中22℃暗培养，待种子发芽后(接种后约6-8d)转入光照培养箱培养，培养条件为光照条件：培养温度(22±2)℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养。黑暗条件：培养温度(22±2)℃。在光照培养箱生长25-30d左右就可以获得长势一致的马尿泡种子无菌苗。
第2步：芽增殖；在超净工作台，将马尿泡种子无菌苗取出，切取带有腋芽的茎段(腋芽上部保留0.5cm，下部保留1.0cm便于扦插)接种在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L固体培养基中，每瓶可接种5个。培养条件：培养温度(25±2)℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养。腋芽基部靠近培养基部位在接种后2周左右会产生少量浅绿色的愈伤组织，腋芽伸长，3周左右在愈伤组织周围陆续产生不定芽，成簇生长，芽体健壮，获得大量长势一致的丛生芽。
第3步：丛生芽生根培养；在超净工作台上，将丛生芽取出，用解剖刀在灭菌的培养皿内将丛生芽分割成带有1-2个芽体的外植体，然后将分离的芽体接种在MS+0.5mg/L NAA的培养基上，培养条件：培养温度(25±2)℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养。3周左右不定芽底部陆续产生不定根，为植株生长提供营养，获得大量生长旺盛的马尿泡快繁苗。
MS培养基配方：
1.准确称取NH4NO341.25g，KNO347.50g，KH2PO44.25g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加20mL母液；
2.准确称取CaCl2·2H2O 22g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
3.准确称取MgSO4·7H2O 18.50g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
4.准确称取MnSO4·4H2O 2230mg或MnSO4·H2O 1690mg，ZnSO4·7H2O 860mg，H3BO3620mg，KI 83mg，NaMoO4·2H2O 25mg，CuSO4·5H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O2.5mg，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取5mL母液；
5.准确称取甘氨酸(Gly)0.1g，VB1(烟酸硫胺素)0.005g，VB6(烟酸吡哆素)0.025g，烟酸0.025g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
6.准确称取肌醇5g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
7.准确称取Na2-EDTA 1.865g，FeSO4·7H2O 1.390g，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
8.附加：蔗糖30g/L，琼脂7g/L。
一、实验流程
1、种子无菌苗的获得
表1为不同因子对马尿泡种子发芽率的影响。
表1
图1为不同消毒试剂、消毒时间对建立马尿泡种子无菌苗繁殖体系的影响示意图。该部分内容得出结论，将常温保存的野生种子经过400ppm赤霉素处理24h，无菌条件下，75％酒精消毒1min，50％NaClO消毒10、15、20min，无菌水冲洗6次，每次3min然后点播在装有30mlMS固体培养基的150ml三角瓶内，黑暗条件：温度为(22±2)℃恒温培养箱培养，待其发芽(一般在7-8就可以发芽)后转入恒温光照培养箱培养。光照条件：培养温度(22±2)℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养，可以获得生长健壮的马尿泡种子无菌苗，成苗率为93.33％。
2、芽增殖培养阶段，图2为不同浓度激素对马尿泡芽增殖的影响。该部分得出的结论，将生长45d左右的马尿泡种子无菌苗在无菌条件下，用剪刀切割成2cm左右长度的带腋芽的茎段，接种在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L，培养温度(25±2)℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养。实验观察统计发现，腋芽基部靠近培养基部位在接种后2周左右会产生少量浅绿色的愈伤组织，腋芽伸长，3周左右在愈伤组织周围陆续产生不定芽，成簇生长，芽体健壮，诱导率为96.67％，增殖系数为2.21。
3、生根培养，图3为不同浓度NAA对马尿泡茎段生根的影响。该部分得出结论为，在无菌条件下选择生长健壮的芽体接种在MS+NAA0.5mg/L培养基上，第3周左右，不定芽上陆续产生不定根，第4周统计，相对其它处理诱导率最高为71.67％，平均每个外植体上产生3.25个不定根，且组培苗生长健壮。
4、马尿泡组培苗各部分生物碱含量的测定，图4为马尿泡组培苗不同组织中四种托烷类生物碱的含量示意图。该部分结论，马尿泡各组织中均检测到四种生物碱活性成分，对马尿泡组培苗不同组织和愈伤组织中四托烷类生物碱含量的比较发现，组培苗根中总生物碱的含量最高，高达14.125mg/100g。
综上所述，马尿泡是生长在青藏高原的特有的单种成属的药用植物，其体内高含量的生物碱，尤其东莨菪碱备受人们的关注。由于其生长环境特殊，分布地域狭窄，随着人们的大量挖掘而面临濒危，由于马尿泡野生种子在自然条件下难萌发，材料获取困难，严重限制了该植物资源的有效利用。该实验建立并优化了藏药马尿泡快繁体系，为该植物资源的持续开发利用提供了一条可行的方法。
以上所述仅是对本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对以上实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (3)
1.藏药马尿泡快繁体系的建立方法，其特征在于按照以下步骤进行：
第1步：马尿泡种子无菌苗的获得；将干燥的马尿泡种子放置于三角瓶中，用蒸馏水冲洗三次，每次遗弃漂浮的种子，将筛选好的种子用400ppm赤霉素浸泡24h，用蒸馏水冲洗三次，然后将处理好的种子放于超净工作台中，用乙醇水溶液消毒1min，无菌水冲洗3次，然后用NaClO水溶液消毒20min，无菌水冲洗6次，将经过消毒的马尿泡种子播种在装有30mlMS培养基的三角瓶中，在恒温培养箱中22℃暗培养，待种子发芽后转入光照培养箱培养，培养条件为光照条件：培养温度20℃-24℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养，黑暗条件：培养温度20℃-24℃。在光照培养箱生长25-30d获得长势一致的马尿泡种子无菌苗；
第2步：芽增殖；在超净工作台，将马尿泡种子无菌苗取出，切取带有腋芽的茎段，接种在MS+6-BA2.0mg/L+NAA0.5mg/L固体培养基中，每瓶接种5个，培养条件：培养温度23℃-27℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养，获得大量长势一致的丛生芽；
第3步：丛生芽生根培养；在超净工作台上，将丛生芽取出，将丛生芽分割成带有1-2个芽体的外植体，然后将分离的芽体接种在MS+0.5mg/L NAA的培养基上，培养条件：培养温度23℃-27℃，光照强度为3000lx，12h.d-1光照条件下培养，获得马尿泡快繁苗。
2.按照权利要求1所述藏药马尿泡快繁体系的建立方法，其特征在于：所述MS培养基配置方法：
1.称取NH4NO341.25g，KNO347.50g，KH2PO44.25g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加20mL母液；
2.称取CaCl2·2H2O 22g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
3.称取MgSO4·7H2O 18.50g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
4.称取MnSO4·4H2O 2230mg或MnSO4·H2O 1690mg，ZnSO4·7H2O 860mg，H3BO3620mg，KI 83mg，NaMoO4·2H2O 25mg，CuSO4·5H2O 2.5mg，CoCl2·6H2O2.5mg，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取5mL母液；
5.称取甘氨酸0.1g，烟酸硫胺素0.005g，烟酸吡哆素0.025g，烟酸0.025g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
6.称取肌醇5g，溶于300mL蒸馏水中，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液；
7.称取Na2-EDTA1.865g，FeSO4·7H2O 1.390g，然后定容至500mL，用时每L培养基加吸取10mL母液。
3.按照权利要求1所述藏药马尿泡快繁体系的建立方法，其特征在于所述MS培养基中，蔗糖30g/L，琼脂7g/L。
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