CN102866191A - 用于检测草酸浓度的电化学生物传感器及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于检测草酸浓度的电化学生物传感器及其制备和应用。将草酸氧化酶固定于部分还原氧化石墨烯表面，利用滴涂法将固定化草酸氧化酶修饰于玻碳电极表面，形成基于草酸氧化酶-部分还原氧化石墨烯修饰的电化学生物传感器。以该电极为工作电极，采用差分伏安脉冲法检测草酸浓度。本发明所采用的生物传感器对草酸有良好的电催化活性。随着草酸氧化酶固载量的增多，电催化活性增强。该电极检测范围宽，具有较低的检测下限，且响应迅速。
Description
技术领域
本发明涉及一种检测草酸的电化学生物传感器的制备，具体涉及一种基于部分还原氧化石墨烯固载草酸氧化酶，将固定化酶修饰玻碳电极制备电化学生物传感器及其对草酸的检测。
背景技术
草酸是一种在细胞代谢过程中大量产生的对几乎所有的生物体都有毒性的有机物。草酸在人体内过量累积将导致很多疾病，如高草酸尿症、草酸钙结石、肾衰竭、心肌病和心肌电导率紊乱等。尿液和血浆中草酸的测定对一期、二期高草酸尿症的诊断和药物处理十分重要。血液中草酸的分析对草酸钙结石早期诊断十分有用。对于草酸诊断的方法有色谱发，光谱发，滴定法以及电化学法。相比其他方法，电化学传感器耗时少，方便快捷，设备简单，应用更为广泛。酶电极由于其催化性高，专一性好，能够简单、快速的给出结果，同时灵敏性较高，备受广泛关注。其中，差分脉冲伏安法拥有较高的灵敏度，因此常用作高灵敏度的检测。
近年来，随着纳米科学技术的迅猛发展，越来越多的纳米材料用于构建新型生物传感器。而自2004年由英国科学家Geim首次报道石墨烯以来，迅速成为国内外研究热点。石墨烯具有良好的导电性和巨大的比表面积，是一种理想的电化学材料。与碳纳米管相比，石墨烯不仅具有成本低廉、表面积大、易于制备等优点，且不含金属杂质，为碳材料的电催化性质的研究提供了一个良好的平台。但由于在无分散剂的情况下，石墨烯在溶液中易团聚，不利于其应用。通过将氧化石墨烯部分化学还原，既保留了官能团利于分散和化学作用，又能体现出石墨烯良好的电化学性能。因此选用部分还原氧化石墨烯(PCRGO)作为电化学材料。鉴于草酸在生物中的重要性，发展检测草酸的方法有十分重要。目前还没有利用石墨烯优异的电化学性能制备出用于草酸检测的电化学生物传感器。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种快速灵敏的用于检测草酸浓度的电化学生物传感器及其制备和应用。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：一种用于检测草酸浓度的电化学生物传感器，该电化学传感器为三电极体系传感器，其中对电极为铂电极，参比电极为饱和甘贡电极，其特征在于，工作电极为固载了草酸氧化酶的部分还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极。
一种用于检测草酸浓度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，固载了草酸氧化酶的部分还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极采用以下方法制备；
1)制备部分还原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶材料：将部分还原氧化石墨烯添加到含有草酸氧化酶的丁二酸钠缓冲溶液中混合，得到固定化的草酸氧化酶的分散液；
2)制备固载了草酸氧化酶的部分还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极：将步骤1)得到的分散液，滴涂在玻碳电极表面，抽真空干燥，制得固载了草酸氧化酶的部分还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极。标记为OxOx-PCRGO/GC电极。所得电极4℃下保存。
所述的步骤1)具体为：采用部分还原氧化石墨烯作为载体，将其添加到含草酸氧化酶的丁二酸钠缓冲溶液中，在4℃下旋转混合2h，通过疏水作用，草酸氧化酶吸附在部分还原氧化石墨烯表面，将所得混合液离心并用缓冲液彻底洗涤3次，除去游离的以及吸附不牢固的草酸氧化酶分子，将沉淀分散在丁二酸钠缓冲溶液即得部分还原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶材料；其中含草酸氧化酶的丁二酸钠缓冲溶液中草酸氧化酶的含量为(0.1～0.5)g/L，丁二酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，pH值为3.5，部分还原氧化石墨烯与草酸氧化酶的质量比为1∶(1～5)。
所述的部分还原氧化石墨烯来自于合成的部分还原氧化石墨烯水溶液PCRGO，其浓度为1mg/mL，合成方法采用文献公开的方法，如文献(Zhang，J.；Yang，H.；Shen，G.；Cheng，P.；Zhang，J.；Guo，S.，Chem.Commun.2010，46，1112-1114.)；
步骤2)所述的玻碳电极在滴涂分散液前抛光至镜面，超声清洗后氮气吹干。
一种用于检测草酸浓度的电化学生物传感器的应用，其特征在于，采用三电极体系，以甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，部分还原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶修饰的电极为工作电极，利用差分伏安脉冲法检测草酸的浓度。
现有技术相比，本发明以K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]为电化学探针，采用循环伏安法考察了不同还原程度的氧化石墨烯制备的电极的电化学性能，实验表明随着氧化石墨烯还原程度的增加，背景电流增大，电化学性能提高，但当还原4小时以后电化学性能趋于稳定，还原4小时与还原12小时得到的PCRG的电化学性能无明显区别。
本发明采用差分脉冲伏安法考察草酸氧化酶不同固载量下制备的电极的草酸检测性能。实验表明，随着草酸氧化酶固载量的提高，草酸检测的范围越宽，灵敏性越好。
本发明构建了一种新型的检测草酸的电化学方法，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为在1mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]的0.1M KCl溶液中，不同还原程度氧化石墨烯制备的电极在扫描速度为0.05V/s的循环伏安曲线；
图2为OxOx-PCRGO电极在20mM丁二酸钠(pH3.5)缓冲溶液中连续添加草酸的差分脉冲伏安曲线；其中，OxOx在PCRGO固载量为1mg/mg，用于制备电极的PCRGO的浓度为0.1mg/mL；
图3为OxOx-PCRGO电极在20mM丁二酸钠(pH3.5)缓冲溶液中连续添加草酸的差分脉冲伏安曲线；其中，OxOx在PCRGO固载量为5mg/mg，用于制备电极的PCRGO的浓度为0.1mg/mL。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明：本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
根据文献(Zhang，J.；Yang，H.；Shen，G.；Cheng，P.；Zhang，J.；Guo，S.，Chem.Commun.2010，46，1112-1114.)制备部分还原氧化石墨烯。10mL 1mg/mL氧化石墨烯水溶液中加入20mg抗坏血酸，室温下分别放置2h，4h，12h。然后经过微孔滤膜过滤洗涤，再分散于超纯水中，经过透析得到浓度为1mg/mL的PCRGO。不同时间还原得到的样品分别命名为CRGO-2，CRGO4，CRGO-12。
将0.1mL，1mg/mL CRGO-12添加到含有0.1-0.5mg草酸氧化酶的0.9ml20mM丁二酸钠缓冲溶液(pH3.5)中混合，在4℃下旋转混合2h。将混合液在15000rpm下离心10min，并用缓冲液彻底洗涤3次，除去游离的以及吸附不牢固的OxOx分子，将沉淀分散在0.2ml20mM丁二酸钠缓冲溶液(pH3.5)中形成CRGO-12浓度为0.5mg/mL的分散液。
将玻碳电极(直径为3mm)在抛光布上依次采用1.0μm，0.3μn，0.05μm的Al2O3粉抛光至镜面。每次抛光后在超纯水中超声1min，再用超纯水、乙醇分别超声清洗5min，然后用大量超纯水洗涤，用氮气吹干。取6μL上述中的分散液滴涂在处理后的玻碳电极表面，通过抽真空干燥，即得到OxOx-PCRGO/GC电极。
将制备的不同还原程度的石墨烯修饰的玻碳电极在CHI660c电化学工作站上测定含1mM K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]探针的电解液中的循环伏安信号的大小。实验结果如图1，随着还原程度的增大，石墨烯修饰的电极电信号明显增大最终区域稳定。还原4小时的石墨烯电极电信号与还原12小时的基本一致，趋于稳定。因此，采用还原12小时的石墨烯制备电极。
采用差分伏安脉冲法，将所得OxOx-PCRGO/GC电极浸入20mM丁二酸钠(pH3.5)缓冲溶液中，连续添加不同量的草酸，测定差分伏安信号的大小。实验结果如图2，图3，电极检测分别在0.3V，0.1V，-0.5V出现三个特征峰，随着草酸浓度的增加，峰电流均增大。如图2所示，当OxOx的固载量为1mg/mg时，随着草酸量的增加，峰电流增加；当草酸浓度达到0.6mM时，继续增加草酸浓度，其峰变化不明显。当OxOx的固载量为5mg/mg时，如图3所示，随着草酸量的增加，峰电流增加，增加明显清晰，且可检测范围叫低固载量时宽，灵敏性更好。
Claims (5)
1.一种用于检测草酸浓度的电化学生物传感器，该电化学传感器为三电极体系传感器，其中对电极为铂电极，参比电极为饱和甘贡电极，其特征在于，工作电极为固载了草酸氧化酶的部分还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极。
2.一种如权利要求1所述的用于检测草酸浓度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，固载了草酸氧化酶的部分还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极采用以下方法制备：
1)制备部分还原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶材料；将部分还原氧化石墨烯添加到含有草酸氧化酶的丁二酸钠缓冲溶液中混合，得到固定化的草酸氧化酶的分散液；
2)制备固载了草酸氧化酶的部分还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极：将步骤1)得到的分散液，滴涂在玻碳电极表面，抽真空干燥，制得固载了草酸氧化酶的部分还原氧化石墨烯修饰的玻碳电极。
3.根据权利要求2所述的用于检测草酸浓度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，所述的步骤1)具体为：采用部分还原氧化石墨烯作为载体，将其添加到含草酸氧化酶的丁二酸钠缓冲溶液中，在4℃下旋转混合2h，通过疏水作用，草酸氧化酶吸附在部分还原氧化石墨烯表面，将所得混合液离心并用缓冲液彻底洗涤3次，除去游离的以及吸附不牢固的草酸氧化酶分子，将沉淀分散在丁二酸钠缓冲溶液即得部分还原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶材料；其中含草酸氧化酶的丁二酸钠缓冲溶液中草酸氧化酶的含量为(0.1～0.5)g/L，丁二酸钠缓冲溶液的浓度为20mM，pH值为3.5，部分还原氧化石墨烯与草酸氧化酶的质量比为1：(1～5)。
4.根据权利要求2所述的用于检测草酸浓度的电化学生物传感器的制备方法，其特征在于，步骤2)所述的玻碳电极在滴涂分散液前抛光至镜面，超声清洗后氮气吹干。
5.一种如权利要求1所述的用于检测草酸浓度的电化学生物传感器的应用，其特征在于，采用三电极体系，以甘汞电极为参比电极，铂电极为对电极，部分还原氧化石墨烯固定化草酸氧化酶修饰的电极为工作电极，利用差分伏安脉冲法检测草酸的浓度。
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| 《small》 20111031 Yan Zhang等 Assembly of Graphene Oxide-Enzyme Conjugates through Hydrophobic Interaction 第154-159页 1-5 第8卷, 第1期 * |
| YAN ZHANG等: "Assembly of Graphene Oxide–Enzyme Conjugates through Hydrophobic Interaction", 《SMALL》 * |
| YAN ZHANG等: "Glass carbon electrode modified with horseradish peroxidase immobilized on partially reduced graphene oxide for detecting phenolic compounds", 《JOURNAL OF ELECTROANALYTICAL CHEMISTRY》 * |
| 黄雪蕾: "草酸氧化酶的催化及固载研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN104237351A (zh) * | 2014-09-12 | 2014-12-24 | 西北师范大学 | 一种葡萄糖传感器的制备方法及其应用 |
| CN107843625A (zh) * | 2017-10-18 | 2018-03-27 | 肇庆市华师大光电产业研究院 | 一种pRGO‑ANSA/金属纳米粒复合电极材料、复合电极及其制备方法和应用 |
| CN116124853A (zh) * | 2022-11-07 | 2023-05-16 | 东北农业大学 | 一种电化学生物传感器、制备方法及应用 |
| CN116124853B (zh) * | 2022-11-07 | 2024-01-16 | 东北农业大学 | 一种检测草酸的电化学生物传感器、制备方法及应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102866191B (zh) | 2015-09-09 |
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