CN116124853A - 一种电化学生物传感器、制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种电化学生物传感器,包括:带电极捕捉界面的工作电极、参比电极、对电极和电解质溶液;带电极捕捉界面的工作电极为负载有壳聚糖‑多壁碳纳米管复合薄膜、草酸脱羧酶和电子媒介体,且通过戊二醛进行固定后的工作电极,还提出了电化学生物传感器的制备方法及应用。本发明的有益效果是:电化学生物传感器为草酸脱羧酶生物传感器(CNTs/1,1‘‑DmFc/β‑CD‑GA/5’utr Oxdc),通过对传感器核心元件酶进行改造,采用多壁碳纳米管和壳聚糖复合膜负载草酸脱羧酶和二甲基二茂铁作为捕捉界面,解决了草酸脱羧酶生物传感器的研制过程中,酶的负载基质影响传感电极界面的电子传输效率、酶的活性低且无法实现较大目标物检测等问题。
Description
技术领域
本发明属于草酸含量测定技术领域,尤其涉及一种用于草酸含量测定的电化学生物传感器及制备方法。
背景技术
近年来,在纸浆和造纸工业中,由于使用臭氧、二氧化氯、氧气和过氧化氢等强氧化剂进行漂白的过程中会形成高浓度的草酸盐,因此纸浆和造纸工业中对草酸的测量和控制的要求也越来越高;因为草酸很容易以草酸钙晶体的形式沉淀,这会导致管道、洗涤过滤器和热交换器发生堵塞;草酸以钙盐和镁盐的形式广泛分布在植物细胞和细胞壁中,人体摄入这些高草酸的植物食物后,会产生草酸钙沉淀,可能形成肾结石;因此,在原发性高草酸尿症的诊断治疗、尿结石的防治研究、高草酸尿症患者的低草酸盐食品加工和啤酒生产等方面,尤其是临床诊断中,草酸的测定具有重要意义;
目前,有大量不同的草酸盐测定方法可供使用,例如高效液相色谱法、基于草酸氧化酶的分光光度法或草酸脱羧酶和化学发光检测法;最常用的草酸含量测定方法为比色法,但比色法需要对样品进行分离,且显色前后需要加热分离后的样品数十分钟,步骤多,费时间;现有的草酸盐测定方法具备高灵敏度和特异性,但也有设备和分析成本高、消耗时间长和操作繁琐等缺点。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术中的不足,提供一种电化学生物传感器、制备方法及应用。
这种电化学生物传感器,为草酸脱羧酶生物传感器,包括:带电极捕捉界面的工作电极、参比电极、对电极和电解质溶液;带电极捕捉界面的工作电极为负载有壳聚糖-多壁碳纳米管复合薄膜、草酸脱羧酶和电子媒介体,且通过戊二醛进行固定后的工作电极;草酸脱羧酶从菌株Bacillus mojavensis XH1中提取得到,为以5’utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc。
作为优选,参比电极为饱和Ag/AgCl电极,对电极为铂电极,电解质溶液为PBS缓冲溶液;工作电极为玻碳电极。
作为优选,电子媒介体为1’1二甲基二茂铁。
这种电化学生物传感器的制备方法,具体包括如下步骤:
步骤1、对工作电极进行预处理,采用壳聚糖粉、多壁碳纳米管、以5’utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc和1’1二甲基二茂铁制备工作电极的电极捕捉界面;
步骤2、将环状糊精加入到戊二醛溶液中,静置一段时间,待环状糊精与戊二醛充分发生羟醛缩合反应后,取上层清液得到β-CD-GA 溶液;
步骤3、向经步骤1制备得到电极捕捉界面的工作电极表面滴加β-CD-GA 溶液,待溶液干燥后,得到固定后带电极捕捉界面的工作电极;采用Ag/AgCl电极作为参比电极,采用铂电极作为对电极,采用PBS缓冲溶液作为电解质溶液,与固定后的带电极捕捉界面的工作电极共同组成草酸脱羧酶生物传感器。
作为优选,步骤1具体包括以下步骤:
步骤1.1、对工作电极进行预处理;
步骤1.2、将壳聚糖粉溶解于醋酸钠溶液中,制得壳聚糖溶液;将多壁碳纳米管加入到乙醇溶液中,超声分散直至分散均匀,得到多壁碳纳米管溶液;将壳聚糖溶液和多壁碳纳米管溶液按体积比混合形成悬浮液,制备得到壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液;
步骤1.3、从菌株Bacillus mojavensis XH1中提取得到草酸脱羧酶;用pET28质粒做载体,在BL21中对草酸脱羧酶进行原核异源表达,得到菌株BL21/pET28-oxdc(大肠埃希氏菌(Escherichia coli),2022年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号为:25643),然后从菌株BL21/pET28-oxdc的5’utr序列出发,使用人工合成的5’utr序列来调控蛋白的翻译起始速率得到以5’utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc;
步骤1.4、将以5’utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc掺杂到壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液中,将掺杂有草酸脱羧酶的壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液滴加到工作电极表面,静置至溶液干燥;
步骤1.5、称取1’1二甲基二茂铁加入乙醇溶液中,超声直到1,1'二甲基二茂铁完全溶解于乙醇中,得到1,1'-DmFc溶液;将1,1'-DmFc溶液滴加到经步骤1.2处理后的工作电极表面,待溶液干燥后,得到工作电极的电极捕捉界面。
这种电化学生物传感器的应用方法,将草酸脱羧酶生物传感器用于检测草酸:将草酸脱羧酶生物传感器浸入不同浓度的草酸样品液中,通过GAMRY Reference 600+电化学工作站,在含有PBS缓冲溶液的电解质溶液中记录和检测电化学生物传感器中的电化学信号变化,根据草酸溶液浓度与电化学信号的对应关系得到草酸的检测结果。
作为优选,电化学信号为微分脉冲伏安法DPV峰值电流,草酸溶液浓度与微分脉冲伏安法DPV峰值电流的对应关系为线性关系曲线:
y=0.03x+0.0283
上式中,y为不同浓度草酸对应的微分脉冲伏安法DPV峰值电流,单位为A;x为草酸的浓度,单位为mmol/l。
作为优选,草酸溶液浓度的范围为0~5mM,每次检测电化学生物传感器中的电化学信号变化的时间为0.5~5秒。
本发明的有益效果是:
本发明的电化学生物传感器为草酸脱羧酶生物传感器(CNTs/1,1‘-DmFc/β-CD-GA/5’utr Oxdc),通过对传感器核心元件酶进行改造,采用多壁碳纳米管和壳聚糖复合膜负载草酸脱羧酶和二甲基二茂铁作为捕捉界面,解决了草酸脱羧酶生物传感器的研制过程中,酶的负载基质影响传感电极界面的电子传输效率、酶的活性低且无法实现较大目标物检测等问题;实现酶高活性、高负载的同时,提高电极界面的电子传输效率;
本发明的电化学生物传感器应用于草酸检测时,检测范围为0~5mM,每次测定的总分析时间为0.5~5秒,进一步推动电化学生物传感器对于草酸的临床检测研究和应用;本发明结合了生物传感和电化学分析技术的分析模式,通过酶促反应实现目标物电化学检测,酶具有专一性、高效性、高灵敏度和反应条件温和等优点;解决了现有的电化学生物传感器对于草酸检测灵敏度较低、检测限较高和难以满足临床要求的问题,实现了草酸的高灵敏性、高选择性、高特异性检测,对于原发性高草酸尿症患者的早期诊断和预后评估提供了一条新途径;与其他检测方法相比,本发明的草酸脱羧酶生物传感器检测草酸,具有操作简单、检测及时(耗时短)、成本低廉、灵敏度高、选择性好和样品不需要分离等优点。
附图说明
图1为本发明的电化学生物传感器制备流程及图例;
图2为电化学生物传感器5’utr Oxdc和Oxdc的循环伏安图;
图3为电化学生物传感器不同浓度草酸对应的DPV电信号曲线图;
图4为电化学生物传感器不同浓度草酸对应的草酸检测值的线性曲线图。
菌株BL21/pET28-oxdc:
分类命名:大肠埃希氏菌 Escherichia coli;
保藏日期:2022年9月2日;
保藏编号:25643;
保藏单位全称:中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心;
保藏单位简称:CGMCC;
保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步描述。下述实施例的说明只是用于帮助理解本发明。应当指出,对于本技术领域的普通人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以对本发明进行若干修饰,这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。
实施例1
如图1所示,本发明的电化学生物传感器,为草酸脱羧酶生物传感器(CNTs/1,1‘-DmFc/β-CD-GA/5’utr Oxdc),包括带电极捕捉界面的工作电极、参比电极、对电极和电解质溶液;带电极捕捉界面的工作电极为负载有壳聚糖-多壁碳纳米管复合薄膜、草酸脱羧酶和电子媒介体,且通过戊二醛进行固定后的工作电极;参比电极为饱和Ag/AgCl电极,对电极为铂电极,电解质溶液为PBS缓冲溶液;
草酸脱羧酶从菌株Bacillus mojavensis XH1中提取得到,为以5’utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc;菌株Bacillus mojavensis XH1的详情见侯宁等人的论文《A novel biodemulsifier of Bacillus mojavensis XH1–Oxalate decarboxylasewith the potential for demulsification of oilfield emulsion》;
工作电极为玻碳电极;
电子媒介体指将酶反应过程中产生的电子从酶反应中心转移到电极表面,使电极产生相应电流变化的分子导电体;电子媒介体为1’1二甲基二茂铁。
实施例2
在实施例1的基础上,电化学生物传感器(草酸脱羧酶生物传感器)的制备方法,具体包括如下步骤:
步骤1、采用壳聚糖粉、多壁碳纳米管、以5’utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc和1’1二甲基二茂铁制备工作电极的电极捕捉界面;
步骤1.1、对工作电极进行预处理;
步骤1.2、在室温下将10mg壳聚糖粉溶解于20mL醋酸钠溶液(0.05M,pH 5.0)中,制得0.5mg/ml壳聚糖溶液;将50mg多壁碳纳米管(CNTs)加入到10mL乙醇溶液中,超声分散几个小时直至分散均匀,得到0.5%的多壁碳纳米管(CNTs)溶液;将0.5mg/ml的壳聚糖溶液和5mg/ml的多壁碳纳米管溶液按体积比1:1混合形成悬浮液,制备得到壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液;
步骤1.3、对电化学生物传感器的核心元件酶进行改造:发明人在前期研究中从菌株Bacillus mojavensis XH1中发现并提取得到草酸脱羧酶(Oxdc);草酸脱羧酶在表达过程中,其表达原件直接影响着蛋白的产量,通过5’utr策略可以提高酶的产量和表达量;所以在本电化学生物传感器中所用的酶,用pET28质粒做载体,在BL21中对草酸脱羧酶(Oxdc)进行原核异源表达,得到菌株BL21/pET28-oxdc(大肠埃希氏菌(Escherichia coli),2022年9月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,保藏编号为:25643),然后从菌株BL21/pET28-oxdc的5’utr序列出发,使用人工合成的5’utr序列来调控蛋白的翻译起始速率,以提高蛋白的表达量以提高酶活,得到以5’utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc;详情见侯宁等论文《A novel biodemulsifier of Bacillusmojavensis XH1 – Oxalate decarboxylase with the potential for demulsificationof oilfield emulsion》;
以5’utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc的提取:将菌株BL/pET28-oxdc接种于100 ml含有100 µg/ml卡那霉素的LB培养基中,37℃恒温摇床中培养4 h后加入50 µl诱导剂IPTG诱导,37℃培养18h。将菌液以8000r/min离心15min,弃上清后使用8ml 10% PBS缓冲溶液冲洗沉淀并震荡混匀至悬液,设定细胞破碎机为超声3s,间歇2s,功率270 W冰浴条件下超声破碎30min,破碎液以12000r/min离心15min,将沉淀和上清混合均匀得到细胞破碎液将菌株细胞破碎液与蛋白染料混合,使用NGC Quest 100plus蛋白纯化仪经镍柱亲和层析进行蛋白纯化,首先使用去离子水冲洗掉系统中的乙醇,使用10倍柱子体积的Buffer A平衡镍柱,随后将1ml预处理后的酶液打入上样口,使用10倍柱子体积的Buffer A冲洗至峰值平缓,确保蛋白吸附于镍柱,最后使用20倍柱子体积的Buffer B将蛋白洗脱,当出现洗脱峰时以每管1.8ml收集至2ml的离心管中得到以5’utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc;
步骤1.4、将以5’utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc掺杂到壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液中,将掺杂有草酸脱羧酶的壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液滴加到工作电极表面,静置至溶液干燥;
步骤1.5、称取50mg 1’1二甲基二茂铁(1,1'-DmFc)加入5mL乙醇溶液中,超声几个小时直到1,1'二甲基二茂铁完全溶解于乙醇中,得到1%的1,1'-DmFc溶液;将5μL 1,1'-DmFc溶液滴加到经步骤1.2处理后的工作电极表面,待溶液干燥后,得到工作电极的电极捕捉界面;
步骤2、将0.7g环状糊精(β-CD,微过量)加入到10mL 8.5%的戊二醛(GA)溶液中,静置一段时间,待环状糊精(β-CD)与戊二醛(GA)充分发生羟醛缩合反应后,取上层清液即可得到β-CD-GA 溶液;
步骤3、向经步骤1制备得到电极捕捉界面的工作电极(玻碳电极)表面滴加5μL β-CD-GA 溶液,待溶液干燥后,得到固定后带电极捕捉界面的工作电极CNTs/1,1‘-DmFc/β-CD-GA/Oxdc;采用Ag/AgCl电极作为参比电极,采用铂电极作为对电极,采用PBS缓冲溶液作为电解质溶液,与固定后的带电极捕捉界面的工作电极共同组成草酸脱羧酶生物传感器(CNTs/1,1‘-DmFc/β-CD-GA/5’utr Oxdc)。
实施例3
在实施例1和实施例2的基础上,将实施例2制备的电化学生物传感器(草酸脱羧酶生物传感器,CNTs/1,1‘-DmFc/β-CD-GA/5’utr Oxdc)用于检测草酸:将采用实施例2方法制备的电化学生物传感器浸入不同浓度的草酸样品液中,基于5’utr Oxdc反应,通过GAMRYReference 600+电化学工作站,在含有PBS缓冲溶液的电解质溶液中记录和检测电化学生物传感器中的电化学信号变化,根据草酸溶液浓度与电化学信号的对应关系实现对草酸的检测。
反应方程式为:;
实验过程中每隔1秒测量一个浓度,根据相同草酸浓度下不同识别元件酶的电化学信号绘制得到如图2所示循环伏安图,如图2电化学生物传感器5’utr Oxdc和Oxdc的循环伏安图所示,滴加了5’utr Oxdc的工作电极的氧化峰较滴加Oxdc的工作电极的氧化峰大了很多,滴加了5’utr Oxdc的工作电极的氧化峰的增大是由于5’utr Oxdc 对草酸的催化反应强,对草酸具有良好的催化氧化性能,所以本发明选用酶为5’utr Oxdc;
根据如图3所示根据草酸溶液浓度与电化学信号(DPV峰值电流)的对应关系,对草酸进行检测;如图4所示,草酸溶液的浓度与微分脉冲伏安法DPV峰值电流y的线性关系曲线为:
y=0.03x+0.028
上式中,y为不同浓度草酸对应的微分脉冲伏安法DPV峰值电流,单位为A;x为草酸的浓度,单位为mmol/l。
序列表
<110> 东北农业大学
<120> 一种电化学生物传感器、制备方法及应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1158
<212> PRT
<213> 以5‘utr序列改造进行原核异源表达的草酸脱羧酶(Escherichia coli)
ATGAAAAAAC AAAACGACAT TCCACAGCCA ATCAGAGGAG ATAAGGGAGC GACAGTGAAA 60
ATCCCGCGTA ATATTGAAAG GGACCGGCAG AATCCCGATA TGCTCGTACC GCCGGAAACC 120
GATCATGGCA CCGTTGAAAA TATGAAGTTT TCTTTCTCAG ATACTCATAA CCGTTTGGAA 180
AAAGGCGGGT ACGCCCGTGA AGTTACCGTA CGTGAGCTGC CGATTTCAGA AAACCTGGCT 240
TCTGTTAATA TGCGGCTGAA GCCAGGCGCC ATTCGAGAGC TTCATTGGCA TAAGGAAGCA 300
GAGTGGGCTT ATATGATCTA CGGGAAAGCA CGCGTCACGA TTGTGGATGA AAAGGGCCGC 360
AGCTTTATTG ATGATGTAGG CGAAGGAGAT TTATGGTACT TCCCGTCAGG CCTGCCGCAC 420
TCGATTCAAG CGCTTGAAGA AGGGGCAGAG TTCCTGCTCG TGTTTGACGA CGGGTCATTC 480
TCTGAAAACA GCACGTTCCA GCTGACAGAC TGGCTTGCCC ACACCCCTAA AGAAGTGATT 540
GCCGCTAATT TTGGCGTAAC AGAAGAAGAA ATTGCCAATT TGCCAGGCAA AGAAAAATAT 600
ATATTTGAAA AACCTGTGCC CGGCTGTTTA AAAGATGACA TTGTGGAAGG GCCGTACGGC 660
GAAGTGCCTT ATCCGTTTAC GTACCGCCTT CTTGAACAGG AGCCGATTGC ATCAGAAGGG 720
GGAAAGGTGT ACATTGCGGA TTCGACAAAC TTTACAGTGT CTAAAACCAT TGCATCTGCG 780
CTTGTAACCG TGGAACCAGG CGCCATGAGA GAGCTTCACT GGCATCCGAA TACGCATGAA 840
TGGCAATATT ACATCTCCGG TAAAGCGAGA ATGACTGTTT TTGCTGCTGA CGGCCATGCG 900
AGAACCTTTA ACTATCAAGC CGGTGATGTC GGTTATGTTC CATTTGCGAT GGGCCACTAC 960
GTAGAAAACC TCGGCGATGA ACCGCTCGTC TTTTTAGAAA TCTTTAAAGA TGACCATTAT 1020
GCCGATGTGT CTTTAAACCA ATGGCTCGCA ATGCTTCCTG AAACCTTCGT CCAAGAACAC 1080
CTTGACTTAG GCAAAGAATT TACGGATGTC CTTTCAAAAG AAAAGCATCC GGTTGTGAAA 1140
AAGAAAAGCA GTAAATAA 1158。
Claims (8)
1.一种电化学生物传感器,其特征在于,为草酸脱羧酶生物传感器,包括:带电极捕捉界面的工作电极、参比电极、对电极和电解质溶液;带电极捕捉界面的工作电极为负载有壳聚糖-多壁碳纳米管复合薄膜、草酸脱羧酶和电子媒介体,且通过戊二醛进行固定后的工作电极;草酸脱羧酶从菌株Bacillus mojavensis XH1中提取得到,为以5’utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc。
2.根据权利要求1所述电化学生物传感器,其特征在于:参比电极为饱和Ag/AgCl电极,对电极为铂电极,电解质溶液为PBS缓冲溶液;工作电极为玻碳电极。
3.根据权利要求2所述电化学生物传感器,其特征在于:电子媒介体为1’1二甲基二茂铁。
4.一种如权利要求3所述电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,具体包括如下步骤:
步骤1、对工作电极进行预处理,采用壳聚糖粉、多壁碳纳米管、以5’utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc和1’1二甲基二茂铁制备工作电极的电极捕捉界面;
步骤2、将环状糊精加入到戊二醛溶液中,静置一段时间,待环状糊精与戊二醛充分发生羟醛缩合反应后,取上层清液得到β-CD-GA 溶液;
步骤3、向经步骤1制备得到电极捕捉界面的工作电极表面滴加β-CD-GA 溶液,待溶液干燥后,得到固定后带电极捕捉界面的工作电极;采用Ag/AgCl电极作为参比电极,采用铂电极作为对电极,采用PBS缓冲溶液作为电解质溶液,与固定后的带电极捕捉界面的工作电极共同组成草酸脱羧酶生物传感器。
5.根据权利要求4所述电化学生物传感器的制备方法,其特征在于,步骤1具体包括以下步骤:
步骤1.1、对工作电极进行预处理;
步骤1.2、将壳聚糖粉溶解于醋酸钠溶液中,制得壳聚糖溶液;将多壁碳纳米管加入到乙醇溶液中,超声分散直至分散均匀,得到多壁碳纳米管溶液;将壳聚糖溶液和多壁碳纳米管溶液按体积比混合形成悬浮液,制备得到壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液;
步骤1.3、从菌株Bacillus mojavensis XH1中提取得到草酸脱羧酶;用pET28质粒做载体,在BL21中对草酸脱羧酶进行原核异源表达,得到菌株BL21/pET28-oxdc,然后从菌株BL21/pET28-oxdc的5’utr序列出发,使用人工合成的5’utr序列来调控蛋白的翻译起始速率得到以5’utr序列进行原核异源表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc;
步骤1.4、将以5’utr序列进行原核表达的草酸脱羧酶5’utr oxdc掺杂到壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液中,将掺杂有草酸脱羧酶的壳聚糖-多壁碳纳米管混合溶液滴加到工作电极表面,静置至溶液干燥;
步骤1.5、称取1’1二甲基二茂铁加入乙醇溶液中,超声直到1,1'二甲基二茂铁完全溶解于乙醇中,得到1,1'-DmFc溶液;将1,1'-DmFc溶液滴加到经步骤1.2处理后的工作电极表面,待溶液干燥后,得到工作电极的电极捕捉界面。
6.一种如权利要求1所述的电化学生物传感器的应用方法,其特征在于,将草酸脱羧酶生物传感器用于检测草酸:将草酸脱羧酶生物传感器浸入不同浓度的草酸样品液中,通过GAMRY Reference 600+电化学工作站,在含有PBS缓冲溶液的电解质溶液中记录和检测电化学生物传感器中的电化学信号变化,根据草酸溶液浓度与电化学信号的对应关系得到草酸的检测结果。
7.根据权利要求6所述的电化学生物传感器的应用方法,其特征在于:电化学信号为微分脉冲伏安法DPV峰值电流,草酸溶液浓度与微分脉冲伏安法DPV峰值电流的对应关系为线性关系曲线:
y=0.03x+0.0283
上式中,y为不同浓度草酸对应的微分脉冲伏安法DPV峰值电流,单位为A;x为草酸的浓度,单位为mmol/l。
8.根据权利要求6所述的电化学生物传感器的应用方法,其特征在于:草酸溶液浓度的范围为0~5mM,每次检测电化学生物传感器中的电化学信号变化的时间为0.5~5秒。
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