CN102838664A - 一种γ-氨基丁酸转运蛋白及其编码基因与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种γ-氨基丁酸转运蛋白及其编码基因与应用。本发明提供了一种蛋白，名称为GabP，其编码基因为GabP，是如下（a）或（b）：（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与转运γ-氨基丁酸相关的由序列2衍生的蛋白质。本发明的实验证明，本发明发现了一个新基因，该基因编码的蛋白可以用来转运γ-氨基丁酸。

Description

一种γ-氨基丁酸转运蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种γ-氨基丁酸转运蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

γ-氨基丁酸是一种非蛋白质氨基酸，是中枢神经系统的神经递质，具有重要的生理活性。γ-氨基丁酸可以降低神经元活性、降血压、抗焦虑、改善睡眠、调节激素分泌。γ-氨基丁酸作为一种新型功能性因子，已经广泛应用于食品、医疗等领域。

已经报道在有些细菌中存在γ-氨基丁酸转运蛋白。例如在大肠杆菌中γ-氨基丁酸转运蛋白基因位于与γ-氨基丁酸代谢相关的基因簇中。而在枯草芽孢杆菌中γ-氨基丁酸转运蛋白基因与γ-氨基丁酸代谢相关的基因并不相邻。大肠杆菌的γ-氨基丁酸转运蛋白与枯草芽孢杆菌的γ-氨基丁酸转运蛋白属于氨基酸－多聚胺－有机金属离子（aminoacid-polyamine-organocation）超家族（APC Superfamily）。在棒杆菌属细菌中还没有报道有γ-氨基丁酸转运蛋白存在。

转运系统在细胞代谢过程中起关键作用，营养物质的摄取，代谢物的分泌，能量和信息的交换都与转运系统密切相关。氨基酸转运系统普遍存在于真核和原核细胞。细胞可以利用氨基酸内运系统从环境中摄入可利用的氨基酸，而直接用于蛋白质或肽的合成，或通过分解代谢为细胞提供碳源、氮源或能源。氨基酸外运系统在产物分泌过程中起重要作用。

氨基酸转运系统除了其生理上的重要性以外，在氨基酸生产方面也是十分重要的。多种氨基酸都可以通过微生物发酵法生产。氨基酸外运系统在产物分泌中起重要作用，而氨基酸内运系统会使已分泌的产物重新被细胞摄入，造成代谢能量的浪费，对细胞内代谢途径上的关键酶产生抑制，阻碍产物的进一步合成，并使氨基酸生产速率降低。

迄今为止，已报道了在氨基酸发酵工业中，为提高氨基酸产量，使用与氨基酸转运有关的基因，例如发生突变的大肠杆菌苏氨酸转运系统提高苏氨酸产量以及发生突变的棒杆菌色氨酸转运系统可以提高色氨酸产量。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种γ-氨基丁酸转运蛋白及其编码基因。

本发明提供的蛋白，转运蛋白名称为GabP，其编码基因命名为GabP，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与转运γ-氨基丁酸相关的由序列2衍生的蛋白质。

其中，序列表中的序列2由415个氨基酸残基组成。

上述蛋白中，所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加是指不多于十个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

编码上述蛋白的基因也是本发明保护的范围。

上述基因是如下(1）或(2）或(3）的DNA分子：

(1）序列表中序列1所示的DNA分子；

(2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码转运γ-氨基丁酸相关蛋白的DNA分子；

(3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码转运γ-氨基丁酸相关蛋白的DNA分子。

其编码基因的读码框序列1由1248个核苷酸组成。

上述基因中的严格条件具体可以为：在6×SSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交,然后用2×SSC,0.1%SDS和1×SSC,0.1%SDS各洗膜一次。

含有上述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

在本发明的实施例中，上述重组载体为将上述蛋白的编码基因插入pXMJ19载体的XbaI和EcoRI酶切位点间，得到表达上述蛋白的重组载体。

扩增上述基因全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

上述蛋白、上述基因或上述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在转运γ-氨基丁酸中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第二个目的是提供一种重组菌A。

本发明提供的重组菌A，为抑制目的菌中上述蛋白的表达或活性得到的重组菌。

上述重组菌A中的目的菌为原核细菌，所述原核细菌具体为谷氨酸棒杆菌；在本发明的实施例中具体为谷氨酸棒杆菌RES167。

上述抑制目的菌中上述蛋白的表达或活性为沉默或缺失目的菌中上述蛋白的编码基因导致抑制上述蛋白的表达或活性。

上述重组菌A中，所述抑制目的菌中上述蛋白的表达或活性通过同源重组实现。

上述的同源重组的方法具体为将DNA分子导入目的菌；所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列3。

在上述同源重组的方法中，将DNA分子导入目的菌为通过重组载体A导入目的菌；所述重组载体A为将所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位点间得到的载体，具体为将上述DNA分子插入pK18mobsacB的SphI和SmaI酶切位点间得到的载体。

本发明的第三个目的是提供一种重组菌B。

本发明提供的重组菌B，为将谷氨酸脱羧酶编码基因导入上述的重组菌A中得到的重组菌；其中，所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列具体为序列表中的序列5；所述谷氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。

上述重组菌B中，所述谷氨酸脱羧酶编码基因通过重组载体B导入上述的重组菌A中；所述重组载体B具体为将所述谷氨酸脱羧酶编码基因插入表达载体pXMJ19中，得到表达谷氨酸脱羧酶的载体；在本发明的实施例中重组载体B为将序列表中序列4插入pXMJ19的HindIII和XbaI酶切位点间得到的载体。

上述的重组菌B在制备γ-氨基丁酸中的应用也是本发明保护的范围。

本发明的第四个目的是提供一种制备γ-氨基丁酸的方法。

本发明提供了一种制备γ-氨基丁酸的方法，为将上述的重组菌B在含有L-谷氨酸的培养基进行转化反应，收集上清液，得到γ-氨基丁酸。

上述收集上清液采用离心方式。

上述转化反应的条件为30℃反应1小时。

上述含有L-谷氨酸的培养基为含有L-谷氨酸的MMII培养基；

在上述方法中，在转化反应前，还包括将重组菌B接入LB培养基中培养的步骤。

本发明的第五个目的是提供一种DNA分子、含有所述DNA分子的重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌或重组载体B。

本发明提供的DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列3。

本发明提供的重组载体A具体为将所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位点间得到的载体；具体为将上述DNA分子插入pK18mobsacB的SphI和SmaI酶切位点间得到的载体。

本发明提供的重组载体B，为将谷氨酸脱羧酶编码基因插入表达载体pXMJ19中，得到表达谷氨酸脱羧酶的载体，具体为将序列表中序列4插入pXMJ19的HindIII和XbaI酶切位点间得到的载体；所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列具体为序列表中的序列5；所述谷氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸酸序列具体为序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。

本发明的实验证明，本发明在谷氨酸棒杆菌RES167（C.glutamicum）中发现了一个新基因，其编码的蛋白具有转运γ-氨基丁酸的功能，将该基因缺失部分片段，则表达的蛋白不具有转运γ-氨基丁酸的功能，说明该基因的确和转运γ-氨基丁酸有关，该蛋白为转运γ-氨基丁酸的蛋白。将谷氨酸棒杆菌RES167中的该蛋白编码基因缺失后，再导入谷氨酸脱羧酶，得到重组菌，利用该重组菌可以生产γ-氨基丁酸。

附图说明

图1为C.glutamicum中GabP的蛋白结构特征

图2为RES167ΔGabPγ-氨基丁酸基因的凝胶电泳图

图3为HPLC测定结果

图4为¹⁴C标记γ-氨基丁酸测定结果

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、GabP基因的克隆

设计引物（464F和464R），以谷氨酸棒杆菌RES167（C.glutamicum，Liebl Wet al.，FEMS Microbiology Letters，65(3):299-304，1989，公众可从中国科学院微生物所获得。该菌株为定向敲除了cglIM、cglIR和cglIIR基因的谷氨酸棒杆菌ATCC13032得到）的基因组为模板，进行PCR扩增。

上游引物464F：

5’-GCCTCTAGAAAGGAGGACAACCATGACTACCGAATCAATAG-3'

下游引物464R：

5’-CGCGAATTCAAGTGACTATGCCCAACC-3'

得到1285bpPCR产物，连接到克隆载体pMD19-T simple（宝生物工程（大连）有限公司，TAKARA Code：D104），转化大肠杆菌，挑取单菌落，提取质粒送去测序，质粒中含有的PCR产物具有序列表中序列1所示的核苷酸，该PCR产物的基因命名为GabP，该基因的核苷酸序列为序列表中的序列1；该基因编码的蛋白命名为GabP，该蛋白的氨基酸序列为序列表中的序列2；该质粒为将包含序列表中的序列1的PCR产物插入pMD19-T simple中得到的载体，命名为T-GabP，将含有该载体的菌命名为DH5α/T-GabP。

序列表中序列1自5’端的第1到第1248位碱基，长度为1248bp，该基因ORF片段的读码框编码415个氨基酸（序列2）。

用TMHMM服务器（http://genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）对该蛋白质序列进行了跨膜区分析，结果如图1所示，显示该蛋白存在11个跨膜区，分别位于27-49位，59-81位，100-122位，129-151位，163-185位，193-215位，239-261位，277-299位，319-341位，346-367位，386-408位氨基酸残基处，具有典型的转运蛋白特征。

实施例2、GabP基因的应用

1、基因敲除菌株RES167ΔGabP的构建

设计引物（464Fk和464Rk）：

上游引物464Fk：

5’-ATAGCATGCTCGCAGCACTAGTGGATGA-3'

下游引物464Rk：

5’-CTACCCGGGATGATGCCATCAAATGA-3'

以谷氨酸棒杆菌RES167的基因组DNA为模板，464Fk和464Rk为引物，进行PCR扩增，得到1961bp的带有GabP的DNA大片段（含有GabP基因完整的核苷酸序列和该基因上游和下游的各一部分序列），将其连接到克隆载体pMD19-T simple，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑取单菌落，进行菌落PCR检测（引物为464Fk和464Rk），得到1961bp的为阳性克隆，将其命名为DH5α/T-GabPk，将该质粒命名为T-GabPk。

从DH5α/T-GabPk中提取质粒T-GabPk，用内切酶HincII酶切，回收大片段，自连，得到质粒T-ΔGabP，将其转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到转化子DH5α/T-ΔGab。

提取转化子DH5α/T-ΔGab的质粒T-ΔGabP，送去测序，结果该质粒上携带序列表中的序列3所示的DNA分子，共1625bp，命名为ΔGabP DNA片段，该片段为将GabP基因中第340bp到675bp的核苷酸去除（即序列表中序列1的自5’末端的第340到675位去除）。

也可人工合成序列3，与pMD19-T连接，也可得到质粒T-ΔGabP。

将上述质粒T-ΔGabP用SphI/SmaI双酶切后回收1806kb片段，与经由同样酶切的pK18mobsacB（SchaferA et al.,Gene，145(1):69-73，1994，公众可从中国科学院微生物研究所获得。）的大片段连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到转化子，提取转化子的质粒，该质粒为将序列表中的序列3的DNA片段插入pK18mobsacB的SphI/SmaI酶切位点间得到的载体，命名为pGXKZ8质粒，将含有该质粒的转化子命名为DH5α/pGXKZ8。

将质粒pGXKZ8电击转化谷氨酸棒杆菌RES167中，转化液涂布于含20μg/mL卡那霉素的LB平板，质粒pGXKZ8与谷氨酸棒杆菌RES167的染色体同源重组，得到重组子（具有卡那霉素抗性的转化子）。然后将具有卡那霉素抗性的转化子涂布在含有10%蔗糖的LB平板上，进行二次筛选。将得到的重组子分别点种到LB平板和含50μg/mL卡那霉素的LB平板上。

挑选不具有卡那霉素抗性的转化子，以464F和464R为引物进行菌落PCR鉴定，结果如图2所示，M泳道为Marker；泳道1为出发菌株RES167的PCR产物，约为1.3kb；泳道2和3为转化子的PCR产物，得到PCR产物约为0.9kb的转化子为基因敲除菌株RES167ΔGabP，

进一步以PCR产物约为0.9kb的转化子基因组DNA为模板，464Fk和464Rk为引物进行扩增，得到的1.6kb PCR产物进行测序，结果为序列3，进一步证明了泳道2和3得到的转化子即为基因敲除菌株RES167ΔGabP。

2、表达载体pGXKZ7的构建

将由实施例1得到的质粒T-GabP，用XbaI/EcoRI双酶切后回收1.25kb片段，与经由同样酶切的pXMJ19（Jakoby M et al.,Biotechnology Techniques，13(6):437-441，1999，公众可从中国科学院微生物研究所获得。）的大片段连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到转化子，提取转化子的质粒，将该质粒送去测序，该质粒为将序列表中的序列1插入pXMJ19的XbaI/EcoRI酶切位点间，将该质粒命名为pGXKZ7，将含有该质粒的转化子命名为DH5α/pGXKZ7。

将pGXKZ7质粒电击转化谷氨酸棒杆菌基因敲除菌株RES167ΔGabP的感受态细胞，得到重组菌，提取重组菌的质粒，送去测序，该质粒为pGXKZ7，将含有该质粒的重组菌命名为RES167ΔGabP/pGXKZ7。

3、HPLC法测定转运活力

分别在LB培养基中培养RES167ΔGabP、RES167ΔGabP/pGXZ7、RES167细胞，当细胞生长到指数期收集细胞，用含有0.1M葡萄糖和补加0.2mg l^-1硫胺素的无其它氮源基础培养基MMI（Na₂HPO₄·12H₂O，2.0g；KH₂PO₄，0.5g；MgSO₄·7H₂O，0.03g；微量元素溶液2mL；生物素，50μg；硫胺素，50μg；调pH至7.5。微量元素溶液组成为：EDTA，0.500g；ZnSO₄·7H₂O，0.220g；CaC1₂，0.055g；MnCl₂·4H₂O，0.051g；FeSO₄·7H₂O，0.0499g；(NH₄)₆MO₇O₂₄·4H₂O，0.011g；CuSO₄·5H₂O,0.0157g；CoCl₂·6H₂O，0.0161g；H₂O，1000m1；pH6.0。Konopka et al，1993）洗2次。收集的细胞悬浮在含有1mMγ-氨基丁酸的MMI培养基中（OD₆₀₀～3）。

30℃温育，不同时间取样，样品立即用0.45μm的一次性过滤器过滤，HPLC[Agilent1200型HPLC仪，Agilent Zorbax Eclipse-AAA色谱柱，4.6x75mm,3.5μm，OPA法自动柱前衍生。流动相A：40mM磷酸二氢钠pH 7.8，B：乙腈：甲醇：水45：45：10(v/v/v)，流速：2mL/min]分析滤液中残余γ-氨基丁酸的浓度。

结果如图3所示，RES167(■)、RES167ΔGabP(△)和RES167ΔGabP/pGXZ7(▲)，可以看出，

RES167(■)滤液在0min、60min、120min、180min、240min时残余γ-氨基丁酸的浓度百分比分别为100％、83％、39％、0％、0%；

RES167ΔGabP (△)滤液在0min、60min、120min、180min、240min时残余γ-氨基丁酸的浓度分别为100％、97％、97％、101％、104%；

RES167ΔGabP/pGXZ7(▲)滤液在0min、60min、120min、180min、240min时残余γ-氨基丁酸的浓度分别为100％、53％、28％、、0％、0%；

上述结果表明，温育出发菌株RES167的滤液中的γ-氨基丁酸含量迅速降低，温育GabP部分基因缺失菌株RES167ΔGabP的滤液中的γ-氨基丁酸含量没有明显变化，而温育互补菌株RES167ΔGabP/pGXZ7的滤液中的γ-氨基丁酸含量也迅速降低；说明GabP具有转运γ-氨基丁酸的能力，转运到胞内。

4、¹⁴C同位素标记法测定转运活力

RES167ΔGabP、RES167ΔGabP/pGXZ7、RES167细胞的培养和收集与上述3相同。收集后的细胞用0.1M Tris磷酸缓冲液（pH6.5）洗2次，然后重悬于同一缓冲液中。反应体系（1mL）：100μmol Tris磷酸缓冲液(pH 6.5)，1μmol MgSO₄·7H₂O，10μmol葡萄糖，100μg氯霉素，and 0.1mL细胞悬液（相当于0.2mg细胞干重）。

当反应体系中加入γ-[4-¹⁴C]-氨基丁酸(美国放射性化学试剂公司，产品号：ARC0693A)，反应开始。

不同时间从反应体系中取出50μl反应液，真空抽滤，通过孔径0.45μm的滤膜，随即用预冷的2mL 0.1M LiCl水溶液快速的洗两次。然后将带有细胞的滤膜放置到带有约1.8mL闪烁液的2.0mL离心管中。通过PerkinElmer MicroBeta液体闪烁计数器测定细胞的放射性。细胞的吸收活力为单位时间每毫克细胞干重吸收氨基酸的纳摩尔数。

结果如图4所示，RES167(■)、RES167ΔGabP(△)和RES167ΔGabP/pGXKZ7(▲)；

RES167(■)在0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s时γ-氨基丁酸的单位转运量（吸收量）分别为0.0nmol(mg DW)^-1、5.3nmol(mg DW)^-1、9.8nmol(mg DW)^-1、12.6nmol(mg DW)^-1、15.0nmol(mg DW)^-1、16.4nmol(mg DW)^-1、16.2nmol(mg DW)^-1；细胞的吸收活力分别为0.0nmol min^-1(mg DW)^-1、10.6nmol min^-1(mg DW)^-1、9.8nmolmin^-1(mg DW)^-1、8.3nmol min^-1(mg DW)^-1、7.5nmol min^-1(mg DW)^-1、6.56nmol min^-1(mg DW)^-1、5.4nmol min^-1(mg DW)^-1；

RES167ΔGabP(△)在0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s时γ-氨基丁酸的单位转运量（吸收量）分别为0.0nmol(mg DW)^-1、0.0nmol(mg DW)^-1、0.0nmol(mg DW)^-1、0.0nmol(mg DW)^-1、0.0nmol(mg DW)^-1、0.1nmol(mg DW)^-1、0.1nmol(mg DW)^-1；细胞的吸收活力分别为0.0nmol min^-1(mg DW)^-1、0.0nmol min^-1(mg DW)^-1、0.0nmolmin^-1(mg DW)^-1、0.0nmol min^-1(mg DW)^-1、0.0nmol min^-1(mg DW)^-1、0.0nmol min^-1(mg DW)^-1、0.0nmol min^-1(mg DW)^-1；

RES167ΔGabP/pGXZ7(▲)在0s、30s、60s、90s、120s、150s、180s时γ-氨基丁酸的单位转运量（吸收量）分别为0.0nmol(mg DW)^-1、10.7nmol(mg DW)^-1、16.2nmol(mg DW)^-1、17.5nmol(mg DW)^-1、17.2nmol(mg DW)^-1、17.6nmol(mg DW)^-1、17.8nmol(mg DW)^-1；细胞的吸收活力分别为0.0nmol min^-1(mg DW)^-1、21.4nmol min^-1(mgDW)^-1、16.2nmol min^-1(mg DW)^-1、11.7nmol min^-1(mg DW)^-1、8.6nmol min^-1(mgDW)^-1、7.0nmol min^-1(mg DW)^-1、5.9nmol min^-1(mg DW)^-1。

以上结果表明，出发菌株C.glutamicum RES167具有较强的转运γ-氨基丁酸的能力，GabP部分基因缺失菌株C.glutamicum RES167ΔGabP丧失了转运γ-氨基丁酸的能力，而互补菌株C.glutamicumRES167ΔGabP/pGXZ7恢复了转运γ-氨基丁酸的能力。

实施例3、利用GabP基因敲除菌株制备γ-氨基丁酸

1、重组菌株RES167ΔGabP/pGXKZ9的构建

谷氨酸脱羧酶基因gadB1的核苷酸序列为序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸，其编码的蛋白谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列为序列表中的序列5。

上游引物1847F：

5’-CGCAAGCTTAAAGGAGGACAACCATGGCTATGTTGTATGGA-3'

下游引物1847R：

5’-ACGGTCTAGAGCTACCGTAACCATTCACG-3'

以短乳杆菌（Lactobacillus brevis）CGMCC 1.2028的基因组DNA为模板，1847F和1847R为引物，得到1516bp的PCR产物，经过测序，该PCR产物具有序列4所示的核苷酸，为带有gadB1的DNA片段。

将其用HindIII/XbaI双酶切PCR产物后回收大片段，与经由同样酶切的pXMJ19的大片段连接，连接产物转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，得到转化子，提取转化子的质粒。经过测序，该质粒为将序列表中序列4的PCR产物插入pXMJ19的HindIII和XbaI酶切位点间得到的载体，命名为pGXKZ9。

将质粒pGXKZ9分别电击转化谷氨酸棒杆菌RES167和RES167ΔGabP的感受态细胞，得到重组菌RES167/pGXKZ9和RES167ΔGabP/pGXKZ9；经过提取质粒并HindIII/XbaI酶切鉴定，得到1.50kb和6.58kb的片段均为阳性重组菌。

2、菌株RES167ΔGabP/pGXKZ9产γ-氨基丁酸能力提高

将上述鉴定阳性的重组菌RES167/pGXKZ9和RES167ΔGabP/pGXKZ9分别在30mL LB培养基中培养12小时，收集菌体（低温离心机4℃，6000rpm，离心3min），菌体(湿重0.45g)接入到30mL含L-谷氨酸的MMII培养基中（每升含L-谷氨酸50g，葡萄糖4g，磷酸氢二钠5g，磷酸二氢钠1g）转化反应（30℃反应1小时），收集转化产物，离心（低温离心机4℃，6000rpm，离心3min）收集上清液。

对上述上清液用HPLC检测[Agilent 1200型HPLC仪，Agilent Zorbax Eclipse-AAA色谱柱，4.6x75mm,3.5μm，OPA法自动柱前衍生。流动相A：40mM磷酸二氢钠pH7.8，B：乙腈：甲醇：水45：45：10(v/v/v)，流速：2mL/min]γ-氨基丁酸产量。标准品γ-氨基丁酸（纯度>98.5%，生物质公司，Bio Basic Inc，加拿大）。

标准品的保留时间为7.25min,实验中收集的上清液保留时间为7.25min，证明上清液中所含物质为γ-氨基丁酸。

结果如下：重组菌RES167/pGXKZ9的产量为23.6g/L，重组菌RES167ΔGabP/pGXKZ9的产量为25.6g/L。

上述结果表明，未敲除GabP的重组菌RES167/pGXKZ9有转运γ-氨基丁酸的能力，将胞外的γ-氨基丁酸转入胞内，因此胞外（上清液）中的γ-氨基丁酸含量低；而敲除GabP的重组菌RES167ΔGabP/pGXKZ9缺失转运γ-氨基丁酸的能力，不能将胞外的γ-氨基丁酸转入胞内，因此胞外（上清液）中的γ-氨基丁酸含量较RES167/pGXKZ9高。

Claims (10)

1.一种蛋白，是如下（a）或（b）：

（a）由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

（b）将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与转运γ-氨基丁酸相关的由序列2衍生的蛋白质。

2.编码权利要求1所述蛋白的基因；

所述基因具体是如下(1）或(2）或(3）的DNA分子：

(1）序列表中序列1所示的DNA分子；

(2）在严格条件下与（1）限定的DNA序列杂交且编码转运γ-氨基丁酸相关蛋白的DNA分子；

(3）与（1）限定的DNA序列至少具有70%、至少具有75%、至少具有80%、至少具有85%、至少具有90%、至少具有95%、至少具有96%、至少具有97%、至少具有98%或至少具有99%同源性且编码转运γ-氨基丁酸相关蛋白的DNA分子。

3.含有权利要求2所述基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌；

或扩增权利要求2所述基因全长或其任意片段的引物对。

4.权利要求1所述蛋白、权利要求2所述基因或权利要求3所述重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在转运γ-氨基丁酸中的应用。

5.一种重组菌A，为抑制目的菌中权利要求1所述蛋白的表达或活性得到的重组菌；所述目的菌具体为原核细菌，所述原核细菌进一步具体为谷氨酸棒杆菌；所述谷氨酸棒杆菌进一步具体为谷氨酸棒杆菌RES167。

6.根据权利要求5所述的重组菌A，其特征在于：

所述抑制目的菌中权利要求1所述蛋白的表达或活性通过同源重组实现；

所述同源重组的方法具体为将DNA分子导入目的菌；所述DNA分子的核苷酸序列为序列表中的序列3；

所述DNA分子进一步具体通过重组载体A导入目的菌；所述重组载体A为将所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位点间得到的载体。

7.一种重组菌B，为将谷氨酸脱羧酶编码基因导入权利要求5或6所述的重组菌A中得到的重组菌；

所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列具体为序列表中的序列5；

所述谷氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸序列具体为序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。

8.根据权利要求7所述的重组菌B，其特征在于：所述谷氨酸脱羧酶编码基因通过重组载体B导入权利要求5或6所述的重组菌A中；所述重组载体B具体为将所述谷氨酸脱羧酶编码基因插入表达载体pXMJ19中，得到表达谷氨酸脱羧酶的载体。

9.权利要求7或8所述的重组菌B在制备γ-氨基丁酸中的应用；

或一种制备γ-氨基丁酸的方法，为将权利要求7或8所述的重组菌B在含有L-谷氨酸的培养基进行转化反应，收集上清液，得到γ-氨基丁酸。

10.一种DNA分子，其核苷酸序列为序列表中的序列3；

或含有所述DNA分子的重组载体A、表达盒、转基因细胞系或重组菌；所述重组载体A具体为将所述DNA分子插入pK18mobsacB的多克隆位点间得到的载体；

或一种重组载体B，为将谷氨酸脱羧酶编码基因插入表达载体pXMJ19中，得到表达谷氨酸脱羧酶的载体；所述谷氨酸脱羧酶的氨基酸序列具体为序列表中的序列5；所述谷氨酸脱羧酶的编码基因的核苷酸酸序列具体为序列表中的序列4或序列表中的序列4自5’末端第24-1430位核苷酸。

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